一种猪肉中空肠弯曲杆菌的检测试剂盒及检测方法.pdf

本发明涉及一种猪肉中空肠弯曲杆菌的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包括培养基和检测液；所述的培养基为肉汤；所述的检测液由以下含量的组分制成:10PCR Buffer缓冲液3~5μl，TaqDNA聚合酶0.2~0.4μl，dNTP3~5μl，100bpDNALadderMarker0.1~0.6μl，PCR引物1~2μl,Tris.Cl5~10mg，氯化钠1~2.2mg，氯化镁1~2.2mg，十二水磷酸氢二钠0.2~0.5mg，增菌液3~5mg。本发明在常规PCR技术基础上进行了改进，可用于空肠弯曲杆菌的定性检测，将PCR及DHPLC等技术的优点相互综合，检测结果特异性强，灵敏度高，保证了食品空肠弯曲杆菌的有效检测。

1.  一种猪肉中空肠弯曲杆菌的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒包括培养基和检测液；所述的培养基为肉汤；所述的检测液由以下含量的组分制成:
10PCR Buffer 缓冲液                 3~5μl，
Taq DNA 聚合酶                  0.2~0.4μl， 
dNTP                               3~5μl，  
100bp DNA Ladder Marker          0.1~0.6μl，
PCR引物                           1~ 2μl,
Tris.Cl                             5~10mg，
氯化钠                            1~2.2mg，
氯化镁                            1~2.2mg，
十二水磷酸氢二钠                 0.2~0.5mg，
增菌液                             3~5 mg。

2.  根据权利要求1所述的猪肉中空肠弯曲杆菌的检测试剂盒，其特征在于，所述的肉汤为Bolton肉汤，肉汤中含有0.3%~0.5%重量份的生长促进剂。

3.  根据权利要求2所述的猪肉中空肠弯曲杆菌的检测试剂盒，其特征在于，所述的生长促进剂为焦亚硫酸钠、丙酮酸钠与硫酸亚铁按2:1:5的重量份混合的混合物。

4.  根据权利要求1所述的猪肉中空肠弯曲杆菌的检测试剂盒，其特征在于，所述的PCR引物为：C16S-F：5’-CTG CTT AAC ACA AGT TGA GTA GG-3’(183～205)，C16S-R：5’-TTC CTT AGG TAC CGT CAG AA-3’(449～468)。

5.  根据权利要求1所述的猪肉中空肠弯曲杆菌的检测试剂盒，其特征在于，所述的Taq DNA 聚合酶浓度为2-5U/μl。

6.  根据权利要求1所述的猪肉中空肠弯曲杆菌的检测试剂盒，其特征在于，所述的dNTP浓度为5-10mmol/L，所述的PCR引物浓度为10-25μmol/L。

7.  一种采用如权利要求1~6中任一所述的检测试剂盒检测猪肉中空肠弯曲杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）量取10PCR Buffer 缓冲液3~5μl，Taq DNA 聚合酶0.2~0.4μl，dNTP3~5μl，100bp DNA Ladder Marker 0.1~0.6μl，PCR引物 1~ 2μl,Tris.Cl 5~10mg，氯化钠1~2.2mg，氯化镁1~2.2mg，十二水磷酸氢二钠0.2~0.5mg，增菌液3~5 mg，配置成检测液；
在Bolton肉汤中加入0.3%~0.5%重量份的生长促进剂制得培养基；
（2）取待测猪肉样品2~5g，研碎，接种于培养基中，于微需氧条件下培养；
（3）取增菌液接种于步骤（2）中的培养基中，按细菌基因组小量提取待测样品DNA；
（4）将步骤（3）中待测样品DNA加入检测液中，并加入灭菌超纯水，离心，进行PCR反应， 94℃变性、72℃变性，进入循环，35个循环后72℃终止延伸，制得样品PCR产物；
（5）DHPLC分析：色谱柱：PS-DVB；C18DNASep；柱温40-50℃；色谱柱：4.5 mm×50mm；流动相体积比：0、30s、60s、120s、240s时缓冲溶液A：缓冲溶液B之比分别为：（55%：45%）、（50.2%：49.8%）、（44.2%：55.8%）、（40.9%：59.1%）、（38.8%：61.2%）；流速：（0.5-0.8）ml/min；进样量：PCR产物 （2-5）μl; PCR检测器：荧光检测器。

8.  根据权利要求7所述的一种检测猪肉中空肠弯曲杆菌的方法，其特征在于，步骤（5）中所述的缓冲溶液A为TEAA水溶液，其浓度为0.5-0.8mmol/L。

9.  根据权利要求7所述的一种检测猪肉中空肠弯曲杆菌的方法，其特征在于，步骤（5）中所述的缓冲溶液B为缓冲溶液A与乙腈的混合溶液，所述的缓冲溶液A与乙腈的体积比为（4-6）:(1-2)。

10.  根据权利要求7所述的一种检测猪肉中空肠弯曲杆菌的方法，其特征在于，步骤（5）中所述的荧光检测器的光源为Xenon灯，功率为150w。

一种猪肉中空肠弯曲杆菌的检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于食品检测领域，具体涉及一种猪肉中空肠弯曲杆菌的检测试剂盒及检测方法。
背景技术
猪肉是人们日常生活中的主要肉食品种，猪肉中微生物的含量是否达标直接关系到大家的饮食健康。空肠弯曲杆菌是猪肉类食品中最容易感染的微生物之一。它是引起全球人类及动物食源性细菌胃肠炎的主要原因，可引起急性肠炎及腹泻，报道显示，空肠弯曲杆菌感染占所有食源性细性菌感染的47%，能导致散发性和地方流行性胃肠炎爆发，尤其以恶性肿瘤、艾滋病、慢性疾病、儿童及老年人发病率最高，此外，还可引起格林巴利综合征（GBS），反应性关节炎、心内膜炎等多种并发疾病，其中格林巴利综合征（GBS）是最严重的并发症，可致感染者死亡。
空肠弯曲杆菌引起的胃肠现病例数已超过沙门氏菌及李斯特菌，其作为一项感染率极高的致病菌，目前已作为食品安全、畜牧兽医及公共卫生等领域的常规监测指标。
传统的检测与分离方法为生化及血清凝集试验，但培养周期长、检验程序复杂、确诊检验结果需10-20d，且报告结果差异大，该菌生长条件苛刻，食品中该菌数量极少，传统的选择性富集培养，很难从样品中检出，且该菌还存在一种“存在但不可培养”的状态，给传统方法检出带来极大的困难。因此，寻求一种能对食品空肠弯曲杆菌进行快速检测、检测灵敏度度且的方法十分重要。
变性高效液相色谱（DHPLC）通过反相高效液相色谱原理，对核苷酸片段分子进行分离，操作全自动化，准确度和灵敏度高，但对于食品中空肠弯曲杆菌含量极低时，检测结果并不十分准确。本发明提供一种检测灵敏度高、准确性高的猪肉中空肠弯曲杆菌的检测试剂盒及检测方法。
发明内容
针对上述现有技术的缺陷，本发明提供一种检测灵敏度高、准确性高的猪肉中空肠弯曲杆菌的检测试剂盒及检测方法。
本发明的技术方案如下：
一种猪肉中空肠弯曲杆菌的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包括培养基和检测液；所述的培养基为肉汤；所述的检测液由以下含量的组分制成:
10PCR Buffer 缓冲液                3~5μl，
Taq DNA 聚合酶                  0.2~0.4μl， 
dNTP                               3~5μl，  
100bp DNA Ladder Marker          0.1~0.6μl，
PCR引物                           1~ 2μl,
Tris.Cl                             5~10mg，
氯化钠                            1~2.2mg，
氯化镁                            1~2.2mg，
十二水磷酸氢二钠                 0.2~0.5mg，
增菌液                             3~5 mg。
优选的，所述的肉汤为Bolton肉汤，肉汤中含有0.3%~0.5%重量份的生长促进剂。
优选的，所述的生长促进剂为焦亚硫酸钠、丙酮酸钠与硫酸亚铁按2:1:5的重量份混合的混合物。
优选的，所述的PCR引物为：C16S-F：5’-CTG CTT AAC ACA AGT TGA GTA GG-3’(183～205)，C16S-R：5’-TTC CTT AGG TAC CGT CAG AA-3’(449～468)。
优选的，所述的Taq DNA 聚合酶浓度为2-5U/μl。
优选的，所述的dNTP浓度为5-10mmol/L，所述的PCR引物浓度为10-25μmol/L。
一种采用上述检测试剂盒检测猪肉中空肠弯曲杆菌的方法，包括以下步骤：
（1）量取10PCR Buffer 缓冲液3~5μl，Taq DNA 聚合酶0.2~0.4μl，dNTP3~5μl，100bp DNA Ladder Marker 0.1~0.6μl，PCR引物 1~ 2μl,Tris.Cl 5~10mg，氯化钠1~2.2mg，氯化镁1~2.2mg，十二水磷酸氢二钠0.2~0.5mg，增菌液3~5 mg，配置成检测液；
在Bolton肉汤中加入0.3%~0.5%重量份的生长促进剂制得培养基；
（2）取待测猪肉样品2~5g，研碎，接种于培养基中，于微需氧条件下培养；
（3）取增菌液接种于步骤（2）中的培养基中，按细菌基因组小量提取待测样品DNA；
（4）将步骤（3）中待测样品DNA加入检测液中，并加入灭菌超纯水，离心，进行PCR反应， 94℃变性、72℃变性，进入循环，35个循环后72℃终止延伸，制得样品PCR产物；
（5）DHPLC分析：色谱柱：PS-DVB；C18DNASep；柱温40-50℃；色谱柱：4.5 mm×50mm；流动相体积比：0、30s、60s、120s、240s时缓冲溶液A：缓冲溶液B之比分别为：（55%：45%）、（50.2%：49.8%）、（44.2%：55.8%）、（40.9%：59.1%）、（38.8%：61.2%）；流速：（0.5-0.8）ml/min；进样量：PCR产物 （2-5）μl; PCR检测器：荧光检测器。
优选的，步骤（5）中所述的缓冲溶液A为TEAA水溶液，其浓度为0.5-0.8mmol/L。
优选的，步骤（5）中所述的缓冲溶液B为缓冲溶液A与乙腈的混合溶液，所述的缓冲溶液A与乙腈的体积比为（4-6）:(1-2)。
优选的，步骤（5）中所述的荧光检测器的光源为Xenon灯，功率为150w。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
（1）本发明在常规PCR技术基础上进行了改进，可用于空肠弯曲杆菌的定性检测，将PCR及DHPLC等技术的优点相互综合，检测结果特异性强，灵敏度高，保证了食品空肠弯曲杆菌的有效检测。
（2）本发明操作简单，不需要电泳及PCR产物纯化，整个检测过程仅需12h左右，与传统检测方法相比，检测时间明显缩短，为食品致病菌检测提供技术支持，能满足检测部门对样品的快速检测需求，为食品安全监督提供了有力的保障。
（3）本发明在检测前采用加入了生长促进剂的Bolton肉汤对样品进行培养增菌，提高了检测阳性率，降低了假阴性率的发生。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明：
本发明中PCR引物购自美国ATCC标准生物品收藏中心，微需氧条件采用微需氧袋实现。
实施例1
一种猪肉中空肠弯曲杆菌的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包括培养基和检测液；所述的培养基为肉汤；所述的检测液由以下含量的组分制成:
10PCR Buffer 缓冲液                 3μl，
Taq DNA 聚合酶                   0.2μl， 
dNTP                               3μl，  
100bp DNA Ladder Marker           0.1μl，
PCR引物                           1μl,
Tris.Cl                             5mg，
氯化钠                            1mg，
氯化镁                            1mg，
十二水磷酸氢二钠                 0.2mg，
增菌液                             3 mg。
所述的肉汤为Bolton肉汤，肉汤中含有0.3%重量份的生长促进剂；所述的生长促进剂为焦亚硫酸钠、丙酮酸钠与硫酸亚铁按2:1:5的重量份混合的混合物。
所述的PCR引物为：C16S-F：5’-CTG CTT AAC ACA AGT TGA GTA GG-3’(183～205)，C16S-R：5’-TTC CTT AGG TAC CGT CAG AA-3’(449～468)。
所述的Taq DNA 聚合酶浓度为2U/μl；所述的dNTP浓度为5mmol/L，所述的PCR引物浓度为10μmol/L。
采用上述检测试剂盒检测猪肉中空肠弯曲杆菌的方法，包括以下步骤：
（1）按上述比例制备培养基和检测试液；
（2）取待测猪肉样品2g，研碎，接种于培养基中，于微需氧条件下培养；
（3）取增菌液接种于步骤（2）中的培养基中，按细菌基因组小量提取待测样品DNA；
（4）将步骤（3）中待测样品DNA加入检测液中，并加入灭菌超纯水，离心，进行PCR反应， 94℃变性、72℃变性，进入循环，35个循环后72℃终止延伸，制得样品PCR产物；
（5）DHPLC分析：色谱柱：PS-DVB；C18DNASep；柱温40-50℃；色谱柱：4.5 mm×50mm；流动相体积比：0、30s、60s、120s、240s时缓冲溶液A：缓冲溶液B之比分别为：（55%：45%）、（50.2%：49.8%）、（44.2%：55.8%）、（40.9%：59.1%）、（38.8%：61.2%）；流速：（0.5-0.8）ml/min；进样量：PCR产物 （2-5）μl; PCR检测器：荧光检测器。
步骤（5）中所述的缓冲溶液A为TEAA水溶液，其浓度为0.5mmol/L；步骤（5）中所述的缓冲溶液B为缓冲溶液A与乙腈的混合溶液，所述的缓冲溶液A与乙腈的体积比为（4-6）:(1-2)；步骤（5）中所述的荧光检测器的光源为Xenon灯，功率为150w。
实施例2
一种猪肉中空肠弯曲杆菌的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包括培养基和检测液；所述的培养基为肉汤；所述的检测液由以下含量的组分制成:
10PCR Buffer 缓冲液                  5μl，
Taq DNA 聚合酶                     0.4μl， 
dNTP                                5μl，  
100bp DNA Ladder Marker             0.6μl，
PCR引物                             2μl,
Tris.Cl                               10mg，
氯化钠                              2.2mg，
氯化镁                              2.2mg，
十二水磷酸氢二钠                   0.5mg，
增菌液                             5 mg。
所述的肉汤为Bolton肉汤，肉汤中含有0.5%重量份的生长促进剂；所述的生长促进剂为焦亚硫酸钠、丙酮酸钠与硫酸亚铁按2:1:5的重量份混合的混合物。
所述的PCR引物为：C16S-F：5’-CTG CTT AAC ACA AGT TGA GTA GG-3’(183～205)，C16S-R：5’-TTC CTT AGG TAC CGT CAG AA-3’(449～468)。
所述的Taq DNA 聚合酶浓度为5U/μl；所述的dNTP浓度为10mmol/L，所述的PCR引物浓度为25μmol/L。
一种采用上述检测试剂盒检测猪肉中空肠弯曲杆菌的方法，包括以下步骤：
（1）按上述比例制备培养基和检测试液；
（2）取待测猪肉样品5g，研碎，接种于培养基中，于微需氧条件下培养；
（3）取增菌液接种于步骤（2）中的培养基中，按细菌基因组小量提取待测样品DNA；
（4）将步骤（3）中待测样品DNA加入检测液中，并加入灭菌超纯水，离心，进行PCR反应， 94℃变性、72℃变性，进入循环，35个循环后72℃终止延伸，制得样品PCR产物；
（5）DHPLC分析：色谱柱：PS-DVB；C18DNASep；柱温40-50℃；色谱柱：4.5 mm×50mm；流动相体积比：0、30s、60s、120s、240s时缓冲溶液A：缓冲溶液B之比分别为：（55%：45%）、（50.2%：49.8%）、（44.2%：55.8%）、（40.9%：59.1%）、（38.8%：61.2%）；流速：（0.5-0.8）ml/min；进样量：PCR产物 （2-5）μl; PCR检测器：荧光检测器。
步骤（5）中所述的缓冲溶液A为TEAA水溶液，其浓度为0.8mmol/L；步骤（5）中所述的缓冲溶液B为缓冲溶液A与乙腈的混合溶液，所述的缓冲溶液A与乙腈的体积比为（4-6）:(1-2)；其特征在于，步骤（5）中所述的荧光检测器的光源为Xenon灯，功率为150w。
实施例3
一种猪肉中空肠弯曲杆菌的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包括培养基和检测液；所述的培养基为肉汤；所述的检测液由以下含量的组分制成:
10PCR Buffer 缓冲液                 4μl，
Taq DNA 聚合酶                    0.3μl， 
dNTP                               4μl，  
100bp DNA Ladder Marker            0.5μl，
PCR引物                          1.5μl,
Tris.Cl                              8mg，
氯化钠                             2mg，
氯化镁                            1.5mg，
十二水磷酸氢二钠                  0.3mg，
增菌液                             4 mg。
所述的肉汤为Bolton肉汤，肉汤中含有0.4%重量份的生长促进剂；所述的生长促进剂为焦亚硫酸钠、丙酮酸钠与硫酸亚铁按2:1:5的重量份混合的混合物。
所述的PCR引物为：C16S-F：5’-CTG CTT AAC ACA AGT TGA GTA GG-3’(183～205)，C16S-R：5’-TTC CTT AGG TAC CGT CAG AA-3’(449～468)。
所述的Taq DNA 聚合酶浓度为3U/μl；所述的dNTP浓度为8mmol/L，所述的PCR引物浓度为15μmol/L。
一种采用上述检测试剂盒检测猪肉中空肠弯曲杆菌的方法，包括以下步骤：
（1）按上述比例制备培养基和检测试液；
（2）取待测猪肉样品4g，研碎，接种于培养基中，于微需氧条件下培养；
（3）取增菌液接种于步骤（2）中的培养基中，按细菌基因组小量提取待测样品DNA；
（4）将步骤（3）中待测样品DNA加入检测液中，并加入灭菌超纯水，离心，进行PCR反应， 94℃变性、72℃变性，进入循环，35个循环后72℃终止延伸，制得样品PCR产物；
（5）DHPLC分析：色谱柱：PS-DVB；C18DNASep；柱温40-50℃；色谱柱：4.5 mm×50mm；流动相体积比：0、30s、60s、120s、240s时缓冲溶液A：缓冲溶液B之比分别为：（55%：45%）、（50.2%：49.8%）、（44.2%：55.8%）、（40.9%：59.1%）、（38.8%：61.2%）；流速：（0.5-0.8）ml/min；进样量：PCR产物 （2-5）μl; PCR检测器：荧光检测器。
步骤（5）中所述的缓冲溶液A为TEAA水溶液，其浓度为0.5-0.8mmol/L；步骤（5）中所述的缓冲溶液B为缓冲溶液A与乙腈的混合溶液，所述的缓冲溶液A与乙腈的体积比为（4-6）:(1-2)；步骤（5）中所述的荧光检测器的光源为Xenon灯，功率为150w。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式，并不应理解为对本发明的限定，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。