一种气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201410436478.9	申请日：	2014.08.29
公开号：	CN104263817A	公开日：	2015.01.07
当前法律状态：	驳回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):C12Q 1/68申请公布日:20150107\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/68申请日:20140829\|\|\|公开
IPC分类号：	C12Q1/68; C12Q1/04; G01N27/447; C12R1/01(2006.01)N	主分类号：	C12Q1/68
申请人：	中国水产科学研究院珠江水产研究所
发明人：	邓玉婷; 黄玉萍; 姜兰; 谭爱萍; 王伟利; 罗理; 梁爱玲
地址：	510380 广东省广州市荔湾区芳村西朗兴渔路1号
优先权：
专利代理机构：	广州市越秀区海心联合专利代理事务所(普通合伙) 44295	代理人：	任琳
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内容摘要

本发明公开了一种气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，旨在提供一种快捷、简便，图像结果优质凝胶电泳分型方法；其技术方案：将采集分离到的气单胞菌在TSA平板上、37℃条件下培养14-18小时，用无菌接种环刮取单菌落于CSB缓冲液中，制成5-6Mcf的细菌悬浊液；配制凝胶溶液；取细菌悬浊液于离心管中，加入的蛋白酶K，SDS，混匀后再加入凝胶溶液，得到混合溶液；将得到的混合溶液注入成胶模具，在室温下凝固30分钟，得到胶块；制备消化液，将步骤得到的胶块放入步骤的消化液中，消化裂解；洗胶块；胶块内DNA酶切；加样；电泳；获取图像分析。

权利要求书

1.  一种气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，依次包括下述步骤：
1)胶块的制备

1.  1)将采集分离到的气单胞菌在TSA平板上培养14-18小时，用无菌接种环刮取单菌落于CSB缓冲液中，制成5-6Mcf的细菌悬浊液；

1.  2)配制凝胶溶液；

1.  3)取步骤1.1)所述的细菌悬浊液于离心管中，加入的蛋白酶K，SDS，混匀后再加入步骤1.2)中的凝胶溶液，吹打均匀，得到混合溶液；

1.  4)将步骤1.3)得到的混合溶液注入成胶模具，在室温下凝固30分钟，得到胶块；
2)胶块消化裂解

2.  1)制备消化液，

2.  2)将步骤1.4)得到的胶块放入步骤2.1)的消化液中，盖上滤筛盖，消化裂解；
3)洗胶块
4)胶块内DNA酶切：

4.  1)将20μL的XbaI限制性内切酶10×缓冲液加入180μL的超纯水中配成酶切缓冲液；

4.  2)将洗涤后胶块切成大小为2mm×4mm，放入装有步骤1)酶切缓冲液的离心管中并置于冰上30分钟；

4.  3)吸出步骤4.2)中的酶切缓冲液，在离心管中加入已混匀的含有75U XbaI、20μL BSA、20μL XbaI限制性内切酶10×缓冲液和155μL超纯水的酶切液，在37℃水浴锅中孵化3小时；
5)加样
6)电泳
在电泳槽中加入TBE缓冲液，待电泳缓冲液恒定为12-15℃后，将步骤5)制好的胶块放于电泳槽中进行电泳。
7)获取图像分析。

2.  根据权利要求1所述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，步骤1.2)配制凝胶溶液的方法是用TE缓冲液配制低熔点琼脂糖溶液，使其浓度为2％，并将凝胶溶液放置于54℃水浴中平衡备用。

3.  根据权利要求1所述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，步骤1.3)的具体方法为：取95μL上述细菌悬浊液于1.5mL离心管中，加入5μL20mg/ml的蛋白酶K，5μl20％SDS，混匀后再加入步骤1.2)中的凝胶溶液95μL，吹打均匀。

4.  根据权利要求1所述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，步骤2.1)所述的制备消化酶的方法是在装有5ml TES缓冲液的50ml离心管中加入25μL20mg/ml的蛋白酶K，混合均匀，得到消化液，置于冰上备用。

5.  根据权利要求1所述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，步骤2.2)所述的消化方法为在54℃、175r/min的水浴摇床中消化3小时。

6.  根据权利要求1所述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，步骤3)所述的洗胶块依次包括下述步骤：

3.  1)将超纯水及TE缓冲液放置于水浴锅中预热至50℃备用；

3.  2)将步骤2.2)中消化完成的胶块离心管取出，倒出管中消化液，倒入10-15ml已预热到50℃的超纯水，使胶块在液面以下，放回50℃水浴摇床中摇洗10-15分钟，结束后再见管内超纯水倒出，再倒入10-15ml50℃的超纯水，50℃ 水浴摇床中摇洗10-15分钟；

3.  3)将步骤3.2)水浴完成后离心管中的超纯水倒出，加入10-15mL已预热到50℃的TE缓冲液，50℃水浴摇床中摇洗10-15分钟；再重复此TE洗涤步骤3次；完成后，从水浴锅中取出离心管，冷却至室温。

7.  根据权利要求1所述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，步骤5)所述的加样依次包括下述步骤：

5.  1)将上述酶切完成的离心管从水浴锅中取出，吸取酶切液，加入1ml TBE缓冲液，确保胶块处于液面下，置于冰上30min；

5.  2)用TBE缓冲液配制1％的脉冲场琼脂糖溶液，置于50-60℃恒温箱中平衡15分钟；

5.  3)将步骤5.1)中的小胶块取出置于电泳梳子齿底部，确保梳子上所有胶块处于一条直线，并用吸水纸吸取胶块周围液体；

5.  4)把加完样的电泳梳子放入胶槽，使电泳梳子齿与胶槽底部距离为1-2mm，并使整个制胶装置处于水平位置；将平衡完成的脉冲场琼脂糖溶液注入胶槽，避免气泡产生，室温下凝固30分钟。

8.  根据权利要求1所述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，步骤6)所述的所述的电泳所设电泳电压为6V/cm，起始脉冲时间10s，终止脉冲时间35s，电场夹角120°，电泳时间22小时。

9.  根据权利要求1所述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，步骤7)所述的图像获取的方法依次包括下述步骤：

7.  1)电泳完成后，将胶块从电泳槽中取出，放入装有0.5μg/ml EB溶液的避光盒子中，使溶液没过胶块而，并将盒子放置摇床中振荡30分钟，

7.  2)步骤完成后，将盒子中的EB溶液换成同体积的纯水，于摇床上振荡脱色60分钟，期间换纯水一次；

7.  3)脱色完成后取出胶块，吸去胶块上多余水份，在凝胶成像系统下成像拍摄。

10.  根据权利要求1所述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，所述的CSB缓冲液的组份为：100mM Tris、100mM EDTA，pH为8.0。

说明书

一种气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法
技术领域
本发明涉及一种脉冲场凝胶电泳分型方法，尤其是一种气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法。
背景技术
气单胞菌是属于气单胞菌科的革兰氏阴性杆菌，广泛分布于自然界，可从水源、土壤以及人的粪便中分离。其可引起蛙的红腿病，鳖的红脖子病，鲑鳟鱼类的疖疮病以及在水产养殖史上造成重大经济损失的淡水鱼类细菌性败血症，并且气单胞菌还可引起牛猝死及人的肺部严重感染，是一种典型的人-兽-鱼共患致病菌。对于共患致病菌需要通过分型的方法对致病菌的来源进行追踪和分析。
对细菌分型的方法主要包括基于表型特征的表型分型方法和基于基因特征的基因分型方法。由于细菌易受环境影响，表型性状表达呈不确定性，基于基因水平的分子分型方法，较之更为稳定和可信。目前常用的基因分型方法包括：随机扩增DNA多态性(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)、限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、肠道细菌重复基因间共有序列PCR(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus Sequence PCR，ERIC-PCR)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、质粒分型等.基于PCR技术的RAPD，RFLP，ERIC-PCR虽然具有快速简便的优点，但检测的均为染色体中的某些片段，并且重复性较差。质粒分型针对的对象为质粒，而质粒相对于染色体更容易获得或缺失，稳定性差。脉冲场凝胶电泳是基于整个细菌基因组的分型技术，具有稳定性好，分辨率高的特点，被誉为分子分型的“金标准”。然而它也具有实验流程长，操作繁琐。。
发明内容
针对上述不足，本发明的前一个目的在于提供一种快捷、简便，图像结果优质的单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法。
为此，本发明提供的技术方案是这样的：该气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，依次包括下述步骤：
1)胶块的制备
1.1)将采集分离到的气单胞菌在TSA平板上培养14-18小时，用无菌接种环刮取单菌落于CSB缓冲液中，制成5-6Mcf的细菌悬浊液；
1.2)配制凝胶溶液；
1.3)取步骤1.1)所述的细菌悬浊液于离心管中，加入的蛋白酶K，SDS，混匀后再加入步骤1.2)中的凝胶溶液，吹打均匀，得到混合溶液；
1.4)将步骤1.3)得到的混合溶液注入成胶模具，在室温下凝固30分钟，得到胶块；
2)胶块消化裂解
2.1)制备消化液，
2.2)将步骤1.4)得到的胶块放入步骤2.1)的消化液中，盖上滤筛盖，消化裂解；
3)洗胶块
4)胶块内DNA酶切：
4.1)将20μL的XbaI限制性内切酶10×缓冲液加入180μL的超纯水中配成酶切缓冲液；
4.2)将洗涤后胶块切成大小为2mm×4mm，放入装有步骤1)酶切缓冲液的离心管中并置于冰上30分钟；
4.3)吸出步骤4.2)中的酶切缓冲液，在离心管中加入已混匀的含有75UXbaI、20μL BSA、20μL XbaI限制性内切酶10×缓冲液和155μL超纯水的酶切液，在37℃水浴锅中孵化3小时；
5)加样
6)电泳
在电泳槽中加入TBE缓冲液，待电泳缓冲液恒定为12-15℃后，将步骤5)制好的胶块放于电泳槽中进行电泳。
7)获取图像分析。
上述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，步骤1.2)配制凝胶溶液的方法是用TE缓冲液配制低熔点琼脂糖溶液，使其浓度为2％，并将凝胶溶液放置于54℃水浴中平衡备用。
上述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，步骤1.3)的具体方法为：取95μL上述细菌悬浊液于1.5mL离心管中，加入5μL20mg/ml的蛋白酶K，5μl20％SDS，混匀后再加入步骤1.2)中的凝胶溶液95μL，吹打均匀。
上述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，步骤2.1)所述的制备消化酶的方法是在装有5ml TES缓冲液的50ml离心管中加入25μL20mg/ml的蛋白酶K，混合均匀，得到消化液，置于冰上备用。
上述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，步骤2.2)所述的消化方法为在54℃、175r/min的水浴摇床中消化3小时。；
上述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，步骤3)所述的洗胶块依次包括下述步骤：
3.1)将超纯水及TE缓冲液放置于水浴锅中预热至50℃备用；
3.2)将步骤2.2)中消化完成的胶块离心管取出，倒出管中消化液，倒入10-15ml已预热到50℃的超纯水，使胶块在液面以下，放回50℃水浴摇床中摇洗10-15分钟，结束后再见管内超纯水倒出，再倒入10-15ml50℃的超纯水，50℃水浴摇床中摇洗10-15分钟；
3.3)将步骤3.2)水浴完成后离心管中的超纯水倒出，加入10-15mL已预热到50℃的TE缓冲液，50℃水浴摇床中摇洗10-15分钟；再重复此TE洗涤步骤3次；完成后，从水浴锅中取出离心管，冷却至室温。
上述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，步骤5)所述的加样依次包括下述步骤：
5.1)将上述酶切完成的离心管从水浴锅中取出，吸取酶切液，加入1ml TBE缓冲液，确保胶块处于液面下，置于冰上30min；
5.2)用TBE缓冲液配制1％的脉冲场琼脂糖溶液，置于50-60℃恒温箱中平衡15分钟；
5.3)将步骤5.1)中的小胶块取出置于电泳梳子齿底部，确保梳子上所有胶块处于一条直线，并用吸水纸吸取胶块周围液体；
5.4)把加完样的电泳梳子放入胶槽，使电泳梳子齿与胶槽底部距离为1-2mm，并使整个制胶装置处于水平位置；将平衡完成的脉冲场琼脂糖溶液注入胶槽，避免气泡产生，室温下凝固30分钟；
上述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，步骤6)所述的所述的电泳所设电泳电压为6V/cm，起始脉冲时间10s，终止脉冲时间35s，电场夹角120°，电泳时间22小时；
上述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，步骤7)所述的图像获取的方法依次包括下述步骤：
7.1)电泳完成后，将胶块从电泳槽中取出，放入装有0.5μg/ml EB溶液的避光盒子中，使溶液没过胶块而，并将盒子放置摇床中振荡30分钟，
7.2)步骤完成后，将盒子中的EB溶液换成同体积的纯水，于摇床上振荡脱色60分钟，期间换纯水一次；
7.3)脱色完成后取出胶块，吸去胶块上多余水份，在凝胶成像系统下成像拍摄。
上述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，所述的CSB缓冲液的组份为：100mM Tris、100mM EDTA，pH为8.0。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案从减少有毒试剂的使用，减少细菌悬浊离心、溶菌酶作用的步骤，缩短蛋白酶K消化和限制性内切酶消化的时间以及修改电泳参数四方面使现有气单胞菌PFGE方法得以优化。
表1 已报道的气单胞菌PFGE方法与本发明的技术方法对比

与现有的气单胞菌PFGE分型方法比较，本发明方法对气单胞菌的区分能力更强，操作更简便，整个实验流程缩短至3天(国外传统PFGE分型方法需至少5天)，为更加简便快速的对气单胞菌病进行监测、追踪、识别等具有非常重要的意义。
附图说明
图1为采用实施例1的方法对2013年采自不同鱼池中不同来源的气单胞菌进行的脉冲场凝胶电泳分型后的电泳结果；
图2为采用实施例2的方法对2013年采集到的五株维氏气单胞菌进行的脉冲场凝胶电泳分型后的电泳结果。
具体实施方式
为了更好的理解、实施本发明的权利要求，下面结合具体实施例和附图，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但本发明并不限于下述实施例，而是以权利要求为限。
实施例1
本发明公开的一种气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，将表1中标号1-11的气单胞菌作为分析样品，具体方法包括以下步骤：
(1)胶块的制备：
1.1)将采集分离到的气单胞菌在TSA平板上、37℃条件下培养14-18小时，用无菌接种环刮取单菌落于CSB缓冲液中，制成5-6Mcf的细菌悬浊液；
其中：所述CSB缓冲液的组份为：100mM Tris、100mM EDTA，pH为8.0。
1.2)用TE缓冲液配制低熔点琼脂糖溶液，使其浓度为2％，并将凝胶溶液放置于54℃水浴中平衡备用；
其中：所述TE缓冲液的组份为：10mM Tris、1mM EDTA，pH为8.0。
1.3)取95μL上述细菌悬浊液于1.5mL离心管中，加入5μL20mg/ml的蛋白酶K，5μl20％SDS，混匀后再加入步骤1.2)中的凝胶溶液95μL，吹打均匀；
1.4)将步骤1.3)得到的混合溶液小心注入成胶模具，避免气泡产生，在室温下凝固30分钟，得到胶块；
(2)胶块消化裂解：
2.1)在装有5mL TES缓冲液的50mL离心管中加入25μL20mg/mL的蛋白酶K，混合均匀，得到消化液，置于冰上备用；
其中：所述TES缓冲液的组份为：50mM Tris、50mM EDTA，1g/100ml十二烷基肌氨酸钠，pH为8.0。
2.2)将步骤1.4)得到的胶块放入上述消化液中，并保证胶块在液面以下，盖上滤筛盖，在54℃、175r/min的水浴摇床中消化3小时；
(3)洗胶块
3.1)将超纯水及TE缓冲液放置于水浴锅中预热至50℃备用；
3.2)将步骤2.2)中消化完成的离心管取出，倒出管中消化液，倒入10-15mL已预热到50℃的超纯水，使胶块在液面以下，放回50℃水浴摇床中摇洗10-15分钟，结束后再见管内超纯水倒出，再倒入10-15mL50℃的超纯水，50℃水浴摇床中摇洗10-15分钟；
3.3)将步骤3.2)水浴完成后离心管中的超纯水倒出，加入10-15mL已预热到50℃的TE缓冲液，50℃水浴摇床中摇洗10-15分钟；再重复此TE洗涤步骤3次；完成后，从水浴锅中取出离心管，冷却至室温；
其中：所述TE缓冲液的组份为：10mM Tris、1mM EDTA，pH为8.0。
(4)胶块内DNA酶切：
4.1)将20μL的XbaI限制性内切酶10×缓冲液加入180μL的超纯水中配成酶切缓冲液；
4.2)将步骤3.3)洗涤完成的胶块切成大小为2mm×4mm，放入装有上述酶切缓冲液的1.5ml离心管中，确保胶块处于液面下，并置于冰上30分钟；
4.3)吸出步骤4.2)中的酶切缓冲液，在离心管中加入已混匀的含有75U XbaI、20μL BSA、20μL XbaI限制性内切酶10×缓冲液和155μL超纯水的酶切液，确保胶块处于液面下，在37℃水浴锅中孵化3小时；
5)加样
5.1)将上述酶切完成的离心管从水浴锅中取出，吸取酶切液，加入1mL TBE缓冲液，确保胶块处于液面下，置于冰上30min；
5.2)用TBE缓冲液配制1％的脉冲场琼脂糖溶液，置于50-60℃恒温箱中平衡15分钟；
其中：所述TBE缓冲液的组份为：5.4g/1L Tris、0.372g/1L EDTA、2.75g/1L硼酸
5.3)将步骤5.1)中的小胶块取出置于电泳梳子齿底部，确保梳子上所有胶块处于一条直线，并用吸水纸吸取胶块周围液体；
5.4)把加完样的电泳梳子放入胶槽，使电泳梳子齿与胶槽底部距离为1-2mm，并使整个制胶装置处于水平位置；将平衡完成的脉冲场琼脂糖溶液注入胶槽，避免气泡产生，室温下凝固30分钟；
(6)电泳
6.1)在电泳槽中加入2.2L的TBE缓冲液，盖上盖子，调价冷凝器，设定温度为14℃；
其中：所述TBE缓冲液的组份为：5.4g/1L Tris、0.372g/1L EDTA、2.75g/1L硼酸
6.2)待电泳缓冲液恒定为14℃后，将步骤5.4)制好的胶块放于电泳槽中进行电泳。所设电泳电压为6V/cm，起始脉冲时间10s，终止脉冲时间35s，电场夹角120°，电泳时间22小时；
(7)图像获取：
7.1)电泳完成后，将胶块从电泳槽中取出，放入装有0.5μg/mL EB溶液的避光盒子中，使溶液没过胶块而，并将盒子放置摇床中振荡30分钟，注意避免EB溶液在振荡过程中溢出；
7.2)步骤7.1)完成后，将盒子中的EB溶液换成同体积的纯水，于摇床上振荡脱色60分钟，期间换纯水一次；
7.3)脱色完成后取出胶块，吸去胶块上多余水份，在凝胶成像系统下成像拍摄，所得图像如图1所示，泳道1-11对应表1中标号1-11的气单胞菌，各气单胞菌均显示不同的带型，表明上述气单胞菌具有不同的基因型。也证明本发明可适用于多种气单胞菌的分型需求，具有较强的分型能力。
实施例2
本发明公开的另一种气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，将表2中标号1-5的气单胞菌作为分析样品，具体方法包括以下步骤：
(1)胶块的制备：
1.1)将采集分离到的气单胞菌在TSA平板上、37℃条件下培养14-18小时，用无菌接种环刮取单菌落于CSB缓冲液中，制成5-6Mcf的细菌悬浊液；
其中：所述CSB缓冲液的组份为：100mM Tris、100mM EDTA，pH为8.0。
1.2)用TE缓冲液配制低熔点琼脂糖溶液，使其浓度为2％，并将凝胶溶液放置于54℃水浴中平衡备用；
其中：所述TE缓冲液的组份为：10mM Tris、1mM EDTA，pH为8.0。
1.3)取95μL上述细菌悬浊液于1.5mL离心管中，加入5μL20mg/ml的蛋白酶K，5μl20％SDS，混匀后再加入步骤1.2)中的凝胶溶液95μL，吹打均匀；
1.4)将步骤1.3)得到的混合溶液小心注入成胶模具，避免气泡产生，在室温下凝固30分钟，得到胶块；
(2)胶块消化裂解：
2.1)在装有5mL TES缓冲液的50mL离心管中加入25μL20mg/mL的蛋白酶K，混合均匀，得到消化液，置于冰上备用；
其中：所述TES缓冲液的组份为：50mM Tris、50mM EDTA，1g/100ml十二烷基肌氨酸钠，pH为8.0。
2.2)将步骤1.4)得到的胶块放入上述消化液中，并保证胶块在液面以下，盖上滤筛盖，在54℃、175r/min的水浴摇床中消化3小时；
(3)洗胶块
3.1)将超纯水及TE缓冲液放置于水浴锅中预热至50℃备用；
3.2)将步骤2.2)中消化完成的离心管取出，倒出管中消化液，倒入10-15mL已预热到50℃的超纯水，使胶块在液面以下，放回50℃水浴摇床中摇洗10-15分钟，结束后再见管内超纯水倒出，再倒入10-15mL50℃的超纯水，50℃水浴摇床中摇洗10-15分钟；
3.3)将步骤3.2)水浴完成后离心管中的超纯水倒出，加入10-15mL已预热到50℃的TE缓冲液，50℃水浴摇床中摇洗10-15分钟；再重复此TE洗涤步骤3次；完成后，从水浴锅中取出离心管，冷却至室温；
其中：所述TE缓冲液的组份为：10mM Tris、1mM EDTA，pH为8.0。
(4)胶块内DNA酶切：
4.1)将20μL的XbaI限制性内切酶10×缓冲液加入180μL的超纯水中配成酶切缓冲液；
4.2)将步骤3.3)洗涤完成的胶块切成大小为2mm×4mm，放入装有上述酶切缓冲液的1.5ml离心管中，确保胶块处于液面下，并置于冰上30分钟；
4.3)吸出步骤4.2)中的酶切缓冲液，在离心管中加入已混匀的含有75U XbaI、20μL BSA、20μL XbaI限制性内切酶10×缓冲液和155μL超纯水的酶切液，确保胶块处于液面下，在37℃水浴锅中孵化3小时；
(5)加样
5.1)将上述酶切完成的离心管从水浴锅中取出，吸取酶切液，加入1mL TBE缓冲液，确保胶块处于液面下，置于冰上30min；
5.2)用TBE缓冲液配制1％的脉冲场琼脂糖溶液，置于50-60℃恒温箱中平衡15分钟；
其中：所述TBE缓冲液的组份为：5.4g/1L Tris、0.372g/1L EDTA、2.75g/1L硼酸
5.3)、将步骤5.1)中的小胶块取出置于电泳梳子齿底部，确保梳子上所有胶块处于一条直线，并用吸水纸吸取胶块周围液体；
5.4)把加完样的电泳梳子放入胶槽，使电泳梳子齿与胶槽底部距离为1-2mm，并使整个制胶装置处于水平位置；将平衡完成的脉冲场琼脂糖溶液注入胶槽，避免气泡产生，室温下凝固30分钟；
(6)电泳
6.1)在电泳槽中加入2.2L的TBE缓冲液，盖上盖子，调价冷凝器，设定温度为14℃；
其中：所述TBE缓冲液的组份为：5.4g/1L Tris、0.372g/1L EDTA、2.75g/1L硼酸
6.2)待电泳缓冲液恒定为14℃后，将步骤5.4)制好的胶块放于电泳槽中进行电泳。所设电泳电压为6V/cm，起始脉冲时间10s，终止脉冲时间35s，电场夹角120°，电泳时间22小时；
(7)图像获取：
7.1)电泳完成后，将胶块从电泳槽中取出，放入装有0.5μg/mL EB溶液的避光盒子中，使溶液没过胶块而，并将盒子放置摇床中振荡30分钟，注意避免EB溶液在振荡过程中溢出；
7.2)步骤7.1)完成后，将盒子中的EB溶液换成同体积的纯水，于摇床上振荡脱色60分钟，期间换纯水一次；
7.3)脱色完成后取出胶块，吸去胶块上多余水份，在凝胶成像系统下成像拍摄，所得图像如图2所示，泳道1-5对应表5中标号1-5的气单胞菌，各气单胞菌均显示不同的带型，表明上述气单胞菌具有不同的基因型。也证明本发明可适用于气单胞菌的分型需求，且不同的种属的菌株可能具有不同的基因型。其中所使用的普通化学试剂盒仪器均为现有的市售产品，或按照公知的PFGE标准操作规程配制；
上述实施例1和实例2所用的限制性内切酶XbaI为市售产品，其中XbaI限制性内切酶10×缓冲液为购买限制性内切酶XbaI时提供的配套产品。
本发明实施例1、实施例2所采用的气单胞菌样品来自于广东佛山不同复合水产养殖环境。具体情况如表1，表2所示。
表1 2013年不同鱼池不同来源气单胞菌样品信息

标号菌株编号鱼池编号菌株来源分子鉴定1A148Ⅰ鲮鱼鳃A.veronii2A149Ⅰ鲮鱼鳃A.veronii3A150Ⅰ鲮鱼肝A.sobria

4A164Ⅰ鱼池养殖水体A.veronii5A190Ⅰ鱼池养殖水体A.veronii6A191Ⅰ鸭粪便A.sobria7A167Ⅱ鱼池养殖水体A.veronii8A194Ⅱ鲮鱼肠道A.veronii9A195Ⅱ鲮鱼鳃A.caviae10A196Ⅱ鲮鱼肠道A.veronii11A197Ⅱ鲮鱼鳃A.veronii

表2 2013年不同鱼池不同来源5株维氏气单胞菌样品信息
标号菌株编号鱼池编号菌株来源分子鉴定1A196Ⅱ鲮鱼肠A.veronii2A197Ⅱ鲮鱼鳃A.veronii3A192Ⅱ鲮鱼肠A.veronii4A193Ⅱ鲮鱼鳃A.veronii5A173Ⅱ鱼塘底泥A.veronii

资源描述

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1、10申请公布号CN104263817A43申请公布日20150107CN104263817A21申请号201410436478922申请日20140829C12Q1/68200601C12Q1/04200601G01N27/447200601C12R1/0120060171申请人中国水产科学研究院珠江水产研究所地址510380广东省广州市荔湾区芳村西朗兴渔路1号72发明人邓玉婷黄玉萍姜兰谭爱萍王伟利罗理梁爱玲74专利代理机构广州市越秀区海心联合专利代理事务所普通合伙44295代理人任琳54发明名称一种气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法57摘要本发明公开了一种气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，旨在提供。

2、一种快捷、简便，图像结果优质凝胶电泳分型方法；其技术方案将采集分离到的气单胞菌在TSA平板上、37条件下培养1418小时，用无菌接种环刮取单菌落于CSB缓冲液中，制成56MCF的细菌悬浊液；配制凝胶溶液；取细菌悬浊液于离心管中，加入的蛋白酶K，SDS，混匀后再加入凝胶溶液，得到混合溶液；将得到的混合溶液注入成胶模具，在室温下凝固30分钟，得到胶块；制备消化液，将步骤得到的胶块放入步骤的消化液中，消化裂解；洗胶块；胶块内DNA酶切；加样；电泳；获取图像分析。51INTCL权利要求书2页说明书9页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书9页附图1页10申请公布号。

3、CN104263817ACN104263817A1/2页21一种气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，依次包括下述步骤1胶块的制备11将采集分离到的气单胞菌在TSA平板上培养1418小时，用无菌接种环刮取单菌落于CSB缓冲液中，制成56MCF的细菌悬浊液；12配制凝胶溶液；13取步骤11所述的细菌悬浊液于离心管中，加入的蛋白酶K，SDS，混匀后再加入步骤12中的凝胶溶液，吹打均匀，得到混合溶液；14将步骤13得到的混合溶液注入成胶模具，在室温下凝固30分钟，得到胶块；2胶块消化裂解21制备消化液，22将步骤14得到的胶块放入步骤21的消化液中，盖上滤筛盖，消化裂解；3洗胶块4胶块内DNA。

4、酶切41将20L的XBAI限制性内切酶10缓冲液加入180L的超纯水中配成酶切缓冲液；42将洗涤后胶块切成大小为2MM4MM，放入装有步骤1酶切缓冲液的离心管中并置于冰上30分钟；43吸出步骤42中的酶切缓冲液，在离心管中加入已混匀的含有75UXBAI、20LBSA、20LXBAI限制性内切酶10缓冲液和155L超纯水的酶切液，在37水浴锅中孵化3小时；5加样6电泳在电泳槽中加入TBE缓冲液，待电泳缓冲液恒定为1215后，将步骤5制好的胶块放于电泳槽中进行电泳。7获取图像分析。2根据权利要求1所述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，步骤12配制凝胶溶液的方法是用TE缓冲液配制低熔点琼。

5、脂糖溶液，使其浓度为2，并将凝胶溶液放置于54水浴中平衡备用。3根据权利要求1所述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，步骤13的具体方法为取95L上述细菌悬浊液于15ML离心管中，加入5L20MG/ML的蛋白酶K，5L20SDS，混匀后再加入步骤12中的凝胶溶液95L，吹打均匀。4根据权利要求1所述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，步骤21所述的制备消化酶的方法是在装有5MLTES缓冲液的50ML离心管中加入25L20MG/ML的蛋白酶K，混合均匀，得到消化液，置于冰上备用。5根据权利要求1所述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，步骤22所述的消化方法为在54、。

6、175R/MIN的水浴摇床中消化3小时。6根据权利要求1所述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，步骤3所述的洗胶块依次包括下述步骤31将超纯水及TE缓冲液放置于水浴锅中预热至50备用；权利要求书CN104263817A2/2页332将步骤22中消化完成的胶块离心管取出，倒出管中消化液，倒入1015ML已预热到50的超纯水，使胶块在液面以下，放回50水浴摇床中摇洗1015分钟，结束后再见管内超纯水倒出，再倒入1015ML50的超纯水，50水浴摇床中摇洗1015分钟；33将步骤32水浴完成后离心管中的超纯水倒出，加入1015ML已预热到50的TE缓冲液，50水浴摇床中摇洗1015分钟；再。

7、重复此TE洗涤步骤3次；完成后，从水浴锅中取出离心管，冷却至室温。7根据权利要求1所述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，步骤5所述的加样依次包括下述步骤51将上述酶切完成的离心管从水浴锅中取出，吸取酶切液，加入1MLTBE缓冲液，确保胶块处于液面下，置于冰上30MIN；52用TBE缓冲液配制1的脉冲场琼脂糖溶液，置于5060恒温箱中平衡15分钟；53将步骤51中的小胶块取出置于电泳梳子齿底部，确保梳子上所有胶块处于一条直线，并用吸水纸吸取胶块周围液体；54把加完样的电泳梳子放入胶槽，使电泳梳子齿与胶槽底部距离为12MM，并使整个制胶装置处于水平位置；将平衡完成的脉冲场琼脂糖溶液注入。

8、胶槽，避免气泡产生，室温下凝固30分钟。8根据权利要求1所述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，步骤6所述的所述的电泳所设电泳电压为6V/CM，起始脉冲时间10S，终止脉冲时间35S，电场夹角120，电泳时间22小时。9根据权利要求1所述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，步骤7所述的图像获取的方法依次包括下述步骤71电泳完成后，将胶块从电泳槽中取出，放入装有05G/MLEB溶液的避光盒子中，使溶液没过胶块而，并将盒子放置摇床中振荡30分钟，72步骤完成后，将盒子中的EB溶液换成同体积的纯水，于摇床上振荡脱色60分钟，期间换纯水一次；73脱色完成后取出胶块，吸去胶块上多余水。

9、份，在凝胶成像系统下成像拍摄。10根据权利要求1所述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，所述的CSB缓冲液的组份为100MMTRIS、100MMEDTA，PH为80。权利要求书CN104263817A1/9页4一种气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法技术领域0001本发明涉及一种脉冲场凝胶电泳分型方法，尤其是一种气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法。背景技术0002气单胞菌是属于气单胞菌科的革兰氏阴性杆菌，广泛分布于自然界，可从水源、土壤以及人的粪便中分离。其可引起蛙的红腿病，鳖的红脖子病，鲑鳟鱼类的疖疮病以及在水产养殖史上造成重大经济损失的淡水鱼类细菌性败血症，并且气单胞菌还可引起牛猝死及人的。

10、肺部严重感染，是一种典型的人兽鱼共患致病菌。对于共患致病菌需要通过分型的方法对致病菌的来源进行追踪和分析。0003对细菌分型的方法主要包括基于表型特征的表型分型方法和基于基因特征的基因分型方法。由于细菌易受环境影响，表型性状表达呈不确定性，基于基因水平的分子分型方法，较之更为稳定和可信。目前常用的基因分型方法包括随机扩增DNA多态性RANDOMAMPLIEDPOLYMORPHICDNA，RAPD、限制性片段长度多态性RESTRICTIONFRAGMENTLENGTHPOLYMORPHISM，RFLP、肠道细菌重复基因间共有序列PCRENTEROBACTERIALREPETITIVEINTERG。

11、ENICCONSENSUSSEQUENCEPCR，ERICPCR、脉冲场凝胶电泳PFGE、质粒分型等基于PCR技术的RAPD，RFLP，ERICPCR虽然具有快速简便的优点，但检测的均为染色体中的某些片段，并且重复性较差。质粒分型针对的对象为质粒，而质粒相对于染色体更容易获得或缺失，稳定性差。脉冲场凝胶电泳是基于整个细菌基因组的分型技术，具有稳定性好，分辨率高的特点，被誉为分子分型的“金标准”。然而它也具有实验流程长，操作繁琐。发明内容0004针对上述不足，本发明的前一个目的在于提供一种快捷、简便，图像结果优质的单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法。0005为此，本发明提供的技术方案是这样的该气单胞菌。

12、脉冲场凝胶电泳分型方法，依次包括下述步骤00061胶块的制备000711将采集分离到的气单胞菌在TSA平板上培养1418小时，用无菌接种环刮取单菌落于CSB缓冲液中，制成56MCF的细菌悬浊液；000812配制凝胶溶液；000913取步骤11所述的细菌悬浊液于离心管中，加入的蛋白酶K，SDS，混匀后再加入步骤12中的凝胶溶液，吹打均匀，得到混合溶液；001014将步骤13得到的混合溶液注入成胶模具，在室温下凝固30分钟，得到胶块；00112胶块消化裂解说明书CN104263817A2/9页5001221制备消化液，001322将步骤14得到的胶块放入步骤21的消化液中，盖上滤筛盖，消化裂解；0。

13、0143洗胶块00154胶块内DNA酶切001641将20L的XBAI限制性内切酶10缓冲液加入180L的超纯水中配成酶切缓冲液；001742将洗涤后胶块切成大小为2MM4MM，放入装有步骤1酶切缓冲液的离心管中并置于冰上30分钟；001843吸出步骤42中的酶切缓冲液，在离心管中加入已混匀的含有75UXBAI、20LBSA、20LXBAI限制性内切酶10缓冲液和155L超纯水的酶切液，在37水浴锅中孵化3小时；00195加样00206电泳0021在电泳槽中加入TBE缓冲液，待电泳缓冲液恒定为1215后，将步骤5制好的胶块放于电泳槽中进行电泳。00227获取图像分析。0023上述的气单胞菌脉冲。

14、场凝胶电泳分型方法，步骤12配制凝胶溶液的方法是用TE缓冲液配制低熔点琼脂糖溶液，使其浓度为2，并将凝胶溶液放置于54水浴中平衡备用。0024上述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，步骤13的具体方法为取95L上述细菌悬浊液于15ML离心管中，加入5L20MG/ML的蛋白酶K，5L20SDS，混匀后再加入步骤12中的凝胶溶液95L，吹打均匀。0025上述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，步骤21所述的制备消化酶的方法是在装有5MLTES缓冲液的50ML离心管中加入25L20MG/ML的蛋白酶K，混合均匀，得到消化液，置于冰上备用。0026上述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，步骤22所述的消化方。

15、法为在54、175R/MIN的水浴摇床中消化3小时。；0027上述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，步骤3所述的洗胶块依次包括下述步骤002831将超纯水及TE缓冲液放置于水浴锅中预热至50备用；002932将步骤22中消化完成的胶块离心管取出，倒出管中消化液，倒入1015ML已预热到50的超纯水，使胶块在液面以下，放回50水浴摇床中摇洗1015分钟，结束后再见管内超纯水倒出，再倒入1015ML50的超纯水，50水浴摇床中摇洗1015分钟；003033将步骤32水浴完成后离心管中的超纯水倒出，加入1015ML已预热到50的TE缓冲液，50水浴摇床中摇洗1015分钟；再重复此TE洗涤步骤3次；完。

16、成后，从水浴锅中取出离心管，冷却至室温。0031上述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，步骤5所述的加样依次包括下述步骤003251将上述酶切完成的离心管从水浴锅中取出，吸取酶切液，加入1MLTBE缓冲说明书CN104263817A3/9页6液，确保胶块处于液面下，置于冰上30MIN；003352用TBE缓冲液配制1的脉冲场琼脂糖溶液，置于5060恒温箱中平衡15分钟；003453将步骤51中的小胶块取出置于电泳梳子齿底部，确保梳子上所有胶块处于一条直线，并用吸水纸吸取胶块周围液体；003554把加完样的电泳梳子放入胶槽，使电泳梳子齿与胶槽底部距离为12MM，并使整个制胶装置处于水平位置；将平衡。

17、完成的脉冲场琼脂糖溶液注入胶槽，避免气泡产生，室温下凝固30分钟；0036上述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，步骤6所述的所述的电泳所设电泳电压为6V/CM，起始脉冲时间10S，终止脉冲时间35S，电场夹角120，电泳时间22小时；0037上述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，步骤7所述的图像获取的方法依次包括下述步骤003871电泳完成后，将胶块从电泳槽中取出，放入装有05G/MLEB溶液的避光盒子中，使溶液没过胶块而，并将盒子放置摇床中振荡30分钟，003972步骤完成后，将盒子中的EB溶液换成同体积的纯水，于摇床上振荡脱色60分钟，期间换纯水一次；004073脱色完成后取出胶块，吸去胶。

18、块上多余水份，在凝胶成像系统下成像拍摄。0041上述的气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，所述的CSB缓冲液的组份为100MMTRIS、100MMEDTA，PH为80。0042与现有技术相比，本发明提供的技术方案从减少有毒试剂的使用，减少细菌悬浊离心、溶菌酶作用的步骤，缩短蛋白酶K消化和限制性内切酶消化的时间以及修改电泳参数四方面使现有气单胞菌PFGE方法得以优化。0043表1已报道的气单胞菌PFGE方法与本发明的技术方法对比0044说明书CN104263817A4/9页70045与现有的气单胞菌PFGE分型方法比较，本发明方法对气单胞菌的区分能力更强，操作更简便，整个实验流程缩短至3天国外传统P。

19、FGE分型方法需至少5天，为更加简便快速的对气单胞菌病进行监测、追踪、识别等具有非常重要的意义。附图说明0046图1为采用实施例1的方法对2013年采自不同鱼池中不同来源的气单胞菌进行的脉冲场凝胶电泳分型后的电泳结果；0047图2为采用实施例2的方法对2013年采集到的五株维氏气单胞菌进行的脉冲场凝胶电泳分型后的电泳结果。具体实施方式0048为了更好的理解、实施本发明的权利要求，下面结合具体实施例和附图，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但本发明并不限于下述实施例，而是以权利要求为限。0049实施例10050本发明公开的一种气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，将表1中标号111的气单胞菌作为分。

20、析样品，具体方法包括以下步骤00511胶块的制备005211将采集分离到的气单胞菌在TSA平板上、37条件下培养1418小时，用无菌接种环刮取单菌落于CSB缓冲液中，制成56MCF的细菌悬浊液；0053其中所述CSB缓冲液的组份为100MMTRIS、100MMEDTA，PH为80。005412用TE缓冲液配制低熔点琼脂糖溶液，使其浓度为2，并将凝胶溶液放置于54水浴中平衡备用；说明书CN104263817A5/9页80055其中所述TE缓冲液的组份为10MMTRIS、1MMEDTA，PH为80。005613取95L上述细菌悬浊液于15ML离心管中，加入5L20MG/ML的蛋白酶K，5L20SD。

21、S，混匀后再加入步骤12中的凝胶溶液95L，吹打均匀；005714将步骤13得到的混合溶液小心注入成胶模具，避免气泡产生，在室温下凝固30分钟，得到胶块；00582胶块消化裂解005921在装有5MLTES缓冲液的50ML离心管中加入25L20MG/ML的蛋白酶K，混合均匀，得到消化液，置于冰上备用；0060其中所述TES缓冲液的组份为50MMTRIS、50MMEDTA，1G/100ML十二烷基肌氨酸钠，PH为80。006122将步骤14得到的胶块放入上述消化液中，并保证胶块在液面以下，盖上滤筛盖，在54、175R/MIN的水浴摇床中消化3小时；00623洗胶块006331将超纯水及TE缓冲液。

22、放置于水浴锅中预热至50备用；006432将步骤22中消化完成的离心管取出，倒出管中消化液，倒入1015ML已预热到50的超纯水，使胶块在液面以下，放回50水浴摇床中摇洗1015分钟，结束后再见管内超纯水倒出，再倒入1015ML50的超纯水，50水浴摇床中摇洗1015分钟；006533将步骤32水浴完成后离心管中的超纯水倒出，加入1015ML已预热到50的TE缓冲液，50水浴摇床中摇洗1015分钟；再重复此TE洗涤步骤3次；完成后，从水浴锅中取出离心管，冷却至室温；0066其中所述TE缓冲液的组份为10MMTRIS、1MMEDTA，PH为80。00674胶块内DNA酶切006841将20L的X。

23、BAI限制性内切酶10缓冲液加入180L的超纯水中配成酶切缓冲液；006942将步骤33洗涤完成的胶块切成大小为2MM4MM，放入装有上述酶切缓冲液的15ML离心管中，确保胶块处于液面下，并置于冰上30分钟；007043吸出步骤42中的酶切缓冲液，在离心管中加入已混匀的含有75UXBAI、20LBSA、20LXBAI限制性内切酶10缓冲液和155L超纯水的酶切液，确保胶块处于液面下，在37水浴锅中孵化3小时；00715加样007251将上述酶切完成的离心管从水浴锅中取出，吸取酶切液，加入1MLTBE缓冲液，确保胶块处于液面下，置于冰上30MIN；007352用TBE缓冲液配制1的脉冲场琼脂糖溶。

24、液，置于5060恒温箱中平衡15分钟；0074其中所述TBE缓冲液的组份为54G/1LTRIS、0372G/1LEDTA、275G/1L硼酸007553将步骤51中的小胶块取出置于电泳梳子齿底部，确保梳子上所有胶块处于一条直线，并用吸水纸吸取胶块周围液体；007654把加完样的电泳梳子放入胶槽，使电泳梳子齿与胶槽底部距离为12MM，并使整个制胶装置处于水平位置；将平衡完成的脉冲场琼脂糖溶液注入胶槽，避免气泡产生，说明书CN104263817A6/9页9室温下凝固30分钟；00776电泳007861在电泳槽中加入22L的TBE缓冲液，盖上盖子，调价冷凝器，设定温度为14；0079其中所述TBE缓。

25、冲液的组份为54G/1LTRIS、0372G/1LEDTA、275G/1L硼酸008062待电泳缓冲液恒定为14后，将步骤54制好的胶块放于电泳槽中进行电泳。所设电泳电压为6V/CM，起始脉冲时间10S，终止脉冲时间35S，电场夹角120，电泳时间22小时；00817图像获取008271电泳完成后，将胶块从电泳槽中取出，放入装有05G/MLEB溶液的避光盒子中，使溶液没过胶块而，并将盒子放置摇床中振荡30分钟，注意避免EB溶液在振荡过程中溢出；008372步骤71完成后，将盒子中的EB溶液换成同体积的纯水，于摇床上振荡脱色60分钟，期间换纯水一次；008473脱色完成后取出胶块，吸去胶块上多余。

26、水份，在凝胶成像系统下成像拍摄，所得图像如图1所示，泳道111对应表1中标号111的气单胞菌，各气单胞菌均显示不同的带型，表明上述气单胞菌具有不同的基因型。也证明本发明可适用于多种气单胞菌的分型需求，具有较强的分型能力。0085实施例20086本发明公开的另一种气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法，将表2中标号15的气单胞菌作为分析样品，具体方法包括以下步骤00871胶块的制备008811将采集分离到的气单胞菌在TSA平板上、37条件下培养1418小时，用无菌接种环刮取单菌落于CSB缓冲液中，制成56MCF的细菌悬浊液；0089其中所述CSB缓冲液的组份为100MMTRIS、100MMEDTA，PH。

27、为80。009012用TE缓冲液配制低熔点琼脂糖溶液，使其浓度为2，并将凝胶溶液放置于54水浴中平衡备用；0091其中所述TE缓冲液的组份为10MMTRIS、1MMEDTA，PH为80。009213取95L上述细菌悬浊液于15ML离心管中，加入5L20MG/ML的蛋白酶K，5L20SDS，混匀后再加入步骤12中的凝胶溶液95L，吹打均匀；009314将步骤13得到的混合溶液小心注入成胶模具，避免气泡产生，在室温下凝固30分钟，得到胶块；00942胶块消化裂解009521在装有5MLTES缓冲液的50ML离心管中加入25L20MG/ML的蛋白酶K，混合均匀，得到消化液，置于冰上备用；0096其中。

28、所述TES缓冲液的组份为50MMTRIS、50MMEDTA，1G/100ML十二烷基肌氨酸钠，PH为80。009722将步骤14得到的胶块放入上述消化液中，并保证胶块在液面以下，盖上滤筛盖，在54、175R/MIN的水浴摇床中消化3小时；说明书CN104263817A7/9页1000983洗胶块009931将超纯水及TE缓冲液放置于水浴锅中预热至50备用；010032将步骤22中消化完成的离心管取出，倒出管中消化液，倒入1015ML已预热到50的超纯水，使胶块在液面以下，放回50水浴摇床中摇洗1015分钟，结束后再见管内超纯水倒出，再倒入1015ML50的超纯水，50水浴摇床中摇洗1015分钟。

29、；010133将步骤32水浴完成后离心管中的超纯水倒出，加入1015ML已预热到50的TE缓冲液，50水浴摇床中摇洗1015分钟；再重复此TE洗涤步骤3次；完成后，从水浴锅中取出离心管，冷却至室温；0102其中所述TE缓冲液的组份为10MMTRIS、1MMEDTA，PH为80。01034胶块内DNA酶切010441将20L的XBAI限制性内切酶10缓冲液加入180L的超纯水中配成酶切缓冲液；010542将步骤33洗涤完成的胶块切成大小为2MM4MM，放入装有上述酶切缓冲液的15ML离心管中，确保胶块处于液面下，并置于冰上30分钟；010643吸出步骤42中的酶切缓冲液，在离心管中加入已混匀的含。

30、有75UXBAI、20LBSA、20LXBAI限制性内切酶10缓冲液和155L超纯水的酶切液，确保胶块处于液面下，在37水浴锅中孵化3小时；01075加样010851将上述酶切完成的离心管从水浴锅中取出，吸取酶切液，加入1MLTBE缓冲液，确保胶块处于液面下，置于冰上30MIN；010952用TBE缓冲液配制1的脉冲场琼脂糖溶液，置于5060恒温箱中平衡15分钟；0110其中所述TBE缓冲液的组份为54G/1LTRIS、0372G/1LEDTA、275G/1L硼酸011153、将步骤51中的小胶块取出置于电泳梳子齿底部，确保梳子上所有胶块处于一条直线，并用吸水纸吸取胶块周围液体；011254把。

31、加完样的电泳梳子放入胶槽，使电泳梳子齿与胶槽底部距离为12MM，并使整个制胶装置处于水平位置；将平衡完成的脉冲场琼脂糖溶液注入胶槽，避免气泡产生，室温下凝固30分钟；01136电泳011461在电泳槽中加入22L的TBE缓冲液，盖上盖子，调价冷凝器，设定温度为14；0115其中所述TBE缓冲液的组份为54G/1LTRIS、0372G/1LEDTA、275G/1L硼酸011662待电泳缓冲液恒定为14后，将步骤54制好的胶块放于电泳槽中进行电泳。所设电泳电压为6V/CM，起始脉冲时间10S，终止脉冲时间35S，电场夹角120，电泳时间22小时；01177图像获取011871电泳完成后，将胶块从电。

32、泳槽中取出，放入装有05G/MLEB溶液的避光盒子中，使溶液没过胶块而，并将盒子放置摇床中振荡30分钟，注意避免EB溶液在振荡过程中溢出；说明书CN104263817A108/9页11011972步骤71完成后，将盒子中的EB溶液换成同体积的纯水，于摇床上振荡脱色60分钟，期间换纯水一次；012073脱色完成后取出胶块，吸去胶块上多余水份，在凝胶成像系统下成像拍摄，所得图像如图2所示，泳道15对应表5中标号15的气单胞菌，各气单胞菌均显示不同的带型，表明上述气单胞菌具有不同的基因型。也证明本发明可适用于气单胞菌的分型需求，且不同的种属的菌株可能具有不同的基因型。其中所使用的普通化学试剂盒仪器均。

33、为现有的市售产品，或按照公知的PFGE标准操作规程配制；0121上述实施例1和实例2所用的限制性内切酶XBAI为市售产品，其中XBAI限制性内切酶10缓冲液为购买限制性内切酶XBAI时提供的配套产品。0122本发明实施例1、实施例2所采用的气单胞菌样品来自于广东佛山不同复合水产养殖环境。具体情况如表1，表2所示。0123表12013年不同鱼池不同来源气单胞菌样品信息0124标号菌株编号鱼池编号菌株来源分子鉴定1A148鲮鱼鳃AVERONII2A149鲮鱼鳃AVERONII3A150鲮鱼肝ASOBRIA4A164鱼池养殖水体AVERONII5A190鱼池养殖水体AVERONII6A191鸭粪便ASOBRIA7A167鱼池养殖水体AVERONII8A194鲮鱼肠道AVERONII9A195鲮鱼鳃ACAVIAE10A196鲮鱼肠道AVERONII11A197鲮鱼鳃AVERONII01250126表22013年不同鱼池不同来源5株维氏气单胞菌样品信息0127标号菌株编号鱼池编号菌株来源分子鉴定1A196鲮鱼肠AVERONII说明书CN104263817A119/9页122A197鲮鱼鳃AVERONII3A192鲮鱼肠AVERONII4A193鲮鱼鳃AVERONII5A173鱼塘底泥AVERONII说明书CN104263817A121/1页13图1图2说明书附图CN104263817A13。

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