一种路氏肠杆菌及其应用.pdf

本发明公开了一种路氏肠杆菌及其应用，该菌株为路氏肠杆菌(Enterobacter ludwigii)MY271，已于2015年3月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2015182。本发明所选育的菌株可利用魔芋粉高产β-甘露聚糖酶，同时得到甘露低聚糖，获得的甘露低聚糖有很好的生物调节功能，能有效降低人体胆固醇水平、降低血糖、促进肠道中双歧杆菌的生长，是良好的食品添加剂。

1.  路氏肠杆菌(Enterobacter ludwigii)MY271，它的专利保藏编号为CCTCC M2015182。

2.  权利要求1所述的路氏肠杆菌MY271发酵产β-甘露聚糖酶的工艺。

3.  权利要求1所述的路氏肠杆菌MY271在利用魔芋粉生产β-甘露聚糖酶中的应用。

4.  权利要求1所述的路氏肠杆菌MY271在利用魔芋粉生产甘露低聚糖中的应用。

一种路氏肠杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体而言，涉及一株利用魔芋粉产β-甘露聚糖酶能力较强的路氏肠杆菌(Enterobacter ludwigii)及其应用。
背景技术
半纤维素是自然界第二大类杂聚多糖，其中β-甘露聚糖是一种主要的半纤维素。β-甘露聚糖广泛存在于槐豆胶、瓜尔豆胶、魔芋精粉和其他植物多糖中。β-甘露聚糖酶(β-mannanase,EC 3.2.1.78)能够水解主链上含有β-1,4甘露糖苷键的多聚糖(β-甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖)为甘露低聚糖。获得的甘露低聚糖有很好的生物调节功能，能有效降低人体胆固醇水平、降低血糖、促进肠道中双歧杆菌的生长，是良好的食品添加剂。该酶还广泛应用于饲料、造纸、纺织印染、石油开采和生物学研究等诸多方面。如在造纸工业中，β-甘露聚糖酶和木聚糖酶等半纤维素降解酶类协同使用，处理纸浆，能明显改善纸质，降低氯漂和碱提取带来的环境污染；β-甘露聚糖酶是油井石油压裂液的优质生物破胶剂；在饲料工业中用作饲料酶添加剂，起到消除抗营养因子的作用和改善饲料的营养价值。
以微生物为β-甘露聚糖酶的酶源，具有制备方便且酶活性高的优势，由于酶获取成本低，促进了对该酶的研究及应用。Lin等通过黑曲霉(Aspergillus niger NCH189)液态发酵获取β-甘露聚糖酶，产酶水平为27.4U/mL。Hossain等用芽孢杆菌(Bacillus sp.KK01)进行液态发酵，产酶水平可达90U/mL。Ferreira等以麦麸为碳源培养嗜热菌(Trichoderma harzianum strainT4)产胞外β-甘露聚糖酶。李剑芳、邬敏辰等人通过筛选以及紫外诱变等手段，从其实验室保存的菌株中筛选到一株优良的酸性β-甘露聚糖酶高产菌株(Aspergil-lus usamii YL-01-78)。杨幼惠等利用刚果红平板筛选法从芽抱杆菌中筛选得到产β-甘露聚糖酶的优良菌株。罗强、孙启玲等人通过离子注入以及紫外线复合诱变的方法，筛选到一株产β-甘露聚糖酶的枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)。
经过查阅国内外现有技术，暂时没有报道使用路氏肠杆菌利用魔芋粉产β-甘露聚糖酶的文献。
发明内容
本发明的目的在于提供一种产β-甘露聚糖酶的路氏肠杆菌(Enterobacter ludwigii)及其应用。
为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验反复进行菌种选育研究，并最终从十堰竹溪魔芋种植基地的土壤中筛选到一株产β-甘露聚糖酶的菌株路氏肠杆菌(Enterobacter ludwigii)，通过对其进行培养条件及培养基优化，提高了该菌株的产酶水平，为β-甘露聚糖酶的工业化生产和应用提供了科学依据。
具体地，本发明获得了一株产β-甘露聚糖酶能力较强的路氏肠杆菌(Enterobacter ludwigii)，将其命名为路氏肠杆菌(Enterobacter ludwigii)MY271，已于2015年3月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏编号为：CCTCC NO：M 2015182。
本发明涉及的高产β-甘露聚糖酶的路氏肠杆菌(Enterobacter ludwigii)MY271具有如下特征和特性：
形态学特征：菌落呈圆形，乳白色，表面光滑，边缘整齐。
生理特性：利用葡萄糖、果糖、鼠李糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、甘露糖、半乳糖、L-阿拉伯糖、肌醇、乳糖、山梨醇以及D-棉子糖等作为碳源。
代谢特性：代谢过程能产β-甘露聚糖酶。 
最优的发酵培养条件为：发酵时间48h，温度31℃，接种量9％，初始pH7.0，装液量50mL/250mL，培养基成分：魔芋粉14g/L、蛋白胨18g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L、Na₂HPO₄ 0.7g/L、MgSO₄ 0.01g/L、ZnSO₄ 0.15g/L。
本发明涉及的高产β-甘露聚糖酶的路氏肠杆菌(Enterobacter ludwigii)MY271是按照如下方法获得的：从湖北十堰竹溪魔芋种植基地采集土样4份。每份样品中称取5g混合土样加入到无菌生理盐水中，在30℃，160r/min的恒温摇床上充分振荡2h制备菌悬液，然后取2mL土壤悬液加入到富集培养基(魔芋粉5.0g/L，蛋白胨5.0g/L，KH₂PO₄ 1.0g/L，MgSO₄ 0.1g/L，pH自然0.1MPa灭菌20min)，30℃，160r/min下振荡培养48h。富集培养所得菌液进行梯度稀释，取适当稀释后的菌液100μL涂布于初筛平板培养基(魔芋粉5.0g/L，NH₄Cl 5.0g/L，KH₂PO₄ 1.0g/L，MgSO₄ 0.1g/L，琼脂20g/L，pH自然 0.1MPa灭菌20min)，于30℃培养箱中倒置培养48h，每个稀释梯度做3次平行。菌株培养48h后，往平板中加适量刚果红染液，静置10min，观察黄色水解圈的大小及透明度，挑选水解圈直径大且透明度好的菌株保存于试管斜面培养基(蛋白胨10g/L，牛肉膏3.0g/L，NaCl 5.0g/L，琼脂20g/L，自然pH，0.1MPa灭菌20min)，以备摇瓶发酵试验。通过摇瓶发酵(魔芋粉5.0g/L，蛋白胨5.0g/L，KH₂PO₄ 1.0g/L， MgSO₄ 0.1g/L，pH自然，0.1MPa灭菌20min)试验，其中的一株路氏肠杆菌的发酵液酶活最高，将其命名为路氏肠杆菌(Enterobacter ludwigii)MY271，同时于2015年3月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2015182。
与现有技术相比，本发明获得的路氏肠杆菌(Enterobacter ludwigii)MY271具有如下优点和显著进步：
(1)本发明所选育的菌株可利用魔芋粉产β-甘露聚糖酶，发酵后所得发酵液中β-甘露聚糖酶的酶活高达62.76U/ml。
(2)β-甘露聚糖酶降解甘露聚糖得到的甘露低聚糖有很好的生物调节功能，能有效降低人体胆固醇水平、降低血糖、促进肠道中双歧杆菌的生长，是良好的食品添加剂。
附图说明
图1为接种量对酶活的影响柱形图；
图2为装液量对酶活的影响柱形图；
图3为初始pH对酶活的影响柱形图；
图4为发酵温度对酶活的影响柱形图；
图5为发酵周期对酶活的影响柱形图；
图6为碳源对酶活的影响柱形图；
图7为碳源添加量对酶活的影响柱形图；
图8为氮源对酶活的影响柱形图；
图9为氮源添加量对酶活的影响柱形图；
图10为无机盐对酶活的影响柱形图；
图11为磷酸二氢钾用量的优选试验结果柱形图；
图12为蛋白胨用量的优选试验结果柱形图；
图13为氯化钠用量的优选试验结果柱形图；
图14为硫酸锌用量的优选试验结果柱形图。
具体实施方式
以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
需要说明的是，本发明中的术语酶活定义为：每分钟水解β-甘露聚糖产生1μmol还原糖所需酶量定义为一个酶活力单位(U)。
粗酶液的制备方法为：取一定体积的菌液于离心管中，8000rpm离心15min取上清液，稀释适当倍数后，则为粗酶液。
β-甘露聚糖酶酶活的测定方法为：取1.5mL0.5％魔芋纯化粉溶液于25mL比色管，加入0.5mL粗酶液于55℃水浴锅反应10min，加入3mLDNS溶液，于沸水浴中煮沸5min后，立即冷却至室温，加入蒸馏水补足至25mL，此为实验组；对照组用已煮沸灭活酶液代替粗酶液。在540nm处测定吸光值。
实施例一：路氏肠杆菌MY271的培养条件优化
(1)菌株：路氏肠杆菌MY271CCTCC M 2015182
(2)方法步骤： 
发酵培养基为初始培养基(魔芋粉5.0g/L，蛋白胨5.0g/L，KH₂PO₄ 1.0g/L，MgSO₄ 0.1g/L)。初始发酵条件为：自然pH，接种量5％，装液量50mL/250mL，30℃，160r/min摇瓶发酵48h。
采用单因素试验考察路氏肠杆菌MY271菌株的接种量、装液量、初始pH、发酵温度、发酵周期对β-甘露聚糖酶产量的影响。
a.接种量的优选试验
其它发酵条件为初始发酵条件，接种量分别为3％、5％、7％、9％、11％、13％和15％时，考察接种量对路氏肠杆菌MY271产β-甘露聚糖酶的影响。
由图1可知，当接种量为9％时，酶活最高，为4.11U/mL。故选择接种量为9％。
b.发酵摇瓶装液量的优选试验
发酵接种量取上述试验确定的最优结果，其它发酵条件为初始发酵条件，采用250mL摇瓶装液，摇瓶装液量分别为25mL、50mL、75mL、100mL、125mL时，考察装液量对路氏肠杆菌MY271产β-甘露聚糖酶的影响。
由图2可知，当摇瓶装液量为50mL/250mL时，酶活达到最大值4.79U/mL。故选择装液量为50mL/250mL。
c.初始pH的优选试验 
发酵接种量和装液量取上述试验确定的最优结果，其它发酵条件为初始发酵条件，调整初始pH分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，摇瓶发酵培养后测定β-甘露聚糖酶酶活，考察pH对路氏肠杆菌MY271产β-甘露聚糖酶的影响。
由图3可知，当发酵初始pH为7.0时，酶活达到最大值7.0U/mL。故选择初始pH为7.0。
d.发酵温度的优选试验
发酵接种量、装液量和初始pH取上述试验确定的最优结果，其它发酵条件为初始发酵条件，分别在25℃、28℃、31℃、34℃、37℃和40℃摇床中进行发酵培养后测定β-甘露聚糖酶酶活，考察温度对路氏肠杆菌MY271产β-甘露聚糖酶的影响。
由图4知，当发酵温度为31℃时，酶活最高，为7.63U/mL。故选择发酵温度为31℃。
e.发酵周期的优选试验
发酵接种量、装液量、初始pH和温度取上述试验确定的最优结果，其它发酵条件为初始发酵条件，每隔12h取样测量β-甘露聚糖酶酶活，确定路氏肠杆菌MY271产β-甘露聚糖酶的最优发酵周期。
由图5知，当发酵48h时酶活达到最大值7.94U/mL。故选择发酵周期为48h。
实施例二：路氏肠杆菌MY271的培养基成分优化
(1)菌株：实施例一筛选出的菌种路氏肠杆菌MY271
(2)方法步骤： 
培养条件为发酵时间4h，温度31℃，接种量9％，初始pH7.0，装液量50mL/250mL。
a.碳源选择及添加量试验
以魔芋粉、槐豆胶、蔗糖、D-甘露糖、D-甘露醇、可溶性淀粉、麦芽糖、葡萄糖、D-果糖、α-乳糖、羧甲基纤维素钠、D-木糖、糖蜜为碳源变量，添加量为5g/L，其他成分为初始培养基成分。
由图6可知，以魔芋粉为碳源时菌株MY271诱导产酶效果最好，酶活为8.01U/mL，槐豆胶次之，因此选择魔芋粉为最佳碳源。
根据上实验选取魔芋粉为最优碳源，研究添加量分别为5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L和12g/L对路氏肠杆菌MY271产β-甘露聚糖酶的影响。
由图7知，当魔芋粉含量为8g/L时，酶活最高，为17.73U/mL。故选择魔芋粉添加量为8g/L。
b.氮源选择试验 
碳源及其添加量使用上述试验结果，以蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、酵母抽提物、玉米浆、麸皮浸出液、大豆粉、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、柠檬酸氢二铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、L-谷氨酸为氮源变量，添加量为5g/L，其他成分为初始培养基成分。
由图8知，当选择蛋白胨时酶活最高，为17.06U/mL，因此选择蛋白胨为最佳氮源。
根据上述试验选取蛋白胨为最优氮源，研究添加量分别为3g/L、5g/L、7g/L、9g/L、11g/L、13g/L、15g/L、17g/L、19g/L、21g/L和23g/L对路氏肠杆菌MY271产β-甘露聚糖酶的影响。
由图9可知，当蛋白胨含量为19g/L时，酶活达到最大值38.42U/mL。故选择蛋白胨添加量为19g/L。
c.无机盐的选择 
碳源、氮源及其添加量使用上述试验结果，以磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、硫酸镁、硫酸钙、硫酸钡、硫酸铜、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌为无机盐变量研究其对路氏肠杆菌MY271产β-甘露聚糖酶的影响。
由图10可知，硫酸锌、氯化钠、硫酸镁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾都能较好的促进路氏肠杆菌MY271产β-甘露聚糖酶，故选择硫酸锌、氯化钠、硫酸镁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾作为无机盐进行后续试验。
d.Plackett-Burman试验
以魔芋粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸锌、氯化钠和硫酸镁做Plackett-Burman试验，试验设计如表1，以确定显著性因素。
表1 Plackett-Burman试验因素与水平
      
表2 Plackett-Burman试验设计与结果
      
表3 Plackett-Burman试验设计的回归分析
      
表4 Plackett-Burman设计方差分析表
      
Significant at 5％level,*represent the significant factor 
取置信区间为95％，由表3和4可知魔芋粉、磷酸氢二钠和硫酸镁为显著性因素，且有99.42％的数据可以解释该试验。
e.最陡爬坡及最低添加量试验
根据Plackett-Burman试验，以显著性因素魔芋粉、磷酸氢二钠和硫酸镁做最陡爬坡试验，不显著性因素蛋白胨、氯化钠、磷酸二氢钾和硫酸锌做最低添加量试验。
表5最陡爬坡试验设计与结果
      
由表5可知，当魔芋粉、磷酸氢二钠和硫酸镁的用量分别为14g/L、0.8g/L、0.05g/L时，酶活达到最大值49.750U/mL。故选择魔芋粉、磷酸氢二钠和硫酸镁的用量分别为14g/L、0.8g/L、0.05g/L作为中心复合设计的中心点。
其它培养基成分用量不变时，磷酸二氢钾用量分别为0g/L，0.5g/L，1.0g/L，1.5g/L，2.0g/L，测定β-甘露聚糖酶酶活，结果见图11。
由图11可知，当磷酸二氢钾用量为0.5g/L时，酶活达到最大值51.17U/mL。故选择磷酸二氢钾用量为0.5g/L。
其它培养基成分用量不变时，蛋白胨用量分别为14g/L，15g/L，16g/L，17g/L，18g/L，19g/L，测定β-甘露聚糖酶酶活，结果见图12。
由图12可知，当蛋白胨用量为18g/L时，酶活达到最大值52.34U/mL。故选择蛋白胨用量为18g/L。
其它培养基成分用量不变时，氯化钠用量分别为0g/L，0.05g/L，0.1g/L，0.15g/L，0.2g/L，测定β-甘露聚糖酶酶活，结果见图13。
由图13可知，随着氯化钠含量的增加，β-甘露聚糖酶酶活基本趋于平衡，为节省成本，故选择氯化钠用量为0g/L。
其它培养基成分用量不变时，硫酸锌用量分别为0g/L，0.05g/L，0.1g/L，0.15g/L，0.2g/L，测定β-甘露聚糖酶酶活，结果见图14。
由图14可知，当硫酸锌用量为0.15g/L时，酶活达到最大值55.03U/mL。故选择硫酸锌用量为0.15g/L。
f.中心复合设计(Central composite design,CCD)
经PB设计筛选得到3种显著影响β-甘露聚糖酶酶活的培养基成分，即魔芋粉、磷酸氢二钠和硫酸镁。以此3显著种因素的浓度(g/L)为自变量，β-甘露聚糖酶的酶活(U/mL)为响应值，进行3因素5水平的中心复合设计试验，见表6。
表6中心复合设计试验因素与水平
      
表7中心复合试验设计与结果
      
      
表8二阶多项式回归分析
      
SS＝Sum of Squares，DF＝Degrees of Freedom，Significant at 5％level，*represent the significant factor. 
根据表7试验数据，以β-甘露聚糖酶活(U/mL)为响应量Y，魔芋粉(g/L)、磷酸氢二钠(g/L)、硫酸镁(g/L)为自变量A、B、C，利用Design-Expert8.0.5软件进行回归分析，可得到二阶经验模型为：
Y＝60.08+1.14A+0.88B-2.24C+2.85AB-1.76AC+2.06BC-3.26A²-1.96B²-0.91C²
由表8知93.06％的数据在线性回归方程上，说明该回归方程对实验结果具有一定的解释能力。
实例三：发酵验证试验
路氏肠杆菌MY271以培养条件为发酵时间48h，温度31℃，接种量9％，初始pH7.0，装液量50mL/250mL，培养基成分魔芋粉14g/L、蛋白胨18g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L、Na₂HPO₄0.7g/L、MgSO₄ 0.01g/L、ZnSO₄ 0.15g/L进行发酵验证试验。
根据实施例一和二的试验设计优化得出的培养条件和培养基组成所发酵得β-甘露聚糖酶酶活理论值63.02U/mL，为验证该模型的准确性和有效性，在预测最优培养基组合下进行发酵试验，重复3次试验，实际验证后β-甘露聚糖酶酶活平均值为62.76U/mL。可见该模型可较好地预测发酵后β-甘露聚糖酶酶活。