陆地棉糖基转移酶GHUGT85O1及其编码基因和应用.pdf

本发明涉及基因工程领域，具体涉及陆地棉糖基转移酶GhUGT85O1及其编码基因和应用，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明克隆了一个棉花糖基转移酶家族1中的基因，GhUGT85O1，通过对其表达模式的分析，以及转基因后代特性的研究，鉴定它参与了植物逆境胁迫，开花时间的调控，和衰老进程的调控，为进一步阐明其功能奠定了基础。

1.  陆地棉糖基转移酶GhUGT85O1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.  陆地棉糖基转移酶基因GhUGT85O1，其特征在于，编码权利要求1所述的陆地棉糖基转移酶GhUGT85O1。

3.  陆地棉糖基转移酶基因GhUGT85O1，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.  包含权利要求2所述陆地棉糖基转移酶基因GhUGT85O1的植物表达载体。

5.  权利要求1所述陆地棉糖基转移酶GhUGT85O1的应用。

陆地棉糖基转移酶GhUGT85O1及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及陆地棉糖基转移酶GhUGT85O1及其编码基因和应用。
背景技术
糖基化是一种普遍的植物次生代谢的修饰方式，涉及到激素内稳态的调节，异生物质的解毒作用，次级产物的合成和贮存等多种过程。植物中这一系列的反应都是由一类特定的酶—糖基转移酶(GT)—来实现的。GT催化糖分子从活化的供体转移到特定的受体上，他们的受体是多种多样的，可以是糖类、脂类、蛋白、核酸、抗生素、以及其他小分子。根据基因产物和序列的特征，GT被分成了94个不同的大家族，其中多基因家族UGT包含的成员最多，它与植物的功能最紧密。葡萄中鉴定到超过200个不同的糖甙，这些物质合成时的高度可塑性使得植物能够及时响应各种环境变化。拟南芥中一共鉴定到了120个编码UGT家族蛋白的基因，根据系统发育关系将它们分成了三枝，两个小枝的成员包含了甾醇和脂类GT，第三个大枝则包含了高度保守的PSPG模体。包含PSPG模体的UGT参与活性天然产物的合成、植物激素的调节、细胞内稳态、以及异源物质的解毒作用等。
虽然UGT家族氨基酸C端序列十分保守，包含了PSPG结构域，但是N端序列变异很大，成员之间的功能也具有差异。拟南芥中的UGT87A2参与了开花时间的调节；在拟南芥中过表达UGT74D1基因使叶片卷曲；UGT73B3和UGT73B5参与拟南芥对病原胁迫的响应；在烟草中异位表达拟南芥UGT85A5基因增强了植物的抗盐性；过表达拟南芥中UGT76B1基因延缓叶片衰老，并且增强了植物的抗逆性。
棉花是一种重要的经济作物。随着我国粮棉争地矛盾的日益突出，推广短季棉品种成为保证粮食安全的重要途径之一。然而，早熟往往伴随着早衰的发生。叶片是进行光合作用的主要器官，棉花叶片早衰严重影响棉花的产量(10％‐20％)和棉纤维质量。
本研究从陆地棉中分离了一个UGT家族基因，命名为GhUGT85O1，对其时空表达模式的分析表明其在在成熟和衰老叶片中大量表达。构建植物过表达载体，采用农杆菌介导的花序浸染法转化模式植物拟南芥，转基因拟南芥比非转基因拟南芥提前开花和衰老，使得转基因植株的生育期比对照缩短。
发明内容
本发明的目的是提供陆地棉糖基转移酶GhUGT85O1。
本发明的再一目的是提供编码上述陆地棉糖基转移酶GhUGT85O1的基因。
本发明的再一目的是提供上述陆地棉糖基转移酶GhUGT85O1的应用。
根据本发明的陆地棉糖基转移酶GhUGT85O1，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：
MGSLETSKPHIVIVPFPAQGHVNPMMLLAKLLHSRGFFITFVNTEFNHRRLVRSKGPDFVKGLPDFQFETIPEGLTSSDRNATQDLPVLCDSIRKHCLAPFVDLLAKLNSSPQVPTVTCIISDGLMSFAIKAAEQLGIPEVQFWTASACSFMGYLHFSELVKRGIIPFQSETFLDEPIDWVPGMSNIRLRDFPSFVRANDPNDILFDYLGSEAQNCLKASAIIFNAFEEFEHEVLDAIAAKFPRIYTVGPLHLVARHLHADPSKSMNPSLWKEDTSCIEWLNEREPNSVVYVNYGSITVMSAKHLKEFAWGLANSKHPFLWIVRPDVVMGDSAILDLEFLKEIKERGLITSWCNQYEVLSHPSVGVFLTHCGWNSTVETISEGVPVVCWPFFADQQTNCRYACTHWGIGMEVDHDVKRENIEFLVKEMMEGEEGKKKKEKALGWKKKAEEAVEVGGSSYIDFDRFVKEALKHG。
根据本发明的陆地棉糖基转移酶GhUGT85O1编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示：
ATGGGTTCACTTGAAACCAGTAAACCCCACATTGTAATCGTCCCATTTCCAGCACAAGGTCATGTTAACCCCATGATGCTACTTGCTAAGCTCTTACACTCTAGAGGCTTCTTCATAACCTTTGTTAACACTGAGTTCAACCATAGGCGTTTGGTCAGGTCCAAAGGCCCTGACTTTGTTAAAGGTCTGCCTGATTTCCAGTTCGAAACAATTCCGGAAGGGCTGACATCGTCCGATCGAAATGCAACACAGGATCTTCCAGTTCTGTGTGATTCGATACGAAAGCATTGCTTGGCACCATTCGTAGATCTACTAGCTAAGTTAAACTCCTCGCCCCAAGTGCCCACTGTTACTTGCATAATCTCTGATGGACTTATGAGCTTTGCTATTAAGGCTGCTGAACAACTTGGCATACCAGAAGTTCAGTTTTGGACTGCCTCAGCATGTAGTTTCATGGGATATCTTCACTTCAGTGAACTGGTTAAACGAGGCATTATTCCATTCCAAAGTGAAACATTTCTCGATGAACCTATTGACTGGGTCCCTGGAATGAGTAACATTCGCCTCAGAGATTTTCCAAGCTTCGTCAGAGCCAACGATCCGAATGACATTTTGTTTGATTATTTAGGATCCGAAGCTCAAAATTGCCTAAAAGCTTCAGCAATAATCTTCAACGCATTTGAAGAGTTCGAACATGAAGTGCTCGACGCCATCGCTGCCAAATTTCCTCGAATTTATACAGTAGGACCACTTCATTTGGTTGCCAGGCACCTACATGCCGATCCCTCCAAGTCAATGAACCCAAGCCTATGGAAGGAAGATACAAGCTGCATTGAATGGCTTAACGAAAGGGAACCCAATTCAGTTGTGTATGTGAACTATGGAAGCATTACTGTCATGTCGGCGAAGCATCTCAAAGAATTTGCATGGGGGTTGGCTAACTCTAAACACCCATTTTTATGGATCGTTAGACCAGATGTCGTGATGGGTGATTCTGCAATTCTGGATCTAGAGTTCCTGAAGGAGATTAAGGAAAGAGGGCTGATAAcAAGCTGGTGCAACCAATATGAGGTCCTTTCACATCCTTCAGTCGGTGTTTTTTTGACACACTGTGGGTGGAATTCTACCGTGGAAACCATATCAGAAGGTGTGCCAGTAGTTTGTTGGCCATTTTTTGCTGATCAGCAAACCAATTGTCGATATGCTTGCACTCATTGGGGCATTGGCATGGAGGTGGATCATGATGTGAAGCGAGAGAACATAGAGTTTTTAGTTAAGGAAATGATGGAAGGTGAGG AAGGAAAGAAAAAGAAAGAGAAGGCATTGGGATGGAAGAAGAAAGCGGAAGAAGCGGTTGAAGTTGGGGGATCATCTTATATTGATTTCGACAGATTTGTTAAGGAAGCTCTCAAACATGGTTAACTGGAAATACTATTGTCAGTGGGAAATTACTTAAATAATGAATGGGGATCATTCAATGTCTCTATTTCTGCTTTTTTTCCTTTGTAAGTGAATGCAGTCGTGTGAGG。
本发明从陆地棉中棉所10号中克隆了一个GhUGT85O1基因，通过其基因结构的分析，发现它含有两个外显子和一个内含子。GhUGT85O1基因在棉花衰老叶片中上调表达，上调趋势高达200倍，这说明它对叶片衰老有一定影响。通过对转基因拟南芥的进一步观察，发现转基因株系的叶绿素含量明显低于野生型对照，并且几个衰老标志基因的表达量在转基因株系中高于野生型，这说明该基因起到了促进叶片衰老的作用。
GhUGT85O1翻译的蛋白序列全长473个氨基酸。为了研究GhUGT85O1基因是否对非生物胁迫有响应，对叶片进行了八种处理，即：赤霉素、热、茉莉酸、一氧化氮供体SNP、伤害、水杨酸、脱落酸、以及PEG。结果表明，在处理后12小时内，该基因对ABA、JA、和PEG有响应。ABA处理4小时后，GhUGT85O1表达量比0小时上调了4倍，这一趋势一直持续到12小时。JA处理8小时后，GhUGT85O1表达量比0小时上调了15倍，到12小时回归原始水平。PEG处理4小时后，GhUGT85O1上调了3倍，8小时后高达40倍，然后这种上调趋势缓慢降低，到12小时约15倍。对于其他的5种处理方式，在取样的12小时内，该基因的表达趋势没有明显的变化。此外，L5、L7、L53三个转基因株系的衰老进程较野生型提前，从表型上看，当转基因株系的叶片大多数黄化，呈现衰老迹象时，野生型拟南芥的大部分叶片的叶色还呈深绿色。通过对叶绿素含量的测定表明：此时3个转基因株系的叶绿素含量低于野生型，L5和L7的叶绿素含量约为野生型的70％，L53的叶绿素含量为野生型的56％，三个株系的降幅均达到了极显著水平(P<0.01)。
本发明克隆了一个棉花糖基转移酶家族1中的基因，GhUGT85O1，通过对其表达模式的分析，以及转基因后代特性的研究，鉴定它参与了植物逆境胁迫，开花时间的调控，和衰老进程的调控，为进一步阐明其功能奠定了基础。
附图说明
图1显示GhUGT85O1基因的时空表达模式分析；
图2.ABA、JA、和PEG处理后GhUGT85O1基因的表达变化；
图3显示pBI121‐GhUGT85O1转基因拟南芥阳性株系的鉴定；
图4显示转基因拟南芥衰老提前(A)，叶绿素含量(B)以及衰老相关基因的表达(C‐G)。
具体实施方式
实验材料
供试材料为短季棉品种中棉所10(CCRI10，Gossypiumhirsutum)，分别取棉花的子叶、根、茎、叶、花、顶芽、胚珠等不同组织。盛花期对主茎叶片进行挂牌标记，展平当天的为0天，从15天开始取样，每隔天取一次，直到叶片衰老。处理试验在人工气候室中进行。所取的样品在液氮中速冻，然后保存在‐80℃冰箱中待用。
实施例1基因克隆及转化
一、棉花中GhUGT85O1基因的克隆 
设计特异性引物从陆地棉中棉所10号中扩增出完整序列。PCR引物为：上游引物5’‐ATGGGTTCACTTGAAACCAG‐3’；下游引物5’‐CCTCACACGACTGCATTCAC‐3’。
根据TAKARA LA Taq Hot Start Version 2.0(DRR042)说明书进行PCR扩增，然后回收目的片段并测序。
二、GhUGT85O1基因的时空表达模式分析
1、提取棉花品种“中棉所10号”的不同组织和不同叶龄叶片的总RNA，并分别反转录为cDNA。
2、以步骤1得到的cDNA的10倍体积稀释液为模板，进行荧光定量PCR。
用于检测GhUGT85O1基因的表达量的引物为：上游引物:5’‐GGCGAAGCATCTCAAAGAAT‐3’；下游引物:5’‐CAGAATCACCCATCACGACA‐3’。用于检测内参基因(actin)的表达量的引物对为：上游引物:5’‐ATCCTCCGTCTTGACCTTG‐3’；下游引物:5’‐TGTCCGTCAGGCAACTCAT‐3’。
荧光定量PCR反应体系：10μl SYBR Premix Ex Tag，0.8μl上游引物，0.8μl下游引物，2μl cDNA模板，6μl ddH2O，0.4μl ROX Reference Dye Ⅱ，总体积20ul。
荧光定量PCR反应程序：95℃预变性1min；95℃变性5s、60℃退火30s、72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸10min；在72℃，30s处收集荧光信号。
采用相对定量ΔΔCt法分析。
GhUGT85O1基因在不同叶龄的叶片以及其它组织的表达情况见图1。结果表明：该基因在成熟以及衰老叶片中(35到45天)的表达量较幼嫩叶片(15到30天)的高；在不同组织之间，GhUGT85O1在叶片、子叶、花中表达量较高，而在花芽、胚珠、茎、根和下胚轴中表达量较低。
为了研究GhUGT85O1基因是否对非生物胁迫有响应，对叶片进行了八种处理，即：赤霉素、热、茉莉酸、一氧化氮供体SNP、伤害、水杨酸、脱落酸、以及PEG。结果表明，在处理后12小时内，该基因对ABA、JA、和PEG有响应(图2)。ABA处理4小时后，GhUGT85O1表达量比0小时上调了4倍，这一趋势一直持续到12小时(A)。JA处理8小时后，GhUGT85O1表达量比0小时上调了15倍，到12小时回归原始水平(B)。PEG处理4小时后，GhUGT85O1上调了3倍，8小时后高达40倍，然后这种上调趋势缓慢降低，到12小时约15倍(C)。对于其他的5种处理方式，在取样的12小时内，该基因的表达趋势没有明显的变化。
三、转基因拟南芥
1、PBI121-GhUGT85O1植物表达载体的构建
以中棉所10号cDNA为模板，以带有相应酶切位点的引物上游:5’‐CACGGGGGACTCTAGAATGGGTTCACTTGAAACCAG‐3’(下划线为XbaI酶切位点)；下游:5’‐GATCGGGGAAATTCGAGCTCCCTCACACGACTGCATTCAC‐3’下划线为SacI酶切位点)，扩增得到包含GhUGT85O1基因编码区的PCR产物。
将植物表达载体pBI121经过XbaI和SacI酶切，得到载体骨架；
将上述载体骨架与上述目的基因片段连接。
2、转GhUGT85O1拟南芥的获得 
将质粒PBI121‐GhUGT85O1转入农杆菌LBA4404感受态细胞中，得到重组菌。将PCR检测含有质粒PBI121‐GhUGT85O1的重组菌命名为LBA4404/PBI121‐GhUGT85O1。将开花的野生型拟南芥植株已授粉的花和结的荚用剪刀剪去，将拟南芥花浸入装有渗透缓冲液的小烧杯中浸染50s，然后将浸染过的拟南芥植株放置大塑料桶中黑暗培养，24h后于拟南芥培养室继续培养；待果荚成熟后混合收种，得到T0代转GhUGT85O1的拟南芥种子。将T0代种子经消毒春化后在加抗生素卡那霉素的MS培养基上培养，阴性转基因株不能正常生长，筛选得到阳性T0代转GhUGT85O1拟南芥。
3、转基因后代的分子鉴定
提取阳性T0代转GhUGT85O1拟南芥的基因组DNA，以正向引物5’‐ GACGCACAATCCCACTATCC‐3’(与载体上35S启动子的一段核苷酸序列匹配)和反向引物5’‐CCTCACACGACTGCATTCAC‐3’为引物进行PCR扩增，以野生型拟南芥(WT)为对照。
1％琼脂糖电泳检测，结果如图3所示，L2、L5、L7、L53可检测到目的片段，确定为阳性T0代转基因株系；提取野生型(WT)拟南芥的基因组DNA作为对照，以同样的引物，未得到目的片段。将阳性T0代转GhUGT85O1拟南芥单株收种子，播种，筛选，直到T3代以上纯合株系。
实施例2GhUGT85O1功能研究
一、转GhUGT85O1拟南芥开花提前
将编号为L2、L5、L7、L53的纯合转GhUGT85O1拟南芥、野生型拟南芥(WT)播种，在长日照条件(16h光照/8h黑暗)下培养。
转空载体拟南芥和野生型拟南芥表型一致。统计4个纯合转GhUGT85O1株系和野生型拟南芥的开花时间、莲座叶数、和茎生叶数，实验重复三次，每个株系都以野生型为参比进行显著性分析，统计分析结果见表1。除L2外，其他3个株系(L5、L7、L53)极显著促进拟南芥早花(P<0.01)，并且莲座叶的数量也极显著减少(P<0.01)，茎生叶数量的变化与野生型相比，L53显著减少(P<0.05)，而其他3个株系均不明显。
表1 转基因拟南芥开花时间、莲座叶和茎生叶数目统计
      
注：WT：野生型拟南芥；L2：转基因株系2；L5：转基因株系5；L7：转基因株系7；L53：转基因株系53。*表示显著差异(P<0.05)，**表示极显著差异(P<0.01)。
二、GhUGT85O1转基因拟南芥促进衰老
通过对转基因拟南芥后代的观察，发现L5、L7、L53三个转基因株系的衰老进程较野生型提前(图4)。从表型上看，当转基因株系的叶片大多数黄化，呈现衰老迹象时，野生型拟南芥的大部分叶片的叶色还呈深绿色(A)。通过对叶绿素含量的测定表明(B)：此时3个转基因株系的叶绿素含量低于野生型，L5和L7的叶绿素含量约为野生型的70％，L53的叶绿素含量为野生型的56％，三个株系的降幅均达到了极 显著水平(P<0.01)。
以表所示荧光定量引物，以AtUBQ1为内参基因，对它们的表达量进行了检测(C‐G)。结果表明：AtNAP、AtORE1、AtPR1、AtSAG12、AtSAG13、以及AtWRKY6等6个基因在转基因株系中的表达量高于野生型拟南芥。
表2 衰老相关基因的荧光定量引物
      
GhUGT85O1基因在棉花衰老叶片中上调表达，上调趋势高达200倍，这说明它对叶片衰老有一定影响。通过对转基因拟南芥的进一步观察，发现转基因株系的叶绿素含量明显低于野生型对照，并且几个衰老标志基因的表达量在转基因株系中高于野生型，这说明该基因起到了促进叶片衰老的作用。在棉花中克隆的GhUGT85O1基因的过表达拟南芥株系的开花时间显著早于野生型，并且莲座叶数少于野生型，这为UGT家族基因和植物开花的关系提供了一个新的证据。因此，通过对其表达模式的分析，以及转基因后代特性的研究，鉴定它参与了植物逆境胁迫，开花时间的调控，和衰老进程的调控，为进一步阐明其功能奠定了基础。