使用膀胱癌特异性甲基化标记基因的膀胱癌诊断试剂盒和芯片.pdf

本发明涉及使用膀胱癌特异性标记基因的用于诊断膀胱癌的试剂盒和核酸芯片。具体涉及用于诊断膀胱癌的试剂盒和核酸芯片，其可检测膀胱癌特异性基因的启动子甲基化，该启动子或其外显子区在膀胱癌的转化细胞中被特异性甲基化。本发明的诊断试剂盒或者核酸芯片的使用能够在转化的早期诊断膀胱癌，由此能够早期诊断膀胱癌，并且与常规方法相比可以更精确迅速的方式诊断膀胱癌。

权利要求书一种诊断膀胱癌的试剂盒，其包括能够扩增含有膀胱癌标记物基因PENK(NM_006211)‑脑啡肽原的CpG岛的片段的引物。
根据权利要求1的诊断膀胱癌的试剂盒，其中所述片段是序列号：37所表示的DNA序列。
一种诊断膀胱癌的核酸芯片，其包括能够与含有膀胱癌标记物基因PENK(NM_006211)‑脑啡肽原的CpG岛的片段杂交的探针。
根据权利要求3的诊断膀胱癌的核酸芯片，其中所述片段是序列号：37所表示的DNA序列。
一种检测来自临床样品的PENK的启动子或者外显子区域的甲基化的方法。
根据权利要求5的检测甲基化的方法，包括测定甲基化的方法，其中所述测定甲基化的方法选自下组：PCR、甲基化特异性PCR、实时甲基化特异性PCR，使用甲基化DNA特异性结合蛋白的PCR、定量PCR、焦磷酸测序和二硫键测序。
根据权利要求5的检测甲基化的方法，其中所述临床样品来自疑似癌症患者或者待诊断受试者的组织、细胞、血液或者尿液。

说明书使用膀胱癌特异性甲基化标记基因的膀胱癌诊断试剂盒和芯片
本申请是申请日为2008年12月1日的中国专利申请号200880118444.8的分案申请。
技术领域
本发明涉及使用膀胱癌特异性标记基因的用于诊断膀胱癌的试剂盒和核酸芯片，具体涉及用于诊断膀胱癌的试剂盒和核酸芯片，其可检测膀胱癌特异性基因的启动子甲基化，该启动子区在膀胱癌的转化细胞中被特异性甲基化。
背景技术
膀胱癌是泌尿系统最常见的癌症，并由许多因素引起。已知膀胱癌主要由吸烟或者各种化学物质(皮革染料、空气污染、人造增甜剂、硝酸盐以及类似物)引起，这些化学物质在体内吸收后作为尿液排泄出来的同时刺激膀胱壁。
作为诊断膀胱癌的常规方法，使用发现尿液中的异常细胞的方法，但是准确率很低。而且，包括将导管插入到膀胱中并从膀胱中收集可疑组织的细胞检查是具有相当高的精确率的侵入方法(invasive method)。
一般说来，当膀胱癌在早期被诊断时，膀胱癌患者的存活率增加，但在早期诊断膀胱癌是不容易的。作为用于诊断膀胱癌的方法，目前使用的是切除身体部分，但其在早期诊断膀胱癌分类是有难度的。根据浸润到膀胱的肌肉层，膀胱癌被分为浅表性癌和浸润性癌。一般说来，在膀胱癌诊断时大约30%的患者是浸润型膀胱癌患者。因此，为了增加患者的存活时间，当膀胱癌病变很小时在早期诊断膀胱癌是最佳方法。因此，迫切需要开发比各种用于膀胱癌的现有诊断方法更为有效的诊断方法，也就是说，允许早期诊断膀胱癌的膀胱癌特异性生物标记物可处理大量的样品并具有高度的灵敏性和特异性。
近年来，通过DNA甲基化测定诊断癌症的方法已经被提出。DNA甲基化主要出现在特定基因的启动子区中的CpG岛的胞嘧啶上以干扰转录因子的结合，由此使基因表达沉默。因此，检测肿瘤抑制基因的启动子中的CpG岛的甲基化极大地有助于癌症研究。近年来，已经尝试通过诸如甲基化特异性PCR(这里称为MSP)或者自动DNA测序来确定启动子的甲基化来诊断并筛查癌症。
尽管关于启动子CpG岛的甲基化是否直接诱导癌症形成或者在癌症形成之后引起次级变化存在争议，但业已发现在许多癌症中肿瘤抑制基因、DNA修复基因、细胞循环调节基因以及家系(line)是超甲基化的，因此这些基因的表达被沉默。特别是，已知特定基因的启动子区域的超甲基化在癌症形成的早期阶段出现。
因此，肿瘤相关基因的启动子甲基化的甲基化是癌症的重要指标，并可在许多应用中使用，包括癌症的诊断和早期诊断，癌症发展的预测，癌症的预后预测，治疗后的进度检查(follow‑up examination)以及对抗癌治疗响应的预测。近年来，检查血液、痰、唾液、粪便中肿瘤相关基因的启动子甲基化并使用检查结果诊断和治疗癌症的实际尝试已经活跃地进行(Esteller，M.等人，Cancer Res.，59:67，1999；Sanchez‑Cespedez，M.等人，Cancer Res.，60:892，2000；Ahlquist，D.A等人，Gastroenterol.，119:1219，2000)。
因此，本发明的发明人付出了极大的努力来开发能够有效诊断膀胱癌的诊断试剂盒，结果发现膀胱癌可通过使用在膀胱癌细胞中特异性表达的甲基化相关基因的启动子的生物标记物来测定甲基化程度进行诊断，由此完成了本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供用于诊断膀胱癌的试剂盒，其包括甲基化的膀胱癌标记物基因的启动子或者外显子区域。
本发明的另一目的在于提供用于诊断膀胱癌的核酸芯片，其包括能够与含有膀胱癌特异性标记物基因的CpG岛的片段杂交的探针。
本发明的还一目的在于提供测定来自诊断样品的基因的启动子或外显子的甲基化的方法。
为了实现上述目的，本发明提供了用于诊断膀胱癌的试剂盒，其包括选自下组的甲基化的膀胱癌标记物基因的启动子或者外显子，所述组由：(1)CDX2(NM_001265)‑尾同源异型盒转录因子2；(2)CYP1B1(NM_000104)‑细胞色素P450，家族1，亚科B，多肽1；(3)VSX1(NM_199425)‑视觉系统同源异型盒1同系物(homolog)，CHX10‑状(斑马鱼)；(4)HOXA11(NM_005523)‑同源异型盒A11；(5)T(NM_003181)‑T，鼠短尾突变体表型同系物(brachyury homolog)(小鼠)；(6)TBX5(NM_080717)‑T‑盒5；(7)PENK(NM_006211)‑脑啡肽原(proenkephalin)；(8)PAQR9(NM_198504)‑黄体酮(progestin)和adipoQ受体家族成员IV；(9)LHX2(NM_004789)‑LIM同源异型盒2；以及(10)SIM2(U80456)‑单意同源物2(single‑minded homolog)2(果蝇)所组成。
本发明还提供了用于诊断膀胱癌的核酸芯片，其包括能够与含有选自下组的膀胱癌标记物基因的启动子或者外显子的CpG岛的片段杂交的探针，该组由：(1)CDX2(NM_001265)‑尾同源异型盒转录因子2；(2)CYP1B1(NM_000104)‑细胞色素P450，家族1，亚科B，多肽1；(3)VSX1(NM_199425)‑视觉系统同源异型盒1同系物(homolog)，CHX10‑状(斑马鱼)；(4)HOXA11(NM_005523)‑同源异型盒A11；(5)T(NM_003181)‑T，鼠短尾突变体表型同系物(brachyury homolog)(小鼠)；(6)TBX5(NM_080717)‑T‑盒5；(7)PENK(NM_006211)‑脑啡肽原(proenkephalin)；(8)PAQR9(NM_198504)‑黄体酮(progestin)和adipoQ受体家族成员IV；(9)LHX2(NM_004789)‑LIM同源异型盒2；以及(10)SIM2(U80456)‑单意同源物2(single‑minded homog 2)(果蝇)所组成。
本发明还涉及测定选自下组的来自诊断样品的基因的启动子或外显子的甲基化的方法，该组由：CDX2、CYP1B1、VSX1、HOXA11、T、TBX5、PENK、PAQR9、LHX2和SIM2所组成。
通过下列详细描述和随附的权利要求书，本发明的其他特征和实施方式将更加容易想到。
附图说明
图1是通过CpG微阵列分析来自正常人和膀胱癌患者的尿液细胞中的用于膀胱癌诊断的甲基化生物标记物的过程的示意图。
图2定量显示了通过膀胱癌细胞系中的10种甲基化生物标记物的焦磷酸测序(Pyrosequencing)得到的甲基化程度。
图3显示了在临床样品中10种生物标记物基因的甲基化指数的测定结果。图3显示了在正常人、膀胱炎患者、血尿症患者和膀胱癌患者尿液细胞中10种生物标记物的甲基化程度的测定结果。
图4显示了测定用于膀胱癌诊断的10种甲基化生物标记物中每种的灵敏性和特异性的受试者操作特征(ROC)曲线分析的结果。
图5显示了正常人和膀胱癌患者尿液细胞中的甲基化频率。
图6显示了用于膀胱癌诊断的使用逻辑回归分析(logistic regression analysis)从10种生物标记物中选择的6种生物标记物基因的最佳组(optimal panel)的甲基化图示，并显示了用于膀胱癌诊断的基因组(gene panel)的灵敏性和特异性。
图7显示了为了测定膀胱癌细胞系中用于膀胱癌的生物标记物SIM2基因的甲基化，使用甲基化的DNA特异性结合蛋白MBD进行PCR的结果。
具体实施方式
在一个方面，本发明涉及用于诊断膀胱癌的试剂盒，其包括膀胱癌标记物基因的甲基化启动子或者外显子区域。
在另一方面，本发明涉及用于诊断膀胱癌的核酸芯片，其包括能够与含有膀胱癌特异性标记物基因的启动子或外显子区域的CpG岛片段杂交的探针。
在本发明中，启动子或者外显子区域可含有至少一个甲基化CpG二核苷酸。而且，启动子或者外显子区域是由序列号:31到序列号:40表示的DNA序列的任何一种。
在本发明中，探针优选具有从10bp到1kb范围的尺寸，并与含有膀胱癌标记基因的启动区或者外显子的CpG岛的碱基序列具有同源性，从而使其可与碱基序列杂交。更优选地，探针具有10‑100bp的尺寸，并与含有膀胱癌标记基因的启动区或者外显子的CpG岛的碱基序列具有同源性，使其可在严格条件下与碱基序列杂交。如果探针尺寸小于10bp，将发生非特异性杂交，如果大于1kb，将发生探针之间的结合，由此使其难以阅读杂交结果。
根据本发明的用于筛选甲基化标记基因的方法包括下列步骤：(a)从转化细胞和非转化细胞中分离基因组DNA；(b)将分离的基因组DNA与甲基化DNA结合的蛋白质反应并从基因组DNA中分离甲基化的DNA；以及(c)扩增分离的甲基化DNA，将扩增的DNA与CpG微阵列杂交，并在杂交基因中筛选在正常细胞与癌细胞之间显示甲基化程度最大差别的甲基化标记基因。
通过筛选甲基化标记物基因的方法，不仅能够筛选在膀胱癌细胞中甲基化的基因，而且还能筛选在膀胱癌发展中的各个异常发育时期的各种基因。筛选的基因还可用于血液癌症筛查、风险评估、预后、疾病鉴别、疾病分期以及治疗目标的选择。
膀胱癌以及各个时期的异常中甲基化基因的鉴别使得能够以精确有效的方式进行膀胱癌的早期诊断，并允许使用多个基因的甲基化数据的建立和治疗目标的鉴别。另外，当与测定其他非甲基化相关生物标记物的方法一起使用时，根据本发明的甲基化数据能够建立膀胱癌诊断的更准确的系统。
本发明的方法能够通过确定来自样品的至少一种核酸生物标记物的甲基化阶段诊断各个阶段的膀胱癌发展。将来自膀胱癌各个阶段的样品中分离的核酸的甲基化阶段与膀胱组织的细胞增殖中没有出现异常的样品中得到的至少一种核酸的甲基化阶段相比时，样品中膀胱癌的某一阶段可被确定。甲基化阶段可以是超甲基化(hypermethylation)。
在本发明的一种实施方式中，核酸可在基因的调节区被甲基化。在另一种实施方式中，由于甲基化从基因的调节区的外边界开始然后向内扩散，调节区外边界的甲基化测定能够早期诊断在细胞转化中涉及的基因。
在本发明的还一种实施方式中，膀胱组织的细胞生长异常(发育异常)可通过使用试剂盒或者核酸芯片测定下列核酸的至少一种核酸的甲基化来诊断，所述核酸包括：CDX2(NM_001265，尾同源异型盒转录因子2)；CYP1B1(NM_000104，细胞色素P450，家族1，亚科B，多肽1)；VSX1(NM_199425，视觉系统同源异型盒1同系物)，CHX10‑状(斑马鱼)；HOXA11(NM_005523，同源异型盒A11)；T(NM_003181)‑T，鼠短尾突变体表型同系物(brachyury homolog)(小鼠)；TBX5(NM_080717，T‑盒5)；PENK(NM_006211，脑啡肽原)；和PAQR9(NM_198504)，黄体酮和adipoQ受体家族成员IV)；LHX2(NM_004789)LIM同源异型盒2；SIM2(U80456)，单意同源物2(果蝇)基因以及它们的组合。
本发明的诊断试剂盒或者核酸芯片的使用可确定样品中膀胱组织的细胞生长异常。确定膀胱组织的细胞生长异常的方法包括测定从样品中分离的至少一种核酸的甲基化。在该方法中，将至少一种核酸的甲基化时期与从没有细胞生长异常(发育异常)分离的核酸的甲基化时期相比较。
所述核酸的例子如下:CDX2(NM_001265，尾同源异型盒转录因子2)；CYP1B1(NM_000104，细胞色素P450，家族1，亚科B，多肽1)；VSX1(NM_199425，视觉系统同源异型盒1同系物)，CHX10‑状(斑马鱼)；HOXA11(NM_005523，同源异型盒A11)；T(NM_003181，T，鼠短尾突变体表型同系物(小鼠))；TBX5(NM_080717，T‑盒5)；PENK(NM_006211，脑啡肽原)；PAQR9(NM_198504，黄体酮和adipoQ受体家族成员IV)；LHX2(NM_004789)‑LIM同源异型盒2)；SIM2(U80456)，单意同源物2(果蝇)基因以及它们的组合。
在本发明的还一种实施方式中，能够形成膀胱癌的细胞可使用甲基化基因标记物在早期进行诊断。当确定在癌细胞中被甲基化的基因在临床或者形态上看似正常的细胞中被甲基化时，该看似正常的细胞是正在进行癌发生的细胞。因此，可通过测定看似正常的细胞中膀胱癌特异性基因的甲基化早期诊断膀胱癌。
本发明的甲基化标记物基因的使用能够测定样品中膀胱组织的细胞生长异常(发育异常形成)。测定膀胱组织的细胞生长异常(发育异常形成)的方法包括将从样品中分离的至少一种核酸与能够测定核酸的甲基化状态的试剂接触。该方法包括确定至少一种核酸中的至少一个区域的甲基化状况，并且核酸的甲基化状态与从膀胱组织的没有细胞生长异常(发育异常形成)的样品中分离的核酸中的相同区域的甲基化状态不同。
在本发明的还一种实施方式中，转化的膀胱癌细胞可通过使用上述试剂盒或者核酸芯片检查标记物基因的甲基化来测定。
在本发明的还一种实施方式中，可通过使用上述试剂盒或者核酸芯片检查标记物基因的甲基化诊断膀胱癌。
在本发明的还一种实施方式中，可通过使用上述试剂盒或者核酸芯片检查显示正常表现型的样品中标记物基因的甲基化诊膀胱癌发展的可能性。样品可以使固体或者液体组织、细胞、尿液、血清或者血浆。
在还一方面，本发明涉及测定来自临床样品的启动子甲基化的方法。
在本发明中，测定来自临床样品的基因的启动子甲基化的方法可选自下组，该组由PCR、甲基化特异性PCR、实时甲基化特异性PCR、使用甲基化的DNA特异性结合蛋白的PCR、定量PCR、焦磷酸测序(Pyrosequencing)和二硫键测序所组成，并且临床样品优选疑似癌症患者或者待诊断受试者的组织、细胞、血液或者尿液。
在本发明中，测定基因的启动子甲基化的方法包括下列步骤：(a)从临床样品中分离DNA；(b)使用引物扩增分离的DNA，所述引物能够扩增含有选自下组的基因启动子CpG岛片段，该组由CDX2、CYP1B1、VSX1、HOXA11、T、TBX5、PENK、PAQR9、LHX2和SIM2所组成；以及(c)在步骤(b)中是否扩增出DNA的基础上确定DNA的启动子甲基化。
在本发明的另一种实施方式中，可通过检查在膀胱癌中特异性甲基化的基因的甲基化频率并确定具有发展成膀胱癌的可能性的组织的甲基化频率来评估组织发展成膀胱癌的可能性。
在本文中，“细胞转化”指的是细胞特性从一种形式改变成另一种形式，诸如从正常细胞变成异常细胞，从非肿瘤细胞变成肿瘤细胞，从未分化细胞变成分化细胞，从干细胞变成非干细胞。此外，转化可通过细胞的形态、细胞表现型、生化特性等等来识别。
在本文中，术语癌症的“早期诊断”指的是在病变转移之前发现癌症的可能性。优选地，其指的是在样品组织或者细胞的形态学变化之前观察到发现癌症的可能性。另外，术语转化的“早期诊断”指的是细胞在形态上标示为被转化之前在其较早时期发生转化的高度可能性。
在本文中，术语“超甲基化”指的是CpG岛的甲基化。
在本文中，术语“样品”或者“生物样品”指的是其最广泛的含义，并包括根据将要进行的分析的类型得自个体、体液、细胞系、组织培养物或者其他来源的任何生物学样品。从哺乳动物得到体液和组织活检的方法通常是广泛已知的。优选来源是膀胱活检。
甲基化调节的生物标记物的筛选
本发明涉及确定当细胞或组织从一种细胞类型转化或改变成另一种细胞类型时被甲基化的生物标记物基因的方法。在本文中，“转化”细胞指的是细胞或组织的性质从一种从改变成另一种，诸如从正常变成异常，从非肿瘤变成肿瘤，从未分化变成分化等等。
在本发明的一种实施例中，从正常人和膀胱癌患者的尿液中分离出尿液细胞，然后从尿液的细胞中分离基因组DNA。为了从基因组DNA中仅仅得到甲基化的DNA，允许基因组DNA与结合到甲基化DNA的McrBt反应，然后分离与McrBt蛋白结合的甲基化DNA。扩增与McrBt蛋白结合的分离的甲基化DNA，然后使用Cy3标记来自正常人的DNA，使用Cy5标记来自膀胱癌患者的DNA。然后，将DNA与人类CpG岛微阵列杂交，并选择在正常人与膀胱癌患者之间显示甲基化差异最大的10种基因作为生物标记物。
在本发明中，为了进一步确认10种生物标记物已经被甲基化，进行了焦磷酸测序。
特别是，将总基因组DNA从膀胱细胞系RT‑4、J82、HT1197和HT1376中分离出来并使用重亚硫酸盐处理。扩增使用重亚硫酸盐转化的基因组DNA。然后，将扩增的PCR产物进行焦磷酸测序以便测定基因的甲基化程度。结果，可以看出10种生物标记物都被甲基化。
用于膀胱癌的生物标记物
本发明提供了用于诊断膀胱癌的生物标记物。
用于膀胱癌的生物标记物‑使用癌细胞与正常细胞进行比较
在本发明的一种实施方式中，可以理解“正常”细胞是没有显示任何异常形态或者细胞学变化的那些细胞。“肿瘤”细胞指的是癌细胞。“非肿瘤”细胞指的是患病组织的一部分，但其不被认为是肿瘤的一部分。
在一个方面，本发明基于膀胱癌与下列10种基因的启动子或者外显子区域的超甲基化之间的关系：CDX2(NM_001265，尾同源异型盒转录因子2)；CYP1B1(NM_000104，细胞色素P450，家族1，亚科B，多肽1)；VSX1(NM_199425，视觉系统同源异型盒1同系物)，CHX10‑状(斑马鱼)；HOXA11(NM_005523，同源异型盒A11)；T(NM_003181，T，鼠短尾突变体表型同系物(小鼠))；TBX5(NM_080717T‑盒5)；PENK(NM_006211，脑啡肽原)；PAQR9(NM_198504，黄体酮和adipoQ受体家族成员IV)；LHX2(NM_004789)‑LIM同源异型盒2；SIM2(U80456)‑单意同源物2(果蝇)基因。
根据本发明的诊断试剂盒或者核酸芯片另一应用，本发明可通过确定从受试者分离的一种或多种核酸的甲基化状态诊断受试者膀胱组织的细胞增殖性疾病，其中当与来自在膀胱组织中没有细胞增殖性疾病的受试者的一种或多种核酸的甲基化状态相比时一种或多种核酸的甲基化状态指示受试者膀胱组织的细胞增殖性疾病的。优选的核酸是含有CpG的核酸，诸如CpG岛。
根据本发明的诊断试剂盒或者核酸芯片的应用，受试者膀胱组织中的细胞生长异常可被诊断，包括确定来自受试者的一种或多种核酸的甲基化。所述核酸优选编码下列基因：CDX2(NM_001265，尾同源异型盒转录因子2)；CYP1B1(NM_000104，细胞色素P450，家族1，亚科B，多肽1)；VSX1(NM_199425，视觉系统同源异型盒1同系物(homolog)，CHX10‑状状(斑马鱼)；HOXA11(NM_005523，同源异型盒A11)；T(NM_003181，T，鼠短尾突变体表型同系物(brachyury homolog)(小鼠))；TBX5(NM_080717，T‑盒5)；PENK(NM_006211，脑啡肽原(proenkephalin)；PAQR9(NM_198504，黄体酮和adipoQ受体家族成员IV)；LHX2(NM_004789)‑LIM同源异型盒2；SIM2(U80456)‑单意同源物2(果蝇)基因以及它们的组合。当与来自没有细胞增殖性疾病倾向的膀胱组织的受试者的一种或多种核酸的甲基化状态相比时一种或多种核酸的甲基化状态指示受试者膀胱组织的细胞增殖性疾病。
在本文中，“倾向”指的是个体将患有疾病的可能性。虽然具有易患病体质的受试者还没有出现疾病，但存在增加的患病倾向。
本发明的另一种实施方式提供了诊断受试者膀胱组织中细胞增殖性疾病的诊断方法，包括将来自受试者的含有核酸的样本与确定样品中核酸的甲基化状态的试剂接触，并识别至少一种核酸的至少一个区域的甲基化状态，其中与没有细胞增殖性疾病的受试者中的相同核酸的相同区域的甲基化状态不同的至少一种核酸的至少一个区域的甲基化状态指示受试者膀胱组织中细胞增殖性疾病。
本发明的方法包括确定从受试者分离的一种或多种核酸的一个或多个区域的甲基化状态。本文中使用的短语“核酸”或者“核酸序列”指的是寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸或者他们中任一的片段，或者可以是单链或者双链的基因组或者合成来源的DNA或RNA，或者可代表有义链或反义链的基因组或者合成来源的DNA或RNA，肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)，或者天然或合成来源的DNA‑状或者RNA‑状物质。如同可由本领域技术人员理解的那样，当核酸是RNA时，脱氧核糖核苷A、G、C和T分别被核糖核苷A、G、C和U代替。
感兴趣的核酸可以是其中需要检测区别地甲基化CpG岛的存在的任何核酸。CpG岛是核酸序列的富CpG区。
甲基化
任何纯化或者非纯化形式的核酸样品可根据本发明被使用，只要其含有或者怀疑其含有包括目标位点的核酸序列(例如含CpG的核酸)。能够被差别甲基化的一种核酸区域是CpG岛，一种与二核苷酸CpG的其他核酸区相比具有增加的密度的核酸序列。CpG二核苷酸(doublet)仅仅以大约20%的频率出现在脊椎动物DNA中，其可被预期来自一部分G*C碱基对。在一些区域中，CpG二核苷酸的密度达到预测值；其相对于剩余基因组增加10倍。CpG岛具有大约60%的G*C平均含量，并且一般DNA具有大约40%的G*C平均含量。该岛采取典型地大约1到2千碱基长的延伸形式。在人类基因中存在大约45,000个这样的岛。
在许多基因中，CpG岛紧邻启动子的上游开始，并向下游延伸到转录区中。在启动子的CpG岛的甲基化常常防止基因的表达。该岛还可围绕基因编码区的5′区和编码区的3′区。因此，CpG岛可在包括调节区的编码序列上游的核酸序列的多个区域包括启动子区，编码区(例如外显子)，编码区的下游例如增强子区和内含子中发现。
一般说来，含有CpG的核酸是DNA。但是，本发明的方法可采用例如含有DNA或者含有DNA和RNA的样品，包括信使RNA，其中DNA或者RNA可以是单链或者双链，或者DNA‑RNA杂交体可包括在样品中。
也可采用核酸的混合物。待测的特定核酸序列可以是大分子序列的碎片，或者可作为离散分子存在，因此特定序列构成了整个核酸。核酸序列最初不需要以纯的形式存在，核酸序列可以使复杂混合物的很小的碎片，诸如包括在整个人类DNA中。用于测定包含在样品中的核酸甲基化状态或者检测甲基化的CpG岛的含核酸样品可通过各种技术提取，诸如由Sambrook等人描述的技术(Molecular Cloning:A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；上述文献全文引入本发明参考)。
核酸可以含有作为编码信息或者控制核酸转录的DNA区域的调节区域。调节区包括至少一个启动子。“启动子”是足以直接转录，使启动子依赖性基因表达可控制细胞类型特异性、组织特异性或者可由外来信号或试剂诱导的最小序列。启动子可定位在基因的5′或者3′区。对于CpG岛甲基化位点，一些核酸的全部或者部分启动子区可被检查。此外，通常认为目标基因启动子的甲基化自然从外边界向内进行。因此，细胞转化的早期阶段可通过在启动子区的外部区域中的甲基化测定来检测。
从受试者分离的核酸得自受试者的生物样本。如果想要检测膀胱癌或者膀胱癌发展的阶段，可通过刮取或者进行生物活检从膀胱组织分离核酸。这些样本可通过对本领域技术人员来说已知的各种手术得到。
在本发明的一个方面，与没有患膀胱组织细胞增殖性疾病的受试者的核酸的相同区域相比，从受试者得到的样品的核酸的甲基化状态是超甲基化的。这里使用的“超甲基化”是一个或多个核酸中甲基化等位基因的存在。当检查相同核酸时，来自没有患膀胱组织细胞增殖性疾病的受试者的核酸不含有可检测的甲基化等位基因。
样品
本发明描述了膀胱癌的早期诊断并以及膀胱癌特异性基因的甲基化的应用。膀胱癌特异性基因的甲基化也出现在肿瘤部位附近的组织中。因此，在用于膀胱癌早期诊断的方法中，膀胱癌特异性基因的甲基化可通过检查所有样品包括液体或者固体组织来检测。样品包括但不限于组织、细胞、尿液、血清或者血浆。
个体基因和组(panel)
可以理解本发明可单独使用每个基因作为诊断或者先兆标记物的来实践，或者少数与组显示形式(panel display format)组合的标记基因来实践，从而多个标记基因可被检测以增加可靠性和效率。此外，在本申请中识别的任何基因可单独或者作为与在申请中引证的任何其他基因以任何组合的一组基因使用。而且，基因可根据它们的重要性以及甲基化基因数目被分级和权重，并且形成癌症的可能性水平可被确定。这些算法也落入本发明的范围之内。
甲基化测定方法
甲基化特异性PCR
当使用重亚硫酸盐处理基因组DNA时，5'‑CpG'‑3区中的甲基化胞嘧啶保持不变，未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶。因此，对于通过重亚硫酸盐修饰的碱基序列，构建了含有5'‑CpG‑3′碱基序列的区域对应的PCR引物。这里，与甲基化情形和未甲基化情形对应的两种类型的引物被设计。当基因组DNA被重亚硫酸盐修饰然后使用两种类型的引物进行PCR时，在其中DNA被甲基化的情况下，PCR产物得自其中与使用甲基化碱基序列对应的引物的DNA。相反，在其中基因未甲基化的情况下，PCR产物得自其中使用与未甲基化的碱基序列对应的引物的DNA。DNA的甲基化可使用琼脂糖凝胶电泳定量分析。
实时甲基化特异性PCR
实时甲基化特异性PCR是由甲基化特异性PCR修改而来的实时测定方法，包括使用重亚硫酸盐处理基因组DNA，设计与甲基化情形对应的PCR引物，并使用引物进行实时PCR。这里，测定甲基化的方法包括两种方法：使用与扩增的碱基序列互补的TanMan探针进行测定的方法，和使用Sybergreen进行测定的方法。因此，实时甲基化特异性PCR选择性地仅仅定量分析DNA。这里，使用体外甲基化DNA样品制备标准曲线，并且作为标准，在碱基序列中没有5'‑CpG‑3'序列的基因也可扩增作为阴性对照组，并定量分析甲基化程度。
焦磷酸测序
焦磷酸测序是由重亚硫酸盐测序方法修改而来的实时测序方法。以与重亚硫酸盐测序相同的方式，基因组DNA通过重亚硫酸盐处理修饰，然后构建与没有5'‑CpG‑3'序列的区域对应的引物。在使用重亚硫酸盐处理基因组DNA之后，使用PCR引物对其进行扩增，然后使用测序引物进行实时序列分析。定量分析5'‑CpG‑3′区域中胞嘧啶和胸腺嘧啶的量，并且甲基化程度以甲基化指数表示。
使用甲基化DNA特异性结合蛋白和DNA芯片的PCR或者定量PCR
在使用甲基化DNA特异性结合蛋白的PCR或者DNA芯片的方法中，当仅仅与甲基化DNA特异性结合的蛋白质与DNA混合时，蛋白质仅仅特异性地与甲基化DNA结合，因此仅仅甲基化DNA可被分离。在本发明中，将基因组DNA与甲基化DNA‑特异性结合蛋白混合，然后仅仅甲基化DNA被选择性分离。分离的DNA使用与其启动子区对应的PCR引物进行扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳测定DNA的甲基化。
另外，DNA的甲基化还可通过定量PCR方法来测定。特别是，使用甲基化DNA特异性结合蛋白分离的甲基化DNA可使用荧光染料标记并与其中互补探针被集成到其中的DNA芯片杂交，由此测定DNA的甲基化。这里，甲基化的DNA‑特异性结合蛋白不限于McrBt。
差别甲基化‑甲基化敏感限制性内切酶的测定
差别甲基化的测定可通过将核酸样品与仅仅在一定条件下裂解未甲基化的CpG位点的甲基化敏感核酸内切酶接触一段时间以允许未甲基化核酸裂解来实现。
在分离反应中，将样品进一步与在一定条件下裂解甲基化和未甲基化两者的CpG位点的甲基化敏感的限制性内切酶的同裂酶接触一段时间以允许甲基化核酸裂解。
在一定条件下将特异性引物加入到核酸样品中一段时间以允许通过常规方法发生核酸扩增。在使用甲基化敏感性核酸限制性内切酶消化的样品中扩增产物存在，但使用裂解甲基化和未甲基化两者的CpG位点的甲基化敏感性核酸限制性内切酶的同裂酶消化的样品中扩增产物不存在，表明在被检测的核酸区域中已经发生了甲基化。但是，使用甲基化敏感性限制性核酸内切酶消化的样品中扩增产物缺少，以及使用裂解甲基化和未甲基化两者的CpG位点的甲基化敏感性核酸限制性内切酶的同裂酶消化的样品中扩增产物缺少，表明在测定的核酸中没有发生甲基化。
在本文中，“甲基化敏感核酸内切酶”是包括CG作为其识别位点的一部分并且与C没有被甲基化(例如，SmaI)时相比C被甲基化时具有变化的活性的限制性内切酶。甲基化敏感的限制性核酸内切酶的非限制性的例子包括MspI、HpaII、BssHII、BstUI和NotI。这种酶可单独或者组合使用。其他甲基化敏感的限制性核酸内切酶诸如SacII和EagI可应用于本发明，但不限于这些酶。
甲基化敏感核酸内切酶的“同裂酶”是识别与甲基化敏感核酸内切酶相同的识别位点，但裂解甲基化CG和非甲基化CG两者的限制性核酸内切酶，诸如MspI。
本发明的引物被设计成与待扩增位点的每条链“大体上”互补，并包括如上所述的适当的G或C核苷酸。这意味着引物必须充分互补以便在允许试剂进行聚合的条件下与它们各自的链杂交。本发明的引物在酶链式反应扩增过程中采用，所述反应产生相对于涉及的反应步骤的数目指数增长量的目标位点(例如聚合酶链反应(PCR))。典型地，一个引物与位点的负(‑)链互补(反义引物)并且另一个引物与正(+)链互补(有义引物)。在通过使用酶诸如大片段DNA聚合酶I(Klenow)和核苷酸延伸之后将引物与变性核酸退火得到新合成的含有目标位点序列的+和‑链。由于这些新合成的序列也作为模板，变性、引物退火和延伸的重复循环导致由引物限定区域(即目标位点序列)的指数产生。链式反应的产物是具有与采用的特定引物末端相对应末端的离散核酸双螺旋。
优选地，扩增方法通过PCR进行，如在这里描述并由本领域普通技术人员使用的那样。但是，扩增的替代方法已经被描述，并且还可采用诸如实时PCR或者使用等温酶(isothermal enzyme)的线性扩增。也可使用多重扩增反应。
差别甲基化重亚硫酸盐测序方法的测定
测定含有甲基化CpG核酸的另一种方法包括将含有核酸的样本与修饰未甲基化的胞嘧啶的试剂接触，通过CpG特异性寡核苷酸引物扩增样本中的含CpG的核酸，其中寡核苷酸引物区分修饰的甲基化和未甲基化的核酸并检测甲基化的核酸。扩增步骤是理想而且需要的，但不是必需的。该方法依赖于PCR反应本身来区分修饰(例如化学修饰)的甲基化和未甲基化的DNA。所述方法在美国专利号.5,786,146中描述，其内容通过全部引用结合入本文，尤其是当涉及用于甲基化核酸测定的重亚硫酸盐测序方法时。
底物
一旦扩增了目标核酸区域，可将核酸与固定在固体上的已知基因探针杂交以支持核酸序列的存在。
在本文中，当参照物质、结构、表面或材料使用时，“底物”指的是包括非生物、合成、非存活(nonliving)、平面、球形或者平坦表面的组合物，它们是迄今为止已知的包括特异性结合、杂交或者催化识别位点或者多个不同识别位点或者超过包括表面、结构或材料的不同分子种类的一些不同识别位点。底物可包括，例如但不限于半导体、合成(有机)金属、合成半导体、绝缘体和搀杂剂；金属、合金、元素(element)、化合物和矿物质；合成、裂解、蚀刻、光刻、印刷、机械加工和微制作玻片(microfabricated slide)、装置、结构和表面；工业聚合物、塑料、膜；二氧化硅、硅酸盐、玻璃、金属和陶瓷；木头、纸张、硬纸板、棉花、毛织品、布、纺织和无纺织纤维、材料和织物。
用于核酸序列粘附的一些类型的膜对本领域技术人员来说是已知的。这些膜的特定的非限制性的例子包括硝化纤维或者用于基因表达测定的其他膜，诸如聚氯乙烯、重氮化纸(diazotized paper)以及其他从市场购买的膜，诸如GENESCREENTM、ZETAPROBETM(Biorad)和NYTRANTM。小珠、玻璃、晶片和金属基板包括在其中。将核酸与这些物质连接的方法对本领域技术人员来说是公知的。作为替代，筛选可在液相中进行。
杂交条件
在核酸杂交反应中，用于实现特定严谨水平的条件基于待杂交的核酸性质而变化。例如在选择杂交条件时可考虑核酸的杂交区域的长度、同源程度、核苷酸序列组成(例如GC/AT含量)以及核酸类型(例如RNA，DNA)。其他考虑是核酸之一是否被固定在例如滤纸上。
进一步更高严谨条件的一个例子如下：大约室温下(杂交条件)的2X SSC/0.1%SDS；大约室温下(低严谨条件)的0.2X SSC/0.1%SDS；大约42°C的(中度严谨条件)的0.2X SSC/0.1%SDS；以及大约68°C的(高严谨条件)的0.1X SSC。可仅仅使用这些条件之一进行洗涤，例如高严谨条件，或者按照上面列举的顺序使用每种条件进行洗涤例如10‑15分钟，重复任何或者所有列举的步骤。但是，如上所述，最佳条件可根据涉及的特定杂交反应而变化，并可根据经验来确定。一般说来，高度严谨条件用于感兴趣的探针的杂交。
标记
感兴趣的探针可以被可检测地标记，例如使用放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合物或者酶标记。本领域普通技术人员将会知道用于与探针结合的其他合适的标记，或者能够使用常规实验确定它们。
试剂盒
根据本发明，提供了一种对于检测受试者细胞增殖性疾病来说有用的试剂盒。根据本发明的试剂盒包括被间隔(compartmentalized)成可使样品容纳在其中的载体部件(carrier mean)；一个或多个容器，所述容器包括一个或多个含有选择性裂解未甲基化胞嘧啶的试剂的第一容器，含有用于含有CpG的核酸扩增的引物的第二容器，以及含有检测裂解或者未裂解核酸存在的部件的第三容器。根据本发明预期使用的引物包括在序列号:1‑20中阐明的那些以及它们的任何功能性组合及片段。功能性组合及片段指的是其被用作引物以检测在试图待测的基因组区域上是否出现甲基化的能力。
载体部件适于包括一个或多个容器部件，诸如小瓶、管以及类似物，每个容器部件包括在本发明中待用的一个分离元件。考虑到在本发明的方法中提供的描述，本领域技术人员可以很容易确定在容器部件中需要的试剂的分配。例如，容器部件之一可包括含有甲基化敏感限制性核酸内切酶的容器。还可包括一个或多个含有与感兴趣的核酸位点互补的容器部件。另外，还可包括一个或多个含有甲基化敏感限制性核酸内切酶的同裂酶的容器部件。
实施例
此后，将参照实施例进一步详细描述本发明。但是应当理解，这些是实力仅仅用于解释的目的而不解释为对本发明的范围的限制。
实施例1:膀胱癌特异性甲基化基因的发现
为了筛选在膀胱癌中特异性甲基化的生物标记物，将10位膀胱癌患者和10位正常人中每位的大约20ml尿液在离心机(Hanil Science Industrial Co.，Ltd.，Korea)中以4,200×g的速度离心10分钟分离尿液细胞。弃去上清，并使用5ml的PBS将细胞沉淀物洗涤两次。使用QIAamp DNA Mini试剂盒(QIAGEN，USA)将基因组DNA从细胞沉淀物中分离出来。将500ng分离的基因组DNA超声(Vibra Cell，SONICS)处理，由此构建大约200‑300‑bp‑基因组DNA片段。
为了从基因组DNA中仅仅得到甲基化的DNA，使用已知与甲基化DNA结合的甲基结合区(MBD)(Fraga等人，Nucleic Acid Res.，31:1765‑1774，2003)。具体地说，将2μg的6X His‑标记的MBD与500ng大肠杆菌JM110(No.2638，生物资源中心，韩国生物科学与生物工艺学研究所)的基因组DNA预培养，然后与Ni‑NTA磁性粒子(Qiagen，USA)结合。从正常人和膀胱癌患者的尿液细胞中分离的超声处理的基因组DNA与在结合缓冲液(10mM Tris‑HCl(pH 7.5)，50mM NaCl，1mM EDTA，1mMDTT，3mM MgCl2，0.1%Triton‑X100，5%甘油，25mg/ml BSA)中存在的粒子在4℃反应20分钟。然后，使用含有700mM NaCl的500μl结合缓冲液将小珠洗涤三次，然后使用QiaQuick PCR纯化试剂盒(QIAGEN，USA)分离与MBD结合的DNA。
然后，使用基因组DNA扩增试剂盒(Sigma，USA，Cat.No.WGA2)扩增与MBD结合的基因组DNA，且4μg扩增的DNA通过Total基因组标记系统(BioPrime Total Genomic Labeling system I)(Invitrogen Corp.，USA)将正常人来源的DNA使用Cy3标记，将来自膀胱癌患者的DNA使用Cy5标记。将正常人的DNA与膀胱癌患者的DNA彼此混合，然后与244K人类CpG微阵列(Agilent，USA)杂交(图1)。杂交之后，将DNA混合物进行一系列洗涤过程，然后使用Agilent扫描仪进行扫描。来自微阵列图像的信号值的计算通过使用Feature Extraction程序v.9.5.3.1(Agilent)计算正常人样品与膀胱癌患者样品之间的信号强度的相对差来进行。
为了从正常样品中选择甲基化的点，将全部Cy3信号值平均，然后具有平均低于10%的信号值的点被认为是正常人样品中未甲基化的那些。结果，筛选到41,674个点具有低于65的Cy3信号值。
为了从41,674个点中选择膀胱癌患者样品中的甲基化点，具有大于130的Cy5信号值的点被认为是膀胱癌中的甲基化点。结果，筛选到631个点具有超过130的信号值的Cy5信号值的。通过这些点。227个与启动子区对应的基因被确定为膀胱癌特异性甲基化基因。
从这些基因中，选择了显示正常人的甲基化程度与膀胱癌患者的甲基化程度之间的最大相对差的10个基因(CDX2，CYP1B1，VSX16，HOXA11，T，TBX5，PENK，PAQR9，LHX2以及SIM2)，并使用MethPrimer(http://itsa.ucsf.edu/~urolab/methprimer/index1.html)确定10个基因的启动子区中的CpG岛的存在。这10种基因被确定为膀胱癌诊断的甲基化生物标记物。10种基因及其相对于正常人尿液细胞的膀胱癌患者的尿液细胞的相对甲基化程度在下表1中显示。
表1：用于膀胱癌诊断的10种甲基化生物标记物

通过将CpG微阵列中膀胱癌患者样品总的平均信号(Cy5)值除以正常人样品中的平均信号(Cy5)值计算正常样品与膀胱癌患者样品之间的相对甲基化程度。
实施例2:癌细胞系中生物标记物基因的甲基化测定
为了确定10种基因的甲基化状态，进行了对每个启动子的重亚硫酸盐测序。
为了使用重亚硫酸盐将未甲基化的胞嘧啶修饰成尿嘧啶，将总基因组DNA从膀胱癌患者细胞系RT‑4(韩国细胞系银行(KCLB 30002)，J82(KCLB 30001)、HT1197(KCLB 21473)和HT1376(KCLB 21472)中分离出来，并使用EZ DNA甲基化金标试剂盒(Zymo Research，USA)以重亚硫酸盐对200ng的基因组DNA进行处理。当使用重亚硫酸盐处理DNA时，未甲基化的胞嘧啶被修饰成尿嘧啶，并且甲基化的胞嘧啶保持不变。将使用重亚硫酸盐处理的DNA在20μl无菌蒸馏水中洗脱并进行焦磷酸测序。
用于进行10种基因焦磷酸测序的PCR和测序引物使用PSQ测定设计程序(Biotage，USA)设计。用于测定每种基因的甲基化的PCR和测序引物在下表2和3中显示。
表2：引物和条件


a到转录起始位点(+1)的距离(核苷酸)：在甲基化测定中使用的基因组DNA上的CpG区的位置。
表3：用于甲基化标记物基因的测序引物的序列
  基因  序列(5'‑‑>3')  序列号  CDX2  ATT AAT AGA GTT TTG TAA ATA T  21  CYP1B1  AAG GGT ATG GGA ATT G  22  VSX1  TTT GGG ATT GGG AAG  23  HOXA11 TAG TTT AGG GTA TTT TTT ATT TAT  24  T GTG AAA GTA ATG ATA TAG TAG AAA  25  TBX5  TTT GGG GGT TGG GGA  26  PENK  GGG TGT TTTAGG TAG TT  27
 PAQR9 CCT CCC AAA CTA AAA TTT C  28 LHX2 TGG GGG TAG AGG AGA  29 SIM2 CCT CCC CAA ATT CTT C  30
将使用重亚硫酸盐修饰的20ng的基因组DNA通过PCR扩增。在PCR扩增中使用PCR反应液(20ng的使用重亚硫酸盐修饰的基因组DNA，5μl的10X PCR缓冲液(Enzynomics，韩国)，5个单位的Taq聚合酶(Enzynomics，韩国)，4μl的2.5mMdNTP(Solgent，韩国)以及2μl(10pmole/μl)的PCR引物)，并在下列条件下进行PCR反应：在95℃预变性5min，然后在95℃变性40sec，45个循环，在60℃退火45sec，并在72℃下延伸40sec，接着在72℃下最终延伸5min。PCR产物的扩增通过在2.0%琼脂糖凝胶上电泳来确认。
使用PyroGold试剂(Biotage，USA)处理扩增的PCR产物，并使用PSQ96MA系统(Biotage，USA)进行焦磷酸测序。在焦磷酸测序之后，通过计算甲基化指数测定DNA的甲基化程度。甲基化指数通过确定与每个CpG岛结合的胞嘧啶的平均率来计算。
图2定量显示了使用焦磷酸测序法测定的膀胱癌细胞系中10种生物标记物的甲基化程度。结果显示，10种生物标记物在至少一个细胞系中都以很高的水平被甲基化。下表4显示了10种基因的启动子序列。
表4：甲基化生物标记物基因的启动子序列
  基因  序列号  CDX2  31  CYP1B1  32  VSX1  33  HOXA11  34  T  35  TBX5  36  PENK  37  PAQR9  38  LHX2  39  SIM2  40
实施例3:膀胱癌患者的尿液细胞中生物标记物基因的甲基化测定
为了验证10种基因是否可被用于膀胱癌诊断的生物标记物，将20个正常人和19种膀胱癌患者的每人的大约20ml尿液在离心机(Hanil Science Industrial Co.，Ltd.，Korea)中以4,200×g的速度离心10分钟以分离细胞。弃去上清，并使用5ml的PBS将细胞沉淀物洗涤两次。使用QIAamp DNA Mini试剂盒(QIAGEN，USA)将基因组DNA从洗涤的细胞中分离出来，然后使用EZ DNA甲基化金标试剂盒(ZymoResearch，USA)以二硫化处理200ng分离的基因组DNA。然后，将DNA在20μl无菌蒸馏水中洗脱并进行焦磷酸测序。
将使用重亚硫酸盐转化的20ng的基因组DNA通过PCR扩增。在PCR扩增中，使用PCR反应液(20ng的使用重亚硫酸盐修饰的基因组，5μl的10X PCR缓冲液(Enzynomics，Korea)，5个单位的Taq聚合酶(Enzynomics，Korea)，4μl的2.5mMdNTP(Solgent，Korea)以及2μl(10pmole/μl)的PCR引物)，并在下列条件下进行PCR反应:在95℃预变性5min，然后在95℃变性40sec，45个循环，在60℃退火45sec，并在72℃下延伸40sec，接着72℃下最终延伸5min。PCR产物的扩增通过在2.0%琼脂糖凝胶上电泳来确认。
使用PyroGold试剂(Biotage，USA)处理扩增的PCR产物，并使用PSQ96MA系统(Biotage，USA)进行焦磷酸测序。在焦磷酸测序之后，通过计算其甲基化指数测定DNA的甲基化程度。甲基化指数通过确定与每个CpG岛结合的胞嘧啶的平均率来计算。在正常人和膀胱癌患者的尿液细胞中的DNA甲基化指数测定之后，用于膀胱癌患者诊断的甲基化指数分界值通过受体操作特征(ROC)曲线分析来确定。
图3显示了尿液细胞中10种生物标记物基因的甲基化的测定结果。如同从图3中看到的那样，基因的甲基化程度在膀胱癌患者的样品中比在正常人样品中高。同时，在膀胱炎和血尿患者中的甲基化指数与正常对照组类似，或者很少高于正常对照组。图4显示了用于确定膀胱癌诊断的分界值的ROC分析结果。而且，基于ROC曲线分析结果计算的对于10种生物标记物的甲基化指数分界值在下表5中显示。
表5：用于10种生物标记物的膀胱癌诊断的分界值
  基因  分界值(%)a  CDX2  5.82<  CYP1B1  8.38<
  VSX1  29.3<  HOXA11  8.81<  T  11.3<  TBX5  6.93<  PENK  11.57<  PAQR9  5.0<  LHX2  13.7<  SIM2  8.2<
在10种生物标记物的甲基化分析中，临床样品中每种生物标记物的甲基化指数被计算。其中计算的用于膀胱癌诊断的甲基化指数高于通过受体操作特性(ROC)分析得到的分界值的情形被判断为甲基化阳性，其中计算的甲基化指数低于分界值的情形被判断为甲基化阴性。
如在下表6和图5中显示的那样，当在通过ROC曲线分析得到的分界值的基础上进行判断时，正常人的尿液细胞对于所有10种生物标记物都是甲基化阴性的，但膀胱癌患者样品的12.5‑62.5%对于10种生物标记物是甲基化阳性的。而且，进行了统计分析，结果可以看出，与正常人组相比，膀胱癌样品的9种样品对于10种生物标记物的9种以显著的水平(p<0.01)呈甲基化阳性。这表明10种甲基化标记物的9种在膀胱癌中被特异性地统计上显著甲基化，并且对于诊断膀胱癌非常有用。
表6：用于10种生物标记物的甲基化阳性样品的频率


a 甲基化样品样品的频率；以b为通过Chi‑Square测试得到的p值
实施例4:6种生物标记物组基因诊断膀胱癌的能力评估
使用10种甲基化生物标记物，进行逻辑回归分析。结果，用于诊断膀胱癌的6种基因的最佳组(panel)被建立。图6A显示了6种生物标记物(CYP1B1、HOXA11、SIM2、PENK、LHX2和TBX5)的甲基化状态。样品是否对6种基因甲基化阳性或者甲基化阴性根据实施例3中描述的方法进行判断。结果可以看出，对于6种基因所有正常样品都是甲基化阴性的，并且仅仅膀胱癌样品对于6种基因是甲基化阳性的。特别是，早期膀胱癌样品对于6种基因也以很高的频率显示甲基化阳性，表明6种基因对于膀胱癌的早期诊断非常有用。当包括6种基因的基因组(panel)的至少一种基因的甲基化被诊断为膀胱癌时，用于早期膀胱癌的基因组(panel)的灵敏性和特异性极高，分别达到84.0%和100%(图6B)。而且，晚期膀胱癌的基因组(panel)的灵敏性和特异性分别被测定为85.7%和100%(图6B)。另外，早期和晚期膀胱癌的基因组(panel)的灵敏性和特异性分别被测定为84.4%和100%。这表明6种基因的甲基化对于膀胱癌的早期诊断高度有用。
实施例5:使用甲基化DNA特异性结合蛋白的生物标记物基因的甲基化的测定
为了测定在膀胱癌中被特异性甲基化的生物标记物的甲基化，将膀胱癌细胞系RT24和HT1197的每种基因组DNA 100ng超声处理(Vibra Cell，SONICS)，由此得到大约200‑400‑bp的基因组DNA片段。
为了仅从基因组DNA得到甲基化的DNA，使用已知与甲基化DNA结合的MBD。具体地说，将2μg的6X His‑标记的MBD与500ng大肠杆菌JM110(No.2638，生物资源中心，韩国生物科学与生物工艺学研究所)的基因组DNA预培养，然后与Ni‑NTA磁珠(Qiagen，USA)结合。允许100ng超声处理的基因组DNA在结合缓冲液(10mMTris‑HCl(pH 7.5)，50mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT，3mM MgCl2，0.1%Triton‑X100，5%甘油，25mg/ml BSA)存在下在4℃与小珠反应20分钟。然后，使用含有700mM NaCl的500μl的结合缓冲液将小珠洗涤三次，然后使用QiaQuick PCR纯化试剂盒(QIAGEN，USA)分离与MBD结合的甲基化的DNA。
然后，DNA与MBD结合的甲基化DNA通过PCR使用与SIM2基因的启动子区(从‑6842到‑6775bp)对应的序列号:41和序列号：42引物进行扩增。
序列号：41:5'‑TTC TTA TTC TCA CCA GAC ATC TCA ACA CCC‑3'
序列号：42:5'‑ATC TCC CAT CCT CCC TCC CAC TCT C‑3'
PCR反应在下列条件下进行：在94℃预变性5min，然后在94℃变性30sec，重复40次，在62℃退火30sec并在72℃延伸30sec，然后在72℃下最终延伸5min。PCR产物的扩增通过在2%的琼脂糖凝胶上电泳来确定。
结果可以看出，对于SIM2基因，扩增的168‑bp产物仅仅在RT24细胞系的基因组DNA中被检测，表明基因被甲基化，而在HT1197细胞系中没有检测到扩增产物，表明在HT1197细胞系中基因没有被甲基化(图7)。这些结果与通过焦磷酸测序方法得到的甲基化测定结果一致。而且，这些结果表明MBD的使用能够测定甲基化的DNA。
工业实用性
如上面详细描述的那样，本发明提供了用于诊断膀胱癌的试剂盒和核酸芯片，其可检测膀胱癌特异性标记物基因的CpG岛的甲基化。能够在转化早期使用本发明的诊断试剂盒和核酸芯片诊断膀胱癌，并且与常规方法相比诊断试剂盒或者核酸芯片可以更准确迅速的方式诊断膀胱癌。
虽然已经参照特定特征对本发明进行了详细描述，本领域技术人员将会理解，本说明书仅仅用于优选实施方式而不是限制本发明的范围。因此，本发明的实际范围将由随附的权利要求书及其等同物来限定。