PDGF和VEGF的适体及它们在治疗PDGF和VEGF介导的病状中的用途.pdf

本文提供了结合PDGF的适体和结合VEGF的适体。此外，本文提供了包含PDGF适体和VEGF适体的适体构建体。本文提供了包含适体和适体构建体的药物组合物，以及使用所述适体和适体构建体治疗病状的方法。

1.  一种包括以下序列的适体：5'-NZVSL_nS'V'ZACNN_mGCGZZZAZAGCG-3'(SEQ ID NO:500)，
其中
V选自A、C或G；
V'选自C、G或Z，其中V'与V互补；
S和S’独立选自C或G，其中S和S’彼此互补；
N独立选自任何天然存在或经修饰的核苷酸；
Z独立选自经修饰的嘧啶；
L是选自任何天然存在或经修饰的核苷酸的间隔基、烃接头、聚乙二醇接头或其组合；
n是0至20；
m是0至20；且
其中任选地包含一种或多种核苷酸插入。

2.  根据权利要求1所述的适体，其包括序列：
5′-ZZVSL_nS′V′ZACNN_mGCGZZZAZAGCG-3′(SEQ ID NO：501)，
其中
V选自A、C或G；
V'选自C、G或Z，其中V'与V互补；
S和S’独立选自C或G，其中S和S'彼此互补；
N独立选自任何天然存在或经修饰的核苷酸；
Z独立选自经修饰的嘧啶；
L是选自任何天然存在或经修饰的核苷酸的间隔基、烃接头、聚乙二醇接头或其组合；
n是0至20；
m是0至20；且
其中任选地包含一种或多种核苷酸插入。

3.  根据权利要求1所述的适体，其包括序列：
5′-ZZVCL_nGV′ZACNMGCGZZZAZAGCG-3′(SEQ ID NO：502)，
其中
V选自A、C或G；
V'选自C、G或Z，其中V'与V互补；
N独立选自任何天然存在或经修饰的核苷酸；
M选自C或A；
Z独立选自经修饰的嘧啶；
L是选自经取代或未取代的C₂-C₂₀接头和经修饰或未修饰的核苷酸的间隔基；任何天然存在或经修饰的核苷酸、烃接头、聚乙二醇接头或其组合；
n是0至20；且
其中任选地包含一种或多种核苷酸插入。

4.  根据权利要求3所述的适体，其包括序列：
5′-ZZACL_nGZZACACGCGZZZAZAGCG-3′（SEQ ID NO：503)，
其中
Z独立选自经修饰的嘧啶；且
L是选自任何天然存在或经修饰的核苷酸的间隔基、烃接头、聚乙二醇接头或其组合；
n是0至20；且
其中任选地包含一种或多种核苷酸插入。

5.  根据权利要求4所述的适体，其包括序列：
5′-ZZACGACZACGZZACACGCGZZZAZAGCG-3′(SEQ ID NO：504)，
其中
Z独立选自经修饰的嘧啶；且其中任选地包含一种或多种核苷酸插入。

6.  一种特异性结合PDGF的适体，其中所述适体包含至少一种经修饰的核苷，所述核苷包含疏水性核碱基修饰，其中所述适体以小于10nM的亲和性结合PDGF，并且其中所述适体与PDGF适体4149-8_260(SEQ ID NO 211)竞争结合PDGF。

7.  根据权利要求6所述的适体，其中所述疏水性核碱基修饰是经修饰的嘧啶。

8.  根据权利要求7所述的适体，其中所述适体包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个经修饰的嘧啶。

9.  根据权利要求7或权利要求8所述的适体，其中每个经修饰的嘧啶独立选自5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-苯乙基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(PedU)、5-(N-硫代苯甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(ThdU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲铵)丙基]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷氯化物、5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-氟尿苷和5-(N-[1-(2,3-二羟丙基)]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷)。

10.  根据权利要求6至9中任一项所述的适体，其中所述适体包括序列：
5′-ZABL_pGYZABK_qGCGZZYDYAG-3′(SEQ ID NO：505)，
其中每个Z独立为经修饰的嘧啶；
每个B独立选自C和经取代或未取代的C₂-C₁₀接头；
每个L独立选自经取代或未取代的C₂-C₁₀接头、聚乙二醇接头和经修饰或未修饰的核苷酸，其中p是1至10；
每个Y独立选自经修饰或未修饰的嘧啶；
每个K独立选自经取代或未取代的C₂-C₁₀接头、聚乙二醇接头和经修饰或未修饰的核苷酸，其中q是1至5；且
D选自A和经取代或未取代的C₂-C₁₀接头。

11.  根据权利要求10所述的适体，其包括序列：
5′-XZABL_pGYZABK_qGCGZZYDYAGBE-3′(SEQ ID NO：506)，
其中X选自经修饰或未修饰的嘧啶和经取代或未取代的C₂-C₁₀接头，或者不存在；且
E选自G和经取代或未取代的C₂-C₁₀接头，或者不存在。

12.  根据权利要求10或权利要求11所述的适体，其中每个经修饰的嘧啶独立选自5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-苯乙基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(PedU)、5-(N-硫代苯甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(ThdU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲铵)丙基]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷氯化物、5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-氟尿苷和5-(N-[1-(2,3-二羟丙基)]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷)。

13.  根据权利要求10至12中任一项所述的适体，其中每个经取代或未取代的C₂-C₁₀接头是经取代或未取代的C₂-C₈接头、经取代或未取代的C₂-C₆接头、经取代或未取代的C₂-C₅接头、经取代或未取代的C₂-C₄接头或经取代或未取代的C₃接头。

14.  根据权利要求10至13中任一项所述的适体，其中至少一个 L是聚乙二醇接头且p是1、2、3、4、5或6。

15.  根据权利要求10至14中任一项所述的适体，其中至少一个L是六乙二醇接头。

16.  根据权利要求14或权利要求15所述的适体，其中p是1、2或3。

17.  根据权利要求10至16中任一项所述的适体，其中至少一个K是聚乙二醇接头且q是1或2。

18.  根据权利要求10至17中任一项所述的适体，其中至少一个K是六乙二醇接头。

19.   20.19.根据权利要求10至18中任一项所述的适体，其中q是1。根据权利要求10至18中任一项所述的适体，其中至少一个K是经取代或未取代的C₂-C₁₀接头且q是1或2。

20.   21.根据权利要求20所述的适体，其中所述经取代或未取代的C₂-C₁₀接头是经取代或未取代的C₂-C₈接头、经取代或未取代的C₂-C₆接头、经取代或未取代的C₂-C₅接头、经取代或未取代的C₂-C₄接头或经取代或未取代的C₃接头。

21.   22.根据权利要求10至21中任一项所述的适体，其中至少一个L是经取代或未取代的C₂-C₁₀接头且p是1、2、3、4、5、6、7或8。

22.   23.根据权利要求22所述的适体，其中所述经取代或未取代的C₂-C₁₀接头是经取代或未取代的C₂-C₈接头、经取代或未取代的C₂-C₆接头、经取代或未取代的C₂-C₅接头、经取代或未取代的C₂-C₄接头或经取代或未取代的C₃接头。

23.   24.一种特异性结合PDGF的适体，其中所述适体包含以下序列：
5′-ACAL_nZGZAZGL_mZLZ-3′(SEQ ID NO.512)；
其中每个Z独立为经修饰的嘧啶；
每个L独立选自经取代或未取代的C₂-C₅₀接头、聚乙二醇接头和经修饰或未修饰的核苷酸；
n是1至5；且
m是1至10。

24.   25.根据权利要求24所述的适体，其中每个Z独立选自5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-苯乙基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(PedU)、5-(N-硫代苯甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(ThdU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲铵)丙基]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷氯化物、5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-氟尿苷和5-(N-[1-(2,3-二羟丙基)]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷)。

25.   26.根据权利要求25所述的适体，其中至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或每个Z是5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(NapdU)。

26.   27.根据权利要求24至26中任一项所述的适体，其中n是1、2、3或4；且其中m是1、2、3、4、5、6、7、8或9。

27.   28.根据权利要求1至27中任一项所述的适体，其中至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或至少五个核苷包含2'-OMe。

28.   29.根据权利要求1至28中任一项所述的适体，其中至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或至少五个核苷间键是硫代磷酸酯键。

29.   30.根据权利要求1至29中任一项所述的适体，其中所述适体 以小于10nM、小于5nM、小于2nM或小于1nM的亲和性结合PDGF。

30.   31.根据权利要求1至30中任一项所述的适体，其中所述适体抑制PDGF-介导的PDGF受体磷酸化。

31.   32.一种以小于10nM、小于5nM、小于2nM或小于1nM的亲和性结合VEGF-121的适体，其中所述适体包含至少一个经修饰的核苷，所述核苷包含疏水性核碱基修饰。

32.   33.根据权利要求32所述的适体，其中所述疏水性核碱基修饰是经修饰的嘧啶。

33.   34.根据权利要求33所述的适体，其中所述适体包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个经修饰的嘧啶。

34.   35.根据权利要求33或权利要求34所述的适体，其中每个经修饰的嘧啶独立选自5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-苯乙基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(PedU)、5-(N-硫代苯甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(ThdU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲铵)丙基]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷氯化物、5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-氟尿苷和5-(N-[1-(2,3-二羟丙基)]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷)。

35.   36.根据权利要求33至35中任一项所述的适体，其中至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个经修饰的嘧啶是5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(NapdU)。

36.   37.根据权利要求32至36中任一项所述的适体，其中所述适体与适体4867-31_192竞争结合VEGF-121。

37.   38.根据权利要求32至37中任一项所述的适体，其中所述适体包括以下序列：
5′-GZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZG-3′，
其中每个Z是经修饰的嘧啶；
Q选自任何经修饰或未修饰的核苷酸和经取代或未取代的C₂-C₅₀接头，或者不存在；
每个E独立选自G和经取代或未取代的C₂-C₅₀接头；
D选自A和经取代或未取代的C₂-C₅₀接头；且
R选自任何经修饰或未修饰的核苷酸和经取代或未取代的C₂-C₅₀接头。

38.   39.根据权利要求37所述的适体，其中所述适体包括选自以下的序列：
5′-CGZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZG-3′；
5′-GZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZGC-3′；
5′-CGZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZGG-3′；和
5′-CVGZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZGG-3′。

39.   40.根据权利要求37或权利要求38所述的适体，其中每个Z独立选自5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-苯乙基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(PedU)、5-(N-硫代苯甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(ThdU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲铵)丙基]羧基酰 胺)-2'-脱氧尿苷氯化物、5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-氟尿苷和5-(N-[1-(2,3-二羟丙基)]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷)。

40.   41.根据权利要求37至39中任一项所述的适体，其中至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或至少八个Z是5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(NapdU)。

41.   42.根据权利要求37至40中任一项所述的适体，其中每个经取代或未取代的C₂-C₅₀接头独立选自经取代或未取代的C₂-C₂₀接头、经取代或未取代的C₂-C₁₀接头、经取代或未取代的C₂-C₈接头、经取代或未取代的C₂-C₆接头、经取代或未取代的C₂-C₅接头、经取代或未取代的C₂-C₄接头和经取代或未取代的C₃接头。

42.   43.根据权利要求42所述的适体，其中每个经取代或未取代的C₂-C₅₀接头是经取代或未取代的C₂-C₁₀接头。

43.   44.根据权利要求43所述的适体，其中每个经取代或未取代的C₂-C₁₀接头是经取代或未取代的C₂-C₈接头、经取代或未取代的C₂-C₆接头、经取代或未取代的C₂-C₅接头、经取代或未取代的C₂-C₄接头或经取代或未取代的C₃接头。

44.   45.根据权利要求32至39中任一项所述的适体，其中至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或至少五个核苷包含2'-OMe。

45.   46.根据权利要求32至45中任一项所述的适体，其中至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或至少五个核苷间键是硫代磷酸酯键。

46.   47.根据权利要求32至46中任一项所述的适体，其中所述适体以小于10nM、小于5nM、小于2nM或小于1nM的亲和性结合VEGF-121。

47.   48.根据权利要求32至47中任一项所述的适体，其中所述适体 抑制VEGF-121-介导的VEGF受体磷酸化。

48.   49.一种表10至14中任一个中显示的适体，其以小于10nM的亲和性结合VEGF-121。

49.   50.一种适体构建体，其包含选自根据权利要求1至31中任一项所述的适体的第一适体和选自根据权利要求32至49中任一项所述的适体的第二适体。

50.   51.根据权利要求50所述的适体构建体，其中所述第一适体和所述第二适体非共价连接。

51.   52.根据权利要求50所述的适体构建体，其中所述第一适体和所述第二适体共价连接。

52.   53.根据权利要求50至52中任一项所述的适体构建体，其中所述适体构建体能够同时结合PDGF和VEGF-121。

53.   54.根据权利要求50至53中任一项所述的适体构建体，其中所述适体构建体以小于10nM的亲和性结合PDGF。

54.   55.根据权利要求50至53中任一项所述的适体构建体，其中所述适体构建体以小于10nM的亲和性结合VEGF-121。

55.   56.一种包含第一适体和第二适体的适体构建体，其中所述第一适体和所述第二适体各自独立地选自根据权利要求1至31中任一项所述的适体。

56.   57.根据权利要求56所述的适体构建体，其中所述第一适体和所述第二适体相同。

57.   58.根据权利要求56所述的适体构建体，其中所述第一适体和所述第二适体不同。

58.   59.根据权利要求56至58中任一项所述的适体构建体，其中所述第一适体和所述第二适体非共价连接。

59.   60.根据权利要求56至58中任一项所述的适体构建体，其中所述第一适体和所述第二适体共价连接。

60.   61.根据权利要求56至60中任一项所述的适体构建体，其中所述适体构建体能够同时结合两个PDGF单体。

61.   62.根据权利要求56至61中任一项所述的适体构建体，其中所述适体构建体以小于10nM的亲和性结合PDGF。

62.   63.一种包含第一适体和第二适体的适体构建体，其中所述第一适体和所述第二适体各自独立选自根据权利要求32至49中任一项所述的适体。

63.   64.根据权利要求63所述的适体构建体，其中所述第一适体和所述第二适体相同。

64.   65.根据权利要求63所述的适体构建体，其中所述第一适体和所述第二适体不同。

65.   66.根据权利要求63至65中任一项所述的适体构建体，其中所述第一适体和所述第二适体非共价连接。

66.   67.根据权利要求63至65中任一项所述的适体构建体，其中所述第一适体和所述第二适体共价连接。

67.   68.根据权利要求63至67中任一项所述的适体构建体，其中所述适体构建体能够同时结合两个VEGF单体。

68.   69.根据权利要求63至68中任一项所述的适体构建体，其中所述适体构建体以小于10nM的亲和性结合VEGF。

69.   70.一种药物组合物，其包含至少一种根据权利要求1至49中任一项所述的适体和药学上可接受的载体。

70.   71.根据权利要求70所述的药物组合物，其包含根据权利要求1至31中任一项所述的第一适体和根据权利要求32至49中任一项所述的第二适体。

71.   72.一种药物组合物，其包含根据权利要求49至69中任一项所述的适体构建体和药学上可接受的载体。

72.   73.根据权利要求69至72中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物用于玻璃体内注射。

73.   74.一种用于治疗黄斑变性的方法，其包括向患有黄斑变性的受试者施用治疗有效量的根据权利要求69至72中任一项所述的药物组合物。

74.   75.一种预防黄斑变性的方法，其包括向处于患有黄斑变性的风险的受试者施用治疗有效量的根据权利要求69至72中任一项所述的药物组合物。

75.   76.一种治疗眼科病状的方法，其包括向患有眼科病状的受试者施用治疗有效量的根据权利要求69至72中任一项所述的药物组合物。

76.   77.根据权利要求76所述的方法，其中所述眼科病状选自视网膜炎、黄斑变性、脉络膜炎、视网膜病变、高血压性视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、慢性干眼、AIDS-相关视力减退、弱视、偏盲、视网膜静脉闭塞、沙眼、圆锥角膜、脉络膜视网膜炎症、中心性浆液性视网膜病、葡萄膜炎、视网膜营养不良症、水肿、青光眼和白内障。

77.   78.根据权利要求74或权利要求75所述的方法，其中所述黄斑变性是年龄相关性黄斑变性。

78.   79.根据权利要求78所述的方法，其中所述黄斑变性是干性年龄相关性黄斑变性或湿性年龄相关性黄斑变性。

79.   80.一种治疗纤维化的方法，其包括向患有纤维化的受试者施用治疗有效量的根据权利要求70至72中任一项所述的药物组合物。

80.   81.根据权利要求80所述的方法，其中所述纤维化选自肺纤维化、肾纤维化和囊性纤维化。

81.   82.一种治疗心血管疾病的方法，其包括向患有心血管疾病的受试者施用治疗有效量的根据权利要求69至72中任一项所述的药物组合物。

82.   83.根据权利要求82所述的方法，其中所述心血管疾病选自动脉粥样硬化、再狭窄、心脏肥大相关的病状和血管病症。

83.   84.一种治疗癌症的方法，其包括向患有癌症的受试者施用治疗有效量的根据权利要求69至72中任一项所述的药物组合物。

84.   85.根据权利要求84所述的方法，其中所述癌症选自膀胱癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、结肠癌和直肠癌、淋巴瘤、子宫内膜癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、前列腺癌、白血病和甲状腺癌

PDGF和VEGF的适体及它们在治疗PDGF和VEGF介导的病状中的用途
发明领域
本公开一般涉及核酸领域，和更具体地涉及能够结合血小板源性生长因子(PDGF)的适体和能够结合血管内皮生长因子(VEGF)的适体领域。在一些实施方案中，此类适体可用作为预防、治疗和/或改善增殖性病症的治疗剂，所述增殖性病症包括但不限于动脉粥样硬化、黄斑变性、纤维化、癌症和PDGF和/或VEGF牵涉其中的其它病症。在一些实施方案中，本公开涉及能够同时或以相互排除的方式结合VEGF和PDGF并可用作治疗剂的适体构建体。
背景
以下描述提供信息总结，并且不承认任何提供的信息或本文参考的公开是对本公开可用的现有技术。
血小板源性生长因子(PDGF-A、-B、-C和-D)是许多结缔组织细胞普遍存在的有丝分裂原和趋化因子(Fredriksson,L.等人,(2004)Cytokine Growth Factor Rev.15(4):197)。PDGF以二硫化物-连接的二聚体的形式出现，并含有通过结合至细胞表面的PDGF受体α和β起作用的半胱氨酸结折叠生长因子结构域(Claesson-Welsh,L.等人,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 86:4917)。PDGF结合包括受体二聚化，这导致细胞内酪氨酸残基处的自磷酸化(Claesson-Welsh,J.(1994)Biol.Chem.269:32023)。PDGF-BB参与了几种增殖性病症，包括动脉粥样硬化、纤维化、黄斑变性和癌症(A.等人,(2001)Adv.Cancer Res.80:1；Appelmann,I.等人,(2010)Recent Results Cancer Res.180:51；Trojanowska,M.等人,(2008)Rheumatology(Oxford)47(增刊5):2；Rutherford等人(1997)Atherosclerosis 130:45；Smits等人(1992)Am.J.Pathol.140:639；Heldin等人(1991)Endocrinology  129:2187；Floege和Johnson(1995)Miner.Electrolyte Metab.21:271；Raines等人(1990)Experimental Pharmacology,Peptide Growth Factors and Their Receptors,Sporn&Roberts,第173-262页,Springer,Heidelberg.)。
VEGF是一种选择性刺激内皮细胞增殖、迁移并产生基质降解酶的分泌性二硫化物-连接的同源二聚体，所有这些是新血管形成所需的过程(Conn,G.等人,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1323；Ferrara,N.等人(1989)Biochem.Biophys.Res.Commun.161:851；Gospodarowicz,D.等人,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:7311；Pepper,M.S.等人,(1991)Biochem.Biophys.Res.Commun.181:902；Unemori,E.N.等人,(1992)J.Cell.Physiol.153:557)。除了为唯一已知的内皮细胞-特异性促分裂原之外，VEGF在血管生成生长因子之中的独特性在于其诱导大分子血管通透性瞬间增加的能力(Dvorak,H.F.等人,(1979)J.Immunol.122:166；Senger,D.R.等人,(1983)Science219:983；Senger,D.R.等人,(1986)Cancer Res.46:5629)。增加的血管通透性和所导致的血浆蛋白在血管外空间的沉积，通过为内皮细胞迁移提供临时基质而促进新血管形成。高通透性的确是新血管的性能特点(Dvorak,H.F.等人,(1995)Am.J.Pathol.146:1029)。此外，由组织缺氧诱导的补偿性血管生成还由VEGF介导(Levy,A.P.等人,(1996)J.Biol.Chem.271:2746；Shweiki,D.等人,(1991)Nature 359:843)。将VEGF鉴定为缺氧诱导蛋白连同缺氧导致VEGF表达受抑制的辅助观察，提供了将氧需求与血管供应匹配的动人机制(Benjamin,L.E.等人,(1999)J.Clin.Invest.103:159；Alon,T.等人,(1995)Nat.Med.1:1024)。
VEGF蛋白的几种亚型由编码VEGF的基因的八个外显子的可变剪接所产生(Eming,S.A.等人,(2006)J.Invest.Dermatol.Symp.Proc.11:79)。最常见的亚型是VEGF-121、VEGF-165和VEGF-189。VEGF的蛋白水解过程可产生额外的亚型。可通过在Arg-110和Ala-111之间用纤溶酶切割VEGF-165以产生VEGF-110，其在功能上等效于VEGF-121(Keyt,B.A.等人,(1996)J.Biol.Chem.271:7788)。可用尿激酶在外显子6结构域内切割VEGF-189，并然后可用纤溶酶进 一步切割以产生VEGF-110(J.等人,(1997)J.Biol.Chem.272:13390)。此外，一个亚组的基质金属蛋白酶(MMP)(包括MMP-3、-7、-9和-19)能够以连续的步骤切割VEGF-165和VEGF-189来产生在功能上等效于VEGF-110的VEGF-113。因此，在给定组织中，VEGF的基质-结合相对丰度和可扩散性通过发生于组织细胞中的可变剪接和蛋白水解过程的结合而确定(Ferrara,N.等人,(2006)Retina26:859)。
年龄相关性黄斑变性(AMD)仍然是超过55岁的人失明的主要原因。该疾病的特征在于在黄斑(具有最高密度的感光器并参与中央视觉的视网膜部分)中形成了被称为璃膜疣的不溶性沉积物。在AMD的起始阶段，沉积物是无血管的，并且所述疾病一般进展缓慢。然而，在约10％的患者中，这种所谓“干”式AMD变为血管化并转变为“湿”式AMD，在此期间所述疾病变得更为进行性并且视力以较快的速率恶化。在许多情况下，在两年之内，中央视觉的模糊不清进展为实质失明。在该疾病的晚期，渗出性或湿性AMD，新血管从脉络膜血管层渗透至视网膜的中央部位(黄斑)，封闭了中央视觉。在美国，湿性AMD在约1,800,000人中流行，并且有望在2020年增加至接近3,000,000。在美国，湿性AMD的发病率为每年约210,000人。
最近，已经通过直接注射结合至VEGF的高亲和性拮抗剂至眼部，预防VEGF与内皮细胞上的其细胞表面受体的相互作用，从而阻断VEGF-介导对血管生成和血管泄露的诱导治疗了AMD。
存在VEGF和PDGF-B信号传导的双重抑制导致更有效阻断血管生成以及新血管消退的大量证据。例如，临床证据表明VEGF和PDGF-B的双重抑制可在AMD患者中实现对眼部血管生成的更完全抑制。最初发现于NeXstar Pharmaceuticals(Green,L.S.等人,(1996)Biochemistry35:14413；美国专利号6,207,816；美国专利号5,731,144；美国专利号5,731,424；和美国专利号6,124,449)的PDGF-B的适体抑制剂(E10030)，正在由Ophthotech公司开发用于AMD治疗。E10030()是一种基于DNA的经修饰的适体，其结合至PDGF-AB或PDGF-BB且K_d为大约100pM，并且在体外和体内抑制PDGF-B的 功能。
在1期研究中，用测试的E10030进行的抗-PDGF疗法联合抗-VEGF疗法可导致12周治疗之后59％经治疗患者的视力提高三行。与历史上用Lucentis单独进行的治疗所观察到的34-40％相比，这是视敏度改进的患者的相当较高的比率。此外，在所有研究参与者中，联合治疗伴随有显著的新血管消退。对449名患有湿性AMD的患者的2期研究最近确证使用联合治疗使功效增强。与接受Lucentis单疗法(p＝0.019)的患者获得的6.5个字母相比，接受联合的Fovista(1.5mg)和Lucentis的患者在24周获得平均10.6个字母的视觉，这代表了62％额外的视敏度益处。
概要
本公开提供结合至血小板源性生长因子B(PDGF-B，包括PDGF-BB和PDGF-AB)的适体，结合血管内皮生长因子(VEGF，包括VEGF-121和VEGF-165)的适体，以及包含结合PDGF-B的适体和结合VEGF的适体的适体构建体。公开的适体和适体构建体可用作预防、治疗和/或改善包括但不限于动脉粥样硬化、黄斑变性、纤维化、糖尿病性视网膜病变和癌症的增殖性疾病或病状和/或PDGF和/或VEGF牵涉其中的其它疾病或病状的治疗剂。在各种实施方案中，适体构建体能够单独结合VEGF和PDGF-B的每一个，和/或同时结合VEGF和PDGF-B。包括了包含PDGF适体、VEGF适体或VEGF/PDGF-B适体构建体或者上述任一者的药学上可接受的盐，以及至少一种药学上可接受的载体的的药物组合物或制剂。可以任何适合的药学上可接受的剂型制备此类组合物。
在另一方面，本公开提供用于预防、治疗和/或改善由PDGF和/或VEGF介导的疾病或病状的方法。在一些实施方案中，方法包括向诸如哺乳动物的受试者施用PDGF适体、VEGF适体和/或VEGF/PDGF-B适体构建体或者包含这些物质的任一个的药物组合物。在一些实施方案中，所述受试者是人。具体来讲，提供了用于治疗、预防和/或改善纤维化、动脉粥样硬化、黄斑变性、糖尿病性视 网膜病变和/或癌症的方法。在一些实施方案中，由PDGF和/或VEGF介导的疾病或病状是一种其中PDGF和/或VEGF活性可直接或间接有助于所述疾病或病状的疾病或病状。此类疾病或病状包括但不限于纤维化、动脉粥样硬化、黄斑变性、糖尿病性视网膜病变和癌症。在一些实施方案中，待治疗、预防和/或改善的疾病或病状是年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性视网膜病变或其它眼部疾病，诸如青光眼、慢性干眼、AIDS-相关的视力减退、弱视、偏盲、视网膜静脉闭塞、沙眼、圆锥角膜、脉络膜视网膜炎症、中心性浆液性视网膜病、葡萄膜炎、视网膜炎、高血压性视网膜病变、视网膜营养不良症等。在一些实施方案中，待治疗、预防和/或改善的疾病或病状是肾纤维化或肾癌症。
在一些实施方案中，本文公开的适体和适体构建体在从生物标志物发现和诊断(Ostroff,R.M.等人,(2010)PLoS One 5:e15003；Mehan,M.等人,(2012)PLoS One 7:e35157)到组织化学和成像(Gupta,S.等人,(2011)Appl.Immunohistochem.Mol.Morphol.19:273)的范围内有潜在的应用。
在一些实施方案中，疗效(如，治疗、预防和/或改善纤维化、动脉粥样硬化、黄斑变性或癌症等)可通过施用PDGF适体、VEGF适体和/或PDGF/VEGF适体构建体来使得适体或适体构建体暴露于并可结合至PDGF和/或VEGF来实现。在一些实施方案中，无论递送适体至正在治疗的受试者的方法如何，此类结合都发生。在一些实施方案中，疗效可通过施用PDGF适体、VEGF适体或PDGF/VEGF适体构建体，使得其暴露于和结合至PDGF和/或VEGF并预防或减少PDGF和/或VEGF与一种或多种细胞受体的结合来实现。
在一些实施方案中，PDGF适体与PDGF-BB或PDGF-AB的结合干扰了PDGF-BB或PDGF-AB与PDGF-α受体的结合。在一些实施方案中，PDGF适体与PDGF-BB或PDGF-AB的结合干扰了PDGF-BB或PDGF-AB与PDGF-β受体的结合。在一些实施方案中，PDGF-BB或PDGF-AB的PDGF适体减少了PDGF受体(诸如PDGF-α受体和/或PDGF-β受体)的磷酸化。
在一些实施方案中，VEGF适体与VEGF-121、VEGF-110、VEGF-165、VEGF-189或VEGF的另一种可变剪接或功能活性的蛋白水解片段的结合干扰了生长因子与VEGFR-1(Flt-1)的结合。在一些实施方案中，VEGF适体与VEGF-121、VEGF-110、VEGF-165、VEGF-189或VEGF的另一种可变剪接或功能活性的蛋白水解片段的结合干扰了生长因子与VEGFR-2(KDR)的结合。在一些实施方案中，VEGF适体减少了VEGF受体(诸如VEGF-1受体和/或VEGF-1受体)的磷酸化。
在一些实施方案中，PDGF/VEGF适体构建体降低了PDGF受体(诸如PDGF-α受体和/或PDGF-β受体)的磷酸化水平并降低了VEGF受体(诸如VEGFR-1和/或VEGFR-2)的磷酸化水平。在一些实施方案中，PDGF适体、VEGF适体或PDGF/VEGF适体构建体减少了沿PDGF受体和/或VEGF受体的信号传导通路的信号传导。
在一些实施方案中，将PDGF适体、VEGF适体或PDGF/VEGF适体构建体与一种或多种额外的活性剂一起施用。此类施用可为连续或联合的。
在一些实施方案中，体外诊断方法包括使PDGF适体与疑似包含PDGF的样品接触。在一些实施方案中，体内诊断方法包括向疑似患有PDGF-介导的疾病或病症的个体施用适当标记的PDGF适体，其中检测所述标记的PDGF适体以诊断或评估个体的健康状况。可根据待使用的成像方式选择使用的标记。
在一些实施方案中，体外诊断方法包括使VEGF适体与疑似包含VEGF的样品接触。在一些实施方案中，体内诊断方法包括向疑似患有VEGF-介导的疾病或病症的个体使用适当标记的VEGF适体，其中检测所述标记的VEGF适体以诊断或评估个体的健康状况。可根据待使用的成像方式选择使用的标记。
在一些实施方案中，体外诊断方法包括使PDGF/VEGF适体构建体与疑似包含PDGF和/或VEGF的样品接触。在另一方面，本公开提供体内诊断方法以诊断或评估个体的健康状况，所述方法包括获得适当标记的PDGF/VEGF适体构建体、向疑似患有PDGF/VEGF-介导 的疾病或病症的个体注射标记的PDGF/VEGF适体构建体和检测标记的PDGF/VEGF适体构建体。可根据待使用的成像方式选择使用的标记。
在一些实施方案中，本发明提供包含PDGF适体和VEGF适体的适体构建体。
在一些实施方案中，本公开提供以和的分辨率解析的两个离散共晶结构，每个含有两个拷贝的结合至PDGF-BB的适体。
在一些实施方案中，本公开提供主要通过疏水相互作用有效结合至蛋白的适体。
在一些实施方案中，本公开提供适体-蛋白复合物，其中所述适体基本上通过疏水相互作用结合至蛋白。
在一些实施方案中，本公开提供能够与蛋白靶形成共晶复合物的适体，其中所述复合物包含少于7个氢键。
在一些实施方案中，本公开提供能够与蛋白靶形成共晶复合物的适体，其中所述复合物包含涉及16个或更少核苷酸的假结结构域。
在一些实施方案中，本公开提供能够结合蛋白靶的适体，其中所述适体结合至蛋白靶且极性接触为每的界面面积小于或等于1，其中所述极性接触包括一个活多个氢键和一种或多种电荷-电荷间的相互作用，并且其中所述界面面积是由适体占据的蛋白表面积的部分。
附图简述
图1显示了(A)三解离速率修饰的适体和适体E10030的K_d值的测定；(B)由本文描述的三个PDGF适体和乱序重排寡核苷酸抑制PDGFRβ的PDGF-BB-刺激的磷酸化；(C)经修饰的适体对比亲本适体4149-8_130的K_d比率，其中相对于亲本适体，特定的Bn-dU核碱基已被另一种修饰的dU核碱基所替代(值为1表明修饰的适体与母本一样能较好地抑制PDGFRβ的磷酸化，而值>1表明与母本相比，修饰的适体具有较少的潜在抑制活性)。
图2显示了(A)适体4149-8_260分子内接触和适体-PDGF接触的 表格；(B)非极性分子内和适体-PDGF接触的代表；和(C)极性分子内和适体-PDGF接触的代表；如在实施例2中所述。疏水性(非极性)相互作用包括π-π相互作用(面对面和边对面芳族相互作用)和范德华接触(vW)。如图B和C所示，极性相互作用包括氢键(虚线)和电荷-电荷相互作用(实线。某些适体残基(如，dC4、dG6、dA9、dC10、dC12、dG13、dC14、dG15、dG22、dC23和2'-O-甲基G24)参与规范的碱基配对和碱基堆积，并且挤出2'-O-甲基A11。
图3显示了(A)如由454焦磷酸测序和每个位置处的核苷酸频率以及六个克隆的序列所确定的来自SELEX库的一组克隆的共有序列；和(B)基于亲本适体4149-8的修饰的适体的K_d值，所述亲本适体如实施例1所示、所述来修饰。
图4说明了如实施例2所述的PDGF-BB:4149-8_260复合物的某些立体观。
图5显示了(A)在存在或不存在200nM tRNA的情况下，不同PDGF二聚体亚型的各种适体的结合亲和性；和(B)成熟形式的PDGF-A、-B、-C和-D的氨基酸序列的比对；如实施例3所描述。粗体显示的PDGF-A的氨基酸残基参与前肽结合，并且粗体显示的PDGF-B的氨基酸残基参与PDGFRβ结合(Shim等人,(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 107(25):11307)。框阴影表明参与适体4149-8_260结合至PDGF-B链1(深阴影)和PDGF-B链2(浅阴影)的残基。
图6显示(A)通过用三碳C-3接头取代适体4149-8_38(SED ID NO:38)中每个指出的位置制备的经修饰的适体的K_d比率，和PDGF-BB结合、PDGF-AB结合的K_d值，以及五个基于亲本适体4149-8的经修饰的适体的细胞IC₅₀；和(B)基于亲本适体4149-8_130(SEQ ID NO:130)的修饰的适体的K_d比率，其中相对于亲本适体，特定的Bn-dU核碱基已被另一种修饰的dU核碱基所替代(数<1表明修饰的适体具有比母本适体更佳的亲和性，而数>1表明修饰的适体具有比母本适体更低的亲和性)；如实施例1所描述。
图7显示了(A)结合至适体4149-8_260(SEQ ID NO:211)的 PDGF-BB同源二聚体的连续剖面图；和(B)当结合至PDGF-B亚单位时，适体构象的示意图和结构示意图；如实施例2所描述。根据Leontis和Westhof命名法，对非规范碱基对编号(Leontis N.B.等人(2003)Curr.Opin.Struct.Biol.13(3):300)。深灰色＝PDGF-B链1；浅灰色＝PDGF-B链2；Bn＝Bn-dU，Pe＝Pe-dU，Th＝Th-dU。
图8A-L说明了来自PDGF-BB:4149-8_260适体复合物的晶体结构的PDGF适体的某些结构特征，如实施例2所描述。图8A说明适体结构，显示了结构域、碱基配对和堆积相互作用。小结的茎显著源自由于明显弯曲和螺旋角度以及螺旋欠旋所致的B型DNA。Bn20是通过与U8堆积与5’茎相互作用的铰链。图8B说明茎1(S1)的端视图。图8C说明了S1和L2的侧视图。经修饰的核苷酸与来自5’茎的Bn2、Bn7和Bn8(其与来自小结的Bn16、Pe17、Th18和Bn20相互作用)形成了疏水簇。Bn8与Bn16和Bn20有边对面π-π相互作用。非规范dU-dU碱基对使用与Bn20的酰胺接头的H-键合。图8D说明了Pe-dU17和Bn-dU20之间的非规范碱基对的细节。图8E说明稳定小结S1的碱基的芳族相互作用。图8F说明在S1和L2核苷酸中的C10-G15沃森-克里克对与A21形成的碱基三体。该碱基三体的Leontis-Westhof分类是顺式沃森-克里克/沃森-克里克、反式糖边/Hoogsteen(Leontis N.B.等人(2003)Curr.Opin.Struct.Biol.13:300)。碱基三体并非平面的，因为在A21和G15之间存在34°的螺旋桨状扭曲角度，以及在沃森-克里克碱基对之间相当弯曲和螺旋桨状扭曲(表5)。图8G说明了残基mA11，即L1和主链转弯中的单个挤出碱基的。图8H说明了S2的轴视图。图8I说明了5’茎基序的轴视图，其强调了显著偏离B型DNA。总体C1’-C1’螺旋参数表明dU-dU对过度扭曲(40°)，从而导致主链中～124°的弯曲，其使Bn-dU1和Bn-dU2之间变平至近乎线性(～172°)。Bn-dU7-Bn-dU8之间显著的径向位移和Bn-dU2-dA3之间近零位移导致碱基2-4和6-7之间更佳的堆积重叠。图8J说明了Bn-dU2和Bn-dU8之间的非规范碱基对。图8K说明了由经修饰的核苷酸形成的结构域内连接。图8L说明了与Bn16和Bn20形成边对面π-π相互作用的Bn8，所述π-π相互作用限定了结构域内 接合处的拓扑结构。用iB-dU(SEQ ID NO:255)取代在适体4149-8_260(SEQ ID NO:211)的位置8处的Bn-dU的有害影响在图8M和图8N中显示的空间填充图片中较为明显。Bn8(8M)能够与相邻的芳族基团进行能量有利的π-π相互作用，并使得SOMAmer包装得更紧。相反，iB8(8N)不是芳族的，并因此缺乏与相邻芳族基团进行π-堆积相互作用的能力。此外，iB基团并非如此大并且在疏水簇中间留下了一个洞。
图9说明了如实施例2所描述的某些蛋白-适体相互作用。在图9A中，Bn-dU1占据了同源二聚体界面处盐桥下的一个袋。U1碱基使得氢键在Val39处连接到蛋白主链，而苄基环被夹在Arg 56的脂肪族侧链和Cys43-Cys52的二硫键之间。在图9B中，Bn2与Trp40具有沿边的相互作用，并且安置在Asn55和Leu38的亚甲基侧链之间。图9C说明了Bn7的芳族环折起对着Asn54和Asn55侧链脂肪族部分。图9D说明了Leu38和Ile75侧链针对Bn-dU8的苄基环呈现了疏水表面以接触蛋白。图9E说明了Bn16与Trp40具有边对面π-堆积，并与Arg73的脂肪族区域具有范德华接触。图9F说明了Pe17被Leu38、Trp40、Arg73和Ile75的疏水性侧链所围绕。Arg73与Pe-dU17的酰胺接头有氢键，和与适体主链进行电荷-电荷相互作用。图9G说明了Th18被Arg73、Ile75和Phe84的疏水性侧链环绕。图9H说明了蛋白和适体之间的堆积相互作用呈现于Pro82和Bn20及U8之间，并且Phe84与U20进行边对面接触。Bn20与Ile77和Lys80进行额外的疏水性接触。
图10显示了传统适体的六种共晶结构(PDB ID:vWF，3HXO；凝血酶，3QLP；GlnRs tRNA，1EXD；人IgG，3AGV；MS2外壳蛋白，6MSF；NF-kB，1OOA)，分析其的极性接触(氢键+电荷-电荷相互作用)的数量和接触表面面积。将所述结果对比针对这些六种适体-靶复合物(深灰色条)和三种SOMAmer(浅灰色条)(包括PDGF-SL5(4149-8_260)复合物和两种未公开的SOMAmer-靶结构)报道的结合亲和性作图。通过线性回归分析六种传统适体的极性接触数量和接触表面积之间的关系，并且99％的置信区间由图底部的灰色阴 影表明。图10B说明了如由Pe-dU17和Th-dU18展现的PDGF-SOMAmer复合物的形状互补性。左边，PDGF链1显示为深灰色表面，Pe-dU17和Th-dU18显示为空间填充表示。右边，与左图框相同的视图，除了Pe-dU17显示为条形表示。图10C说明了Bn-dU1与PDGF相互作用的细节，其中PDGF链1显示为深灰色表面、PDGF链2显示为浅灰色表面和Bn-dU1显示为空间空间填充表示。
图11显示了SL5和PDGFRβ结合至PDGF-BB的比较。(A)受体共晶显示了PDGF同源二聚体(链1，中度灰色；链2，浅灰色)和颜色为深灰色的受体胞外结构域(参见Shim,A.H.等人,(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 107(25):11307)。(B)PDGF同源二聚体(链1，中度灰色；链2，浅灰色)和SL5(深灰色)的复合物。(C)PDGF-B成熟形式的氨基酸序列。框阴影表明与4149-8_260、PDGFRβ或这两者接触的残基。与4149-8_260有接触但不接触PDGFRβ的PDGF残基加框但无阴影。与PDGFRβ有接触但不接触4149-8_260的PDGF残基加框且具有深灰色阴影。与4149-8_260和PDGFRβ两者都有接触的PDGF残基加框且具有中度灰色阴影。
图12说明可包含至适体(诸如慢解离速率适体)中的某些示例性C-5嘧啶修饰。
图13显示了如实施例4所描述用SOMAmer 4149-8_379(标记为OH-4149-8_379)或5’氨基-接头修饰的SOMAmer 4149-8_379(标记为N-4149-8_379)在Hs27成纤维细胞中抑制PDGF-BB-诱导的PDGF Rβ磷酸化的代表性曲线。
图14显示了如实施例5所描述通过454焦磷酸测序所确定的来自SELEX库的一组PDGF-结合克隆的共有序列，和每个位置处的核苷酸频率。
图15显示了相对于亲本适体基于亲本适体4867-31_143的经修饰的适体的K_d比率，其中特别的Nap-dU核碱基已被另一经修饰的dU核碱基所替代(数量<1表明经修饰的适体的亲和性比母本适体高，和数量>1表明经修饰的适体的亲和性比母本适体低)；如实施例7所描述。
图16显示了如实施例7所描述通过454焦磷酸测序所确定的来自SELEX库的一组VEGF-结合克隆的共有序列，和每个位置处的核苷酸频率。
图17显示了用VEGF-121或VEGF-165和VEGF适体4867-31_43与4867-31_192刺激的人脐静脉内皮细胞中的百分比VEGFR2磷酸化，如实施例9所描述。
图18显示了(A)在Hs27成纤维细胞中用PDGF适体4149-8_379(开环)和PDGF/VEGF适体构建体4149-8_401(闭环)抑制PDGF-诱导的PDGF Rβ磷酸化；和(B)在HUVEC中用VEGF适体4867-31_192(开环)和PDGF/VEGF适体构建体4149-8_401(闭环)抑制VEGF-诱导的VEGF R2磷酸化；如实施例11所描述。
图19显示了在(A)涂覆有VEGF的添加了生物素化PDGF的微量滴定板上，和(B)在涂覆有PDGF的添加了生物素化VEGF的微量滴定板上，通过PDGF/VEGF适体构建体SL1012(20kDaPEG-N-4149-8_401)同时结合PDGF和VEGF，如实施例12所描述。
图20显示了如实施例12所描述在添加了生物素化VEGF的涂覆有PDGF的微量滴定板上通过PDGF/VEGF适体构建体(A)SL1012(20kDa PEG-N-4149-8_401)和(B)SL1013(40kDA PEG-N-4149-8-401)同时结合PDGF和VEGF。
图21显示了如实施例12所描述在(A)添加了生物素化PDGF的涂覆有VEGF的微量滴定板上，和在(B)添加了生物素化VEGF的涂覆有PDGF的微量滴定板上，通过各种PDGF/VEGF适体构建体同时结合PDGF和VEGF。
图22显示了(A)传统适体(菱形)和SOMAmer(环形)的极性接触的数量(定义为氢键和电荷-电荷相互作用的和)对比界面面积的曲线(线性回归拟合的R²＝0.91，斜率为0.016；虚线表示该趋势的99％置信区间，SOMAmer落在那些边界外)，(B)传统适体(菱形)和SOMAmer(环形)的自由能结合对比极性接触的曲线(线性回归拟合的R²＝0.64，斜率为0.073)，和(C)显示六种先前适体-蛋白晶体结构和三种SOMAmer-蛋白晶体结构(包括PDGF-BB:4149-8_260)的各种热 力学性质和接触特征的表，如实施例2所描述。(C)结合至蛋白靶的适体和SOMAmer的相互作用特征(数据参考：(a)Convery等人(1998)Nat.Struct.Biol.5(2):133；(b)Nomura等人(2010)Nucleic Acid Res.38(21):7822；(c)Pagano等人(2008)Biophys.J.94(2):562；(d)Huang等人(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(16):9268；(e)Huang等人(2009)结构17(11):1476；(f)Bullock等人(2000)Nat.Struct.Biol.7(6):497。自由能计算由测量的针对SOMAmer的结合亲和性或使用以下温度的公开的Kd值来确定：MS2、凝血酶、NFkB、vWF和GlnRs，室温(296K)；IgG，298K；SOMAmer，310K。SOMAmer显示了以下趋势：较高的结合亲和性；对于六种适体结合的平均自由能或-ΔG值为11.4±1.3kcal/mol，和对于三种SOMAmer该值为14.3kcal/mol±0.8kcal/mol。在PyMOL中，确定每个配体的内的蛋白接触原子。用PISA(适体)(Krissinel等人(2007)J.Mol.Biol.372(3):774)或PyMOL(SOMAmer)(DeLano(2002)The Pymol Molecular Graphics System,Delano Scientific,San Carlos,CA)进行界面面积计算。在晶体学评估的相互作用的该相对小的数据集中，相较于SOMAmer的0.16±0.04kcal/mol/非氢接触原子，适体以0.21±0.14kcal/mol/非氢接触原子的平均配体效率连接它们的靶。每界面面积的结合自由能也类似，对于适体其平均值为，和对于SOMAmer其平均值为就由表中的值计算出的每极性接触的结合自由能值而言，SOMAmer的(平均为1.75±0.36kcal/mol/极性接触)约为适体的(0.89±0.56kcal/mol/极性接触)两倍。
详述
现在将详细参考本发明的代表性实施方案。尽管将连同列举的实施方案一起描述本发明，将理解本发明并非意在限制于那些实施方案。相反，本发明意在覆盖所有可包括如权利要求所定义的本发明范围内的改变、修饰和等同物。
本领域的技术人员将认识类似于本文描述的那些方法和材料的 许多方法和材料，其可用于本发明的实践中并在本发明实践的范围内。本发明不以任何方式局限于所描述的方法和材料。
除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文描述的那些方法、设备和材料类似或等同的任何方法、设备和材料可用于本发明的实践或测试，但现在描述优选的方法、设备和材料。
本公开中所有公布、公开的专利文件和引用的专利申请表明了本公开所属领域技术人员的水平。本文所有公布、公开的专利文件和引用的专利申请在此通过引用并入，就如同每个单独的公布、公开的专利文件或专利申请特别和各自表明通过引用并入一般。
如本公开所用，包括随附的权利要求书，除非上下文另外明确指定，否则单数形式的“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“该(the)”包括复数指示物，并可与“至少一个/一种”和“一个或多个/一种或多种”互换使用。因此，提及的“适体”包括适体等的混合物。
如本文所用，术语“约”表示数值不显著的修改或改变，使得数值所涉及的物品的基础功能不改变。
如本文所用，术语“包含/包括(comprises)”、“包含/包括(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“含有(contains)”、“含有(containing)”及其任何变体意在涵盖非排他性的包含，使得包括/包含、包括或含有要素或要素列表的工艺、方法、由工艺得到的产品或物质组合物不仅包括那些要素而且还包括未明确列出或此类工艺、方法、由工艺得到的产品或物质组合物固有的其他要素。
如本文所用，术语“核苷酸”是指核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或其修饰形式，以及其类似物。核苷酸包括以下种类，包括嘌呤(如，腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤及它们的衍生物和类似物)以及嘧啶(如，阿糖胞苷、尿嘧啶、胸腺嘧啶及它们的衍生物和类似物)。
如本文所用，“核酸”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用以指代核苷酸的聚合物，并包括DNA、RNA、DNA/RNA杂合体以及这些种类的核酸、寡核苷酸和多核苷酸的修饰，其中包括了各种实体或部分与核苷酸单元在任何位置处的连接。术语“多核苷酸”、“寡核苷 酸”和“核酸”包括双链或单链分子以及三螺旋分子。核酸、寡核苷酸和多核苷酸是比术语适体更宽泛的术语，并因此术语核酸、寡核苷酸和多核苷酸包括为适体的核苷酸的聚合物，但术语核酸、寡核苷酸和多核苷酸并不限于适体。
如本文所用，术语“修饰(modify)”、“修饰的(modified)”、“修饰modification)”及其任何变形，当用于指代寡核苷酸时，意指寡核苷酸的四种组成核苷酸碱基(即，A、G、T/U和C)是天然存在的核苷酸的类似物或酯。在一些实施方案中，修饰的核苷酸赋予寡核苷酸对核酸酶的耐受性。在一些实施方案中，修饰的核苷酸导致适体与蛋白靶的主要疏水相互作用，进而产生高结合效率和稳定共晶复合物。C-5位置处存在取代的嘧啶是经修饰的核苷酸的实例。修饰可包括主链修饰、甲基化、不寻常的碱基配对组合，诸如异碱基(isobases)异胞苷和异胍等。修饰还可包括3'和5'修饰，诸如加帽。其它修饰可包括用类似物取代一种或多种天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰(诸如，例如那些用不带电荷的键进行的修饰(如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨甲酸酯等)和那些用带电荷的键进行的修饰(如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、那些用嵌入剂进行的修饰(如，吖啶、补骨脂素等)、那些含有螯合剂的修饰(如，金属、放射性金属、硼、氧化金属等)、那些含有烷化剂的修饰和那些用经修饰的键进行的修饰(如，α-异头核酸等)。此外，一般存在于核苷酸糖部分上的任何羟基可被膦酸基或磷酸基替代；被标准保护基团保护；或被活化以制备额外的与额外的核苷酸或固体载体的键。5′和3′端OH基可被磷酸化或被胺、约1至约20个碳原子的有机加帽基团部分、在一些实施方案中范围为约10至约80kDa的聚乙二醇(PEG)聚合物、在一些实施方案中范围为约20至约60kDa的PEG聚合物或其它亲水性或疏水性生物聚合物或合成聚合物所取代。在一些实施方案中，修饰是在嘧啶的C-5处的修饰。这些修饰可通过直接在C-5位置处的酰胺键或通过其它类型的键产生。
多核苷酸还可含有本领域通常已知的类似形式的糖类：核糖或脱氧核糖(包括2'-O-甲基核糖、2'-O-烯丙基核糖、2'-氟核糖或2'-叠氮基 核糖)、碳环糖类似物、α-异头碳糖、差向异构糖(诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、非环状类似物和无碱基核苷类似物(诸如甲基核糖核苷)。如上所指出，一个或多个磷酸二酯键可被替代性的连接基团所替代。这些可替代的连接基团包括其中磷酸酯被以下代替的实施方案：P(O)S(“硫代酯”)、P(S)S(“二硫代酯”)、(O)NR₂(“酰胺酯”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH₂(“甲缩醛”)，其中每个R或R'独立地为H或经取代或未取代的烷基(1-20个C)(任选地含有醚(-O-)键)、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。并非多核苷酸中的所有键必须相同。取代类似形式的糖、嘌呤和嘧啶可能在设计成品中是有利的，可替代的主链结构(像聚酰胺主链)也可有利。
如本文所用，术语“核酸酶”是指能够切割寡核苷酸的核苷酸亚单位之间的磷酸二酯键的酶。如本文所用，术语“内切核酸酶”是指在寡核苷酸内部位点处切割磷酸二酯键的酶。如本文所用，术语“外切核酸酶”是指切割连接寡核苷酸的末端核苷酸的磷酸二酯键的酶。生物体液通常含有内切核酸酶和外切核酸酶的混合物。
如本文所用，术语“核酸酶耐受的”和“核酸酶耐受性”是指寡核苷酸作为内切核酸酶或外切核酸酶的底物的能力降低，使得当与此类酶接触时，所述寡核苷酸既不降解也不比由未修饰的核苷酸组成的寡核苷酸降解得更慢。
如本文所用，术语“C-5修饰的嘧啶”是指在C-5位置处具有修饰的嘧啶，包括但不限于那些在图12中说明的部分。C-5修饰的嘧啶的实例包括于美国专利号5,719,273和美国专利号5,945,527中描述的那些。C-5修饰的实例包括脱氧尿苷在C-5位置处的取代，取代基独立选自如下立即说明的基团：苄基羧基酰胺(可替代为苄基氨基羰基)(Bn)、萘基甲基羧基酰胺(可替代为萘基甲基氨基羰基)(Nap)、色氨基羧基酰胺(可替代为色氨基羰基)(Trp)、苯乙基羧基酰胺(可替代为苯乙基氨基羰基)(Pe)、硫代苯甲基羧基酰胺(可替代为硫代苯甲基氨基羰基)(Th)和异丁基羧基酰胺(可替代为异丁基氨基羰基)(iBu)。

C-5修饰的嘧啶的化学修饰还可单独或以任何组合的形式与2'-位置处的糖修饰、环外胺处的修饰和4-硫代尿苷的取代等联合。
代表性的C-5修饰的嘧啶包括：5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-苯乙基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(PedU)、5-(N-硫代苯甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(ThdU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲铵)丙基]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷氯化物、5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-氟尿苷或5-(N-[1-(2,3-二羟丙基)]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷)。
可在寡核苷酸合成之前或之后修饰核苷酸。寡核苷酸中的核苷酸序列可被一种或多种非核苷酸组分打断。可在聚合之后诸如例如通过与任何适合的标记的组分共轭进一步修饰修饰的寡核苷酸。
如本文所用，术语“至少一种嘧啶”当指代核酸的修饰时，是指核酸中的一种、几种或所有嘧啶，表明任何或所有出现的核酸中的C、T或U的任何一种或所有可被修饰或不被修饰。
如本文所用，除非另有说明，否则A、C、G、U和T分别表示dA、dC、dG、dU和dT。
如本文所用，“核酸配体”、“适体”和“克隆”可互换使用以指代对靶分子进行目标行为的非天然存在的核酸。目标作用包括但不限于结合靶、催化地改变靶、与靶以修饰或者改变靶或靶功能活性方式反应，共价连接至靶(如在自杀性抑制剂中)和促进靶和另一种分子之间的反应。在一些实施方案中，所述行为是针对靶分子的特异性结合亲和性，此类靶分子是三维化学结构而不是通过独立于沃森/克里克(Watson/Crick)碱基配对或三螺旋形成的机制结合至核酸配体的多核苷酸，其中所述适体并不是具有已知由靶分子结合的生理作用的核酸。给定靶的适体包括通过以下方法从核酸候选混合物鉴定的核酸，其中所述适体是所述靶的配体，所述方法包括：(a)使候选混合物与靶接触，其中对靶亲和性增加的核酸相对于候选混合物中的其它核酸可从候选混合物的剩余部分中区分出；(b)将亲和性增加的核酸从候选混合物的剩余部分中区分出；和(c)扩增亲和性增加的核酸以产生富含配体的核酸混合物，由此鉴定靶分子的适体。亲和性相互作用被认为是程度问题；然而，在本文的上下文中，适体对其靶的“特异性结合亲和性”意指适体一般以比其结合至混合物或样品中的其它非靶组分高得多的亲和性结合至其靶。“适体”或“核酸配体”是具有特定核苷酸序列的一种类型或种类的核酸分子的一组拷贝。适体可包括任何适合数量的核苷酸。“适体”是指多于一个组的此类分子。不同的适体可具有相同或不同数量的核苷酸。适体可为DNA或RNA，并可为单链、双链或含有双链区或三链区。
如本文所用，“SOMAmer”或解离速率慢的修饰的适体是指解离速率(t_1/2)≥30分钟、≥60分钟、≥90分钟、≥120分钟、≥150分钟、≥180分钟、≥210分钟或≥240分钟的适体(包括包含至少一种具有疏水性修饰的核苷酸的适体)。在一些实施方案中，SOMAmer是使用标 题为“Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates”的美国专利号7,947,447中描述的改进的SELEX方法产生的。
如本文所用，“蛋白”可与“肽”、“多肽”或“肽片段”同义地使用。“纯化的”多肽、蛋白、肽或肽片段基本上不含有可从中获得氨基酸序列的细胞物质或者来自细胞、组织或不含细胞的来源的其它污染蛋白，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质。
如本文所用，“共晶结构”或“共晶复合物”是包括两种或多种相互作用的分子的晶体结构。
如本文所用，“心血管病状或疾病”意指与心脏或其血管系统的病状或疾病。此类病状或疾病的一些实例是动脉瘤、咽峡炎、心律失常、动脉粥样硬化、心房颤动、充血性心力衰竭、心肌病、冠状动脉心脏病、再狭窄、缺血、左心室肥大、外周血管疾病、心肌梗塞、高血压、瓣膜性心脏病和限制性心脏病。
如本文所用，“纤维化”意指由器官中的过量和异常量的纤维结缔组织引起，造成结缔组织加厚和结疤，进而导致器官功能失常的疾病或病状。此类疾病和病状的实例是是肺纤维化、肾纤维化、肝纤维化和囊性纤维化。
如本文所用，“AMD”或“年龄相关性黄斑变性”或“黄斑变性”意指由视网膜损害所导致并造成视野中心(被称为黄斑)的视力丧失的眼部的病状。AMD以“湿性”和“干性”发生。在“湿性”AMD中，血管从视网膜后的脉络膜生长。在“干性”AMD中，细胞碎片(玻璃疣)聚集在视网膜和脉络膜之间。在任何一种形式中，视网膜可脱离。
如本文所用，“眼科疾病”或“眼科病状”或“眼部疾病”或“眼部病状”是指任何影响或涉及眼部新血管形成病症的疾病或病状，诸如黄斑变性(“湿性”和“干性”)、早产儿视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、新血管性青光眼、角膜新血管形成、增殖性糖尿病性视网膜病变(糖尿病性视网膜病变的最严重阶段)、葡萄膜炎(眼部的炎性病状，常常导致黄斑水肿)、白内障手术后囊样黄斑水肿、近视性变性(一种病状，其中高度近视眼的患者患有脉络膜性新血管形成)、炎性黄斑变性(一种病状，其中由于感染或其它原因而在黄斑区有炎症的患者患有脉络 膜性新血管形成)和虹膜新血管形成(涉及新血管在虹膜表面生长的糖尿病性视网膜病变或视网膜静脉阻塞的严重并发症)。
如本文所用，“肾疾病”或“肾病状”是指任何影响或涉及肾病症的疾病或病状，诸如肾小球肾炎、系膜增生性肾疾病、多囊性肾疾病、肾癌、急性肾功能衰竭、肾病变、淀粉样变性、水肿、纤维化、肾小球疾病、肾梗死和肾炎。
如本文所用，“癌症”意指涉及失调和异常细胞生长的疾病或病状。常见癌症的一些实例是膀胱癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、结肠和直肠癌、淋巴瘤、子宫内膜癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、前列腺癌、白血病和甲状腺癌。
如本文所用，“调节”意指通过提高或降低肽或多肽的水平来改变，或者通过提高或降低肽或多肽的稳定性或活性来改变。术语“抑制”意指降低肽或多肽的水平，或者降低肽或多肽的稳定性或活性。如本文所描述，调节或抑制的蛋白是PDGF。
如本文所用，术语“生物活性”表明对可影响生理或病理生理过程的一种或多种细胞或胞外过程(如，经由结合、信号传导等)的作用。
如本文所用，术语“血小板源性生长因子”和“PDGF”是指PDGFA、B、C和D亚型以及他们的同源或异源二聚体AA、BB、AB、CC和DD。在一些情况下，上下文将决定意指的是PDGF的哪一种同种型和/或异源二聚体。例如，在一些实施方案中，本文描述的PDGF适体结合至PDGF-B同种型以及包含该同种型的同源二聚体和异源二聚体，尽管所述适体可被描述为结合至PDGF。定义中特别包括了天然存在的人PDGF AA、AB和BB亚型及变体。如本文所用，PDGF包括所有哺乳动物物种的PDGF，所述哺乳动物物种包括人、犬科动物、猫科动物、鼠科动物、灵长类动物、马科动物和牛科动物。非限制性示例性人PDGF-B同种型前体具有显示于Swiss-Prot登记号P01127.1中的序列。非限制性示例性人PDGF-B同种型成熟蛋白可能具有Swiss-Prot登记号P01127.1的氨基酸82至241或82至190(在本文是指PDGF-B的氨基酸1至160或1至109)序列。
如本文所用，“PDGF受体”是指由PDGF结合和激活的受体，诸 如PDGF受体α和PDGF受体β。PDGF受体包括任何哺乳动物物种的受体，所述哺乳动物物种包括但不限于人、犬科动物、猫科动物、鼠科动物、马科动物、灵长类动物和牛科动物。非限制性示例性人PDGFRβ前体具有Swiss-Prot登记号P09619.1中显示的序列。非限制性示例性人PDGFRβ成熟蛋白具有Swiss-Prot登记号P09619.1的氨基酸33至1106的序列。非限制性示例性人PDGFRα前体具有Swiss-Prot登记号P16234.1中显示的序列。非限制性示例性人PDGFRα成熟蛋白具有Swiss-Prot登记号P16234.1的氨基酸24至1089的序列。
“PDGF适体”是能够结合和修饰PDGF活性的适体。在一些实施方案中，PDGF适体在体外抑制PDGF的活性。在一些实施方案中，PDGF适体在体内抑制PDGF的活性。PDGF的非限制性示例性活性是PDGF-介导的PDGF受体(诸如PDGF受体α(PDGF Rα)或PDGF受体β(PDGF Rβ))磷酸化。
在一些实施方案中，如本文所定义的“VEGF适体”是单体、二聚体或多聚体构建体，任选地由接头连接。
如本文所用，术语“血管内皮生长因子”和“VEGF”是指天然存在的VEGF，包括亚型和变体，诸如VEGF-121、VEGF-145、VEGF-165、VEGF-183、VEGF-189和VEGF-206。如本文所用，VEGF包括所有哺乳动物物种的VEGF，所述哺乳动物物种包括人、犬科动物、猫科动物、鼠科动物、灵长类动物、马科动物和牛科动物。非限制性示例性人VEGF前体具有Swiss-Prot登记号P15692.2中显示的序列。VEGF-121描述于如，Tee等人(2001)Biochem.J.359:219；Bornes等人(2004)J.Biol.Chem.279:18717中。
如本文所用，“VEGF受体”是指由VEGF结合和激活的受体，诸如VEGFR-1和VEGFR-2。VEGF受体包括任何哺乳动物物种的受体，所述哺乳动物物种包括但不限于人、犬科动物、猫科动物、鼠科动物、马科动物、灵长类动物和牛科动物。非限制性示例性人VEGFR-1前体具有Swiss-Prot登记号P17948.2中显示的序列。非限制性示例性人VEGFR-1成熟蛋白具有Swiss-Prot登记号P17948.2的氨基酸27至 1338的序列。非限制性示例性人VEGFR-2前体具有Swiss-Prot登记号P35968.2中显示的序列。非限制性示例性人VEGFR-2成熟蛋白具有Swiss-Prot登记号P35968.2的氨基酸20至1356的序列。
“VEGF适体”是能够结合和修饰VEGF活性的适体。在一些实施方案中，VEGF适体在体外抑制VEGF的活性。在一些实施方案中，VEGF适体在体内抑制VEGF的活性。VEGF的非限制性示例性活性包括VEGF-介导的VEGF受体(诸如VEGFR-1或VEGFR-2)磷酸化。在一些实施方案中，提供与适体4867-31_183竞争结合VEGF-121的VEGF适体。
在一些实施方案中，如本文所定义的“VEGF适体”是单体、二聚体或多聚体构建体，任选地由接头连接。
术语“PDGF/VEGF适体构建体”和“VEGF/PDGF适体构建体”可互换使用以指代包含PDGF适体和VEGF适体的构建体。词语“PDGF”和“VEGF”在“PDGF/VEGF适体构建体”和“VEGF/PDGF适体构建体”中的顺序不表明适体如何连接，如，该顺序不表明哪一个适体位于适体构建体的5’-末端位置和哪一个适体位于适体构建体中的3’-末端位置。在一些实施方案中，PDGF/VEGF适体构建体能够同时结合PDGF和VEGF。在一些实施方案中，PDGF/VEGF适体构建体能够分别结合PDGF和VEGF的每一个。在PDGF/VEGF适体构建体中，PDGF适体和VEGF适体可如通过结合对(诸如链霉亲和素和生物素)共价连接或非共价连接。PDGF/VEGF适体构建体可包含PDGF适体和VEGF适体之间的接头。
如本文所用，“由PDGF介导的疾病或病状”是指其中PDGF活性可直接或间接导致所述疾病或病状的疾病或病状。非限制性示例性由PDGF介导的疾病或病状包括心血管疾病，诸如动脉粥样硬化、再狭窄、心脏肥大相关的病状和血管病症；眼科疾病，诸如黄斑变性；纤维化；和癌症。
如本文所用，“由VEGF介导的疾病或病状”是指VEGF活性可直接或间接导致所述疾病或病状的疾病或病状。非限制性示例性由VEGF介导的疾病或病状包括在所述疾病过程中各个阶段的心血管 疾病、自身免疫疾病、炎性风湿性疾病、眼科疾病和癌症。心血管疾病的非限制性实例是动脉粥样硬化、再狭窄、心脏肥大相关的病状和血管病症。眼科疾病的非限制性实例是视网膜炎、黄斑变性、脉络膜炎、视网膜病变、水肿、青光眼和白内障。
如本文所用，术语“药学上可接受的”意指由由美国联邦或州政府的管理机构批准的，或在美国药典或其它公知的药典中列出的，以用于动物更具体地说是人。术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物，并且包括但不限于诸如水和油的无菌液体。
如本文所用，术语PDGF适体、VEGF适体或PDGF/VEGF适体构建体的“药学上可接受的盐”或“盐”是适于向个体施用的含有离子键并通常通过使本公开化合物与酸或碱反应而产生的本公开化合物的产物。药学上可接受的盐可包括但不限于酸加成盐，其包括盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、氢硫酸盐、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐、芳基烷基磺酸盐、乙酸盐、苯甲酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐和酒石酸盐；碱金属阳离子(诸如Li、Na、K)盐、碱土金属盐(诸如Mg或Ca)或有机胺盐。
如本文所用，术语“药物组合物”是适于向个体施用形式的包含PDGF适体、VEGF适体或PDGF/VEGF适体构建体的制剂。通常将药物组合物配制为与其预期施用途径相容。施用途径的实例包括但不限于经口和胃肠外，如静脉内、真皮内、皮下、经吸入、局部用、经皮、经粘膜和经直肠施用。
如本文所用，术语“治疗有效量”一般意指改善如本文所描述的待预防、缓减或治疗的病症或病状的至少一个症状所需的量。短语“治疗有效量”当涉及本公开的PDGF适体、VEGF适体或PDGF/VEGF适体构建体时，其意指为在显著数量的需要此类治疗的个体中施用适体的情况提供特定药理学反应的适体剂量。应强调的是，在特定情况下向特定个体施用的适体的治疗有效量将不常在治疗本文描述的病状/疾病中有效，尽管此类剂量被本领域的技术人员视为治疗有效量。
术语“SELEX”和“SELEX技术”可在本文中互换使用，通常用于 指代(1)选择与靶分子以期望方式相互作用(例如通过以高亲和性与蛋白结合)的核酸与(2)扩增那些选择的核酸的组合。SELEX技术可用于鉴定对特定靶分子有高亲和性的适体。
SELEX一般包括制备核酸的候选混合物、使候选混合物与目标靶分子结合以形成亲和复合物、从未结合的候选核酸分开亲和复合物、从亲和复合物分开和分离核酸、纯化核酸和鉴定特异性适体序列。所述过程可包括多轮以进一步限定选择的适体的亲和性。所述过程可包括过程的一个或多个时间点时的扩增步骤。参见，如标题为“Nucleic Acid Ligands”的美国专利号5,475,096。所述SELEX技术可用于产生共价结合其靶的适体以及非共价连接结合其靶的适体。参见，如标题为“Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment:Chemi-SELEX”的美国专利号5,705,337。
所述SELEX技术可用于鉴定含有经修饰的核苷酸的高亲和性适体，所述经修饰的核苷酸赋予适体改良的特征，诸如例如改良的体内稳定性或改良的递送特征。此类修饰的实例包括在核糖和/或磷酸盐和/或碱基位置处的化学取代。含有经修饰的核苷酸的SELEX技术-鉴定的适体描述于标题为“High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides”的描述含有在嘧啶的C5和/或2'-位置处化学修饰的核苷酸衍生物的寡核苷酸的美国专利号5,660,985中。美国专利号5,580,737，参见同上，描述了含有用2'-氨基(2'-NH₂)、2'-氟(2'-F)和/或2'-O-甲基(2'-OMe)进行的一种或多种核苷酸修饰的高特异性适体。还可参见，标题为“SELEX and PHOTOSELEX”的美国专利公布号20090098549，其描述了具有延伸的物理和化学性质的核酸文库，以及它们在SELEX和photoSELEX中的用途。
SELEX还可用于鉴定具有目标解离速率特征的适体。参见标题为“Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates”的美国专利号7,947,447，其描述了用于产生可结合至靶分子的适体的改良的SELEX方法。描述了用于产生从它们各自靶分子解离速率较慢的适体和光适体的方法。所述方法涉及使候选混合物与靶分子接触，允许核酸-靶复合物的形成发生和进行慢解离速率富集过程，其中具有快 解离速率的核酸-靶复合物解离并不重组，而具有慢解离速率的复合物保持完整。此外，所述方法包括在候选核酸混合物的产生中使用修饰的核苷酸，以产生具有改良的解离速率性能的适体(参见美国专利公布号2009/0098549，标题为“SELEX and PhotoSELEX”)。(还可参见美国专利号7,855,054和美国专利公布号2007/0166740)。这些申请的每一篇通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，提供选择结合至靶分子的适体的方法，所述方法包括(a)制备核酸的候选混合物，其中所述候选混合物包含经修饰的核酸，其中将候选混合物的至少一个或每一个核酸中的至少一种嘧啶在C5-位置处化学修饰；(b)使靶分子与候选混合物接触，其中相对于候选混合物中的其它核酸对靶分子具有增加亲和性的核酸结合所述靶分子，形成核酸-靶分子复合物；(c)从候选混合物的剩余部分中区分出亲和性增加的核酸；和(d)扩增亲和性增加的核酸以产生富集能够以提高的亲和性结合靶分子的核酸序列的核酸混合物，由此鉴定靶分子的适体。在某些事实方案中，所述方法进一步包括进行慢解离速率富集过程。
“靶”或“靶分子”或“靶”在本文中是指核酸可以期望的方式作用的任何化合物。靶分子可为但不限于蛋白、肽、核酸、碳水化合物、脂质、多糖、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、病毒、病原体、毒性物质、物质、代谢产物、过渡态类似物、辅因子、抑制剂、药物、染料、营养物、生长因子、细胞、组织、上述任何一项的任何部分或片段等。几乎任何化学或生物效应子可为适合的靶。任何大小的分子可用作为靶。还可以某种方式修饰靶，以提高靶和核酸之间的相互作用的可能性或强度。靶还可包括具体化合物或分子的任何微小变化，诸如在蛋白的情况下，例如氨基酸序列的微小变化、二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它基本上不改变分子识别的操作或修饰(诸如与标记组分共轭)。“靶分子”或“靶”是能够结合适体的一种类型或种类的分子或多分子结构的一组拷贝。“靶分子”或“靶”是指多于一个此类分子组。其中靶是肽的SELEX技术的实施方案描述于标题为“Modified SELEX Processes Without Purified Protein”的美国专 利号6,376,190中。
示例性PDGF适体
如实施例1所描述，使用改良的鉴定具有慢解离速率的适体的SELEX方法鉴定本公开的PDGF适体，所述方法描述了选择和产生结合PDGF的具有慢解离速率的适体的代表性方法。由苄基-dU(Bn-dU)、dA、dC和dG组成的随机DNA文库用于选择。使用该方法鉴定了命名为适体4149-8_1(SEQ ID NO:1)的PDGF-BB的DNA适体。
使用适体4149-8_1(SEQ ID NO:1)进行了研究鉴别维持针对PDGF的强亲和性所需的最小序列长度。来自5’和3’端的系统性截短使得能够鉴定由29个核苷酸构成的核心基序(4149-8_38；SEQ ID NO.38)。适体4149-8_38展现了结合PDGF-BB的高亲和性(K_d值为20pM；图6)。
对从中选出适体4149-8_1(SEQ ID NO:1)的序列库进行额外的测序研究。454测序(一种使用平行焦磷酸测序的大规模、高通量方法)提供了无偏样品制备和非常精确的序列分析。这些测序数据可用于鉴定如图3所示的PDGF适体的共有序列。此外，图6中说明的核苷酸取代研究导致发现共有序列中八个BndU位置中的六个适宜用于PDGF结合，但四个BndU位置可被dT替代且基本不或不损失结合活性。共有序列显示于图3A，连同核苷酸在每个对应于适体4149-8_1(SEQ ID NO:1)的位置处的频率的图示。
在一些实施方案中，PDGF适体包括以下序列：
5′-NZVSL_nS′V′ZACNN_mGCGZZZAZAGCG-3′(SEQ ID NO：500)，
其中
V选自A、C或G；
V'选自C、G或Z，其中V'与V互补；
S和S’独立选自C或G，其中S和S’彼此互补；
每个N独立选自任何天然存在或修饰的核苷酸；
每个Z独立选自经修饰的嘧啶；
L选自任何天然存在或修饰的核苷酸、烃接头、聚乙二醇接头或其组合；
n是0至20；且m是0至20；并且其中任选地包含一种或多种核苷酸插入。
在一些实施方案中，PDGF适体包括以下序列：5'-ZZVSL_nS'V'ZACNN_mGCGZZZAZAGCG-3'(SEQ ID NO:501)，其中V、V’、N、S、S’、Z、L、n和m如上所定义。
在一些实施方案中，PDGF适体包括以下序列：5'-ZZVCL_nGV'ZACNMGCGZZZAZAGCG-3'(SEQ ID NO:502)，
其中Z、V、V’、N、Z、L和n如上所定义且M选自C和A。
在一些实施方案中，PDGF适体包括以下序列：5'-ZZACL_nGZZACACGCGZZZAZAGCG-3'(SEQ ID NO:503)，其中Z、L和n如上所定义。
在一些实施方案中，PDGF适体包括以下序列：5'-ZZACGACZACGZZACACGCGZZZAZAGCG-3'(SEQ ID NO:504)，其中其中Z如上所定义。
在一些实施方案中，PDGF适体包括以下序列：
5′-ZVSL_nS′V′ZACNN_mGCGZZZAZAG-3′(SEQ ID NO：507)，
其中
V选自A、C或G；
V'选自C、G或Z，其中V'与V互补；
S和S’独立选自C或G，其中S和S’与其它互补；
每个N独立选自经修饰或未修饰的核苷酸；
每个Z独立选自经修饰的嘧啶；
L选自经取代或未取代的C₂-C₂₀接头和经修饰或未修饰的核苷酸；
n是1至50；且m是0至50；并且
其中任选地包含一种或多种核苷酸插入。
在一些实施方案中，PDGF适体包括以下序列：5'-Z'ZVSL_nS'V'ZACNN_mGCGZZZAZAGC-3'(SEQ ID NO:508)，其中 Z'是经修饰的嘧啶或dT；且V、V’、N、S、S’、Z、L、n和m如上所定义。
在一些实施方案中，PDGF适体包括以下序列：5'-Z'ZVCL_nGV'ZACNMGCGZZZAZAGC-3'(SEQ ID NO:509)，
其中Z、Z’、V、V’、N、Z、L和n如上所定义，且M选自C和A。
在一些实施方案中，PDGF适体包括以下序列：5'-Z'ZACL_nGZZACACGCGZZZAZAGC-3'(SEQ ID NO:510)，其中Z、Z'、L和n如上所定义。
在一些实施方案中，PDGF适体包括以下序列：5'-Z'ZACGACZACGZZACACGCGZZZAZAGC-3'(SEQ ID NO:511)，其中Z和Z'如上所定义。
在一些实施方案中，PDGF适体包括以下序列：
5′-ZABL_pGYZABK_qGCGZZYDYAG-3′(SEQ ID NO：505)
其中每个Z独立地为经修饰的嘧啶；
每个B独立选自C和经取代或未取代的C₂-C₁₀接头；
每个L独立选自经取代或未取代的C₂-C₁₀接头、六乙二醇接头和经修饰或未修饰的核苷酸，其中p是1至10；
每个Y独立选自经修饰或未修饰的嘧啶；
每个K独立选自经取代或未取代的C₂-C₁₀接头、六乙二醇接头和经修饰或未修饰的核苷酸，其中q是1至5；且
D选自A和经取代或未取代的C₂-C₁₀接头。
在一些实施方案中，PDGF适体包括以下序列：
5′-XZABL_nGYZABL_nGCGZZYDYAGBE-3′(SEQ ID NO:506)，
其中X选自经修饰或未修饰的嘧啶和经取代或未取代的C₂-C₁₀接头，或者不存在；并且E选自G和经取代或未取代的C₂-C₁₀接头或者不存在。
一种适体构建体，其包含序列NZVS(SEQ ID NO 761)和S'V'ZACNN_mGCGZZZAZAGCG(SEQ ID NO:762)，
其中
V选自A、C或G；V'选自C、G或Z，其中V'选自C、G或Z，其中V'与V互补；
S和S’独立选自C或G，其中S和S’彼此互补；
N独立选自任何天然存在或经修饰的核苷酸；
Z独立选自经修饰的嘧啶；
m是1至20；且
其中任选地包含一种或多种核苷酸插入。
在一些实施方案中，Z是经修饰的尿苷。在一些实施方案中，每个Z独立选自如本文所定义的C-5修饰的嘧啶。在一些实施方案中，每个Z独立选自
5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)，
5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷，
5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-氟尿苷，
5-(N-苯乙基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(PEdU)，
5-(N-硫代苯甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(ThdU)，
5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)，
5-(N-酪氨酰羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TyrdU)，
5-(N-3,4-亚甲基二氧基苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(MBndU)，
5-(N-4-氟苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(FBndU)，
5-(N-3-苯基丙基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(PPdU)，
5-(N-咪唑基乙基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(ImdU)，
5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷，
5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-氟尿苷，
5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)，
5-(N-R-苏氨酰羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(ThrdU)，
5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷，
5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-氟尿苷，
5-(N-[1-(3-三甲铵)丙基]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷氯化物，
5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(NapdU)，
5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷，
5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-氟尿苷，
5-(N-[1-(2,3-二羟丙基)]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷)，
5-(N-2-萘基甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(2NapdU)，
5-(N-2-萘基甲基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷，
5-(N-2-萘基甲基羧基酰胺)-2'-氟尿苷，
5-(N-1-萘基乙基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(NEdU)，
5-(N-1-萘基乙基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷，
5-(N-1-萘基乙基羧基酰胺)-2'-氟尿苷，
5-(N-2-萘基乙基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(2NEdU),
5-(N-2-萘基乙基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷，
5-(N-2-萘基乙基羧基酰胺)-2'-氟尿苷，
5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧基酰胺)-2’-脱氧尿苷(BFdU)，
5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷，
5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧基酰胺)-2’-氟尿苷，
5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧基酰胺)-2’-脱氧尿苷(BTdU)，
5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷,和
5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧基酰胺)-2'-氟尿苷。
在某些实施方案中，PDGF和/或VEGF适体(Y)的部分可不必维持结合，并且相邻的PDGF和/或VEGF适体的某些部分可被修饰，包括但不限于用间隔基或接头部分替换。在这些实施方案中，例如Y可表示为Y'-Q-Y″-Q'-Y"'，其中Y'、Y″和Y'"是PDGF和/或VEGF适体的一部分或者不同PDGF和/或VEGF适体的片段，并且Q和/或Q'是修饰原始PDGF和/或VEGF适体的某些核酸特征的间隔基或接头分子。当Q和Q'不存在时，Y'、Y″和Y'"表示一个连续的PDGF和/或VEGF适体(Y)。
如本文所用，"接头"是一种通过共价键或非共价相互作用而连接两个或多个分子实体，并可允许以保持一种或多种分子实体的功能性质的方式部分分开各个分子实体的分子实体。接头还可被称为间隔基。本领域的技术人员将根据本公开很容易确定适当的接头序列。
如本文所用，接头可包含选自以下的一种或多种分子或亚组分， 其包括但不限于多核苷酸、多肽、肽、核酸、锁核酸、寡糖、多糖、抗体、亲和体、抗体模拟物、脂肪族、芳族或杂芳族碳分子、聚乙二醇(PEG)分子、细胞受体、配体、脂质、这些结构的任何片段或衍生物、上述各项的任何组合，或者任何其它化学结构或组分。
在一些实施方案中，至少一个L是聚乙二醇接头。在一些实施方案中，至少一个L是六乙二醇接头。在一些实施方案中，L是经取代或未取代的C2-C10接头。在一些实施方案中，p是1、2、3、4、5、6、7或8。在一些实施方案中，p是1、2或3。在一些实施方案中，至少一个K是聚乙二醇接头。在一些实施方案中，至少一个K是六乙二醇接头。在一些实施方案中，K是经取代或未取代的C2-C10接头。在一些实施方案中，q是1或2。在一些实施方案中，q是1。
在各种实施方案中，m可为0至20、0至19、0至18、0至17、0至16、0至15、0至15、0至14、0至13、0至12、0至11、0至10、0至9、0至8、0至7、0至6、0至5、0至4或0至3。
在一些实施方案中，L可为接头，诸如18-原子的六乙二醇接头。在一些实施方案中，L可为核苷酸和接头的组合。作为一个非限制性实例，以下适体(SEQ ID NO 67和SEQ ID NO 69)包含六乙二醇(Heg)接头：
(SEQ ID NO.67)5′-Bn-Bn-A-C-Heg-G-Bn-Bn-A-C-X-C-G-C-G-Bn-Bn-Bn-A-Bn-A-G-C-G-3′
(SEQ ID NO.69)5′-Bn-Bn-A-C-G-Heg-C-G-Bn-Bn-A-C-A-C-G-C-G-Bn-Bn-Bn-A-Bn-A-G-C-G-3′
其中Bn是苄基-dU且Heg是六乙二醇接头。
在一些实施方案中，N可替代接头，诸如在以下适体中：
(SEQ ID NO.329)5′-Bn-Bn-A-C-Heg-G-Bn-Bn-A-C-C3-G-C-G-Bn-Bn-Bn-A-Bn-A-G-C-3′
(SEQ ID NO.408)5′-Bn-Bn-A-C-Heg-G-Bn-Bn-A-C-C3-C-G-Bn-Bn-Bn-A-Bn-A-G-3′
其中Bn是苄基-dU、Heg是六乙二醇接头且C3是三碳接头。
如实施例5所描述，使用改良的鉴定具有低解离速率的适体的SELEX方法的鉴定另外的PDGF适体，其描述了用于选择和产生结 合PDGF的具有慢解离速率的适体的代表性方法。由萘基-dU(Nap-dU)、dA、dC和dG组成的随机DNA文库可用于选择。在筛选中鉴定PDGF适体5169-4_26。
在一些实施方案中，提供了特异性结合PDGF的适体，其中所述适体与PDGF适体5169-4_26竞争结合PDGF。在一些此类实施方案中，所述适体包含至少一种经修饰的核苷(包含疏水性核碱基修饰)。此外，在一些此类实施方案中，所述疏水性核碱基修饰是经修饰的嘧啶。在一些实施方案中，每个经修饰的嘧啶可独立选自5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-苯乙基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(PedU)、5-(N-硫代苯甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(ThdU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲铵)丙基]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷氯化物、5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-氟尿苷和5-(N-[1-(2,3-二羟丙基)]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷)。
在一些实施方案中，提供了特异性结合PDGF的适体，其中所述适体包含以下序列：
5′-ACAL_nZGZAZGL_mZLZ-3′(SEQ ID NO.512)；
其中每个Z独立为经修饰的嘧啶；每个L独立选自经取代或未取代的C2-C50接头、聚乙二醇接头和经修饰或未修饰的核苷酸；n是1至5；且m是1至10。
在一些实施方案中，每个独立选自5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-苯乙基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(PedU)、5-(N-硫代苯甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(ThdU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N- 色氨基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲铵)丙基]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷氯化物、5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-氟尿苷和5-(N-[1-(2,3-二羟丙基)]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷)。在一些实施方案中，至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或每个Z是5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(NapdU)。在一些实施方案中，n是1、2、3、4或5。在一些实施方案中，m是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，n是3。在一些实施方案中，m是4。在一些此类实施方案中，每个L独立选自经修饰的核苷酸、未修饰的核苷酸和C3接头。
C2-C50接头或间隔基可为包括2至50碳原子(C2-C50)(饱和、不饱和、直链、支链或环状)、0至10个芳基、0至10个杂芳基以及0至10个杂环基的链的主链，其任选地包含醚(-O-)键(如，一种或多种亚烷基二醇，包括但不限于一个或多个乙二醇单元-O-(CH2CH2O)-；一个或多个1,3-丙二醇单元-O-(CH2CH2CH2O)-等)；胺(-NH-)键；酰胺(-NC(O)-)键；和硫醚(-S-)键；等；其中每个主链碳原子可独立地为未取代的(即，包含–H取代基)或可被一种或多种选自以下的基团取代：C1至C3烷基、-OH、-NH2、-SH、-O-(C1至C6烷基)、-S-(C1至C6烷基)、卤素、-OC(O)(C1至C6烷基)、-NH-(C1至C6烷基)等。在一些实施方案中，C2-C50接头是C2-C20接头、C2-C10接头、C2-C8接头、C2-C6接头、C2-C5接头、C2-C4接头或C3接头，其中每个碳可如上所述独立地被取代。
在一些实施方案中，PDGF适体的一种或多种核苷包含选自以下的修饰：2'-位置糖修饰(诸如2'-氨基(2'-NH2)、2'-氟(2'-F)或2'-O-甲基(2'-OMe))、阿糖胞苷环外胺处的修饰、核苷间键的修饰和5-甲基-阿糖胞苷。在一些实施方案中，PDGF适体包含3'帽、5'帽和/或3'末端的反向脱氧胸苷。
在一些实施方案中，PDGF适体包含至少一个经修饰的核苷间键。在一些实施方案中，至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或至少五个核苷间键是硫代磷酸酯键。
在一些实施方案中，PDGF适体的序列选自表1、2和6至9中显示的序列(SEQ ID NO:1至499和517至545)。在一些实施方案中，PDGF适体的序列选自以小于10nM的亲和性(Kd)结合PDGF的表1显示的序列和表6至9显示的序列。在一些实施方案中，PDGF适体的序列与表1、2和6至9显示的序列(SEQ ID NO:1至1至499和517至545)的同一性为至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。在一些实施方案中，PDGF适体的序列与以小于10nM的亲和性(Kd)结合PDGF的表1显示的序列和表6至9显示的序列的同一性为至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
术语“序列同一性”、“序列百分比同一性”、“百分比同一性”、“％同一的”、“％同一性”及其变形当在两条核酸序列的背景下使用时可互换使用，以指代当为了获得最大对应性与参考核酸比较和比对时，查询核酸或查询核酸的一部分中相同的核苷酸碱基的数目除以(1)5'末端对应的(即，比对的)核苷酸碱基和3'末端对应的(即，比对的)核苷酸碱基之间，和包含5'末端对应的(即，比对的)核苷酸碱基和3'末端对应的(即，比对的)核苷酸碱基的查询序列中的核苷酸碱基的数量，或者(2)参考序列的总长(以更长的时间为准)。为了比较，如可通过Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源算法、Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源比对算法、通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444的相似性搜索方法、通过计算机实施这些算法(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)或目测(一般参见，Ausubel,F.M.等人(1987),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience)，进行序列的示例性比对。
适用于确定百分比序列同一性的算法的一个实例是基于局部比对算法(下文称为“BLAST”)的搜索工具中使用的算法，参见，如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403和Altschul等人 (1997)Nucleic Acids Res.15:3389。用于进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information)(下文的“NCBI”)获得。使用从NCBI获得的软件如BLASTN(用于核苷酸序列)确定序列同一性中所用的默认参数描述于McGinnis等人(2004)Nucleic Acids Res.32:W20中。
如本文所用，当描述核酸的百分比同一性时，诸如其序列与参考核苷酸序列至少有例如约95％的同一性的PDGF适体，预期的是除了核酸序列可包括多达五个点突变/参考核酸序列的每100个核苷酸之外，核酸序列与参考序列相同。换句话说，为了获得其序列与参考核苷酸序列至少有约95％的同一性的目标核酸序列，参考序列中多达5％的核苷酸可被缺失或被另一种核苷酸取代，或者一些数量的核苷酸(多达参考序列核苷酸总数量的5％)可被插入到参考序列(在本文被称为插入)中。参考序列的这些产生目标序列的突变看发生于参考核苷酸序列的5′或3′末端位置处，或者这些末端位置之间的任何地方，或者单独地散布在参考序列的核苷酸之中，或者以一个或多个相邻的组存在在参考序列中。此外，当核苷酸碱基(1)与参考序列中的核苷酸碱基相同时，或(2)源自参考序列中的核苷酸碱基时，或(3)源自相同的核苷酸碱基，所述核苷酸碱基为参考序列中的核苷酸碱基的来源时，为了确定百分比同一性，核苷酸碱基意在被认为“相同”。例如，为了计算百分比同一性，5-甲基阿糖胞苷被认为与阿糖胞苷“相同”。类似地，为了确定百分比同一性，图12中显示的经修饰的尿苷被认为彼此相同。所述参考序列可为SEQ ID NO:1至437中显示的任何一条核苷酸序列。
在一些实施方案中，本公开提供当结合PDGF时调节PDGF功能的PDGF适体。在一些实施方案中，本文描述的PDGF适体抑制PDGF-介导的PDGF受体(诸如PDGF Rα或PDGF Rβ)磷酸化。在一些实施方案中，本文描述的PDGF适体抑制PDGF-介导的PDGF Rβ磷酸化。在各种实施方案中，所述PDGF适体在体内调节PDGF的功能，诸如在体内抑制PDGF-介导的受体磷酸化。在各种实施方案中，所述PDGF适体的序列选自SEQ ID NO:1至437的序列。在各种实施方 案中，所述PDGF适体选自表1和2中显示的适体。在各种实施方案中，所述PDGF适体选自表1中显示的适体。在一些实施方案中，所述PDGF适体包含选自SEQ ID NO:1至1至499和517至545的序列的至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30个连续核苷酸。在一些实施方案中，PDGF适体由至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30个连续核苷酸组成，所述连续的核苷酸的核碱基序列与选自SEQ ID NO:1至1至499和517至545的序列相同。在一些实施方案中，所述PDGF适体包含表1、2、6、7、8或9中显示的适体的至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30个连续核苷酸。在一些实施方案中，所述PDGF适体包含以小于10nM的亲和性(Kd)结合PDGF的表1中显示的适体或表6至9中显示的适体的至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30个连续核苷酸。在一些实施方案中，PDGF适体由表1、2、6、7、8或9中显示的适体的至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30个连续核苷酸组成。在一些实施方案中，PDGF适体由以小于10nM的亲和性(Kd)结合PDGF的表1中显示的适体或表6至9中显示的适体的至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30个连续核苷酸组成。
在一些实施方案中，PDGF适体的核碱基序列选自SEQ ID NO.500至512；761和762的序列。在一些实施方案中，PDGF适体的序列是SEQ ID NO:1至1至499和517至545的任何一个。在一些实施方案中，PDGF适体与SEQ ID NO:1至1至499和517至545的任何一个有至少95％的同一性、至少90％的的同一性、至少85％的的同一性、至少80％的的同一性或至少75％的同一性。在本文的任何一个实施方案中，PDGF适体可在适体的5'端、3'端或者5'和3'两端包含额外的核苷酸或其它化学部分。
所述PDGF适体可含有除了PDGF结合区之外的任何数量的核苷酸。在各种实施方案中，所述PDGF适体可包含多达约100个核苷酸、多达约95个核苷酸、多达约90个核苷酸、多达约85个核苷酸、多达约80个核苷酸、多达约75个核苷酸、多达约70个核苷酸、多达约65个核苷酸、多达约60个核苷酸、多达约55个核苷酸、多达约50个核苷酸、多达约45个核苷酸、多达约40个核苷酸、多达约35个核苷酸、多达约30个核苷酸、多达约25个核苷酸或、多达约20个核苷酸。
在一些实施方案中，所述PDGF适体选自与选自SEQ ID NO:1至1至499和517至545的适体具有类似的结合特征和治疗PDGF相关的动脉粥样硬化、黄斑变性、纤维化或癌症病状能力的适体。在一些实施方案中，PDGF适体与选自表1、2和6至9中显示的适体一样结合至PDGF-B单体(在PDGF-BB或PDGF-AB二聚体的背景下)的相同区域。在一些实施方案中，PDGF适体与选自表1中显示的适体一样结合至PDGF-B单体(在PDGF-BB或PDGF-AB二聚体的背景下)的相同区域。在一些实施方案中，PDGF适体与选自表6中显示的适体一样结合至PDGF-B单体(在PDGF-BB或PDGF-AB二聚体的背景下)的相同区域。在一些实施方案中，PDGF适体与PDGF适体4149-8_260一样结合至PDGF-B单体(在PDGF-BB或PDGF-AB二聚体的背景下)相同的区域。在一些实施方案中，PDGF适体结合至包含PDGF-B氨基酸24至86的PDGF-B区域。在一些此类实施方案中，所述PDGF适体与PDGF适体4149-8_260竞争结合PDGF。在一些 实施方案中，PDGF适体以小于15％、小于14％、小于13％、小于12％、小于11％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％或小于6％的极性接触与蛋白接触原子的比率结合至PDGF-B。极性接触被定义为氢键和电荷-电荷相互作用的和。在一些实施方案中，PDGF适体以极性接触与界面面积的比率小于0.01、小于0.009、小于0.008、小于0.007或小于0.006结合至PDGF-B。在一些实施方案中，PDGF适体与PDGF适体5169-4_26一样结合至PDGF-B单体(在PDGF-BB或PDGF-AB二聚体的背景下)的相同区域。
在一些实施方案中，PDGF适体具有以下特征的任何组合：
(a)结合至PDGF-B中包含PDGF-B氨基酸24至86的区域；
(b)与PDGF适体4149-8_260竞争结合PDGF；
(c)与PDGF适体5169-4_26竞争结合PDGF；
(d)以极性接触与界面面积的比率小于0.01、小于0.009、小于0.008、小于0.007或小于0.006结合至PDGF-B；和/或
(e)以极性接触与蛋白接触原子比率小于15％、小于14％、小于13％、小于12％、小于11％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％或小于6％结合至PDGF-B。
可选择具有任何适合的针对PDGF的解离常数(Kd)的PDGF适体。在一些实施方案中，PDGF适体的针对PDGF的解离常数(Kd)为小于30nM、小于25nM、小于20nM、小于15nM、小于10nM、小于9nM、小于8nM、小于7nM、小于6nM、小于5nM、小于4nM、小于3nM、小于2nM或小于1nM。如下实施例3所描述，可用使用多点滴定和拟合方程y＝(最大–最小)(蛋白)/(Kd+蛋白)+最小的结合测定确定解离常数。在一些实施方案中，PDGF适体是Kd小于或等于表1、2或6至9中任一个中显示的适体的Kd的适体。在一些实施方案中，所述PDGF适体是Kd小于或等于表1或表6中显示的适体的Kd的适体。
适体4149-8_1以1:1的化学计量与PDGF单体结合。因为PDGF形成与其靶受体反应所需的紧密同源二聚体，所以更有效地抑制PDGF活性可通过使用二聚体或其它多聚体形式的适体4149-8_1来 实现。因此，在一些实施方案中，所述PDGF适体是适体4149-8_1、4149-8_379的序列和SEQ ID NO 500至512的任何组合的多聚化。在一些实施方案中，适体构建体包含选自本文描述的PDGF适体的任一个的第一适体和本文描述的PDGF适体的任一个的第二适体，其中所述第一适体和第二适体可相同或不同。PDGF适体构建体的第一适体和第二适体可共价或非共价连接。非限制性示例性键为本领域已知的和/或描述于本文。在一些实施方案中，PDGF适体构建体可能同时能够结合两个PDGF单体。在一些实施方案中，PDGF适体构建体以小于10nM的亲和性(Kd)结合PDGF。
示例性VEGF适体
如实施例7所描述，使用改良的鉴定具有慢解离速率的适体的SELEX方法鉴定本公开的VEGF适体，其描述了用于选择和产生结合具有慢解离速率的VEGF的适体的代表性方法。
我们将来自Nap-dU VEGF-121SELEX实验的克隆截短至29个核苷酸的最小序列。该SOMAmer以高亲和性结合至VEGF-121和VEGF-165(Kd值分别为90pM和20pM)。所述SOMAmer还在体外有效抑制VEGF两种亚型在人脐静脉内皮细胞中诱导VEGFR2磷酸化的能力(参见实施例9)，支持了其结合至并阻断VEGF上的受体-结合结构域的看法。
本公开提供了针对VEGF-121的抑制性适体的第一鉴定。因此，本文的VEGF适体表示VEGF的广谱抑制剂，类似于基于蛋白的药物像贝伐单抗()、雷珠单抗()和阿柏西普()(Papadopoulos等人(2012)Angiogenesis 15:171；Yu等人(2011)Biochem.Biophys.Res.Commun.408:276。因此，本文VEGF适体可比更有效地抑制VEGF信号传导，其为VEGF-165的选择性抑制剂。
来自成功的Nap-dU VEGF-121SELEX实验的截短的克隆提供了29个核苷酸的序列。该适体(或SOMAmer)(4867-31以高亲和性(Kd值分别为90pM和20pM)结合至VEGF-121和VEGF-165。该SOMAmer还在体外有效地在人脐静脉内皮细胞中抑制两种VEGF亚 型诱导VEGFR2磷酸化的能力，支持了其结合至并阻断VEGF上的受体-结合结构域的看法。
适体4867-31_192以1:1的化学计量与VEGF单体结合。因为VEGF形成了与其靶受体反应所需的紧密同源二聚体，所以更有效抑制VEGF活性可通过使用二聚体或其它多聚体形式的适体4867-31_192来实现。因此，在一些实施方案中，所述VEGF适体是适体4867-31_192的序列(SEQ ID NO 513至516)的任何组合的多聚化。在一些实施方案中，适体构建体包含选自本文描述的任何一种VEGF适体的第一适体和包含本文描述的任何一种VEGF适体的第二适体，其中第一适体和第二适体可相同或不同。VEGF适体构建体的第一适体和第二适体可共价或非共价连接。非限制性示例性键为本领域已知和/或描述于本文中。在一些实施方案中，VEGF适体构建体可能能够同时结合两个VEGF单体。在一些实施方案中，VEGF适体构建体以小于10nM的亲和性(Kd)结合VEGF。
在一些实施方案中，VEGF适体以小于10nM的Kd结合VEGF-121。在一些实施方案中，所述VEGF适体包含一种或多种经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述VEGF适体包含一种或多种经修饰(包括疏水性修饰)的核苷酸。在一些实施方案中，所述VEGF适体包含一种或多种经修饰的嘧啶。在一些实施方案中，所述VEGF适体包含一种或多种图12所示的经修饰的嘧啶。在一些实施方案中，所述VEGF适体包含一种或多种图12中组II至V所示的经修饰的嘧啶。在一些实施方案中，所述VEGF适体包含一种或多种图12中组III至V所示的经修饰的嘧啶。在一些实施方案中，所述VEGF适体包含一种或多种图12中组III至IV所示的经修饰的嘧啶。在一些实施方案中，所示VEGF适体包含一个或多个(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(NapdU)。
在一些实施方案中，VEGF适体包含以下序列：
5′-GZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZGG-3′(SEQ ID NO.513)
其中每个Z是经修饰的嘧啶；
Q选自任何经修饰或未修饰的核苷酸和经取代或未取代的 C2-C50接头，或者不存在；
每个E独立选自G和经取代或未取代的C2-C50接头；
D选自A和经取代或未取代的C2-C50接头；且
R选自任何经修饰或未修饰的核苷酸和经取代或未取代的C2-C50接头。
在一些实施方案中，VEGF适体包括选自以下的序列：
5′-CGZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZG-3′(SEQ ID NO.514)；
5′-GZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZGG-3′(SEQ ID NO.513)；
5′-CGZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZGG-3′(SEQ ID NO.515)；和
5′-CCGZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZGG-3′(SEQ ID NO.516)；
其中Z、Q、E、D和R如上所定义。
在一些实施方案中，Z是经修饰的尿苷。在一些实施方案中，每个Z独立选自如本文所定义的C-5修饰的嘧啶。在一些实施方案中，每个Z独立选自：
5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)，
5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷，
5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-氟尿苷，
5-(N-苯乙基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(PEdU)，
5-(N-硫代苯甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(ThdU)，
5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)，
5-(N-酪氨酰羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TyrdU)，
5-(N-3,4-亚甲基二氧基苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(MBndU)，
5-(N-4-氟苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(FBndU)，
5-(N-3-苯基丙基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(PPdU)，
5-(N-咪唑基乙基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(ImdU)，
5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷，
5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-氟尿苷，
5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)，
5-(N-R-苏氨酰羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(ThrdU)，
5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷，
5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-氟尿苷，
5-(N-[1-(3-三甲铵)丙基]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷氯化物，
5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(NapdU)，
5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷，
5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-氟尿苷，
5-(N-[1-(2,3-二羟丙基)]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷)，
5-(N-2-萘基甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(2NapdU)，
5-(N-2-萘基甲基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷，
5-(N-2-萘基甲基羧基酰胺)-2'-氟尿苷，
5-(N-1-萘基乙基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(NEdU)，
5-(N-1-萘基乙基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷，
5-(N-1-萘基乙基羧基酰胺)-2'-氟尿苷，
5-(N-2-萘基乙基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(2NEdU)，
5-(N-2-萘基乙基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷，
5-(N-2-萘基乙基羧基酰胺)-2'-氟尿苷，
5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧基酰胺)-2’-脱氧尿苷(BFdU)，
5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷，
5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧基酰胺)-2’-氟尿苷，
5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧基酰胺)-2’-脱氧尿苷(BTdU)，
5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷，和
5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧基酰胺)-2'-氟尿苷。
在一些实施方案中，每个Z独立选自图12中组II至V所显示的经修饰的嘧啶。在一些实施方案中，每个Z独立选自图12中组III至V所显示的经修饰的嘧啶。在一些实施方案中，至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或至少八个Z为5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(NapdU)。在一些实施方案中，每个Z独立选自图12中组III至IV所显示的经修饰的嘧啶。在一些实施方案中，每个Z是5-(N-萘基甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(NapdU)。
C2-C50接头或间隔基可为包括2至50碳原子(C2-C50)(饱和、不 饱和、直链、支链或环状)、0至10个芳基、0至10个杂芳基以及0至10个杂环基的链的主链，其任选地包含醚(-O-)键(如，一种或多种亚烷基二醇，包括但不限于一个或多个乙二醇单元-O-(CH2CH2O)-；一个或多个1,3-丙二醇单元-O-(CH2CH2CH2O)-等)；胺(-NH-)键；酰胺(-NC(O)-)键；和硫醚(-S-)键；等；其中每个主链碳原子可独立地为未取代的(即，包含–H取代基)或可被一种或多种选自以下的基团取代：C1至C3烷基、-OH、-NH2、-SH、-O-(C1至C6烷基)、-S-(C1至C6烷基)、卤素、-OC(O)(C1至C6烷基)、-NH-(C1至C6烷基)等。在一些实施方案中，C2-C50接头是C2-C20接头、C2-C10接头、C2-C8接头、C2-C6接头、C2-C5接头、C2-C4接头或C3接头，其中每个碳可如上所述独立地被取代。
在一些实施方案中，每个经取代或未取代的C2-C50接头独立选自经取代或未取代的C2-C20接头、经取代或未取代的C2-C10接头、经取代或未取代的C2-C8接头、经取代或未取代的C2-C6接头、经取代或未取代的C2-C5接头、经取代或未取代的C2-C4接头和经取代或未取代的C3接头。在一些实施方案中，每个经取代或未取代的C2-C50接头是经取代或未取代的C2-C10接头。在一些此类实施方案中，每个经取代或未取代的C2-C10接头是经取代或未取代的C2-C8接头、经取代或未取代的C2-C6接头、经取代或未取代的C2-C5接头、经取代或未取代的C2-C4接头或经取代或未取代的C3接头。
在一些实施方案中，VEGF适体的一种或多种核苷包含选自以下的修饰：2'-位置糖修饰(诸如2'-氨基(2'-NH2)、2'-氟(2'-F)或2'-O-甲基(2'-OMe))、阿糖胞苷环外胺处的修饰、核苷间键的修饰和5-甲基-阿糖胞苷。在一些实施方案中，VEGF适体包含3'帽、5'帽和/或3'末端的反向脱氧胸苷。
在一些实施方案中，VEGF适体包含至少一个经修饰的核苷间键。在一些实施方案中，至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或至少五个核苷间键是硫代磷酸酯键。
在一些实施方案中，VEGF适体的序列选自表10至14中显示的序列。在一些实施方案中，VEGF适体的序列选自表10至14中显示 的Kd小于10nM的序列。在一些实施方案中，VEGF适体的序列与表10至14中显示的序列的同一性为至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。在一些实施方案中，VEGF适体的序列与表10至14中显示的Kd小于10nM的序列的同一性为至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。如上所述确定PDGF适体的百分比同一性，除了参考序列是表10至14中显示的VEGF适体序列，诸如Kd小于10nM的序列。
在一些实施方案中，本公开提供当结合VEGF时调节VEGF功能的VEGF适体。在一些实施方案中，VEGF适体抑制VEGF-介导的VEGF受体(诸如VEGFR1或VEGFR2)磷酸化。在一些实施方案中，VEGF适体抑制VEGF-介导的VEGF受体磷酸化。在各种实施方案中，所述VEGF适体在体内调节VEGF功能，诸如在体内抑制VEGF-介导的受体磷酸化。在各种实施方案中，所述VEGF适体的序列选自表10至14中显示的序列。在各种实施方案中，所述VEGF适体选自表10至14中显示的Kd小于10nM的适体。在各种实施方案中，所述VEGF适体选自表10至14中显示的适体。在一些实施方案中，所述VEGF适体包含表10至14中显示的Kd小于10nM的序列的至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30个连续核苷酸。在一些实施方案中，VEGF适体由至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30个连续核苷酸组成，所述连续核苷酸的核碱基序列与表10至14中显示的Kd小于10nM的序列相同。在一些实施方案中，所述VEGF适体包含表10至14中显示的适体的至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少 26、至少27、至少28、至少29或至少30个连续核苷酸。在一些实施方案中，所述VEGF适体包含表10至14中显示的Kd小于10nM的适体的至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30个连续核苷酸。在一些实施方案中，VEGF适体由表10至14中显示的适体的至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30个连续核苷酸组成。在一些实施方案中，VEGF适体由表10至14中显示的Kd小于10nM的适体的至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30个连续核苷酸组成。
在本文中的任何一个实施方案中，VEGF适体可包含适体的5'端、3'端或者5'和3'端两端的额外核苷酸或其它化学部分。
所述VEGF适体可含有除了VEGF结合之外的任何数量的核苷酸。在各种实施方案中，所述VEGF适体包含多达约100个核苷酸、包含多达约95个核苷酸、包含多达约90个核苷酸、包含多达约85个核苷酸、包含多达约80个核苷酸、包含多达约75个核苷酸、包含多达约70个核苷酸、包含多达约65个核苷酸、包含多达约60个核苷酸、包含多达约55个核苷酸、包含多达约50个核苷酸、包含多达约45个核苷酸、包含多达约40个核苷酸、包含多达约35个核苷酸、包含多达约30个核苷酸、包含多达约25个核苷酸或包含多达约20个核苷酸。
在一些实施方案中，所述VEGF适体选自与表10至14中显示的Kd小于10nM的适体具有类似的结合特征和治疗VEGF相关的动脉粥样硬化、黄斑变性、纤维化或癌症病状能力的适体。在一些实施方案中，VEGF适体与选自表10至14中显示的Kd小于10nM的适体一样结合至VEGF-121的相同区域。在一些实施方案中，VEGF适体 与表10、11、12、13或14中显示的Kd小于10nM的VEGF适体一样结合至VEGF-121的相同区域。在一些实施方案中，VEGF适体与VEGF适体4867-31_183结合至VEGF-121的相同区域。
可选择具有任何适合的针对VEGF的解离常数(Kd)的VEGF适体。在一些实施方案中，VEGF适体的针对VEGF-121的解离常数(Kd)为小于30nM、小于25nM、小于20nM、小于15nM、小于10nM、小于9nM、小于8nM、小于7nM、小于6nM、小于5nM、小于4nM、小于3nM、小于2nM或小于1nM。如以下实施例3所描述，可用使用多点滴定和拟合方程y＝(最大–最小)(蛋白)/(Kd+蛋白)+最小的结合测定来确定解离常数。
在一些实施方案中，适体构建体包含选自任何一种本文描述的VEGF适体的第一适体和选自任何一种本文描述的VEGF适体的第二适体，其中第一适体和第二适体可相同或不同。VEGF适体构建体的第一适体和第二适体可共价或非共价连接。非限制性示例性键为本领域已知和/或描述于本文中。在一些实施方案中，VEGF适体构建体可能能够同时结合两个VEGF单体。在一些实施方案中，VEGF适体构建体以小于10nM的亲和性(Kd)结合VEGF。
示例性PDGF/VEGF适体构建体
有大量证据表明，通过VEGF和PDGF-B信号传导通路的联合抑制，可能实现更有效地阻断结合新血管消退的肿瘤相关的血管生成和眼部血管生成(Bergers,G.等人,(2003)J.Clin.Invest.111:1287；Jo,N.等人,(2006)Am.J.Pathol.168:2036)。该作用由破坏内皮细胞之间的紧密的细胞-细胞关联介导，所述内皮细胞形成初始的毛细血管芽和内皮周围细胞(或周细胞)，当内皮周围细胞成熟时环绕新血管，使得血管对VEGF抑制剂更不易感(Benjamin,L.E.等人,(1998)Development 125:1591；Benjamin,L.E.等人,(1999)J.Clin.Invest.103:159)。本文描述的适体可形成此类双重抑制剂的基础。
在一些实施方案中，PDGF/VEGF适体构建体包含与本文描述的任何一种VEGF适体相连的本文描述的任何一种PDGF适体。在一些实施方案中，PDGF/VEGF适体构建体包含与表10至14中显示的Kd 小于10nM的任何一种VEGF适体相连的表1中显示的任何一种PDGF适体。所述键可为共价或非共价的。
所述PDGF/VEGF适体构建体可包含任何取向的PDGF适体和VEGF适体，诸如PDGF适体在其3'端处或附近与VEGF适体的5'端处或附近的一点连接，或者VEGF适体在其3'端处或附近与PDGF适体的5'端处或附近的一点连接，或者任何其它保留构建体的每个适体结合性质的取向。
在一些其中键为共价的实施方案中，所述PDGF/VEGF适体构建体可通过磷酸酯键或硫代磷酸酯键连接。还涵盖了许多其它共价键，诸如通过包括但不限于六乙二醇接头、聚乙二醇接头、经取代或未取代的烃接头等的各种接头部分的键。本领域的技术人员可选择适合的连接PDGF适体与VEGF适体的共价键。
在一些实施方案中，所述PDGF适体和VEGF适体经由非共价键连接。非共价键包括但不限于生物素/链霉亲和素；金属-结合肽/金属；可杂交的经修饰和/或未修饰的寡核苷酸等。本领域的普通技术人员可选择适合的非共价键来连接PDGF适体与VEGF适体。
包含适体和适体构建体的药物组合物
在一些实施方案中，提供包含本文描述的至少一种适体或适体构建体以及至少一种药学上可接受的载体的药物组合物。适合的载体描述于由Lippincott Williams&Wilkins出版的“Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第二十一版”，其通过引用并入本文。包含本文描述的至少一种适体或适体构建体以及至少一种药学上可接受的载体的药物组合物还可包含一种或多种非PDGF或VEGF抑制剂的活性剂。
可以任何药学上可接受剂型使用本文描述的适体，所述剂型包括但不限于注射用剂型、液体分散剂、凝胶剂、气雾剂、软膏剂、霜剂、冻干制剂、干粉剂、片剂、胶囊、控释制剂、速熔制剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲式释放制剂、混合的速释和控释制剂等。具体来讲，可将本文描述的适体配制：(a)以用于施用，所述施用选自经口、经肺、静脉内、动脉内、鞘内、关节内、经直肠、经眼、经结肠、 胃肠外、脑池内、阴道内、腹膜内、局部、经颊部、经鼻和局部施用的任何一种；(b)为选自液体分散剂、凝胶剂、气雾剂、软膏剂、霜剂、片剂、囊剂和胶囊的任何一种的剂型；(c)为选自冻干制剂、干粉剂、速熔制剂、控释制剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲式释放制剂及混合的速释和控释制剂的任何一种的剂型；或(d)其任何组合。
用于胃肠外、真皮内或皮下施加的溶液或混悬液可包含一种或多种以下组分：(1)无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；(2)抗细菌剂，诸如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；(3)抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；(4)螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；(5)缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和(5)用于调节张力的试剂，诸如氯化钠或葡萄糖。可用诸如盐酸或氢氧化钠的酸或碱调节pH。可将胃肠外制剂包入安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶。
适于注射用途的药物组合物可包含无菌水溶液(其中水可溶)或混悬液及用于临时制备无菌注射用溶液或混悬液的无菌粉末。对于静脉内施用，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有的情况下，所述组合物应为无菌，并且应为流体以达到容易注射的程度。所述药物组合物应在制造和贮藏期间稳定，并且应当针对诸如细菌和真菌的微生物污染作用而防腐。如本文所用，术语“适合的”意指保持在适于向受试者施用的状态或情况下。
所述载体可为溶剂或分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其适合的混合物。例如，可通过使用包衣(诸如卵磷脂)、通过在分散体的情况下维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等实现对微生物作用的预防。在许多情况下，可优选地在所述组合物中包含等渗剂，例如，糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨糖醇)或无机盐(诸如氯化钠)。可通过在所述组合物中包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)引起注射用组合物的吸收延长。
通过以下方式制备无菌注射用溶液：将活性剂(如，适体和/或适体构建体)视需求以适当的量连同上文列举的一种成分或成分组合一起掺入适宜的溶剂中，随后过滤消毒。通常，通过将至少一种适体和/或适体构建体插入到含有基础分散介质和任何其它所需成分的无菌媒介物中来制备混悬液。在用于制备无菌注射用溶液的无菌粉末的情况下，示例性制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，所述两者将产生适体和/或适体构建体，外加来自其先前无菌过滤的溶液的任何额外的所需成分的粉末。
在一些实施方案中，配制适体和/或适体构建体以用于玻璃体内注射。适用于玻璃体内施用的制剂描述于如，讨论眼部药物递送，如Rawas-Qalaji等人(2012)Curr.Eye Res.37:345；Bochot等人(2012)J.Control Release 161:628；Yasukawa等人(2011)Recent Pat.Drug Deliv.Formul.5:1；和Doshi等人(2011)Semin.Ophthalmol.26:104中。在一些实施方案中，包含适体和/或适体构建体的药物组合物通过每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每八周一次、每九周一次、每10周一次、每11周一次、每12周一次或少于每12周一次的频率的玻璃体内注射来施用。
口服组合物一般包含惰性稀释剂或可食用的载体。例如，它们可包封在明胶胶囊中或压制为片剂。为了口服治疗剂施用的目的，可将适体和/或适体构建体掺入赋形剂并以片剂、含片或胶囊的形式使用。还可使用流体载体制备口服组合物以用作嗽口水，其中所述流体载体中化合物被经口施加和发出嗖嗖声以及吐出或吞咽。可包含药学上相容结合剂和/或佐剂材料以作为所述组合物的一部分。
为了通过吸入施用，将所述化合物从含有适合推进剂(如诸如二氧化碳的气体)的加压容器或分散器以气溶胶喷雾剂、雾化的液体形式递送，或者从适合的设备喷干粉。对于经粘膜或经皮施用，在制剂中使用适合于待渗透屏障的渗透剂。此类穿透剂通常为本领域已知，并包括例如用于经粘膜施用的洗涤剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜施用可通过使用经鼻喷雾或栓剂来完成。为了经皮施用，将所述 活性试剂配制为如本领域通常所知的软膏剂、油膏剂、凝胶剂或霜剂。所述试剂还可制备为栓剂形式(如，与常规栓剂基质诸如可可脂或其他甘油酯一起)或用于经直肠递送的保留灌肠剂。
在一些实施方案中，用将保护免受身体快速消减的载体制备适体和/或适体构建体。例如，可使用控释制剂，包括植入物和微胶囊化递送系统。可使用生物可降解的生物相容聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类制剂的方法将对本领域的技术人员显而易见。所述材料还可从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals,Inc商购获得。
脂质体混悬液(包括靶向用病毒抗原的单克隆抗体感染的细胞的脂质体)还可用作药学上可接受的载体。这些可根据本领域技术人员已知的方法例如如在美国专利号4,522,811中所描述的那样来制备。
此外，适体和/或适体构建体的混悬液可制备为合适的油性注射混悬液。适合的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油(诸如花生油)或合成脂肪酸酯(诸如油酸乙酯、甘油三酯)或脂质体。非脂质聚阳离子氨基聚合物还可用于递送。混悬液还可任选含有适合的稳定剂或增加化合物溶解度的试剂，从而能制备高度浓缩的溶液。
在一些情况下，以剂量单位形式配制口服或胃肠外组合物可能特别有利于便于施用和剂量均一。如本文所用的剂量单位形式是指适和用作待治疗的受试者的单位剂量的物理上分散的单位；每个单位含有预定量的适体和/或适体构建体，该量计算为与所需的药物载体相结合时产生目标疗效所需的量。本文描述的适体和/或构建体的剂量单位形式的说明书表示为并且直接取决于特定适体的特征和/或适体构建体的特征和待实现的特定疗效以及配混用于治疗个体的此类活性剂领域固有的限制。
包含至少一种适体和/或适体构建体的药物组合物可包含一种或多种药物赋形剂。此类赋形剂的实例包括但不限于结合剂、填充剂、润滑剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂、防腐剂、缓冲剂、湿润剂、崩解剂、泡腾剂和其它赋形剂。此类赋形剂为本领域已知。示例性赋形剂包括：(1)结合剂，其包括各种纤维素和交联聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤 维素(诸如PH101和PH102)、硅化微晶纤维素(ProSolv SMCC^TM)、黄蓍胶和明胶；(2)填充剂，诸如各种淀粉、乳糖、乳糖单水合物和无水乳糖；(3)崩解剂，诸如藻酸、Primogel、玉米淀粉、轻度交联的聚乙烯吡咯烷酮、马铃薯淀粉、玉米淀粉和经修饰的淀粉、交联羧甲纤维素钠、交联聚维酮、羟乙酸淀粉钠及其混合物；(4)润滑剂，包括作用于待压制粉末的流动性的药剂并包括硬脂酸镁、胶态二氧化硅，诸如200、talc、硬脂酸、硬脂酸钙和硅胶；(5)助流剂，诸如胶态二氧化硅；(6)防腐剂，诸如山梨酸钾、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸和其盐、对羟基苯甲酸的其它酯(诸如对羟基苯甲酸丁酯)、醇(诸如乙醇或苄醇)、酚类化合物(诸如苯酚)或季化合物(诸如苯扎氯铵)；(7)稀释剂，诸如药学上可接受的惰性填充剂(诸如微晶纤维素、乳糖)、二碱式磷酸钙、糖和/或任何上述物质的混合物；稀释剂的实例包括微晶纤维素(诸如PH101和PH102)；乳糖，诸如乳糖单水合物、无水乳糖和DCL21；二碱式磷酸钙，诸如；甘露糖醇；淀粉；山梨糖醇；蔗糖；和葡萄糖；(8)甜味剂，包括任何天然或人工甜味剂，诸如蔗糖、糖精蔗糖、木糖醇、糖精钠、环己氨磺酸盐、阿斯巴甜、安赛蜜；(9)调味剂，诸如薄荷、水杨酸甲酯、柑桔调味剂、(MAFCO的商品名)、泡泡糖口味、果味等；和(10)泡腾剂，包括泡腾对，诸如有机酸和碳酸盐或碳酸氢盐。适合的有机酸包括例如柠檬酸和酐及酸盐、酒石酸和酐及酸盐、苹果酸和酐及酸盐、富马酸和酐及酸盐、脂肪酸和酐及酸盐、琥珀酸和酐及酸盐、以及藻酸和酐及酸盐。适合的碳酸盐和碳酸氢盐包括，例如碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸镁、甘氨酸钠碳酸盐、L-赖氨酸碳酸盐和精氨酸碳酸盐。可选地，泡腾对只有碳酸氢钠组分可能存在。
在各种实施方案中，本文描述的制剂大体上是纯的。如本文所用，“大体上纯的”意指活性成分(如，适体和/或适体构建体)是存在的主要种类(即，当按摩尔计算时，其量比组合物中任何其他种类更多)。在一些实施方案中，大体上纯化的部分是组合物，其中所述活性成分包含至少约50％(当按摩尔计算时)的存在的所有大分子种类。通常，大 体上纯的组合物将包含超高约80％的组合物中存在的所有大分子种类。在各种实施方案中，大体上纯的组合物将包含至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的组合物中存在的所有大分子种类。在各种实施方案中，纯化所述活性成分至匀质(通过常规检测方法不能在所述组合物中检出污染物种类)，其中所述组合物基本上由单个大分子物种组成。
包含适体和适体构建体的试剂盒
本公开提供试剂盒包含本文描述的任何适体和/或适体构建体。此类试剂盒可包含例如(1)至少一种适体和/或适体构建体；和(2)至少一种药学上可接受的载体，诸如溶剂或溶液。额外的试剂盒组分可任选地包括，例如：(1)任何一种本文鉴定的药学上可接受赋形剂，诸如稳定剂缓冲剂等，(2)至少一种容器、小瓶或类似的保存和/或混合试剂盒组分的装置；和(3)递送装置。
治疗方法
本公开提供通过使用PDGF适体或适体构建体、VEGF适体或适体构建体和/或VEGF/PDGF适体构建体预防或治疗医学病状(如，减轻其一种或多种症状)的方法。所述方法包括向需要其的受试者施用治疗有效量的此类适体和/或适体构建体。描述的适体还可用于预防性疗法。在一些实施方案中，经口或静脉内施用所述适体和/或适体构建体。
治疗方法中使用的适体和/或适体构建体可为：本文描述的PDGF适体或适体构建体、VEGF适体或适体构建体和/或VEGF/PDGF适体构建体，或者其药学上可接受的盐，或者其前药。
所述个体或受试者可为任何动物(家养、牲畜或野生)，包括但不限于猫、狗、马、猪和牛，并且优选人。如本文所用，术语患者、个体和受试者可互换使用。
如本文所用，“治疗”描述了对患者的管理和护理以治疗疾病、病状或病症，并且包括施用适体和/或适体构建体以预防疾病、病状或病症的症状或并发症发作；以减轻疾病、病状或病症的症状或并发症；或以消除患者中存在的疾病、病状或病症。更具体来讲，“治疗”包括 逆转、减弱、减轻、最小化、抑制或停止疾病(病症)状态、疾病进展、疾病病原体或其它异常情况的至少一种有害症状或影响。只要症状和/或病变改善，治疗通常就持续。
如本文所用，“预防”意指全部或部分预防；改善或控制；较少、减弱或降低；或阻止或停止。
在各种实施方案中，本公开的组合物和方法用于治疗心血管疾病、癌症、纤维化、肾病或眼科疾病。
在一些实施方案中，可将本公开化合物或其药学上可接受盐或前药与其它改善或根除如上所述的疾病情况的治疗联合施用。组合物包括本文公开的适体和/或适体构建体可含有例如多于一种的适体。在一些实施例中，将含有一种或多种适体的组合物与另一种有用的心血管药剂或抗癌剂或抗纤维化剂等联合施用。通常，已知的治疗剂当前可用的剂型将适用于此类组合中。
“联合疗法”(或“共同-疗法”)包括施用适体和/或适体构建体组合物以及至少一种作为特异性治疗方案一部分意在从这些治疗剂的共同作用提供有益作用的第二试剂。联合的有益作用包括但不限于由治疗剂联合所产生的药代动力学或药效动力学共同作用。通常联合施用这些治疗剂在一段限定的时间内进行(根据所选择的组合，通常为数分钟、数小时、数天或数周)。
“联合疗法”可能但通常并不意在涵盖将这些治疗剂的两种或多种作为单独的偶然且任意地产生本公开组合的单一疗法方案的一部分施用。“联合疗法”意在涵盖以连续的方式施用这些治疗剂，即其中在不同时间点施用每种治疗剂，以及以基本上同时的方式施用这些治疗剂或至少两种所述治疗剂。例如，可通过向受试者施用单剂量的具有固定比率的各种治疗剂或多次单剂量的各种治疗剂来完成基本上同时施用。
根据包括以下各种因素选择使用所述适体和/或适体构建体的剂量方案，例如：受试者的类型、人种、年龄、体重、性别和医学病况；待治疗病状的严重程度；施用途径；受试者的肾和肝功能；以及采用的具体适体和/或适体构建体或其盐。普通的有经验的医生或兽医可 以容易地确定缓解、抵抗或停滞病状的进展所需的有效量的组合物并开处方。
通常，剂量(即治疗有效量)范围为每天约1μg至约100mg/正在治疗的受试者体重kg。
实施例
提供以下实施例仅用于说明目的，并不意在限制由随附的权利要求书所限定的本发明的范围。使用本领域的技术人员熟知且常规的标准技术进行本文描述的所有实施例。以下实施例中描述的常规分子生物学技术可按诸如Sambrook等人(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)的标准实验室手册中描述的那样进行。
实施例1.PDGF适体选择和序列
候选混合物的制备：部分随机化的ssDNA寡核苷酸的候选混合物通过与生物素化ssDNA模板退火的DNA引物的聚合酶延伸来制备。
SELEX条件：按照描述(Gold等人(2010)PLoS One 5:e15004)，由SomaLogic Inc从含有其中用Bn-dU取代dT的40-核苷酸随机区的文库中选择PDGF-BB蛋白(R&D System)的适体。正向引物是5'-CGCCCTCGTCCCATCTC，并且反向引物是5'-CGTTCTCGGTTGGTGTTC。将PDGF-BB蛋白生物素化并分配于链霉亲和素MyOne-SA(Dynal)珠粒上。使用动力学攻击(Kinetic challenge)实现解离速率低的适体的优先选择，其中将蛋白-DNA复合物在10mM硫酸葡聚糖的存在下于37℃孵育，且在连续数轮中孵育时间增加并且蛋白浓度降低。动力学攻击在第4轮选择中引发并且持续到最后的第8轮，孵育时间如下：第4轮，5分钟；第5-7轮，15分钟；第8轮，30分钟。
库测序：将来自第8轮的库的寡核苷酸序列克隆，并且对几个克隆测序。这导致相关序列家族(以4149-8_1为例)的测定。
PDGF SELEX库的深度测序：为了更完全评估4149-8_1适体家 族中的序列，使用454焦磷酸测序技术对第8轮库测序。将库DNA用454引物扩增，并且将PCR产物纯化且使用Sequal归一化平板归一化(Invitrogen，目录号A10510-01)。洗出液跑凝胶，以确保每个扩增子的大小和纯度。在位于奥罗拉的科罗拉多大学保健科学中心(University of Colorado Health Science Center in Aurora CO)的454焦磷酸测序设施上对纯化的PCR产物测序。
将所述454序列通过CLUSTAL分析与4149-8_1比对。来自含有10,803条全长序列(即那些含有双向引物序列的序列)且3,839条是独特的库的序列数据集。对这些3,839条独特序列搜索基序“5'-ZACNCGCGZZZAZAGCG”(同一性＝0.65)，然后从其搜索上游“ZZ”(同一性＝1.0)。发现436条序列含有这些基序(即上述两种)。此外，58条其它序列含有第一种样式，但是同一性一般较低且没有显著的上游发夹结构。然后如下比对所述436条序列，(1)就“ZZ”而言，(2)就环的中心而言，和(3)就“ZACNCGCGZZZAZAGCG”而言。对于所有的序列，如图3A中所列出的那样，计算与4149-8_1在各个位置的百分比同一性。表1和2列出了代表4149-8_1适体家族序列的多条序列。
适体合成：通过以下制备用于固相合成的经修饰的脱氧尿苷-5-咪唑羧酰胺亚酰胺试剂：使5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-5-三氟乙氧基羰基-2'-脱氧尿苷(Nomura等人(1997)Nucl.Acids Res.25:2784)与合适的伯胺(RNH₂，1.2当量；Et₃N，3当量；乙腈；60℃；4h)缩合；与2-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(1.2当量；iPr₂EtN，3当量；CH₂Cl₂；-10至0℃；4h)3'-O-亚磷酰化；和通过在中性硅胶上的快速色谱纯化(Still等人,(1978)J.Org.Chem.43:2923)。通过使用亚磷酰胺法的固相合成制备适体(Beaucage和Caruthers(1981)Tetrahedron Lett.22:1859)，对方案进行些许调整以产生本文描述的独特碱基修饰。用10％二氯乙酸于甲苯中45秒完成脱三苯甲基；用于由5-苄基巯基四唑活化的1:1的乙腈：二氯甲烷中的0.1M亚磷酰胺实现偶联，且允许反应3次，持续5分钟；根据仪器供应商的建议，进行加帽和氧化。去保护用1:1:2的叔丁胺：甲醇：水(Mullah 1998)，于37℃反 应24小时来实现。以200nmol的规模合成适体，并按描述使用UV定影法且Costar Spin-X(不包括硅化处理的玻璃棉或纺成的聚丙烯预滤器)和Amicon YM3浓度按照制造商的建议，将所述适体从聚丙烯酰胺凝胶纯化(Fitzwater和Polisky(1996)Methods Enzymol.267:275)。
经修饰的核苷酸构效关系和亲和性成熟：为了检测八个苄基侧链中的每一个对结合的作用，我们通过用经修饰的dU亚磷酰胺的定制文库化学合成5-位置变体，进行了另一系列的系统性点取代。为了此目的，我们设计了一个文库，以通过改变H-键供体和受体的大小、极性、布局，接头长度以及5-位置取代基的取向使我们能够用探针探查每个位置的微环境。在选择官能团用于该分析时，我们目的在于包含在原始修饰的主题下的变异(在这种情况下，为苄基)、抗体的互补决定区(CDR)中过表达的氨基酸侧链(如色氨酸和酪氨酸)(Mian,IS等人,(1991)J.Mol.Biol.217:133；Ramaraj T.等人(2012)Biochim.Biophys.Acta.1824:520)和小分子药物的“特许”片段(Welsch等人(2010)Curr.Opin.Chem.Biol.14:347)。在某种意义上，我们尽力抗体中亲和性成熟的元素和药物化学中构效关系(SAR)优化。尽管我们在SELEX中使用了单个经修饰的核苷酸，但SELEX后优化受限于经修饰的单体的合成可及性和与固相合成的相容性。
用十四个替代性的部分在5-位置处单独取代苄基的影响总结于图1C和D和图6B中，相对亲和性表达为离解常数比率且相对PDGFRβ磷酸化表达为百分比磷酸-PDGF Rβ比率。用在5-位置处具有甲基的dT进行的取代表示最剧烈的改变，并且在这个意义上相当于蛋白中的丙氨酸扫描突变(Cunningham,B.C.等人(1989)Science243:1330)。并不令人惊奇的是，这是八个经修饰的核苷酸位置中的六个处最不能耐受的取代。例外是其中该取代可良好耐受的核苷酸1和7。这两个位置还耐受许多其它取代，其中一些替代可使结合亲和性产生高达5倍的改良(图6B)。相反地，核苷酸8、17和18展现出对改变的最高敏感性。然后组合最佳单一取代，从而产生包括4149-8_255和4149-8_260(图6B)的额外变体。组合了核苷酸17处的苯乙基-dU(Pe-dU)和核苷酸18处的噻吩-dU(Th-dU)的适体 4149-8_260显示出与PDGF-BB和PDGF-AB的优良结合(图6B)。值得注意的是，最初选择的SOMAmer的亲和性已经非常高(K_d＝20pM)，以致于其达到了结合测定的检测极限，因此亲和性改良的程度可能被低估。我们对其它SOMAmer进行了起始结合较弱的类似的SELEX后优化策略(如，K_d值的范围为100pM至>10nM)，并且已经观察到亲和性改良高达100倍。
PDGF适体4149-8_260(SL5)的同源二聚体：由于PDGF形成了共价连接的同源二聚体且两个SOMAmer结合至每个PDGF同源二聚体，我们确定了对结合同源二聚化的SOMAmer的影响。与对应单体的亲和性相比，由于亲合作用，所述PDGF适体同源二聚体的亲和性基本上可得以改进。晶体结构显示SOMAmer的5'端之间相距，而3'端之间相距。将5'与3'端连接将需要至少，因为这两点之间的最短路程将蛋白一分为二。根据易于获取的化学物质，订购了两种类型的同源二聚体。这些是1)由两个至六个Heg接头连接的头至尾同源二聚体，其提供了～的距离/Heg，和2)经由与一至三个Heg组合的合成双倍体载体连接的3'-3'同源二聚体。在PDGF-BBZorbax结合测定中，测试4149-8_260的同源二聚体。用有限量的SOMAmer进行结合测定，并且所述结合测定将不区分每个蛋白二聚体结合一个SOMAmer对比每个蛋白二聚体结合两个SOMAmer。同源二聚体的结构显示于表1(序列4149-8_334至4149-8_342)。如表1a所示，Zorbax测定中获得的K_d值表明在5'至3'构型中需要较长的接头，并且致力于使结合亲和性改进10倍。在3'-3'连接的同源二聚体中，较短的接头实际上似乎比较长的接头表现地更好。这由细胞磷酸化结果所确证，参见表1a。
基于这些序列，示例性共有序列为：
5′-ZZVCL_nGVZACNMGCGZZZAZAGCG-3′(SEQ ID NO：502)，
其中
V选自A、C或G；
V'选自C、G或Z，其中V'与V互补；
N独立选自任何天然存在或经修饰的核苷酸；
M选自C或A；
Z独立选自经修饰的嘧啶；L是选自任何天然存在或经修饰的核苷酸的间隔基、烃接头、聚乙二醇接头或其组合；且
n是0至20；
其中任选地包含一种或多种核苷酸插入。
序列截短研究：如表3所示，对来自4149-8_1的5'和3'端进行系统性截短以限定维持适体对人PDGF-BB的完整结合活性所需的最小长度。显示了一个亚组的截短的K_d值。Z＝苄基-脱氧尿苷(Bn-dU)；A、C、G和T是脱氧核糖核苷酸。
蛋白表达和纯化，以及适体复合物形成
为了晶体学研究，从Creative BioMart(Shirley,NY)购买重组人PDGF-BB蛋白。所示重组蛋白在大肠杆菌细胞中表达。将适体溶液解冻，然后通过加热至～95℃5分钟来退火，然后在40℃下孵育5分钟，然后冷却至室温。将退火的适体溶液与蛋白以1.1:1的DNA：蛋白比率混合。将所述复合物在含有20mM Na/K磷酸盐(pH 7)和100mM NaCl的缓冲液中稀释5倍。将所得混合物在1.5mL Amicon离心滤器中浓缩至于蛋白中的～4mg/mL。根据残余物的最终体积估计最终浓度。
实施例2.PDGF-适体复合物的晶化和结构
使用坐滴蒸汽扩散法在设置在16℃的紧凑Jr.板(Emerald BioSystem,WA)中生长晶体。从初级筛(ProPlex,Molecular Dimensions)获得用于数据收集的晶体。PDGF-BB:4149-8_255复合物的晶体生长自100mM醋酸镁、100mM醋酸钠(pH 4.5)和8％(w/v)PEG 8000。PDGF-BB:4149-8_260复合物的晶体生长自100mM醋酸镁、100mM二甲胂酸钠(pH 6.5)和15％(w/v)PEG 6000。用Litho Loops收集晶体，并在通过快速转移至含有33％(v/v)乙二醇的储器溶液，及随后通过直接投入液氮快速冷却，而将其冷冻保护。
数据收集和结构测定：在先进光子源的19-ID光束线(Argonne,IL)下收集两个结构的数据。使用XDS处理数据集(Kabsch 2010)。使用 来自CCP4软件协议(CCP4,1994)的Phaser，以来自PDGF-BB:β型PDGF受体复合物(PDB登录号3MJG)的结构的PDGF蛋白模型作为搜素模型，通过分子替换对PDGF-BB:4149-8_260复合物的结构进行初始调整相位。分子替换位于不对称单元的单个蛋白单体。REFMAC中开始一轮的限制性精化之后检查电子密度图显示出与蛋白模型相邻的核酸一致的特征。随后通过“自展”的过程建立适体的模型，即部分模型进行重复数轮的精化；导致允许进一步的模型建立的略微改进的图。首先，根据核酸主链密度，建立磷酸根离子。其次，用dT残基替代磷酸根。在精化之后，可由突出强阳性差别电子密度而分辨出经修饰的残基。对经修饰的残基的鉴定促进了适体的序列成行的测定，并且在最后的步骤中用正确的核碱基替换dT残基。使用面向晶体对象的工具包(Coot)进行所有建设(Emsley&Cowtan,2004)。使用4149-8_260复合物的完成的模型，通过分子替换解析PDGF-BB:4149-8_255结构。
在每个结构中，针对残基Thr88和Thr90的Oγ原子的电子密度观察到连续的电子密度突出。尽管已经报道了这些用于在酵母中表达的重组PDGF-B的位点的O-甘露糖基化(Settineri等人,,(1990))，但是几乎没有理由期待大肠杆菌中表达的PDGF-B有类似的翻译后修饰。如观察到的电子密度所表明并未完全占有，将苏氨酸残基不经翻译后修饰重塑。
表4分别公开了4149-8_260(SEQ ID.NO.211)和4149-8_255(SEQ ID.NO.207)的两种适体配体的数据收集统计和精化及模型统计。
表5说明了与B型DNA相比PDGF BB适体的碱基对参数。PDGFBB适体采用5'茎环结构域和小结的两个茎中偏离的B型构象。当合适时，给定平均值和标准偏差(括号中)。适体值基于使用web3DNA的分析(Zheng等人(2009)Nucleic.Acids Res.37:W240)和使用如Olson等人,(2001)J.Mol.Biol.313(1):229中描述和报道的3DNA确定B-DNA值(如在高分辨率的晶体结构中所发现)。
PDGF-BB的单体亚单位形成了扭曲的β-折叠，所述β-折叠以胱 氨酸结蛋白家族特有的反平行取向二聚化(Oefner等人(1992)EMBO J.11:3921)。SL5(4149-8_260)在长轴任一端处结合两个同源位点，跨过同源二聚体界面并接触三个PDGF环的每一个(图7A)。SOMAmer由通过疏水性芳族相互作用网络连接的两个结构域组成(图7B)。在5'端，用Heg环对短茎加帽(在晶体结构中无序的)，而分子的剩余部分折叠为特别小的H型假结(Aalberts,D.P.等人(2005)Nucleic Acids Res.33:2210)且经修饰的核苷酸聚集在茎环/假结接合处。显著地，所有八个经修饰的核苷酸与PDGF接触。七个经修饰的核苷酸沿着蛋白上疏水性小沟聚集，而Bn-dU1采用延伸的构象，沿着PDGF同源二聚体界面上的通道。两个天然核苷酸还接触PDGF，而剩下的天然核苷酸有助于内部结构(图2和图7)。SL5的二级结构元件，茎环和假结，是熟知的核酸结构基序。然而，用经修饰的核苷酸替代某些常规的碱基为另外的相互作用提供了新的官能团。SL5的这种区别性特征产生了用于蛋白结合的广泛疏水表面，以及规范和经修饰的核苷酸之间特定的分子内接触。
尽管SL5的3'端展现了H型假结的标志性特征(Staple,D.W.等人(2005)PLoS Biol.3:e213)，但该分类保守地描述了该标记“小结”基序的非常规性质。与需要21个核苷酸的最小的结构上报道的H型假结相比(Nonin-Lecomte S.等人(2006)Nucleic Acids Res.34:1847)，SL5小结仅由16个核苷酸组成(图7B)。此外，缺失茎2(S2)的末端mG24:dC12碱基对导致未被降低的结合亲和性(图3)，这表明了14个核苷酸小结的功能完整性。在前所未有的主链扭曲和堆积相互作用下，所述小结表示新型假结变体，其中一般小的尺寸可经由通过包装经修饰的核苷酸的疏水部分产生的稳定而获得。
小结茎1(S1)正式仅由两个沃森-克里克碱基对(图8A)形成，而环2(L2)额定地由5个碱基(Pe-dU17、Th-dU18、dA19、Bn-dU20和mA21)组成。尽管L2和S1之间的相互作用是假结的确定特征，但是他们通常限于H-键合。相反，SOMAmer小结造成了由非常规碱基配对支持的非典型环-至-茎堆积相互作用。特别的是，通过与源自L2的非规范的Bn-dU17:Bn-dU20碱基对堆积来稳定S1(图8C和图8B)，这有 效地产生了具有新型主链间断的三碱基对S1。与前述的U:U亚氨基羰基碱基对相反，Pe-dU17:Bn-dU20碱基对利用了Bn-dU17的N3和Bn-dU20的酰胺接头中的羰基氧之间的单个H-键(图8D)。Bn-dU20的糖基键的顺式构象妨碍了与Bn-dU17的H-键合，但允许Bn20与Bn-dU8碱基堆积而不与Bn-dU8的糖发生空间碰撞。通过将核苷酸18和20之间的主链转280°，可使得非常规的Pe-dU17:Bn-dU20碱基对成为可能(图8C)。这种显著的链反转使得Bn-dU20碱基与dA9的糖堆积，并与Pe-dU17形成氢键。重要的是，Pe-dU17:Bn-dU20碱基对通过由修饰的核苷酸赋予的疏水相互作用得到额外的稳定；Pe-dU17侧链的亚乙基(接头)部分指向Bn16(CH::π)，而它的苄基与Bn2和Th18以π-π边对面相互作用堆积(图8E)。L2和S1之间的一种额外的相互作用是碱基三体(mA21:dG15:dC10；图8F)，一种假结中的复现基序(Chen,G.等人(2009)Proc.Natl.Acad.Sci.USA106:12706)。这是SL5中唯一的长程三级相互作用，其不涉及修饰的核苷酸。
环1(L1)由单个挤出的核苷酸mA11组成，其使得主链能够急转弯94°，mA11和dC12之间的链内磷酸酯距离压缩到仅有(图8G)。H型假结通常具有L1中的一个或两个核苷酸，其通常与S2形成氢键并堆积成螺旋结(Nonin-Lecomte,S.等人(2006)Nucleic Acids Res.34:1847；Michiels,P.J.等人(2001)J.Mol.Biol.310:1109)。挤出的L1核苷酸是保持结构压缩所必需的，使得5'茎结构域可与小结通过经修饰的核苷酸的疏水性部分相互作用。如预期，挤出的碱基并非保守(图3)并且可被单个C3间隔基所替换(图6A)，然而它的缺失终止了结合，推测是由于干扰了小结形成。
小结S1的沃森-克里克碱基对(dA9:Bn-dU16,dC10:dG15)通过偏好的H型假结排列组装，其中S2的链1直接导致S1的链2，进而提供了茎的有效堆积(Klein,D.J.等人(2009)Nat.Struct.Mol.Biol.16:343)。S2的三个碱基对完全由沃森-克里克相互作用构成，并形成了稍微扭曲不足的B-型螺旋(图8H)。如对假结拓扑结构所期待的那样，该扭曲不足导致其螺旋参数与A-型螺旋更相似；然而，鉴于该 结构中的螺旋长度短，这些计算的关联性是含糊的。由于在接合处由S1的dC10:dG15和S2的dC14:dG22形成的严重螺旋过旋(扭曲角度为70°)，S2不与S1形成常规的共轴堆积。然而，由于dC14与dG15堆积且dG22与来自碱基三体的mA21堆积，维持茎的持续堆积(图8H)。在该接合处的广泛螺旋扭曲是使mA21桥接S2的大沟同时拓宽小沟以用于碱基三体形成所必要的。该构象在于L1中有一个或两个核苷酸的假结中是典型的(Nonin-Lecomte,S.等人(2006)Nucleic Acids Res.34:1847；Michiels,P.J.等人(2001)J.Mol.Biol.310:1109)。
SL55'茎由两个沃森-克里克碱基对(mA3:Bn-dU7和dC4:dG6)和茎基部的非规范的Bn-dU2:Bn-dU8碱基对组成(图8I)。Bn-dU2:Bn-dU8碱基对含有两个氢键，即典型的4-羰基-N3和独特的从Bn-dU2碱基的4-羰基到Bn-dU8的酰胺接头的键(图8J)。对在富含亲和性的库中相关序列的分析显示5'茎的长度和基本组分可改变，值得注意的例外是茎基部的变体Bn-dU:Bn-dU支撑(图3A和B)，进而强调了该非规范碱基对在SL5的整个结构和功能中的重要性。5'茎螺旋的稳定性进一步由PDGF的dU8、Bn20和Pro82的堆积支撑(图9H)。当主链急转弯111°时，SL5的5'茎环和小结结构域汇合。5'茎中碱基对的显著的扭曲角和径向位移导致碱基2-4和6-7比常规B型螺旋具有更佳的堆积重叠(因为螺旋扭曲不足)，而Bn-dU8碱基移出且Bn-dU7碱基与Bn-dU8的酰胺接头堆积(图8I)。该非典型的螺旋促进了与SL5的剩余部分和与PDGF的关键相互作用；Bn-dU8碱基与Bn20堆积，同时Bn8垂直地位于处于连续的π-π边对面相互作用中的Bn16和Bn20的环之间。这些长程三级相互作用定义了小结和茎环结构域之间的精巧铰链(图8L和8K)。初始两个核苷酸之间缺乏弯曲预防了Bn-dU1碱基与Bn2碰撞，增大环的堆积(图8I)。Bn2位于由Bn7与Bn8(来自5'茎)和Bn16、Pe17与Bn20(来自小结)创造的疏水簇中间(图7B、图8I和图8K)。该疏水簇有助于SOMAmer稳定，这由观察到SL5展现出64℃的T_m所支持，所述T_m比缺乏经修饰的核苷酸的其类似物高>30℃。
除了SL5之外，我们还解析了SL4的结构(4149-8_255)，其与SL5 除了用异丁基-dU(iB-dU)替换Bn-dU8之外相同。当iB-dU8与变体SL4中的Pe-dU17和Th-dU18合并时，SOMAmer基本上显示出了较弱的结合(约20-50倍相对于SL5)和75倍较低的体外抑制活性(图1A、图1B和图6B)。较小的非芳族异丁基侧链不能形成用SL5中的Bn-dU20、Bn-dU8和Bn-dU16的苄基侧链所观察到的能量上有利的π-π边对面堆积(图8M和图8N)。这在蛋白界面的疏水簇中心创造了一个洞，从而有效开启了5'茎和小结结构域之间的铰链。该取代的结构作用直接类似于蛋白疏水性核心中的Phe至Leu的突变。此类蛋白突变得到详细描述(Kadonosono,T.等人(2003)Biochemistry 42:10651；Lin,H.J.等(2003)Biochim.Biophys.Acta.1649:16；Baase,W.A.等人(2010)Protein Sci.19:631)并且通常具有显著的失稳作用。二级结构基序之间的接合处已知在确定核酸三级结构中起到重要作用(Pyle,A.M.等人(2011)Curr.Opin.Struct.Biol.21:293)。
尽管靶-结合亲和性显著较弱，在缺乏配体的情况下，SL4展现了与SL5类似的热熔特性(T_m值分别为62℃和64℃)。这与以下观点一致：由SL4中的iB-dU8取代创造的腔和改变的接合拓扑结构使得蛋白-结合界面失稳，同时保持SOMAmer的结构域内结构完整。溶液中的游离SOMAmer的构象可能非常不同于与蛋白复合的那些SOMAmer的构象，其还可消除T_m和结合亲和性之间的关系。实际上，因为使SOMAmer的较大的疏水表面溶剂化的能力消耗可能是大量的，我们期望未复合的SOMAmer在疏水性侧链周围崩解并采用其中疏水性侧链部分免受溶剂的构象。
与前述的蛋白：适体复合物相反，疏水相互作用支配了SL5和PDGF之间的界面(图2、图4和图9)。结合至PDGF-BB产生了每埋藏的表面积。SL5的八个经修饰的核苷酸产生了与PDGF的13个非极性氨基酸(Ala35、Phe37、Leu38、Val39、Trp40、Pro42、Cys52、Cys53、Ile75、Ile77、Pro82、Ile83和Phe84)相互作用的广泛疏水性界面，其占据了总非极性接触的大约一半，剩余的非极性接触包括极性或带电氨基酸(诸如Glu24、Arg27、Asn36、Asn54、Asn55、Arg56、Arg73、Lys74、Lys80、Lys85和Lys86)的脂肪族区 域(图9)。常常在蛋白中观察到带电氨基酸的类似的完全非极性残基和非极性部分之间的相互作用。因此，由SOMAmer中经修饰的核苷酸提供的结构多样性使得它们能够模拟蛋白可及的相互作用的丰富的所有组成部分。当界面原子展现在靶蛋白表面时，与传统适体相比由SOMAmer产生的疏水性接触程度的惊人差异是显著的。尽管极为接近碱性氨基酸，SL5展现了非常少的极性相互作用，仅具有六个H-键和一种与PDGF的电荷-电荷相互作用(图4)。相对于接触表面面积，这显著低于对适体而言典型的极性相互作用。对于六种传统适体，H-键和电荷-电荷相互作用(即极性接触)的总数大概以与界面面积直接成比例的形式线性增加(图10A，图22A)，其相关系数为0.91和平均1.9±0.4的极性接触/界面面积。SL5以及其它共晶结构中的两个额外的SOMAmer清楚地落在该趋势的99％置信区间之外，且小于一般数量的极性接触/界面面积(平均界面面积)，而展现了针对它们的靶有较高的结合亲和性的趋势(图22C)。就配体效率(结合自由能/非氢接触原子)而言(Kuntz,I.D.等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:9997)，适体和SOMAmer不显示出不同(图22C)，涵盖了用基于蛋白的和基于小分子的配体观察到的一系列值(Wells,J.A.等人(2007)Nature450:1001)。结合自由能/界面面积也是类似的(图22C)。然而，不同的是结合自由能/极性接触的值，SOMAmer的该值大约是适体的两倍(图22B和C)，这与以下观点一致：SOMAmer从疏水相互作用获得了对结合的较大贡献。
电荷-电荷相互作用通常贡献了小于0.2kcal/mol给折叠蛋白的稳定性(Sali,D.等人(1991)J.Mol.Biol.220:779。相反，估计仅埋藏单个亚甲基就贡献～1-1.5kcal/mol给球蛋白稳定性和/或结合相互作用(Kellis,J.T.,Jr.等人(1988)Nature333:784；Pace,C.N.等人(2011)Mol.Biol.408:514)。SOMAmer结构对疏水相互作用显示出较强的依赖性，并且从这种意义上讲，它们结合至蛋白更非常类似典型的蛋白-蛋白相互作用。与该观察一致，与用传统适体所观察到的作用相反，SL5对PDGF的亲和性显示广泛的盐浓度(0.1至1.0M NaCl)或pH值(5.0至8.8)实际上没有减少(Ahmad,K.M.等人(2011)PLoS ONE 6:e27051； Tang,Q.等人(2007)J.Colloid.Interface.Sci.315:99)。
SELEX后优化促进了形状互补和疏水性填充相互作用的微调。例如，Pe-dU17和Th-dU18在蛋白界面处异常的形状互补(图10B)被构效关系确证(图6B)。Bn-dU1还与PDGF-BB形成了独特的相互作用，其中苄基环位于由Cys43-Cys52二硫键和PDGF链1的Glu24与链2的Arg56之间的盐桥形成的通道中(图10C)。所述晶体结构表明结合袋可容纳包括较大的双环取代基的各种侧链，从而增强该与蛋白接触的点。实际上，我们在该位置具有相同的几种经修饰的核苷酸取代，其赋予结合亲和性5至10倍的增强(图6B)。
PDGF-BB:SL5结构的显著特征是SOMAmer模拟PDGFRβ的程度。受体主要通过疏水相互作用结合至PDGF，包括PDGF界面处的七个疏水性氨基酸(Shim,A.H.等人(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.USA107:11307)、SL5结合位点与受体的结合位点大量重叠，其中Bn-dU芳环占据蛋白上相同的疏水沟(图11)。PDGF用24个残基接触受体和SL5两者，其中10个残基是共享的。这些共享的或“泛宿主性的”残基可能表示PDGF表面上的结合能量热点(Wells,J.A.等人(2007)Nature 450:1001；Clackson,T.等人(1994)Science 267:383。然而，与PDGF Rβ相比，SL5展现出了10倍较高的针对PDGF-BB的亲和性10倍(Lokker,N.A.等人(1997)J.Biol.Chem.272:33037)。与这些观察一致，SL5是PDGF-BB的有效抑制剂(图1B和图6B)。
实施例3.结合亲和性测定
为了测定靶结合亲和性，使用T4多核苷酸激酶(New England Biolabs)和γ-³²P-ATP(Perkin Elmer)对SOMAmer进行5′端-标记。结合测定通过在37℃下将浓度为～0.03-0.05nM的放射性标记的SOMAmer(～20,000c.p.m)和浓度范围在10^-7至10^-12M的靶蛋白于1XSB18T缓冲液(40mM HEPES，pH 7.5；120mM NaCl；5mM KCl；5mM MgCl₂和0.01％TWEEN-20)中孵育30分钟来进行。将结合的复合物与Zorbax树脂混合，并在滤板上捕获。用PhosphorImager(FUJI FLA-3000)定量结合的SOMAmer的部分。为了放射性标记SOMAmer 非特异性背景结合至Zorbax树脂，修正原始结合数据。如前所述确定平衡解离常数(Kd)(Jellinek等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.91:11227)。如图5所表明，将浓度为200nM的竞争剂tRNA包括在同种型特异性研究中。为了确定所述盐对PDGF-BB/SOMAmer和E10030相互作用的依赖性，在40mM Hepes pH 7.5、0.01％TWEEN-20以及100mM,250mM,500mM,750mM或1.0M NaCl之一)的存在下，如上所述进行并分析结合亲和性测定。使用简单线性回归拟合盐浓度对比解离常数的log-log曲线。如由反离子凝聚理论所描述，该曲线的斜率表示当蛋白结合时从DNA释放的反离子的数量(Manning,G.S.(1969)J.Chem.Phys.51:924)。与用传统适体所示的作用相反，PDGF的适体4149-8_260(SEQ ID NO.211)的亲和性显示了在较广范围的盐浓度(0.1至1.0M NaCl)或pH值(5.0至8.8)下几乎没改变(Ahmad,K.M.等人(2011)PLoS One 6:e27051；Tang,Q.等人(2007)J.Colloid.Interface Sci.315:99)。
实施例4.PDGF-BB细胞磷酸化测定
PDGF-BB活性。为了测定PDGF-BB SOMAmer抑制PDGF Rβ活化的能力，将Hs27人包皮成纤维细胞(美国典型培养物保藏中心)以5000个细胞/孔接种于96孔板中，并血清饥饿24小时。将SOMAmer(如图中所表明，改变浓度)与PDGF-BB(20ng/mL)(Creative BioMart)于不含血清的培养基中于37℃下孵育30分钟，然后将复合物添加至血清饥饿的Hs27细胞中。在刺激后的五分钟，弃掉上清液并将细胞在裂解缓冲液#9(R&D Systems：1％NP-40Alternative，20mM Tris(pH 8.0)，137mM NaCl，10％甘油，2mM EDTA，1mM活化的原钒酸钠，10μg/mL抑肽酶和10μg/mL亮抑酶肽)中于冰上裂解5分钟。根据制造商的指导，使用DuoSet磷酸-PDGF Rβ试剂盒(R&D Systems)进行磷酸-PDGF Rβ的Elisa检测。在无刺激物对照的情况下，测量在OD₄₅₀下的百分比磷酸-PDGF Rβ，修正板吸光和背景信号。通常一式两份或一式三份进行实验。将数据在GraphPad Prism 3.0中作图并使用非线性回归拟合为单点竞争曲线。SOMAmer 4149-8_379和5'氨基 -接头修饰的SOMAmer 4149-8_379的IC₅₀测定的代表性曲线显示于图13中，其IC₅₀值分别为1.6nM和1.7nM。
为了克隆4149-8的变体的活性筛选，在如上所述相同的条件下但在单一浓度的SOMAmer变体(通常为20nM)的情况下，评估了于Hs27成纤维细胞中对PDGF-BB-诱导的PDGF Rβ磷酸化的百分比抑制。
实施例5.基于Nap-dU修饰的额外PDGF配体
为了鉴定以高亲和性结合至PDGF-BB的额外适体，我们已经用包含Nap-dU修饰的核苷酸的文库进行了另一SELEX实验。以基本上类似以上实施例1所描述的方式类似的方式进行选择，并且导致了对Nap-dU适体克隆5169-4的鉴定。
PDGF Nap-dU SELEX库的深度测序：为了更完全评估5169-4_1适体家族中的序列，使用454焦磷酸测序技术对第7轮库测序。用454引物扩增库DNA，并且纯化PCR产物并使用Sequal归一化平板(Invitrogen，目录号A10510-01)归一化。洗出液跑凝胶，以确保每个扩增子的大小和纯度。在位于奥罗拉的科罗拉多大学保健科学中心的454焦磷酸测序设施上对纯化的PCR产物测序。
来自库的序列数据集含有8,273条全长序列(即，那些含有双向引物序列的序列)，其中1,629条是独特的。通过对序列集中所有可能的n-聚体(4-聚体至30-聚体)计数，这1,629条独特序列用于寻找统计学上显著的n-聚体形式。通过比较每个经鉴定的n-聚体的计数与来自相同组合物的库的n-聚体的随机期待的计数，发现了统计学上显著的形式。在序列集中鉴定了两种主要形式，并且发现5169-4_1在由在11条序列中发现的保守序列基序“APGPAPGCACAPCP”所定义的第二种形式中是对齐的。通过所有独特序列对该基序(同一性＝0.75)的搜索发现了51条序列，然后对所述51条序列由基序基序比对。对于所有序列，如图14所列出的那样，在表明共有序列的情况下，计算出在比对中每个位置处的部分同一性。
序列截短研究：对来自50-核苷酸5169-4克隆的5'和3'端进行系 统性截短，以如表6所示定义维持适体对人PDGF-BB的完全结合活性所需的最小长度。显示这些截短的K_d值(P＝萘基-脱氧尿苷(Nap-dU)；A、C、G和T是脱氧核糖核苷酸)。5169-4克隆证明非常适于截短，并且鉴定以比50-聚体改善的结合亲和性结合至PDGF-BB(分别为17pM和29pM)的21-核苷酸序列(5169-4_26)。5169-4_2621-聚体含有5个Nap-dU修饰的核苷酸对比50-聚体中的9个Nap-dU修饰的核苷酸。
在5169-4_26(21-聚体)中的C3间隔基单次取代：Nap-dUPDGF-BB适体的第一轮SELEX后修饰包括在21-聚体5169-4_26中的所有位置处的C3间隔基步查(walk)。C3间隔基步查意在鉴定非高亲和性结合所需要的碱基，所述碱基可有效地一起去除，用C3间隔基或其它接头(诸如六乙二醇(Heg)或聚乙二醇(PEG)接头)替代。C3间隔基取代的结果显示于表7中。在该表中，“P”表示Nap-dU，“C3”表示C3间隔基；A、C和G表示脱氧核糖核苷酸，且“NB”表示不结合高达100nM的PDGF-BB。三个位点可耐受C3取代，且结合亲和性适度降低：C1、G6和C7(编号是指如下表所示的21-聚体)。与5169-4_26相比，一个位置(C15)可耐受C3间隔基取代且对结合亲和性没有影响。
5169-4_26(21-聚体)中的2'-O-甲基单次取代：在所有天然碱基处，进行2'O-甲基取代，以鉴定可耐受该耐核酸酶取代的位置。我们还用我们实验室合成的2'O-甲基Nap亚磷酰胺(Nap-mU)，评估了将耐受Nap-mU单次取代的Nap-dU位置。此外，用脱氧胸苷(T)取代Nap-dU以评估每个Nap-dU的重要性。结合亲和性结果显示于表8中，并且表明了所有位置不同程度地耐受2'O-甲基取代。与结合亲和性降低高达2倍的5169-4_26相比，2'O-甲基取代在每个脱氧胞苷位置(C)处的影响导致结合亲和性没有改变。与5169-4_26相比，四个脱氧鸟苷位置(G)显示了当用2'O-甲基取代时从G14处2.5倍增加的结合亲和性，变化为G10处5.5倍降低的结合亲和性的结果。在六个脱氧腺苷位置(A)处的2'O-甲基取代对结合亲和性有零至超过50倍的副作用。针对适体5'端的脱氧腺苷(A3、A5和A8)是三个对2'O-甲基取 代最敏感的脱氧腺苷。与5169-4_26相比，只有位置21处的Nap-dU完全耐受Nap-mU取代而对结合亲和性无影响，而在位置11处的Nap-mU取代显示了结合亲和性降低2.5倍。剩下的Nap-mU取代导致结合亲和性降低15至30倍。仅有完成消除性结合(在PDGF-BB浓度高达100nM的情况下)的取代是在位置12和21处的脱氧胸苷取代，剩余的脱氧胸苷取代对结合亲和性有显著负面的影响(>400倍)。在表8中，P＝5-萘修饰的dU，上标1表明表明2'-O-甲基修饰的核苷。A、C、G和T表示天然存在的脱氧核糖核苷酸，且“NB”表示不结合高达100nM的PDGF-BB。
在5169-4_26(21-聚体)中的多次2'-O-甲基取代。2'-O-甲基取代在5169-4_26中的复合效应导致对结合亲和性改善的几种变体(包括变体5169-4_146)的鉴定。该21-聚体具有11个通过2'O-甲基核酸酶-保护的位置，并且其结合亲和性超过亲本截短5169-4_26至少20倍(分别为0.60pM相对于17pM)。与3至10个2'O-甲基的组合的许多其它变体的结合亲和性还有显著的改良(大约3倍)。在表9中，P＝5-萘修饰的dU，上标1表明2'-O-甲基修饰的核苷，A、C和G表示天然存在的脱氧核糖核苷酸，和“NB”表示不结合高达3.2nM的PDGF-BB。
实施例6.PDGF Nap-dU适体活性测定
为了分析PDGF Nap-dU适体对PDGF Rβ活化的抑制作用，如实施例4所描述进行细胞磷酸化抑制测定。测试的四种适体序列抑制了PDGF Rβ活化，且IC₅₀值如下：5169-4_26，IC₅₀＝1.6nM；5169-4_84，IC₅₀＝3.3nM；5169-4_85，IC₅₀＝7.3nM；5169-4_112，IC₅₀＝1.0nM。
实施例7.VEGF适体选择和序列
候选混合物的制备：部分随机化的ssDNA寡核苷酸的候选混合物通过与生物素化ssDNA模板退火的DNA引物的聚合酶延伸来制备。
VEGF SELEX条件：如描述一样(Gold等人(2010)PloS One 5:e15004)，由SomaLogic Inc从含有40-核苷酸随机区的文库(其中用Nap-dU取代dT)选择重组人VEGF-121蛋白的适体(都来自R&D Systems)。对于VEGF-121，正向引物是5'-GCCACACCCTGCCCTC-3'且反向引物是5'-GAGGACACAGACAGACAC-3'。将VEGF-121蛋白生物素化并分配在链霉亲和素MyOne-SA(Dynal)珠粒上。使用动力学攻击实现对具有慢解离速率的适体的优先选择，其中将蛋白-DNA复合物在10mM硫酸葡聚糖的存在下于37℃孵育，且在连续数轮中孵育时间增加和蛋白浓度降低。在VEGF-121SELEX中，第4轮和第5轮包括15分钟的动力学攻击，而第6轮和第7轮(最后一轮)包括30分钟的动力学攻击。
最小可变剪接形式的血管内皮生长因子，VEGF-121，对于SELEX是一个较难的蛋白靶。使用天然存在的DNA或RNA文库，或使用核糖的2'-位置处修饰的核酸文库，我们之前已经不能获得甚至适度的亲和性改善。这显著由两个原因所导致。首先，在胱氨酸结蛋白超家族的成员中，VEGF-121与PDGF-BB具有最高的结构类似性，对于124Cα原子均方根偏差为(Muller等人,1997)。其次，较大且最普遍的VEGF同种型(VEGF-165)已经证明是SELEX的良好靶。例如，培加尼布(Macugen)(迄今唯一已接受注册审批的基于适体的治疗剂(用于治疗黄斑变性))仅通过肝素-结合外显子-7-编码的结构域结合至VEGF-165，其为VEGF-121中所缺乏(Lee等人,2005；Ruckman等人,1998)。VEGF-121、VEGF-165和PDGF-BB之间的差异是总电荷，pI值分别为5.8、8.5和10.1。这指向极性相互作用在适体结合中的重要性。最终用SELEX Nap-dU文库实现VEGF-121的成功的亲和性富集。
VEGF-121Nap-dU适体序列的鉴定：根据如上所述进行的Nap-dU SELEX实验，鉴定在单个位置处不同的两个高度相关的高亲和性变体(4867-15和4867-31)。在一系列的缺失实验(表7)中，克隆4867-31已被截短至29-聚体。值得注意的是，两个高亲和性克隆(4867-15和4867-31)的截短产生相同的29-聚体，因为单核苷酸差异位于最小序列的5'边界之外。涵盖具有高亲和性结合的较短序列的截 短的变体，29-聚体4867-31_143(5'-CCGPP CAAGP GCPPG PAGGA PPPAA APGG-3'；其中“P”是Nap-dU的单字母名称)及其接近变体，以可比较的亲和性结合至人VEGF-121、人VEGF-165、小鼠VEGF-120和大鼠VEGF-164，所述亲和性范围为0.1–1nM(表10)。在该表中，“P”表示Nap-dU；A、C和G表示天然存在的脱氧核糖核苷酸且“NB”表示不结合高达100nM的VEGF。
4867-15_2(50-聚体)中的C3间隔基单次取代。VEGF-121适体的第一轮SELEX后修饰是50聚体4867-15_2(截短的50-聚体)中的所有位置处的C3间隔基步查。C3间隔基步查意在鉴定并非高亲和性结合所需要的碱基，所述碱基可有效地一起去除，用C3间隔基或其它接头(诸如六乙二醇(Heg)或聚乙二醇(PEG)接头)替代。C3间隔基取代的结果显示于表11中。在该表中，“P”表示Nap-dU，“V”表示C3间隔基；A、C和G表示天然存在的脱氧核糖核苷酸，且“NB”表示不结合高达100nM的VEGF。至少三个位点可耐受C3取代：C17、G26和C29(编号是指如下所示的50-聚体)。
4867-31_43(32-聚体)中的2'-O-甲基单次取代。在天然碱基处进行2'O-甲基取代，以鉴定可耐受该耐核酸酶取代的位置。此外，用2'-OMe-尿苷(2'-OMeU)取代Nap-dU以评估Nap-dU的重要性。此外，现在在32聚体的情况下，在假设为待挤出的碱基的某些内部位置处测试C3间隔基。也在所述三个位置的每一个处测试内部缺失和替代性碱基。以下显示了精选的SOMAmer(单一浓度为20nM)的结合亲和性和细胞培养抑制数据。结果显示于表12中，并表明在较短的截短的情况下C8(表11中的C17)不完全耐受对C3的取代。在此情况下，其它两个假定挤出碱基(G17和G20)保持与C3或替代性碱基取代一样良好的结合和功能活性。在那些位置处的内部缺失并不能被耐受。在该实验中，没有一个Nap-dU修饰可用2'OMe-U替换。然而，几个内部位点可耐受2'OMe修饰。在表12中，P＝5-萘修饰的dU，和上标1表明2'-OMe修饰的核苷，V＝3碳间隔基和空框表明核苷缺失。A、C、G和U表示天然存在的脱氧核糖核苷酸。
4867-31_143(29-聚体)中的2'-O-甲基Nap-dU取代和多次2'-O- 甲基取代。用我们实验室合成的2'O-甲基Nap亚磷酰胺(Nap-mU)，我们评估了将耐受Nap-mU单次取代的Nap-dU位置。此外，我们测试了在每个天然碱基处的2'OMe和C3接头取代的组合。以下显示了精选的SOMAmer(单一浓度为20nM)的结合亲和性和细胞培养抑制数据。如下表13所示，大部分的Nap-dU残基不耐受OMe取代，但在位置22处用Nap-mU取代Nap-dU使得亲和性增加10倍并产生良好的抑制活性。在该表中，上标“1”表示2'-O-甲基取代，“V”表示C3间隔基。根据亲和性，2'-OMe组合大部分是良好耐受的，但是某些组合显示了抑制活性惊人的损失。
2'-O-甲基和C3取代的联合作用使得鉴定出了几种具有改良结合亲和性的变体(包括变体4867-31_188)。该29-聚体具有10个通过2'OMe或C3而受核酸酶-保护的位置，并且其结合亲和性比亲本截短4867-31_143高约3倍(分别为38pM相对于140pM)。变体4867-31_188相对于亲本SOMAmer保持了相当的细胞抑制活性。参见表13。
唯一耐受Nap-mU的位置是核苷酸22(使用4867-31_143截短作为亲本序列)。然后将该Nap-mU取代置于最佳合并的2'OMeSOMAmer(4867-31_188)的背景中。此外，将用C3间隔基取代位置15处的初始dG与在该位置处的2'-OMe取代相比较，以检测核酸酶-保护的碱基可能给分子添加硬度并因此增加结合的可能性。使用变体4867-31_192获得了最佳聚集结果，与亲本29-聚体截短变体4867-31_143相比，变体4867-31_192现在具有9个受保护的位置(参见下表14；上标“1”表示2'-O-甲基取代和“V”表示C3间隔基)。
经修饰的核苷酸结构活性关系和亲和性成熟：为了检测十个萘基侧链的每一个对结合的贡献，我们通过用经修饰的dU亚磷酰胺的定制文库化学合成5-位置变体进行了另一系列的系统性点取代。为了该目的，我们设计了一个文库，以通过改变H-键供体和受体的大小、极性、布局，接头长度以及5-位置取代基的取向使我们能够用探针探查每个位置的微环境。在选择用于该分析的官能团时，我们目的在于在包含原始修饰的主题下的变异(在这种情况下，为苄基)、抗体的互 补决定区(CDR)中过表达的氨基酸侧链(如色氨酸和酪氨酸)(Mian,I.S.等人(1991)J.Mol.Biol.217:133；Ramaraj,T.等人(2012)Biochim.Biophys.Acta.1824:520)和小分子药物的“特许”片段(17)。图15显示了这些取代的结果，表示为Kd值的比率(经取代的/未取代的)。在测试十个Nap-dU位置中的每一个的17种不同修饰取代中，只有四种取代(Trp-dU 27、NE-dU 16、MBn-dU 10和BT-dU 16)几乎不影响结合亲和性。所有其它取代导致各种程度更弱的结合亲和性。
VEGF SELEX库的深度测序：为了更完全评估4149-8_1适体家族中的序列，使用454焦磷酸测序技术对富集的库测序。用454引物扩增库DNA，并将PCR产物纯化和使用Sequal归一化平板(Invitrogen。目录号A10510-01)归一化。洗出液跑凝胶，以确保每个扩增子的大小和纯度。在位于奥罗拉的科罗拉多大学保健科学中心(University of Colorado Health Sciences Center in Aurora,CO)的454焦磷酸测序设施上对纯化的PCR产物测序。
将454序列通过CLUSTAL分析与4867-31比对。来自库的序列数据集含有13,139条全长序列(即，那些含有双向引物序列的序列)，其中2,235条是独特的。搜索这些2,235条独特序列的基序5'-CCGPP CAAGP GCPPG PAGGA PPPAA APGG-3'。发现有86条序列含有该基序。对于所有学历，如图16所列出的那样，计算每个位置处的与4867-31的百分比同一性。
实施例8.VEGF结合亲和性测定
为了测定靶结合亲和性，使用T4多核苷酸激酶(New England Biolabs)和γ-³²P-ATP(Perkin Elmer)对SOMAmer进行5′端-标记。结合测定通过在37℃下将浓度为～0.03-0.05nM放射性标记SOMAmer(～20,000c.p.m)和浓度范围为10^-7至10^-12M的靶蛋白于1XSB18T缓冲液(40mM HEPES，pH 7.5；120mM NaCl；5mM KCl；5mM MgCl₂和0.01％TWEEN-20)中孵育30分钟进行。将结合的复合物与Zorbax树脂混合，并于Durapore滤板上捕获。用PhosphorImager(FUJI FLA-3000)对结合的SOMAmer部分定量。为了 非特异性背景结合放射性标记SOMAmer至Zorbax树脂，修正原始结合数据。如前所述确定平衡解离常数(K_d)(Jellinek等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90:11227)。
实施例9.VEGF活性测定
为了分析VEGF121SOMAmer对VEGF-R2(血管内皮生长因子受体2)的细胞激酶活性的抑制作用，我们使用内源表达高水平VEGF-R2的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(Lonza,^#CC-2519)。将HUVEC细胞置于补充有含有2％FBS、生长因子(hEGF、氢化可的松、VEGF、HFGF-B、R3-IGF-1)、肝素、抗坏血酸和GA-1000(庆大霉素，两性霉素-B)的EGM-2BulletKit(^#CC-3162)的EGM-2(内皮细胞生长培养基)中。当HUVEC细胞达到70至80％汇合时，将它们置于24孔板(10⁵个细胞/孔)中并用不含血清的培养基饥饿过夜。
将SOMAmer(20nM的单一浓度或一系列浓度)于37℃下添加至具有20ng/mL(1nM)的VEGF-121的培养物(R&D System,^#4464-VS)(含有1％BSA)中30分钟。将所述细胞在PBS中洗涤两次，并用预孵育的VEGF-121/SOMAmer复合物刺激5分钟。用PBS再次洗涤经处理的细胞两次，并添加补充有Halt磷酸酶抑制剂(Thermo Scientific,#78428)的冰冷的裂解缓冲液(1％NP-40可替换，20mM Tris(pH8.0)，137mM NaCl，10％甘油，2mM EDTA，1mM活化的原钒酸钠，10μg/mL抑肽酶和10μg/mL亮抑酶肽。通过使用人磷酸-VEGF R2/KDR试剂盒(R&D,DYC 1766-2)，测量细胞裂解物的VEGF-R2磷酸化。
在体外功能活性实验中，在20nM的筛选浓度下，克隆4867-31的各种截短的变体能够在永生化或原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中基本上完全抑制由VEGF-121或VEGF-165(1-4nM)诱导的VEGFR2磷酸化。IC₅₀测定的代表性曲线显示于VEGF适体4867-31_43和4867-31_192的图17中，IC₅₀值分别为2.2nM和2.1nM。
为了克隆4867-31的变体的活性筛选，我们已经在与上述相同的条件但单一浓度的SOMAmer变体(一般为20nM)的情况下，评估了在HUVEC中的VEGF-诱导的VEGF R2磷酸化的百分比抑制。
实施例10.PDGF和VEGF适体的同源二聚体构建体
PDGF-BB和VEGF均为二硫键连接的同源二聚体，其通过二聚化酪氨酸激酶受体，从而造成受体自磷酸化和信号传导来发挥它们的生物作用。如果多余一种的适体可如PDGF-BB适体4149-8_260(基于晶体结构)那样结合至其蛋白靶，则此类适体可以允许单个适体亚单位同时结合至蛋白的形式在多聚体构建体中共价连接。这可通过亲合力效应导致亲和性改善。根据容易获取的化学物质，合成了两种类型的同源二聚体。这些是1)由零至六个Heg接头连接的头-至-尾同源二聚体，其提供～距离/Heg，和2)经由合成二倍体载体连接的3'-3'同源二聚体，在两侧与一至三个Heg合并(即二聚体中总共有两个、四个或六个Heg)。在竞争结合测定中，测试4149-8_379、5169-4_26和4867-31_192的同源二聚体。为了测定竞争剂结合亲和性，使用T4多核苷酸激酶(New England Biolabs)和γ-³²P-ATP(Perkin Elmer)对适体配体进行5′端-标记。通过将固定浓度的荧光标记的配体(1.0nM)与各种浓度的竞争剂适体(10^-11至10^-6M)预混合，来进行竞争测定。将所述配体和竞争剂稀释液与靶蛋白(100pM)于1XSB18T缓冲液(40mM HEPES，pH 7.5；120mM NaCl；5mM KCl；5mM MgCl₂和0.01％TWEEN-20)中于37℃孵育60分钟。将结合的复合物与Zorbax树脂混合，并于Durapore滤板上捕获。用PhosphorImager(FUJI FLA-3000)对结合的配体部分定量。针对不添加竞争剂的结合对原始结合数据进行归一。将数据在GraphPad Prism 3.0中作图，并使用非线性回归拟合为单点竞争曲线，以确定竞争剂适体的平衡解离常数(K_i)。PDGF同源二聚体：序列4149-8_379的PDGF同源二聚体(序列4149-8_438至4149-8_447)和5169-4_26的PDGF同源二聚体(序列5169-4_134至5169-4_143)的结构示于表15中。对于基于4149-8_379的同源二聚体，在竞争测定中获得的K_i值表明在5'至3'构象的中，较长的接头是所需的，因为与无Heg接头相比，测量到用五个Heg接头的结合亲和性改善超过10倍(分别为0.25pM相对于4.2pM)。在3'至3'连接的4149-8_379同源二聚体中，较长的四个和六个Heg接头还表现得比无接头好至少10倍，和比两个Heg接头好大约2倍。对于基于 5169-4_26的同源二聚体，所述K_i值表明较长的Heg接头在5'至3'构象中是有利的，因为K_i从无Heg接头情况下的28pM改善到六个Heg接头的3.6pM。在5'至3'构象中，五个和六个Heg接头的K_i值没有差异。在3'至3'连接的基于5169-4_26的同源二聚体中，观察到相同的模式，即随着Heg接头长度增加，K_i也改善。与无Heg接头相比，六个Heg接头显示_Ki改善了5倍(分别为2.0pM相对于11pM)。在表15和16中，Z＝苄基-脱氧尿苷(Bn-dU)，P＝5-萘修饰的dU(Nap-dU)，M＝亚甲基二氧基苄基-dU(MBn-dU)，上标1表明2'-O-甲基修饰的核苷，没有上标表明脱氧核糖核苷酸，“C3”表明三个碳接头和“H”表明六乙二醇接头。
实施例11.PDGF/VEGF异源二聚体适体构建体
基于PDGF适体4149-8和VEGF适体4867-31的异源二聚体。为了开发对PDGF和VEGF有特异性的构建体，我们设计和测试了各种包含连接至PDGF适体的VEGF适体的适体构建体。测试的第一适体构建体合并了PDGF变体4149-8_273和VEGF 4867-31_183。由头-至-尾合成适体构建体，通过零个至三个六乙二醇(Heg)接头以两个取向连接(与PDGF适体在5'端相连或与VEGF适体在5'端相连)。所述结果示于下表17和18中。在表17中，“Z”表示Bn-dU，“P”表示Nap-dU，上标“1”表示2'-O-甲基取代，没有上标表明脱氧核糖核苷酸，“V”表示C3间隔基和“H”表示六乙二醇(Heg)接头。在表18中，剩余的百分比活性表示相对于对照(无适体)在20nM适体的存在下于Hs27成纤维细胞中的部分PDGFβR磷酸化水平。
基于针对PDGF-BB、-AB、VEGF-121和VEGF-165的结合亲和性，适体构建体4149-8_320显示出在该实验中给出最佳的结果。如表18所示，我们还在PDGF细胞磷酸化测定中测试了适体构建体。基于功能测定数据，测试的所有适体构建体抑制了在Hs27成纤维细胞中的PDGF-BB-诱导的PDGFβR磷酸化。适体构建体4149-8_313、4149-8_314、4149-8_315、4149-8_316、4149-8_319和4149-8_320抑制了PDGF-BB-诱导的PDGFβR磷酸化，其IC₅₀值为<20nM。适体 构建体4149-8_317和4149-8_318的IC₅₀值为～20nM。
基于4149-8_320(5'PDGF-3Heg-VEGF3')的构象，我们合成了包含PDGF适体4149-8_379和VEGF适体4867-31_192的4149-8_401。参见表19。在该表中，“Z”表示Bn-dU，“P”表示Nap-dU，M表示MBn-dU，上标“1”表示2'-O-甲基取代，没有上标表示脱氧核糖核苷酸，“C3”表示C3间隔基和“H”表示六乙二醇(Heg)接头。适体构建体4149-8_401显示了针对PDGF-BB和VEGF121的结合亲和性，所示结合亲和性等同或优于其前体适体构建体(4149-8_320)的结合亲和性。参见表20。
适体构建体4149-8_320和4149-8_401抑制的PDGF-BB-诱导的是Hs27成纤维细胞中的PDGF-Rβ磷酸化，其IC₅₀值分别为约1nM和5nM。此外，包含缀合至20kDa或40kDa PEG的5'氨基接头的适体构建体4149-8_401保持在Hs27成纤维细胞中抑制PDGF-BB-诱导的PDGF-Rβ磷酸化的能力，其IC₅₀值为约1nM。那些结果与测定中的所有PDGF的化学计量滴度/抑制(1nM单体)一致。
我们测试了包含适体4149-8_379和4867-31_192的另一组适体构建体，以确定总接头长度以及PDGF和VEGF适体的取向的作用。参见下表21。当VEGF位于5'端时，我们测试了零至六个Heg接头。当PDGF位于5'端时，我们测试了二至六个Heg接头，包括具有三个Heg接头的4149-8_401。当在此取向时，不测试一个Heg接头变体，因为它在相关的变体4149-8_318中稍微展现出结合减少。结合数据示于表16中。大部分适体构建体表现良好，除了多少表现出了针对PDGF-BB较弱的亲和性的4149-8_408和4149-8_409。包括了Ophthotech适体E10030(Fovista)的结合亲和性以用于比较。
如上所述，在受体磷酸化实验中测试了适体构建体4149-8_401在体外抑制PDGF和VEGF活性的能力。适体构建体4149-8_401以与PDGF单体4149-8_379效能相当的效能抑制了在Hs27成纤维细胞中的PDGF-诱导的PDGFRβ磷酸化(IC₅₀值分别为2.4nM和1.7nM)。类似地，适体构建体4149-8_401以与VEGF单体4867-31_192效能相当的效能抑制了在HUVEC细胞中的VEGF-诱导的VEGFR2磷酸化(IC₅₀值分别为0.7nM和2.1nM)。图18显示了此实验的结果。图 18A显示(A)用PDGF适体4149-8_379(开环)和PDGF/VEGF适体构建体4149-8_401(闭环)抑制Hs27成纤维细胞中的PDGF-诱导的PDGFRβ磷酸化，和(B)用VEGF适体4867-31_192(开环)和PDGF/VEGF适体构建体4149-8_401(闭环)抑制HUVEC中的VEGF-诱导的VEGF R2磷酸化。
基于PDGF适体5169-4和VEGF适体4867-31的异源二聚体。我们已经设计并测试了额外的基于PDGF适体5169-4_26和VEGF适体4867-31_192的异源二聚体构建体。由头至尾合成适体构建体，所述适体构建体由一至六个六乙二醇(Heg)接头以两个取向相连(与PDGF适体在5'端相连或与VEGF适体在5'端相连)。结果示于表22中。当VEGF处于5'端时，三至六个Heg接头产生最高的亲和性。该亲和性一般比当VEGF-121适体序列在3'端时稍低，大部分的K_d值落在100-300pM的范围内，除了K_d为56pM的五个Heg接头序列。当PDGF位于5'端时，K_d值的范围为对于三个Heg接头的11pM至对于四个Heg接头的0.54pM，剩余的K_d值落入对于所有其它Heg接头长度的K_d值之间。当PDGF位于3'端时，存在一个趋势即随着接头长度的增加，结合亲和性较高，一个Heg接头的K_d为5.3pM和六个Heg接头的K_d为0.20pM。在表22中，“P”表示Nap-dU，上标“1”表示2'-O-甲基取代，没有上标表示脱氧核糖核苷酸和“H”表示六乙二醇(Heg)接头。
实施例12.PDGF/VEGF适体构建体与VEGF和PDGF的同时结合
为了证明PDGF/VEGF适体构建体同时结合VEGF和PDGF的能力，开发了夹心法。简而言之，将Nunc板用人PDGF-BB或人VEGF-121(20ng/mL)涂覆。在用1％BSA溶液阻断孔后，添加PDGF/VEGF适体构建体(10nM)，并使其结合至吸附的蛋白靶上。洗涤后，使得生物素化互补蛋白(对于涂覆有VEGF-121的板是2nM PDGF-BB，和对于涂覆有PDGF-BB的板是2nM VEGF-121或VEGF-165)结合以形成四价复合物。在另一次洗涤后，添加辣根过氧 化物酶缀合的链霉亲和素(HRP-SA)，并使其形成四价复合物。在最后洗涤后，根据制造商的说明添加颜色形成辣根过氧化物酶底物(Thermo Scientific TMB底物试剂盒34021)，并且通过添加1.6MH₂SO₄使反应适时停止。用带有自动检查的Spectramax M5板读数仪确定每孔在450nm下的吸光度。与上述方法并行的是，进行了一组四个对照试验，其中包括了组成四价复合物的4个组分之一。
如图19所示，PDGF/VEGF适体构建体SL1012(20kDa PEG-N-4149-8_401)能够同时结合人VEGF-121和PDGF-BB。当添加四价复合物的所有组分时(完整)，观察到了强信号，而缺乏所示4个组分任何一者将导致背景或近背景信号。用PDGF和VEGF涂覆的板获得了类似的结果，这表明了添加蛋白至适体构建体的顺序无关紧要。如图19所示，SL1012能够同时结合至人VEGF-165和PDGF-BB。图19A显示了添加了生物素化PDGF的涂覆有VEGF的微量滴定板。FIG.19B显示了添加了生物素化VEGF的涂覆有PDGF的微量滴定板。数据显示为平均值+95％置信区间(n＝3)。当添加四价复合物的所有组分时(完整)，观察到了强信号，而排除所述四种组分的任何一种将导致背景或近背景信号。所述数据还表明添加PEG部分至适体构建体的5'-末端不阻碍同时结合活性。
人VEGF-165和人PDGF-BB与(A)SL1012或和(B)SL1013(40kDA PEG-N-4149-8-401)的同时结合显示于图20中。用PDGF涂覆微量滴定板，且添加生物素化VEGF。完整意指添加了四价复合物的所有组分，而没有所述四种组分之一的每个条件显示于图中。数据表示为平均值+95％置信区间(n＝3)
用不含有PEG部分的各种适体构建体进行类似实验。在该实验中仅包括了一个无适体对照，因为之前的结果表明需要所述复合物的其它组分来产生信号。如图21所示，适体构建体4149-8_317、4149-8_318、4149-8_320、4149-8_401和4149-8_414同时结合PDGF和VEGF而不管蛋白添加的顺序。图21(A)显示了添加了生物素化PDGF的涂覆有VEGF的微量滴定板和图21(B)显示了添加了生物素化PDGF的涂覆有PDGF的微量滴定板。
添加有关同时结合PDGF适体5169-4和VEGF适体4867-31的变体的异源二聚体构建体的数据。
实施例13.玻璃体内药代动力学研究
进行初始眼部药代动力学测试以了解适体和适体构建体在眼中如何其作用。如表23所示测试了四种适体和适体构建体。
对于每种适体或适体构建体，向五只新西兰白兔的双眼(10只眼)进行单次玻璃体内注射。动物接受0.5mg/眼的剂量(SL1010和SL1011)或1.0mg/眼的剂量(SL1012和SL1013)。这些剂量表示仅有适体或适体构建体的重量(该计算排除了PEG重量)。将所有供试品在磷酸盐缓冲盐水中配制。对于每个适体或适体构建体供试品，从给药后2、24、48、96或192小时的动物的双眼收集玻璃体液样品。将玻璃体液样品冷冻贮藏直至对它们进行测试。
通过在260纳米(nm)处检测吸光度的超高效液相色谱(UPLC)测定法确定适体或适体构建体的玻璃体浓度。简而言之，经由使其通过20规格针头数次，而避开玻璃质水凝胶。将玻璃质蛋白通过添加2体积的2-乙氧基乙醇沉淀。离心后，回收上清液并将其注入C18柱(0.2×100mm)。柱温为80℃并且流速维持在0.2mL/min。缓冲液A由TEAA pH 7.0和5％乙腈组成。缓冲液B由100％乙腈组成。该程序将50％缓冲液B在注射样品后维持1分钟，然后在4分钟内线性增加缓冲液B至70％。由在260nm处的吸光度完成检测。通过将未知样品的峰吸光度单位插入到那些通过用已知浓度的适体或适体构建体制备的标准曲线获得的峰吸光度单位中，确定玻璃体液中的适体或适体构建体的浓度(游离酸当量)。
此实验的结果显示于表24中。
普通线性回归拟合玻璃体浓度的自然对数对比时间导致SL1010、SL1011、SL1012和SL1013的玻璃体半衰期的估值分别为105、47、69和92小时。表25显示了结果连同95％的置信区间。
这些玻璃体半衰期与类似规格的治疗性VEGF抑制剂的NZW兔的半衰期有利地比较，所述治疗性VEGF抑制剂诸如Macugen(83小 时，Eyetech Study Group(2002)Retina 22:143)和Lucentis(70小时，Gaudreault等人(2007)Retina 27:1260)。因此，这些适体和适体构建体可用于治疗诸如AMD和糖尿病性视网膜病变的眼部疾病。
前述实施方案和实施例仅仅意在作为实例。不应将特定的实施方案、实施例或者特定实施方案或实施例的元素理解为权利要求任一项的关键、需要或基本的元素或特征。可对本文公开的实施方案进行各种改变、修饰、取代和其它变化而不偏离由随附的权利要求书所限定的本发明的范围。将以说明性方式而不是限制性方式理解包括图和实施例的本说明书，并且所有此类修饰和取代意在被包括在本发明的范围内。相应地，本发明的范围应由随附的权利要求书和它们合法的等同物来确定，而不是由以上给定的实施例。例如，任何方法或工艺权利要求中引用的步骤可以任何容易的顺序实施并且不限于在任何一个实施方案、实施例或权利要求中所呈现的顺序。
表1.代表4149-8_1和截短的变体的序列，针对PDGF的K_d值为10nM或更小
















无上标表明脱氧核糖
上标o表明2'-氟
上标1表明2'-O-甲基
上标2表明硫代磷酸酯(脱氧核糖)
C3＝三碳接头
Heg＝六乙二醇接头
Nap＝萘基-dU
Pe＝苯乙基-dU
BT＝苯并苯硫基-dU
Th＝苯硫基-dU
Ib＝异丁基-dU
Trp＝色胺基-dU
2Nap＝2-萘基-dU
2NE＝2-萘基乙基-dU
NE＝萘基乙基-dU
MBn＝亚甲基二氧基苄基-dU
PP＝苯丙基-dU
Tyr＝酪氨酰-dU
FBn＝氟苄基-dU
Bn＝苄基-dU
3'-双倍体＝对称双倍体亚磷酰胺(Glen Research，目录号10-1920-02)
表1a.PDGF适体4149-8_260(SL5)的同源二聚体：

表2.代表截短的变体的序列，针对PDGF的K_d值超过10nM



无上标表明脱氧核糖
上标o表明2'-氟
上标1表明2'-O-甲基
上标2表明硫代磷酸酯(脱氧核糖)
C3＝三碳接头
Heg＝六乙二醇接头
Nap＝萘基-dU
Pe＝苯乙基-dU
BT＝苯丙苯硫基-dU
Th＝苯硫基-dU
Ib＝异丁基-dU
Trp＝色胺基-dU
2Nap＝2-萘基-dU
2NE＝2-萘基乙基-dU
NE＝萘基乙基-dU
MBn＝亚甲基二氧基苄基-dU
PP＝苯丙基-dU
Tyr＝酪氨酰-dU
FBn＝氟苄基-dU
Bn＝苄基-dU
表3.PDGF适体克隆4149-8_1的截短。



表4.数据收集、精化和模型统计。


括号中的值表明二十个反射壳的值
R_融合＝Σ_hΣ_i|I_i(h)-<I(h)>|/Σ_hΣ_iI_i(h)
R_游离＝Σ_h||F_观察|-|F_计算||/Σ_h|F_观察|。
游离的R因子使用从精化中省略的5％的反射计算(CCP4套装：用于蛋白晶体学的程序，1994)。
*配体B-因子针对蛋白单体的活性位点中的配体。来自溶剂(PEG，甘油等。)的配体不包括在计算中。
表5.与B型DNA相比PDGF BB适体的碱基对参数。

表6.PDGF适体克隆5169-4的截短。



表7.5169-4_26中所有位置处的C3间隔基取代。


表8.5169-4_26中的2'O-甲基和脱氧胸苷取代。



表9.PDGF适体5169-4_26中的多个2'-O-甲基取代。











表12：VEGF适体4867-31_43中的2'-O-甲基取代




表15.4149-8_379和5169-4_26的PDGF同源二聚体。



表16.4867-31_192的VEGF同源二聚体。




表19.PDGF/VEGF适体构建体4149-8_401

表20.PDGF/VEGF适体构建体4149-8_401的结合亲和性

表21：包含4149-8_379和4867-31_192的PDGF/VEGF适体构建体的结合亲和性

表22.包含5169-4_26和4867-31_192的PDGF/VEGF适体构建体的结合亲和性。


表23.眼部PK研究中测试的适体和适体构建体。

表24.眼部药代动力学研究中适体和适体构建体在玻璃体液中的浓度。

OS-左眼；OD-右眼
表25向NZW兔单次双向玻璃体内给药之后适体和适体构建体的玻璃体液半衰期。