一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201410586586.4	申请日：	2014.10.28
公开号：	CN104371995A	公开日：	2015.02.25
当前法律状态：	实审	有效性：	审中
法律详情：	实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/10申请日:20141028\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N15/10	主分类号：	C12N15/10
申请人：	范惠玲
发明人：	范惠玲
地址：	734099甘肃省张掖市甘州区北环路846号
优先权：
专利代理机构：	兰州中科华西专利代理有限公司62002	代理人：	李艳华
PDF下载：	PDF下载

内容摘要

本发明涉及一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法，该方法包括以下步骤：⑴油菜及其近缘植物干种子加石英砂研成粉末后加提取液，研磨成匀浆；⑵匀浆装入离心管，并水浴保温以充分裂解；⑶离心管冰浴冷却后加氯仿-异戊醇，混匀至不分层，离心得到上清液A；⑷上清液A中加NaCl，摇匀后加预冷无水乙醇，冰浴静置，然后离心得到沉淀物A；⑸沉淀物A中加NaCl，待沉淀物溶解后再加氯仿-异戊醇，轻轻混匀至不分层，然后离心，得到上清液B；⑹上清液B中加NaCl和预冷无水乙醇，冰浴静置，然后离心得到沉淀物B；⑺沉淀物B中加乙醇，洗涤沉淀后自然风干，加入TE缓冲液进行充分溶解，即得DNA提取液。本发明操作简便、实用，易于实施。

权利要求书

1.  一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法，包括以下步骤：
⑴将油菜及其近缘植物干种子0.5 ~1g置于研钵中，用研棒压破，加几颗石英砂后用力粗研成粉末，然后再加入500~700 μL提取液，迅速用力研磨成匀浆；所述提取液是按下述方法制得：
①将1.2114 g Tris加蒸馏水溶解，并定容至100 mL，即得0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液；
②吸取浓度为10~14 mol/L分析纯盐酸0.85 mL，加水至100mL，混匀后用0.1 mol/L标准氢氧化钠溶液滴定，即得0.1mol/L 盐酸；
③将50 mL所述0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液与29.2mL所述0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100 mL，即得pH =8.0的0.05mol/L Tris-HCl 缓冲液；
④将14.61g EDTA和4g氢氧化钠加水溶解，并定容至100 mL，即得0.5 mol/L乙二胺四乙酸溶液；
⑤分别将10~20g十六烷基三乙基溴化铵、1~3g二硫苏糖醇、1~2g PEG8000用水溶解，然后将该三种溶液混合，得到混合液；
⑦在所述混合液中依次加入90~100 mL所述0.05mol/L Tris-HCl 缓冲液、40~50mL 所述0.5 mol/L乙二胺四乙酸溶液，并加水定容至500mL即得；
⑵所述匀浆装入2 mL 的离心管中，并置于65 ℃水浴中保温15~20 min，每间隔5 min轻轻摇动离心管1次，以充分裂解；
⑶将所述步骤⑵所得的离心管采用冰浴冷却后，加入500~700 μL氯仿-异戊醇，混匀至不分层，以10000~12000 r/min的速率离心5 min，得到上清液A；
⑷在300~400 μL所述上清液A中加入150~200 μL、3mol/L 的NaCl，摇匀后加入700~800 μL预冷无水乙醇，冰浴静置5~10 min，然后在温度为4℃的条件下以10000~12000 r/min的速率离心5~8 min，得到沉淀物A；
⑸在所述沉淀物A中加入300~400μL、1 mol/L 的NaCl，待所述沉淀物溶解后再加入300~400 μL氯仿-异戊醇，轻轻混匀至不分层，然后在温度为4℃的条件下以10000~12000 r/min的速率离心5 min，得到上清液B；
⑹在300~400μL所述上清液B中依次加入30~40μL、1 mol/L 的NaCl和800~900 μL预冷无水乙醇，冰浴静置5~10 min，然后在温度为4℃的条件下以10000~12000 r/min的速率离心5 min，得到沉淀物B；
⑺所述沉淀物B中加入体积浓度为70~75%的乙醇300~400 μL，洗涤沉淀2~3次后自然风干该沉淀物B，然后加入50~100μL、 pH=8的TE 缓冲液进行充分溶解，即得DNA 提取液。

2.  如权利要求1所述的一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法，其特征在于：所述步骤⑴中油菜及其近缘植物干种子是指甘蓝型油菜种子、白菜型油菜种子、芥菜型油菜种子、青海白芥种子以及和田芸芥种子中的任意一种。

3.  如权利要求1所述的一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法，其特征在于：所述步骤⑶和所述步骤⑸中的氯仿-异戊醇是指将氯仿与异戊醇按24mL：1 mL的体积比混合而成的混合物。

说明书

一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法
技术领域
本发明涉及植物分子生物学研究的技术领域，尤其涉及一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法。
背景技术
甘肃河西地区气候属高原寒冷半湿润气候，昼夜温差大，日照充足，有利于油菜脂肪的形成和积累，油菜籽出油率达42%以上。民乐、山丹两县是河西油菜主产区，也是甘肃最大的油菜连片种植示范基地，种植面积最大时达44万多亩，是发展优质油菜的理想地带。该地区油菜在增加当地人民收入方面起到了积极作用。
目前，存在的主要问题是：①随着油菜品种数量日益增加，遗传基础相对狭窄，使得完全根据形态性状进行油菜品种的鉴别越来越困难，给种子生产、经营、管理和维权等环节带来不同程度的困难，导致油菜品种多、乱、杂的现象日益突出，对产量和品质造成了严重的影响。②至今，用于油菜品种纯度鉴定，遗传多样性分析的技术主要是SSR和RAPD标记技术，而应用这两大技术的关键环节是基因组DNA的有效提取。多数研究者以幼嫩的组织如新鲜叶片提取基因组DNA，但在实际操作中，为得到幼嫩组织，必须在实验室条件下播种或者田间取材，播种油菜或田间取材耗费大量的人力物力和时间。③三大类型油菜籽、芸芥籽、白芥籽中均贮藏较多的蛋白质和淀粉，采用一般的方法，如CTAB法、SDS法，提取的DNA往往内含杂质（蛋白质、多糖），影响后续的种子纯度鉴定或遗传多样分析等工作。同时，油菜籽中还含有小分子次生物质，如黄酮、香豆素、鞣质等，其中含有酚羟基的化合物，氧化后要与DNA结合，引起DNA降解。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种简便实用的油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法。
为解决上述问题，本发明所述的一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法，包括以下步骤：
⑴将油菜及其近缘植物干种子0.5 ~1g置于研钵中，用研棒压破，加几颗石英砂后用力粗研成粉末，然后再加入500~700 μL提取液，迅速用力研磨成匀浆；所述提取液是按下述方法制得：
①将1.2114 g Tris加蒸馏水溶解，并定容至100 mL，即得0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液；
②吸取浓度为10~14 mol/L分析纯盐酸0.85 mL，加水至100mL，混匀后用0.1 mol/L标准氢氧化钠溶液滴定，即得0.1mol/L 盐酸；
③将50 mL所述0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液与29.2mL所述0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100 mL，即得pH =8.0的0.05mol/L Tris-HCl 缓冲液；
④将14.61g EDTA和4g氢氧化钠加水溶解，并定容至100 mL，即得0.5 mol/L乙二胺四乙酸溶液；
⑤分别将10~20g十六烷基三乙基溴化铵、1~3g二硫苏糖醇、1~2g PEG8000用水溶解，然后将该三种溶液混合，得到混合液；
⑦在所述混合液中依次加入90~100 mL所述0.05mol/L Tris-HCl 缓冲液、40~50mL 所述0.5 mol/L乙二胺四乙酸溶液，并加水定容至500mL即得；
⑵所述匀浆装入2 mL 的离心管中，并置于65 ℃水浴中保温15~20 min，每间隔5 min轻轻摇动离心管1次，以充分裂解；
⑶将所述步骤⑵所得的离心管采用冰浴冷却后，加入500~700 μL氯仿-异戊醇，混匀至不分层，以10000~12000 r/min的速率离心5 min，得到上清液A；
⑷在300~400 μL所述上清液A中加入150~200 μL、3mol/L 的NaCl，摇匀后加入700~800 μL预冷无水乙醇，冰浴静置5~10 min，然后在温度为4℃的条件下以10000~12000 r/min的速率离心5~8 min，得到沉淀物A；
⑸在所述沉淀物A中加入300~400μL、1 mol/L 的NaCl，待所述沉淀物溶解后再加入300~400 μL氯仿-异戊醇，轻轻混匀至不分层，然后在温度为4℃的条件下以10000~12000 r/min的速率离心5 min，得到上清液B；
⑹在300~400μL所述上清液B中依次加入30~40μL、1 mol/L 的NaCl和800~900 μL预冷无水乙醇，冰浴静置5~10 min，然后在温度为4℃的条件下以10000~12000 r/min的速率离心5 min，得到沉淀物B；
⑺所述沉淀物B中加入体积浓度为70~75%的乙醇300~400 μL，洗涤沉淀2~3次后自然风干该沉淀物B，然后加入50~100μL、 pH=8的TE 缓冲液进行充分溶解，即得DNA 提取液。
所述步骤⑴中油菜及其近缘植物干种子是指甘蓝型油菜种子、白菜型油菜种子、芥菜型油菜种子、青海白芥种子以及和田芸芥种子中的任意一种。
所述步骤⑶和所述步骤⑸中的氯仿-异戊醇是指将氯仿与异戊醇按24mL：1 mL的体积比混合而成的混合物。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明直接以油菜及其近缘植物干种子为材料进行DNA提取，相比现有常用方法中以叶片为材料的提取方法，不仅能获得高质量的DNA，而且简单快速，省去了育苗过程，在降低实验成本的同时大大降低了工作效率。
2、本发明所采用的提取液中EDTA的浓度为50 mmol/L，能保护DNA不被内源核酸酶降解，保证得到完整性较好的DNA。
3、本发明种子和CTAB提取液之间的质量体积比为0.5~1：700~800(g/μL)，不仅降低了多糖对提取DNA的干扰作用，而且CTAB与核酸复合物沉淀容易产生，得到的DNA不宜降解。
4、本发明采用2~3×CTAB提取液，且在用乙醇沉淀DNA时采用高盐法，使多糖保留在溶液中，有效除去种子中的多糖，使2.0﹤A260/A230﹤2.5，从而获得无多糖污染的DNA样品。
5、本发明在提取液中加入1~3%的二硫苏糖醇和1~2%的PEG，不但起到防止酚类氧化的作用，还可防止酚类与DNA的结合，完全保护DNA的完整性。
6、本发明通过氯仿-异戊醇混合液对先后得到的上清液进行两次抽提，然后用预冷乙醇对上清液中的DNA进行两次沉淀，能有效除去种子中贮藏的蛋白质，获得无蛋白质污染的DNA样品。
7、本发明在适量提取液中研样，不需液氮中冷冻研样，也能防止DNA的降解，解决了河西走廊油菜主产地区制造液氮及提供液氮的场地较少的问题。
8、本发明材料易得，操作简便、实用，易于实施，在保证DNA提取量的前提下能够快速提取纯度较高、完整性较好的基因组DNA，满足油菜种质资源遗传多样性分析和种子纯度检测的需要，利于后续PCR扩增实验。
9、对本发明所获得的基因组DNA进行测试。
⑴所获得的基因组DNA采用Nanaphotometer 核酸蛋白分析仪测定各种DNA提取样品的A260/A280，A260/A230，A320值和浓度。
DNA纯度检测：若所测DNA样品的A260/A280 ≈1.8，说明所提取的DNA样品纯度较高，无蛋白质污染。较纯净的核酸其A260/A230的比值大于2.0。若比值小于2.0，表明样品被糖类污染。A320为检测溶液样品的浊度和其他干扰因子，该值应该接近0.0。
将总DNA在1~2%琼脂糖凝胶（1~1.5%Gold View Ⅰ型核酸染色剂）中电泳，1×TAE为电泳缓冲液，按5V/cm电泳30~40 min。电泳结束后，在凝胶成相系统上观察，记录，并照相。
⑵PCR扩增反应：
使用美国伯乐公司生产的MycyclerTM  thermal cycler扩增仪，对三大类型油菜及其近缘植物的基因组DNA进行PCR扩增。反应体系为25μL，包括18.5μL ddH₂O，2μL 10×buffer（主要含Mg2+），2 μL dNTPs, 1μL引物，0.5μL TaqDNA聚合酶，1μL模板；反应条件为 94℃预变性4min，然后进行94℃50s， 37℃退火1min 20s，72℃延伸2min，35个循环后，在 72℃延伸10min。
⑶实验结果参见表1和图1~6，通过表1可以看出，油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法和传统CTAB方法比较，从3种类型油菜和2种油菜近缘植物干种子中所提取的基因组DNA的A260/A230，A320， A260/A280值都较理想。
表1  油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法和传统CTAB方法的提取效果比较

由图1可见，观察到1、3、5、8、10各泳道中的DNA带型清晰，无拖尾且未发生降解现象，而2、4、6、7、9泳道中有明显的拖尾现象，条带不够清晰或带型成锯齿状，表明DNA样品降解或内含多糖等杂质。不同程度的拖尾现象，带型成锯齿状，表明DNA样品中杂质污染。
由图1~6可见，用本发明提取方法得到的基因组DNA进行PCR 扩增能得到带型清晰的图谱，完全可用于油菜及其近缘植物遗传多样性、纯度鉴定等研究工作。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为本发明三种类型油菜及其近缘植物干种子总DNA琼脂糖凝胶电泳图。
图2为本发明甘蓝型油菜PCR扩增图谱。
图3为本发明白芥PCR扩增图谱。
图4为本发明芸芥PCR扩增图谱。
图5为本发明芥菜型油菜PCR扩增图谱。
图6为本发明白菜型油菜PCR扩增图谱。
图中：1、2为甘蓝型油菜；3、4为白菜型油菜；5、6为芥菜型油菜；7、8为白芥；9、10为芸芥；1、3、5、8、10本发明提取方法；2、4、6、7、9传统提取方法。
具体实施方式
实施例1    一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法，包括以下步骤：
⑴将油菜及其近缘植物干种子0.5g置于研钵中，用研棒压破，加几颗石英砂后用力粗研成粉末，然后再加入500 μL提取液，迅速用力研磨成匀浆。
其中：油菜及其近缘植物干种子是指甘蓝型油菜种子、白菜型油菜种子、芥菜型油菜种子、青海白芥种子以及和田芸芥种子中的任意一种。
提取液是按下述方法制得：
①将1.2114 g Tris加蒸馏水溶解，并定容至100 mL，即得0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液；
②吸取浓度为10~14 mol/L分析纯盐酸0.85 mL，加水至100mL，混匀后用0.1 mol/L标准氢氧化钠溶液滴定，即得0.1mol/L 盐酸；
③将50 mL、0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液与29.2mL、0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100 mL，即得pH =8.0的0.05mol/L Tris-HCl 缓冲液；
④将14.61g EDTA和4g氢氧化钠加水溶解，并定容至100 mL，即得0.5 mol/L乙二胺四乙酸溶液；
⑤分别将10~20g十六烷基三乙基溴化铵、1~3g二硫苏糖醇、1~2g PEG8000用水溶解，然后将该三种溶液混合，得到混合液；
⑦在混合液中依次加入90~100 mL、0.05mol/L Tris-HCl 缓冲液、40~50mL、0.5 mol/L乙二胺四乙酸溶液，并加水定容至500mL即得。
⑵匀浆装入2 mL 的离心管中，并置于65 ℃水浴中保温15 min，每间隔5 min轻轻摇动离心管1次，以充分裂解。
⑶将步骤⑵所得的离心管采用冰浴冷却后，加入500 μL氯仿-异戊醇，混匀至不分层，以10000 r/min的速率离心5 min，得到上清液A。
其中：氯仿-异戊醇是指将氯仿与异戊醇按24mL：1 mL的体积比混合而成的混合物。
⑷在300 μL上清液A中加入150 μL、3mol/L 的NaCl，摇匀后加入700 μL预冷无水乙醇，冰浴静置5 min，然后在温度为4℃的条件下以10000 r/min的速率离心5min，得到沉淀物A。
⑸在沉淀物A中加入300μL、1 mol/L 的NaCl，待沉淀物溶解后再加入300 μL氯仿-异戊醇，轻轻混匀至不分层，然后在温度为4℃的条件下以10000 r/min的速率离心5 min，得到上清液B。
其中氯仿-异戊醇同步骤⑶。
⑹在300μL上清液B中依次加入30μL、1 mol/L 的NaCl和800 μL预冷无水乙醇，冰浴静置5 min，然后在温度为4℃的条件下以10000 r/min的速率离心5 min，得到沉淀物B。
⑺沉淀物B中加入体积浓度为70%的乙醇300 μL，洗涤沉淀2次后自然风干该沉淀物B，然后加入50μL、 pH=8的TE 缓冲液进行充分溶解，即得DNA 提取液。
实施例2    一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法，包括以下步骤：
⑴将油菜及其近缘植物干种子1g置于研钵中，用研棒压破，加几颗石英砂后用力粗研成粉末，然后再加入700 μL提取液，迅速用力研磨成匀浆。
其中：油菜及其近缘植物干种子和提取液同实施例1。
⑵匀浆装入2 mL 的离心管中，并置于65 ℃水浴中保温20 min，每间隔5 min轻轻摇动离心管1次，以充分裂解。
⑶将步骤⑵所得的离心管采用冰浴冷却后，加入700 μL氯仿-异戊醇，混匀至不分层，以12000 r/min的速率离心5 min，得到上清液A。
其中：氯仿-异戊醇同实施例1。
⑷在400 μL上清液A中加入200 μL、3mol/L 的NaCl，摇匀后加入800 μL预冷无水乙醇，冰浴静置10 min，然后在温度为4℃的条件下以12000 r/min的速率离心8 min，得到沉淀物A。
⑸在沉淀物A中加入400μL、1 mol/L 的NaCl，待沉淀物溶解后再加入400 μL氯仿-异戊醇，轻轻混匀至不分层，然后在温度为4℃的条件下以12000 r/min的速率离心5 min，得到上清液B。
其中氯仿-异戊醇同步骤⑶。
⑹在400μL上清液B中依次加入40μL、1 mol/L 的NaCl和900 μL预冷无水乙醇，冰浴静置10 min，然后在温度为4℃的条件下以12000 r/min的速率离心5 min，得到沉淀物B。
⑺沉淀物B中加入体积浓度为75%的乙醇400 μL，洗涤沉淀3次后自然风干该沉淀物B，然后加入100μL、 pH=8的TE 缓冲液进行充分溶解，即得DNA 提取液。
实施例3    一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法，包括以下步骤：
⑴将油菜及其近缘植物干种子0.8g置于研钵中，用研棒压破，加几颗石英砂后用力粗研成粉末，然后再加入600 μL提取液，迅速用力研磨成匀浆。
其中：油菜及其近缘植物干种子和提取液同实施例1。
⑵匀浆装入2 mL 的离心管中，并置于65 ℃水浴中保温18 min，每间隔5 min轻轻摇动离心管1次，以充分裂解。
⑶将步骤⑵所得的离心管采用冰浴冷却后，加入600 μL氯仿-异戊醇，混匀至不分层，以11000 r/min的速率离心5 min，得到上清液A。
其中：氯仿-异戊醇同实施例1。
⑷在350 μL上清液A中加入180 μL、3mol/L 的NaCl，摇匀后加入750 μL预冷无水乙醇，冰浴静置8 min，然后在温度为4℃的条件下以11000 r/min的速率离心6 min，得到沉淀物A。
⑸在沉淀物A中加入350μL、1 mol/L 的NaCl，待沉淀物溶解后再加入350 μL氯仿-异戊醇，轻轻混匀至不分层，然后在温度为4℃的条件下以11000 r/min的速率离心5 min，得到上清液B。
其中氯仿-异戊醇同步骤⑶。
⑹在350μL上清液B中依次加入35μL、1 mol/L 的NaCl和850 μL预冷无水乙醇，冰浴静置8 min，然后在温度为4℃的条件下以11000 r/min的速率离心5 min，得到沉淀物B。
⑺沉淀物B中加入体积浓度为72%的乙醇350 μL，洗涤沉淀2次后自然风干该沉淀物B，然后加入800μL、 pH=8的TE 缓冲液进行充分溶解，即得DNA 提取液。

资源描述

《一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法.pdf（11页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、10申请公布号43申请公布日21申请号201410586586422申请日20141028C12N15/1020060171申请人范惠玲地址734099甘肃省张掖市甘州区北环路846号72发明人范惠玲74专利代理机构兰州中科华西专利代理有限公司62002代理人李艳华54发明名称一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法57摘要本发明涉及一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法，该方法包括以下步骤油菜及其近缘植物干种子加石英砂研成粉末后加提取液，研磨成匀浆；匀浆装入离心管，并水浴保温以充分裂解；离心管冰浴冷却后加氯仿异戊醇，混匀至不分层，离心得到上清液A；上清液A中加NACL，摇匀后加。

2、预冷无水乙醇，冰浴静置，然后离心得到沉淀物A；沉淀物A中加NACL，待沉淀物溶解后再加氯仿异戊醇，轻轻混匀至不分层，然后离心，得到上清液B；上清液B中加NACL和预冷无水乙醇，冰浴静置，然后离心得到沉淀物B；沉淀物B中加乙醇，洗涤沉淀后自然风干，加入TE缓冲液进行充分溶解，即得DNA提取液。本发明操作简便、实用，易于实施。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图2页10申请公布号CN104371995A43申请公布日20150225CN104371995A1/1页21一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法，包括以下步骤将油菜及其近缘植物。

3、干种子051G置于研钵中，用研棒压破，加几颗石英砂后用力粗研成粉末，然后再加入500700L提取液，迅速用力研磨成匀浆；所述提取液是按下述方法制得将12114GTRIS加蒸馏水溶解，并定容至100ML，即得01MOL/L三羟甲基氨基甲烷溶液；吸取浓度为1014MOL/L分析纯盐酸085ML，加水至100ML，混匀后用01MOL/L标准氢氧化钠溶液滴定，即得01MOL/L盐酸；将50ML所述01MOL/L三羟甲基氨基甲烷溶液与292ML所述01MOL/L盐酸混匀后，加水稀释至100ML，即得PH80的005MOL/LTRISHCL缓冲液；将1461GEDTA和4G氢氧化钠加水溶解，并定容至100。

4、ML，即得05MOL/L乙二胺四乙酸溶液；分别将1020G十六烷基三乙基溴化铵、13G二硫苏糖醇、12GPEG8000用水溶解，然后将该三种溶液混合，得到混合液；在所述混合液中依次加入90100ML所述005MOL/LTRISHCL缓冲液、4050ML所述05MOL/L乙二胺四乙酸溶液，并加水定容至500ML即得；所述匀浆装入2ML的离心管中，并置于65水浴中保温1520MIN，每间隔5MIN轻轻摇动离心管1次，以充分裂解；将所述步骤所得的离心管采用冰浴冷却后，加入500700L氯仿异戊醇，混匀至不分层，以1000012000R/MIN的速率离心5MIN，得到上清液A；在300400L所述上清。

5、液A中加入150200L、3MOL/L的NACL，摇匀后加入700800L预冷无水乙醇，冰浴静置510MIN，然后在温度为4的条件下以1000012000R/MIN的速率离心58MIN，得到沉淀物A；在所述沉淀物A中加入300400L、1MOL/L的NACL，待所述沉淀物溶解后再加入300400L氯仿异戊醇，轻轻混匀至不分层，然后在温度为4的条件下以1000012000R/MIN的速率离心5MIN，得到上清液B；在300400L所述上清液B中依次加入3040L、1MOL/L的NACL和800900L预冷无水乙醇，冰浴静置510MIN，然后在温度为4的条件下以1000012000R/MIN的速率。

6、离心5MIN，得到沉淀物B；所述沉淀物B中加入体积浓度为7075的乙醇300400L，洗涤沉淀23次后自然风干该沉淀物B，然后加入50100L、PH8的TE缓冲液进行充分溶解，即得DNA提取液。2如权利要求1所述的一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法，其特征在于所述步骤中油菜及其近缘植物干种子是指甘蓝型油菜种子、白菜型油菜种子、芥菜型油菜种子、青海白芥种子以及和田芸芥种子中的任意一种。3如权利要求1所述的一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法，其特征在于所述步骤和所述步骤中的氯仿异戊醇是指将氯仿与异戊醇按24ML1ML的体积比混合而成的混合物。权利要求书CN104371995。

7、A1/7页3一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法技术领域0001本发明涉及植物分子生物学研究的技术领域，尤其涉及一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法。背景技术0002甘肃河西地区气候属高原寒冷半湿润气候，昼夜温差大，日照充足，有利于油菜脂肪的形成和积累，油菜籽出油率达42以上。民乐、山丹两县是河西油菜主产区，也是甘肃最大的油菜连片种植示范基地，种植面积最大时达44万多亩，是发展优质油菜的理想地带。该地区油菜在增加当地人民收入方面起到了积极作用。0003目前，存在的主要问题是随着油菜品种数量日益增加，遗传基础相对狭窄，使得完全根据形态性状进行油菜品种的鉴别越来越困难，给种子生。

8、产、经营、管理和维权等环节带来不同程度的困难，导致油菜品种多、乱、杂的现象日益突出，对产量和品质造成了严重的影响。至今，用于油菜品种纯度鉴定，遗传多样性分析的技术主要是SSR和RAPD标记技术，而应用这两大技术的关键环节是基因组DNA的有效提取。多数研究者以幼嫩的组织如新鲜叶片提取基因组DNA，但在实际操作中，为得到幼嫩组织，必须在实验室条件下播种或者田间取材，播种油菜或田间取材耗费大量的人力物力和时间。三大类型油菜籽、芸芥籽、白芥籽中均贮藏较多的蛋白质和淀粉，采用一般的方法，如CTAB法、SDS法，提取的DNA往往内含杂质（蛋白质、多糖），影响后续的种子纯度鉴定或遗传多样分析等工作。同时，油。

9、菜籽中还含有小分子次生物质，如黄酮、香豆素、鞣质等，其中含有酚羟基的化合物，氧化后要与DNA结合，引起DNA降解。发明内容0004本发明所要解决的技术问题是提供一种简便实用的油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法。0005为解决上述问题，本发明所述的一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法，包括以下步骤将油菜及其近缘植物干种子051G置于研钵中，用研棒压破，加几颗石英砂后用力粗研成粉末，然后再加入500700L提取液，迅速用力研磨成匀浆；所述提取液是按下述方法制得将12114GTRIS加蒸馏水溶解，并定容至100ML，即得01MOL/L三羟甲基氨基甲烷溶液；吸取浓度为1014MOL/。

10、L分析纯盐酸085ML，加水至100ML，混匀后用01MOL/L标准氢氧化钠溶液滴定，即得01MOL/L盐酸；将50ML所述01MOL/L三羟甲基氨基甲烷溶液与292ML所述01MOL/L盐酸混匀后，加水稀释至100ML，即得PH80的005MOL/LTRISHCL缓冲液；将1461GEDTA和4G氢氧化钠加水溶解，并定容至100ML，即得05MOL/L乙二胺说明书CN104371995A2/7页4四乙酸溶液；分别将1020G十六烷基三乙基溴化铵、13G二硫苏糖醇、12GPEG8000用水溶解，然后将该三种溶液混合，得到混合液；在所述混合液中依次加入90100ML所述005MOL/LTRISH。

11、CL缓冲液、4050ML所述05MOL/L乙二胺四乙酸溶液，并加水定容至500ML即得；所述匀浆装入2ML的离心管中，并置于65水浴中保温1520MIN，每间隔5MIN轻轻摇动离心管1次，以充分裂解；将所述步骤所得的离心管采用冰浴冷却后，加入500700L氯仿异戊醇，混匀至不分层，以1000012000R/MIN的速率离心5MIN，得到上清液A；在300400L所述上清液A中加入150200L、3MOL/L的NACL，摇匀后加入700800L预冷无水乙醇，冰浴静置510MIN，然后在温度为4的条件下以1000012000R/MIN的速率离心58MIN，得到沉淀物A；在所述沉淀物A中加入3004。

12、00L、1MOL/L的NACL，待所述沉淀物溶解后再加入300400L氯仿异戊醇，轻轻混匀至不分层，然后在温度为4的条件下以1000012000R/MIN的速率离心5MIN，得到上清液B；在300400L所述上清液B中依次加入3040L、1MOL/L的NACL和800900L预冷无水乙醇，冰浴静置510MIN，然后在温度为4的条件下以1000012000R/MIN的速率离心5MIN，得到沉淀物B；所述沉淀物B中加入体积浓度为7075的乙醇300400L，洗涤沉淀23次后自然风干该沉淀物B，然后加入50100L、PH8的TE缓冲液进行充分溶解，即得DNA提取液。0006所述步骤中油菜及其近缘植物。

13、干种子是指甘蓝型油菜种子、白菜型油菜种子、芥菜型油菜种子、青海白芥种子以及和田芸芥种子中的任意一种。0007所述步骤和所述步骤中的氯仿异戊醇是指将氯仿与异戊醇按24ML1ML的体积比混合而成的混合物。0008本发明与现有技术相比具有以下优点1、本发明直接以油菜及其近缘植物干种子为材料进行DNA提取，相比现有常用方法中以叶片为材料的提取方法，不仅能获得高质量的DNA，而且简单快速，省去了育苗过程，在降低实验成本的同时大大降低了工作效率。00092、本发明所采用的提取液中EDTA的浓度为50MMOL/L，能保护DNA不被内源核酸酶降解，保证得到完整性较好的DNA。00103、本发明种子和CTAB提。

14、取液之间的质量体积比为051700800G/L，不仅降低了多糖对提取DNA的干扰作用，而且CTAB与核酸复合物沉淀容易产生，得到的DNA不宜降解。00114、本发明采用23CTAB提取液，且在用乙醇沉淀DNA时采用高盐法，使多糖保留在溶液中，有效除去种子中的多糖，使20A260/A23025，从而获得无多糖污染的DNA样品。00125、本发明在提取液中加入13的二硫苏糖醇和12的PEG，不但起到防止酚类氧化的作用，还可防止酚类与DNA的结合，完全保护DNA的完整性。说明书CN104371995A3/7页500136、本发明通过氯仿异戊醇混合液对先后得到的上清液进行两次抽提，然后用预冷乙醇对上清。

15、液中的DNA进行两次沉淀，能有效除去种子中贮藏的蛋白质，获得无蛋白质污染的DNA样品。00147、本发明在适量提取液中研样，不需液氮中冷冻研样，也能防止DNA的降解，解决了河西走廊油菜主产地区制造液氮及提供液氮的场地较少的问题。00158、本发明材料易得，操作简便、实用，易于实施，在保证DNA提取量的前提下能够快速提取纯度较高、完整性较好的基因组DNA，满足油菜种质资源遗传多样性分析和种子纯度检测的需要，利于后续PCR扩增实验。00169、对本发明所获得的基因组DNA进行测试。0017所获得的基因组DNA采用NANAPHOTOMETER核酸蛋白分析仪测定各种DNA提取样品的A260/A280，。

16、A260/A230，A320值和浓度。0018DNA纯度检测若所测DNA样品的A260/A28018，说明所提取的DNA样品纯度较高，无蛋白质污染。较纯净的核酸其A260/A230的比值大于20。若比值小于20，表明样品被糖类污染。A320为检测溶液样品的浊度和其他干扰因子，该值应该接近00。0019将总DNA在12琼脂糖凝胶（115GOLDVIEW型核酸染色剂）中电泳，1TAE为电泳缓冲液，按5V/CM电泳3040MIN。电泳结束后，在凝胶成相系统上观察，记录，并照相。0020PCR扩增反应使用美国伯乐公司生产的MYCYCLERTMTHERMALCYCLER扩增仪，对三大类型油菜及其近缘植物。

17、的基因组DNA进行PCR扩增。反应体系为25L，包括185LDDH2O，2L10BUFFER（主要含MG2），2LDNTPS,1L引物，05LTAQDNA聚合酶，1L模板；反应条件为94预变性4MIN，然后进行9450S，37退火1MIN20S，72延伸2MIN，35个循环后，在72延伸10MIN。0021实验结果参见表1和图16，通过表1可以看出，油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法和传统CTAB方法比较，从3种类型油菜和2种油菜近缘植物干种子中所提取的基因组DNA的A260/A230，A320，A260/A280值都较理想。0022表1油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法和传统。

18、CTAB方法的提取效果比较说明书CN104371995A4/7页6由图1可见，观察到1、3、5、8、10各泳道中的DNA带型清晰，无拖尾且未发生降解现象，而2、4、6、7、9泳道中有明显的拖尾现象，条带不够清晰或带型成锯齿状，表明DNA样品降解或内含多糖等杂质。不同程度的拖尾现象，带型成锯齿状，表明DNA样品中杂质污染。0023由图16可见，用本发明提取方法得到的基因组DNA进行PCR扩增能得到带型清晰的图谱，完全可用于油菜及其近缘植物遗传多样性、纯度鉴定等研究工作。附图说明0024下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。0025图1为本发明三种类型油菜及其近缘植物干种子总DNA。

19、琼脂糖凝胶电泳图。0026图2为本发明甘蓝型油菜PCR扩增图谱。0027图3为本发明白芥PCR扩增图谱。0028图4为本发明芸芥PCR扩增图谱。0029图5为本发明芥菜型油菜PCR扩增图谱。0030图6为本发明白菜型油菜PCR扩增图谱。0031图中1、2为甘蓝型油菜；3、4为白菜型油菜；5、6为芥菜型油菜；7、8为白芥；9、10为芸芥；1、3、5、8、10本发明提取方法；2、4、6、7、9传统提取方法。说明书CN104371995A5/7页7具体实施方式0032实施例1一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法，包括以下步骤将油菜及其近缘植物干种子05G置于研钵中，用研棒压破，加几颗石英砂。

20、后用力粗研成粉末，然后再加入500L提取液，迅速用力研磨成匀浆。0033其中油菜及其近缘植物干种子是指甘蓝型油菜种子、白菜型油菜种子、芥菜型油菜种子、青海白芥种子以及和田芸芥种子中的任意一种。0034提取液是按下述方法制得将12114GTRIS加蒸馏水溶解，并定容至100ML，即得01MOL/L三羟甲基氨基甲烷溶液；吸取浓度为1014MOL/L分析纯盐酸085ML，加水至100ML，混匀后用01MOL/L标准氢氧化钠溶液滴定，即得01MOL/L盐酸；将50ML、01MOL/L三羟甲基氨基甲烷溶液与292ML、01MOL/L盐酸混匀后，加水稀释至100ML，即得PH80的005MOL/LTRIS。

21、HCL缓冲液；将1461GEDTA和4G氢氧化钠加水溶解，并定容至100ML，即得05MOL/L乙二胺四乙酸溶液；分别将1020G十六烷基三乙基溴化铵、13G二硫苏糖醇、12GPEG8000用水溶解，然后将该三种溶液混合，得到混合液；在混合液中依次加入90100ML、005MOL/LTRISHCL缓冲液、4050ML、05MOL/L乙二胺四乙酸溶液，并加水定容至500ML即得。0035匀浆装入2ML的离心管中，并置于65水浴中保温15MIN，每间隔5MIN轻轻摇动离心管1次，以充分裂解。0036将步骤所得的离心管采用冰浴冷却后，加入500L氯仿异戊醇，混匀至不分层，以10000R/MIN的速率。

22、离心5MIN，得到上清液A。0037其中氯仿异戊醇是指将氯仿与异戊醇按24ML1ML的体积比混合而成的混合物。0038在300L上清液A中加入150L、3MOL/L的NACL，摇匀后加入700L预冷无水乙醇，冰浴静置5MIN，然后在温度为4的条件下以10000R/MIN的速率离心5MIN，得到沉淀物A。0039在沉淀物A中加入300L、1MOL/L的NACL，待沉淀物溶解后再加入300L氯仿异戊醇，轻轻混匀至不分层，然后在温度为4的条件下以10000R/MIN的速率离心5MIN，得到上清液B。0040其中氯仿异戊醇同步骤。0041在300L上清液B中依次加入30L、1MOL/L的NACL和80。

23、0L预冷无水乙醇，冰浴静置5MIN，然后在温度为4的条件下以10000R/MIN的速率离心5MIN，得到沉淀物B。0042沉淀物B中加入体积浓度为70的乙醇300L，洗涤沉淀2次后自然风干该沉淀物B，然后加入50L、PH8的TE缓冲液进行充分溶解，即得DNA提取液。0043实施例2一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法，包括以下步骤将油菜及其近缘植物干种子1G置于研钵中，用研棒压破，加几颗石英砂后用力粗研说明书CN104371995A6/7页8成粉末，然后再加入700L提取液，迅速用力研磨成匀浆。0044其中油菜及其近缘植物干种子和提取液同实施例1。0045匀浆装入2ML的离心管中，并。

24、置于65水浴中保温20MIN，每间隔5MIN轻轻摇动离心管1次，以充分裂解。0046将步骤所得的离心管采用冰浴冷却后，加入700L氯仿异戊醇，混匀至不分层，以12000R/MIN的速率离心5MIN，得到上清液A。0047其中氯仿异戊醇同实施例1。0048在400L上清液A中加入200L、3MOL/L的NACL，摇匀后加入800L预冷无水乙醇，冰浴静置10MIN，然后在温度为4的条件下以12000R/MIN的速率离心8MIN，得到沉淀物A。0049在沉淀物A中加入400L、1MOL/L的NACL，待沉淀物溶解后再加入400L氯仿异戊醇，轻轻混匀至不分层，然后在温度为4的条件下以12000R/MI。

25、N的速率离心5MIN，得到上清液B。0050其中氯仿异戊醇同步骤。0051在400L上清液B中依次加入40L、1MOL/L的NACL和900L预冷无水乙醇，冰浴静置10MIN，然后在温度为4的条件下以12000R/MIN的速率离心5MIN，得到沉淀物B。0052沉淀物B中加入体积浓度为75的乙醇400L，洗涤沉淀3次后自然风干该沉淀物B，然后加入100L、PH8的TE缓冲液进行充分溶解，即得DNA提取液。0053实施例3一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法，包括以下步骤将油菜及其近缘植物干种子08G置于研钵中，用研棒压破，加几颗石英砂后用力粗研成粉末，然后再加入600L提取液，迅速用。

26、力研磨成匀浆。0054其中油菜及其近缘植物干种子和提取液同实施例1。0055匀浆装入2ML的离心管中，并置于65水浴中保温18MIN，每间隔5MIN轻轻摇动离心管1次，以充分裂解。0056将步骤所得的离心管采用冰浴冷却后，加入600L氯仿异戊醇，混匀至不分层，以11000R/MIN的速率离心5MIN，得到上清液A。0057其中氯仿异戊醇同实施例1。0058在350L上清液A中加入180L、3MOL/L的NACL，摇匀后加入750L预冷无水乙醇，冰浴静置8MIN，然后在温度为4的条件下以11000R/MIN的速率离心6MIN，得到沉淀物A。0059在沉淀物A中加入350L、1MOL/L的NACL。

27、，待沉淀物溶解后再加入350L氯仿异戊醇，轻轻混匀至不分层，然后在温度为4的条件下以11000R/MIN的速率离心5MIN，得到上清液B。0060其中氯仿异戊醇同步骤。0061在350L上清液B中依次加入35L、1MOL/L的NACL和850L预冷无水乙醇，冰浴静置8MIN，然后在温度为4的条件下以11000R/MIN的速率离心5MIN，得到沉淀物B。0062沉淀物B中加入体积浓度为72的乙醇350L，洗涤沉淀2次后自然风干该沉说明书CN104371995A7/7页9淀物B，然后加入800L、PH8的TE缓冲液进行充分溶解，即得DNA提取液。说明书CN104371995A1/2页10图1图2图3说明书附图CN104371995A102/2页11图4图5图6说明书附图CN104371995A11。

展开阅读全文