光能诱导的生物材料的稳定性.pdf

公开了用于使水溶液中的不稳定生物分子稳定的方法和装置，所述方法包括以下步骤：将不稳定生物分子如蛋白的水溶液暴露于光能，以使所述溶液中的生物分子稳定。

权利要求书一种用于使生物分子稳定的方法，所述方法包括：
将水溶液中的一种或多种不稳定生物分子暴露于有效量的光能，以至少部分地使所述溶液中的所述一种或多种不稳定生物分子稳定。
根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种不稳定生物分子在变性剂存在下暴露于光能。
根据权利要求2所述的方法，其中所述变性剂是热。
根据权利要求3所述的方法，其中所述热变性剂包括加热至约40℃至约100℃的温度。
根据权利要求2所述的方法，其中所述变性剂是化学变性剂。
根据权利要求5所述的方法，其中所述化学变性剂是还原剂。
根据权利要求1‑6中任一项所述的方法，其中所述一种或多种不稳定生物分子选自由下列各项组成的组：蛋白、核酸、脂质和多糖。
根据权利要求7所述的方法，其中所述一种或多种不稳定生物分子是蛋白。
根据权利要求8所述的方法，其中所述蛋白在没有有效量的光能存在下发生聚集和/或解折叠。
根据权利要求9所述的方法，其中所述蛋白的聚集与没有暴露于所述光能的蛋白的聚集相比减少约10％至约60％。
根据权利要求8所述的方法，其中所述蛋白选自由下列各项组成的组：血红蛋白、胰岛素和柠檬酸合酶。
根据权利要求1‑11中任一项所述的方法，其中水溶液中的所述一种或多种不稳定生物分子在选自由下列各项组成的组中的材料中：食物、饮料、治疗剂、植入物和它们的组合。
根据权利要求12所述的方法，其中所述食物是蛋制品。
根据权利要求12所述的方法，其中所述饮料是牛奶。
根据权利要求1‑14中任一项所述的方法，其中所述光能是红光波长激光辐射。
根据权利要求15所述的方法，其中所述光能的波长为约630±20nm。
根据权利要求1‑16中任一项所述的方法，其中所述光能具有小于约1.8瓦/cm2的功率密度。
根据权利要求1‑17中任一项所述的方法，其中所述荧光发射为约900±10nm。
根据权利要求1‑18中任一项所述的方法，所述方法还包括同时对所述材料进行巴氏消毒。
根据权利要求19所述的方法，其中所述材料包括工业用酶、重组蛋白、食物、饮料、治疗剂和医疗装置。
一种用于使样品中的生物分子稳定的系统，所述系统包括：
样品室；和
光能来源，所述光能来源能够照射所述样品室以从水产生在约900±20nm的荧光发射。
根据权利要求21所述的系统，其中所述光能来源是红光波长激光器。
根据权利要求22所述的系统，其中所述红光波长激光器发射波长为约630±20nm的光能。
根据权利要求22所述的系统，其中所述红光波长激光器发射功率密度小于约1.8瓦/cm2的光能。

说明书光能诱导的生物材料的稳定性
技术领域
本公开内容总体涉及用于增强不稳定(易变的，labile)生物分子如蛋白(质)的稳定性的方法和试剂盒。
背景技术
提供下面的描述来辅助读者的理解。提供的信息或引用的参考文献都不承认是现有技术。
生物分子如蛋白的结构的变化可以由各种因素造成。例如，当许多生物分子暴露于高温时，可能在相当狭窄的范围内发生溶解度或活性的丧失。取决于所研究的生物分子和加热的严重度，这些变化可以是或不是可逆的。例如，随着蛋白的温度升高，蛋白分子中的大量键变弱。首先受影响的是，维持三级结构所需的远程相互作用。随着这些键变弱或断裂，蛋白获得更柔性的结构，且这些基团暴露于溶剂中。如果加热在这个阶段停止，那么所述蛋白应能够容易地重新折叠成天然结构。随着加热继续，稳定螺旋结构的一些协作氢键开始断裂。随着这些键断裂，水可以与肽键的酰胺氮和羰基氧相互作用，并形成新的氢键。随着螺旋结构破坏，疏水基团暴露于溶剂。
新的氢键合基团和疏水基团暴露的效应是增加由蛋白分子结合的水的量。发生解折叠增加该分子的流体动力学半径，引起溶液粘度增加。净结果是，蛋白尝试通过以下方式使它的自由能最小化：埋藏尽可能多的疏水基团，同时将尽可能多的极性基团暴露于溶剂。在冷却后，由聚集的蛋白获得的结构可能不是具有最低可能自由能的那些结构，但是动力学壁垒将阻止它们返回到天然结构。大多数蛋白暴露于高温导致不可逆的变性。
分子伴侣(侣伴蛋白，chaperone)是辅助其它大分子结构的非共价折叠和装配的蛋白，但是当所述其它大分子结构执行它们的正常生物学功能时，分子伴侣不会出现在这些结构中。分子伴侣的一种主要功能是，阻止新合成的多肽链和装配的亚基聚集成无功能的结构。由于该原因，许多分子伴侣(但绝不是所有的分子伴侣)也是热激蛋白，因为随着蛋白通过应激发生变性，聚集的趋势增大。
发明内容
在一个方面，本公开内容提供了一种用于使生物分子稳定的方法，所述方法包括：使水溶液中的一种或多种不稳定生物分子暴露于有效量的光能，以至少部分地使所述溶液中的一种或多种不稳定生物分子稳定。在一个实施方案中，一种或多种不稳定生物分子在变性剂存在下暴露于光能。
在一个实施方案中，所述变性剂是能够诱导不稳定生物分子的二级、三级或四级结构中的变化的试剂。在一个实施方案中，所述变性剂是热。在一个实施方案中，所述热包括：在生理温度以上加热所述不稳定生物分子。在一个实施方案中，所述热变性剂包括将所述不稳定生物分子加热到约40℃至约100℃的温度。在一个实施方案中，所述变性剂是破坏不稳定生物分子的二级、三级或四级结构的化学变性剂。在一个实施方案中，所述化学变性剂是还原剂如二硫苏糖醇。
在一个实施方案中，所述一种或多种不稳定生物分子选自由下列各项组成的组：蛋白、核酸、脂质和多糖。在一个实施方案中，所述一种或多种不稳定生物分子是蛋白。在一个实施方案中，所述蛋白在没有有效量的光能存在下发生聚集和/或解折叠。在一个实施方案中，与没有暴露于光能的一种或多种蛋白的聚集相比，所述蛋白的聚集减少约10％至约60％。在一个实施方案中，所述蛋白选自由下列各项组成的组：血红蛋白、胰岛素和柠檬酸合酶。
在一个实施方案中，水溶液中的一种或多种不稳定生物分子在选自由下列各项组成的组中的材料中：食物、饮料、治疗剂、植入物和它们的组合。在一个实施方案中，所述食物是蛋制品。在一个实施方案中，所述饮料是牛奶。
在一个实施方案中，所述光能是红光波长激光辐射。在一个实施方案中，所述光能的波长为约630±20nm。在一个实施方案中，所述光能具有小于约1.8瓦/cm2的功率密度。在一个实施方案中，所述光能产生在约900至约1000nm的NIR发射。
在一个方面，本公开内容提供了一种用于使生物分子在巴氏消毒过程中稳定的方法，所述方法包括：将在水溶液中具有一种或多种不稳定生物分子的材料暴露于有效量的光能，以至少部分地使所述溶液中的一种或多种不稳定生物分子稳定；并且同时将所述材料进行巴氏消毒。在一个实施方案中，所述材料包含工业用酶、重组蛋白、食物、饮料、治疗剂、医疗装置或它们的组合。
在一个方面，本公开内容提供了一种用于使样品中的生物分子稳定的系统，所述系统包括：样品室；和能够照射所述样品室的光能来源(lightenergy source)。在一个实施方案中，所述光能来源是红光波长激光器。在一个实施方案中，所述红光波长激光器发射波长为约630±20nm的光能。在一个实施方案中，所述红光波长激光器发射功率密度小于约1.8瓦/cm2的光能。
前述内容仅仅是示例性的，并且不以任何方式进行限制。除了上述的示例性方面、实施方案和特征以外，其它方面、实施方案和特征通过参考下面的附图和详细描述将变得明显。
附图说明
图1描绘了生物分子稳定化系统的一个示例性实施方案的框图。
图2显示了在光能(例如，激光)存在下和任选地不存在下，用于处理生物材料的系统的一个示例性实施方案。
图3显示图示，其举例说明了在有和没有激光存在下不同的示例性蛋白的聚集程度。深色条表示在没有激光存在下的聚集(对照样品)，而浅色条表示实验样品在有激光存在下的聚集。
图4是在有和没有红激光存在下，血红蛋白的示例性动态光散射图案(DLS)。
图5显示了在有低功率(5mW)和高功率(15mW)红激光存在下，柠檬酸合酶的聚集程度。所述结果显示了在暴露于低功率(5mW)红激光后柠檬酸合酶的聚集减少，但是在暴露于高功率(15mW)红激光后，柠檬酸合酶的聚集增加。
详细描述
在下面的详细描述中，可以参考附图，所述附图形成详细描述的一部分。在附图中，相同的标记通常表示相同的组件，除非上下文另有指示。在详细描述、附图和权利要求中描述的示例性实施方案不用于限制。可以利用其它实施方案，并且可以做出其它变化，而不脱离本文提呈的主题的精神或范围。
除非另有说明，如本文使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。因而，例如，提及的“一种蛋白”包括多种蛋白分子。
如本文使用的，术语“约”是本领域普通技术人员所理解的，且在某种程度上随它使用的上下文而变化。如果存在使用本领域普通技术人员不清楚的术语，考虑到它使用的上下文，关于数量值的术语“约”是指列举的值±多达10％。
如本文使用的，术语“聚集”是指这样的过程：其中生物分子如多肽彼此稳定地缔合，以形成多聚体的不溶复合物，其在生理条件下不会解离。
如本文使用的，术语“激光”是指，通过辐射的受激发射而放大的任何频率的电磁辐射。激光器也指通过称作受激发射的过程而发射电磁辐射的装置。激光通常是空间上相干的，这意味着，所述光以狭窄的低发散束发射，或可以在光学组件如透镜辅助下转化成狭窄的低发散束。如本文使用的，术语“红光波长激光辐射”是指具有在约600至约700nm范围内的波长的激光辐射。
如本文中一般地使用的，术语“不稳定的”是指分子或键发生化学、物理或生物学变化、降解或破坏的性质。
如本文使用的，术语“不稳定生物分子”是指这样的生物分子：当加热至高温如大于生理温度的温度或暴露于化学变性剂时，其会丧失大量活性或结构。在前一种情况下，所述生物分子也可以称作“热不稳定的生物分子”，而在后一种情况下，所述生物分子可以称作“化学不稳定的生物分子”。不稳定生物分子的实例包括：蛋白、多肽、核酸和多糖。这些类型的分子经常在生理条件下以活性必需的构象存在，且在加热后，发生构象变化。活性构象可以通过诸如氢键和盐桥的相互作用而加以稳定，当所述分子溶解于非水溶剂如二甲基亚砜中时，所述相互作用会被破坏。本文中描述的稳定化方法对于不稳定的生物分子是特别有利的，因为它能够用化学试剂或高温对不稳定的生物分子进行处理，并且所述生物分子仍然保留它们的活性或结构。
如本文使用的，术语“光能”是指任何类型的电磁辐射或能量，无论是由狭窄的离散频率或多个频率构成。光能的实例包括可见光、红外辐射和紫外辐射。
如本文使用的，术语“脂质”是指，以它们在有机溶剂中的溶解度为特征的各种化合物。这样的化合物包括但不限于：脂肪、蜡、类固醇、甾醇、糖脂、鞘糖脂(包括神经节苷脂)、磷脂、萜类、脂溶性维生素、前列腺素、胡萝卜素和叶绿素。如本文使用的，短语“基于脂质的材料”是指含有脂质的任何材料。
如本文使用的，“核酸”、“核苷酸序列”或“核酸序列”是指核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸或它们的任何片段，以及天然或合成的分子，如L‑DNA、硫代磷酸酯、锁定核酸等。
如本文使用的，术语“巴氏杀菌”和“巴氏消毒”是指这样的处理过程：其中将材料加热至足以至少部分地消毒所述材料以免于微生物和/或霉菌生长的温度并持续一定时间。巴氏消毒过的材料的特征在于，抵抗微生物和霉菌生长造成的腐败的稳定性延长。术语“巴氏杀菌”和“巴氏消毒”包括更加限制性术语“灭菌”和“消毒”，其中处理过的材料基本上没有微生物和霉菌生长。巴氏消毒通常使用低于水沸点的温度。
如本文使用的，术语“生理条件”是指与存活有机体相容，和/或通常在存活哺乳动物细胞中胞内存在的温度、pH、离子强度、粘度等生化参数。
术语“多肽”、“蛋白”和“肽”在本文中互换地用于指其中氨基酸残基通过肽键或修饰的肽键连接的氨基酸链。所述氨基酸链可以为具有大于2个氨基酸的任何长度。大多数蛋白折叠成独特的三维结构。蛋白天然折叠成的形状被称作它的天然构象。尽管许多蛋白可以无辅助地、简单地通过它们的氨基酸的化学性质进行折叠，但是其它需要分子性分子伴侣的辅助而折叠成它们的天然状态。生物化学家经常提及蛋白结构的4个不同方面。“一级结构”是指氨基酸序列。“二级结构”是指通过氢键稳定的规则地重复的局部结构。最常见的实例是α螺旋、β折叠和转角。因为二级结构是局部的，所以在同一蛋白分子中可以存在许多的不同二级结构的区域。“三级结构”是指单个蛋白分子的总体形状，即，二级结构相对于彼此的空间关系。三级结构通常通过非局部的相互作用，最常见地形成疏水核心，但是也通过盐桥、氢键、二硫键和甚至翻译后修饰加以稳定。“四级结构”是指由多个蛋白分子(多肽链)，在这个上下文中通常称作蛋白亚基形成的结构，这些蛋白分子起单个蛋白复合物的功能。
如本文使用的，“多糖”是由彼此连接的单糖组成的聚合物。在许多多糖中，多糖的基本结构单元实际上是二糖单元，其可以是重复的或非重复的。因而，当关于多糖使用时，单元是指多糖的基本结构单元，且可以包括单体结构单元(单糖)或二聚体结构单元(二糖)。术语多糖也意图包括寡糖。多糖包括但不限于：葡萄糖胺聚糖如硫酸软骨素、硫酸皮肤素、肝素、肝素‑样葡萄糖胺聚糖(HLGAG)、硫酸类肝素、透明质酸、硫酸角质素、壳多糖，以及它们的衍生物和类似物。
术语“稳定化”或“使...稳定”是指改善或维持组合物的结构或构象的过程，所述组合物含有本文所描述的不稳定生物分子，包括例如，蛋白、核酸、多糖等。改善的稳定性涉及，例如，增加的生物分子对破坏、分解、降解、变性、聚集等的抗性。如本文使用的，术语“至少部分地使...稳定”是指，与未暴露于光能的不稳定生物分子的等效样品相比，当如本文所述的暴露于光能时，水溶液中大于约5％、大于约10％、大于约20％、大于约30％、大于约40％、大于约50％、大于约60％、大于约70％或大于约80％的不稳定生物分子被维持在天然结构构象，例如，活性构象。
设备和方法
本文所描述的设备和方法基于这样的发现：用低功率光能辐照生物分子可以维持蛋白的折叠状态。该效应模仿蛋白分子伴侣的活性。
许多生物分子如蛋白的活性的丧失，是由于解折叠造成的结构完整性的丧失。许多含有蛋白的药物(例如，蛋白生物制品或疫苗)和富蛋白食物在加热或贮存以后会丧失功能性质，这是由于蛋白的错折叠，其随后经常是蛋白聚集体的不可逆形成。本公开内容总体涉及通过将生物分子暴露于光能而用于使水溶液中的生物分子稳定的方法。例如，所述生物分子可以是多肽、脂质、核酸或多糖。所述生物分子可以被包含在材料如食物、饮料、治疗剂(如生物药物或疫苗)或医疗装置(如植入物)中。辐射起“分子伴侣”的作用，其有助于蛋白的折叠或阻止蛋白的解折叠。因此，本文所描述的方法可以防止生物分子在贮存和加工过程中降解。
在一些实施方案中，使用低功率红激光辐照来防止不稳定生物分子的结构完整性丧失(即，变性)。在一个实施方案中，通过将低强度红激光辐射暴露于材料而可以获得生物分子的稳定化。
在一些实施方案中，通过在约550nm至约750nm、约575nm至约725nm、约600至约700nm、或约600至约650nm的波长操作的激光辐射而可以诱导稳定化。在一个示例性实施方案中，通过在约630±10nm的波长操作的激光辐射而可以诱导稳定化。
在一些实施方案中，通过功率密度小于约10瓦/cm2、小于约5瓦/cm2、小于约4瓦/cm2、小于约3瓦/cm2、小于约2瓦/cm2、小于约1.8瓦/cm2或小于约1.5瓦/cm2的低强度红激光辐射而可以诱导稳定化。在一些实施方案中，通过功率密度为至少约0.1瓦/cm2、至少约0.2瓦/cm2、至少约0.3瓦/cm2、至少约0.4瓦/cm2、至少约0.5瓦/cm2或至少约0.6瓦/cm2的低强度红激光辐射而可以诱导稳定化。在一个具体实施方案中，所述红激光辐射的强度可以为约0.63瓦/cm2。尽管本文中的实施方案不限于使用激光，但是使用激光时，光能诱导的不稳定生物分子的稳定化看起来是最显著的，这可能是由于多种分子如水纳米簇的相干的同时激发。
在一个示例性实施方案中，低强度红光激光器可以是小型低功率可见光、连续氦氖激光器，如由US Laser Corporation生产的激光器。这种激光器在约632.8nm(在光谱的红光部分)操作。低强度红光激光器也可以具有极化输出。例如，激光器的输出束直径可以是小于约1mm。
参考图1，显示了根据一个示例性实施方案的用于使不稳定生物分子稳定的系统100的框图。生物分子稳定化系统100可以包括：计算机系统102、NIR检测器104和生物分子稳定化室106。可以将不同和额外的组件整合到生物分子稳定化系统100中。计算机系统102可以包括输入接口108、通信接口109、计算机可读介质110、输出接口112、处理器114、数据处理应用程序116、显示器118、扬声器120和打印机122。可以将不同和额外的组件整合到计算机系统102中。
如本领域技术人员已知的，输入接口108提供用于接收来自用户的信息的接口，用于输入计算机系统102。输入接口108可以使用各种输入技术，包括但不限于键盘、笔和触摸屏、鼠标、跟踪球、触摸屏、小键盘、一个或多个按钮等，以允许用户将信息输入计算机系统102中，或作出显示在显示器118上的用户界面中呈现的选择。同一个界面可以支持输入接口108和输出接口112。例如，触摸屏允许用户输入并将输出呈现给用户。计算机系统102可以具有一个或多个使用相同或不同的输入接口技术的输入接口。
通信接口109提供使用如本领域技术人员已知的各种方案、传输技术和介质用于在装置之间接收和传输数据的接口。通信接口109可以支持使用各种可以是有线的或无线的传输介质的通信。计算机系统102可以具有一个或多个利用相同或不同的通信接口技术的通信接口。使用通信接口109，可以在计算机系统102、荧光检测器104和/或生物分子稳定化室106之间传递数据和信息。
计算机可读介质110是用于信息的电子保存场所或贮存，以使所述信息可以被处理器114存取，如本领域技术人员已知的。计算机可读介质110可以包括，但不限于，任何类型的随机存取存储器(RAM)、任何类型的只读存储器(ROM)、任何类型的闪速存储器等，如磁性贮存装置(例如，硬盘、软盘、磁条、...)、光盘(例如，CD、DVD、...)、智能卡、闪存装置等。计算机系统102可以具有一个或多个利用相同或不同存储介质技术的计算机可读介质。计算机系统102也可以具有一个或多个驱动器，所述驱动器支持诸如CD或DVD的存储介质的加载。计算机可读介质110可以为荧光检测器104和/或生物分子稳定化室106提供电子存储介质。计算机可读介质110另外可以通过通信接口109接入计算机系统102。
输出接口112提供用于输出由计算机系统102的用户检查的信息的接口。例如，输出接口112可以包括对显示器118、扬声器120、打印机122等的接口。显示器118可以是薄膜晶体管显示器、发光二极管显示器、液晶显示器，或本领域技术人员已知的各种不同显示器中的任一种。扬声器120可以是本领域技术人员已知的各种扬声器中的任一种。打印机122可以是本领域技术人员已知的各种打印机中的任一种。计算机系统102可以具有一个或多个使用相同或不同接口技术的输出接口。显示器118、扬声器120和/或打印机122另外可以通过通信接口109接入计算机系统102。
如本领域技术人员已知的，处理器114执行指令。所述指令可以由专用计算机、逻辑电路或硬件电路实现。因此，处理器114可以在硬件、固件或这些方法的任何组合中和/或与软件联合执行。术语“执行”是运行应用程序或实现被指令调用的操作的过程。所述指令可以使用一种或多种编程语言、脚本语言、汇编语言等编写。处理器114执行指令，这意味着，它实施/控制被该指令调用的操作。处理器114与输入接口108、与通信接口109、与计算机可读介质110和与输出接口112可操作地耦接，以接收、发送和处理信息。处理器114可以从永久存储装置取回一组指令，并将可执行形式的该指令拷贝至临时存储装置，后者通常是某种形式的RAM。计算机系统102可以包括多个使用相同或不同处理技术的处理器。
数据处理应用程序116执行与处理样品的数据有关的操作，所述数据使用一个或多个电子装置收集，所述电子装置连续地、定期地和/或在请求以后对样品的物理和/或化学特性进行监测、感测、测量等。使用硬件、固件、软件或这些方法的任何组合，可以实现所述操作。参考图1的示例性实施方案，数据处理应用程序116在存储于计算机可读介质110中的软件(由计算机可读的和/或计算机可执行的指令组成)中实现，且可被处理器114接入，用于执行具体体现数据处理应用程序116的操作的指令。数据处理应用程序116可以使用一种或多种编程语言、汇编语言、脚本语言等编写。
NIR检测器104可以包括荧光检测系统如荧光计等。NIR检测器104产生与样品有关的数据，如样品中的生物分子的聚集。数据的来源和维数不用于限制。计算机系统102可以与NIR检测器104分开或集成以控制NIR检测器104的操作。
生物分子稳定化室106可以包括光源124和任选的加热室126。可以将不同和额外的组件整合到生物分子稳定化室106中。光源124产生足以使生物分子稳定的光能。加热室126产生足以对生物分子稳定化室106内的样品进行巴氏消毒的热能。
图2显示了用于测试光能对水溶液中的生物分子的聚集的作用的一种示例性设备。生物分子稳定化室206包括用于保持样品瓶230的加热室226。至少一个样品瓶230容纳需要在室206中的处理期间至少部分地稳定化的试验生物分子样品240。在处理所述试验生物分子样品240期间，所述试验生物分子样品240暴露于光源224。所述处理可以例如是巴氏消毒。任选地，至少一个样品保持器含有参照生物分子样品250，其没有暴露于光能，但是在其它方面暴露于与图2的设备中的试验生物分子样品240相同的处理。
光源224可以被包括在图2的设备内，或可以在该设备的外面，并指向所述试验生物分子样品240。选择光源224以具有对所述试验生物分子样品240产生稳定作用的波长和功率。例如，在图2的光源224的一个示例性实施方案中，光源224由US Laser Corporation制备，在632.8nm(在光谱的红色部分)操作，具有0.63瓦/cm2的功率密度。
在另一个实施方案中，所述设备可以是连续流处理装置，其中将试验样品暴露于光能如激光达到给定的时间，同时使样品停留在连续流处理装置中。例如，所述连续流处理装置可以是活塞流反应器型装置或管壳热交换型装置。可以使所述连续流处理装置中的试验样品流过管或通道，同时进行处理，例如热处理以进行巴氏消毒，同时还暴露于光能以稳定化。
在一个实施方案中，图2的设备可以具有控制器(未显示)，所述控制器被构造成控制光能的操作波长和功率密度。所述控制器可以是反馈控制器，以基于通过检测器(未显示)检测的信号来控制光能的功率密度。
在一个方面，本公开内容涉及用于使水溶液中的不稳定生物分子稳定和防止变性的方法。变性通常定义为生物分子的结构中的任何共价或非共价变化。在蛋白的情况下，该变化可能改变所述分子的二级、三级或四级结构。本发明的方法可以应用于宽范围的各种蛋白，且不依赖于特定的辅基(prosthetic group)或特定的一级、二级或三级结构。如在实施例中详述的，已经测试了大量具有极大不同的结构和特性的蛋白。光能用于诱导水溶液中的生物分子的稳定性的用途，被认为可适用于在水中的许多不同类型的生物分子。
可以以各种方式测量生物分子的变性。用于跟踪变性过程的一种方法是，测量溶解度的变化。例如，蛋白在它们对聚集的抗性方面变化很大。溶解度的丧失，是响应于热而可能在生物分子中发生的一系列结构变化之一。在一些实施方案中，本公开内容的方法防止水溶液中的生物分子的溶解度丧失。例如，与没有暴露于光能的生物分子的样品相比，暴露于有效量光能的水溶液中的不稳定生物分子可以保留至少约99％的溶解度、至少约95％的溶解度、至少约90％的溶解度、至少约75％的溶解度、至少约50％的溶解度、至少约25％的溶解度或至少约10％的溶解度。
对于是酶的那些蛋白，变性可以包括结构的丧失，这使所述酶无活性。酶分子的变性，可能影响反应速率、底物亲和力、最佳pH、最佳温度、反应特异性等的变化。酶活性的丧失可以是变性的一种极灵敏的量度，因为一些测定程序能够检测非常低水平的产物。在一些情况下，可以证实活性的丧失仅在通过其它程序可以观察到结构的一些其它变化以后发生。大量蛋白分子可以表现出在性质上不是酶促的生物活性。例如，抗体能够与特定抗原分子相互作用。其它蛋白(如血红蛋白)可以起载体的作用，而一些蛋白(例如，铁蛋白)可以在特定组分的贮存中起作用。这些活性中的任一种的丧失，可以检测作为蛋白变性。在一些实施方案中，对于是酶的那些蛋白，变性可以定义为足以造成下述结果的结构丧失：使所述酶无活性，或引起反应速率、底物亲和力、最佳pH、最佳温度、反应特异性等的变化。
在一些实施方案中，本公开内容的方法防止水溶液中的生物分子的活性丧失。例如，与没有暴露于光能的生物分子的样品相比，暴露于有效量光能的水溶液中的不稳定生物分子可以保留至少约99％的活性、至少约95％的活性、至少约90％的活性、至少约75％的活性、至少约50％的活性、至少约25％的活性或至少约10％的活性。
本发明的方法的应用
意图用于本发明的方法中的生物分子包括生物学或工业上有用的任何生物分子。例如，生物学上有用的生物分子可以是这样的任何生物分子，其可以用于疾病的诊断、治愈、减轻、治疗或预防，或用于增强人或动物的期望身体或心智发展和状况。用于人和/或兽用药物或用于诊断(体内或体外)的多肽，特别是蛋白，是特别感兴趣的。工业上有用的多肽是这样的多肽，其用于生产的分析中，或其以其它方式用于化学工业中。还包括对于人和动物营养重要的生物分子。
在一个方面，所述方法用于使在生产或贮存过程中存在于药物产品或医疗装置中的一种或多种生物分子稳定。术语“药物”是指这样的任何物质：当被吸收到活有机体中时，其改变正常的身体功能。药物包括毒素、食物添加剂、变应原、补充物、维生素等。因此，本文所述的一些方法的用途包括改善治疗性多肽在生产和贮存过程中的稳定性。这样的多肽可以用于例如免疫(作为疫苗)、体外或体内诊断(以增加抗原或抗体的溶解度/稳定性)，以及治疗上有用的多肽，如生长因子、激素和类似的生物活性肽，如由以下举例说明的：α‑1‑抗胰蛋白酶、心钠素(atrial natriuretic factor)(利尿剂)、降钙素、钙调蛋白、绒毛膜促性腺激素(α和β)、集落刺激因子、促皮质素释放因子、β‑内啡肽、内皮细胞生长添加剂、表皮生长因子、促红细胞生成素、成纤维细胞生长因子、纤连蛋白、滤泡刺激激素、粒细胞集落刺激因子、生长激素(促生长素)、生长激素释放因子(促生长素释放素)、胰岛素、胰岛素‑样生长因子(生长调节素)、干扰素、白介素、促黄体素、淋巴毒素、巨噬细胞源生长因子、巨噬细胞抑制因子、巨噬细胞刺激因子、巨核细胞刺激因子、神经生长因子、胰腺内啡肽、甲状旁腺激素、血小板源生长因子、松弛素、分泌素、骨骼生长因子、超氧化物歧化酶、胸腺激素因子、胸腺因子、胸腺生成素、促甲状腺素、组织纤溶酶原活化剂、转化生长因子(α和β)、肿瘤坏死因子、肿瘤血管生成因子、血管活性肠多肽和伤口血管生成因子；免疫抑制剂，如RHO(D)ISG和IVGG的；溶栓剂如尿激酶、链激酶和组织纤溶酶原活化剂；以及抗原如Rhus all(毒葛(poison ivy))、Rhus tox毒葛‑多价和葡萄球菌噬菌体溶解物(葡萄球菌溶解物)。
在一个方面，所述方法用于稳定含有蛋白的药物(例如，疫苗)，其在生产和贮存过程中可能丧失功能性质。因此，使用本文所述的利用光能的稳定化方法，可以增强这样的物质的贮存和热处理。一种应用可以是储存不稳定的生物分子，其中蛋白的水溶液在恒定光能下储存。
在一个方面，所述方法用于使存在于食物和饮料产品中的一种或多种生物分子在处理如巴氏消毒过程中稳定。食物如牛奶和蛋需要通过热处理进行巴氏消毒，以便没有病原性生物。尽管从杀死某些不希望的生物的角度，期望高温巴氏消毒，但巴氏消毒通常使用可以使蛋白不可逆地聚集的高温。巴氏消毒过程的类型包括：高温/短时间(HTST)、延长的贮存期限(ESL)处理和超高温(UHT或超热处理)。在HTST过程中，生物材料如牛奶被迫在金属板之间或穿过管(它们通过热水在外部加热)，并被加热至71.7℃(161°F)达15‑20秒。UHT处理将生物材料如牛奶保持在138℃(280°F)的温度达一秒的几分之一。ESL处理具有微生物过滤步骤，且在比HTST更低的温度下进行。
实施例
通过参考以下实施例，将更容易地理解由此总体描述的本发明的组合物、方法和试剂盒，所述实施例通过举例说明的方式提供，而不用于限制本发明的方法和试剂盒。
实施例1‑使用红激光来稳定蛋白
在该实施例中，考察了光能对水溶液中的不稳定生物分子的聚集的影响。所述装置包括加热元件和激光器，如图2所示。所述激光器在632.8nm(在光谱的红色部分)操作，具有0.63瓦/cm2的功率密度。采取在360nm的180度散射(根据在360nm的OD)来测量聚集的程度，因为众所周知的，这种散射是蛋白形成聚集体的倾向的量度。将参照样品的蛋白的聚集作为100％，并且相对于参照样品的100％聚集，计算试验样品中的激光处理过的蛋白的聚集。
选取各种蛋白，包括血红蛋白(一种富α螺旋的蛋白)，其在60℃聚集；胰岛素(一种非常小的蛋白)，其通过二硫键断裂剂如二硫苏糖醇而在40℃聚集；和柠檬酸合酶(一种富β折叠的酶)，其通过在45℃的热处理而容易地聚集。
血红蛋白的热聚集。血红蛋白购自Sigma‑Aldrich(St.Louis，MO)，并且通过与100mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)混合而制备0.5mg/ml储备溶液。通过在60℃在Perkin Elmer分光光度计中测量360nm波长的辐射的吸收，持续时间为20min，观察0.1mg/ml血红蛋白溶液的聚集。用功率密度为0.63瓦/cm2且在632.8nm波长操作的He‑Ne激光器辐照试验样品。对照样品经过相同的条件，除了没有实施激光辐照。结果显示在图3中，并且表明，与未辐照的对照样品相比，激光辐照使血红蛋白聚集体的形成减少约25％。
图4示出了在60℃在有和没有红激光存在下蛋白血红蛋白的动态光散射图。血红蛋白在25℃的流体动力学直径为5.6nm。当这种蛋白溶液在没有红激光下在60℃加热20min时，流体动力学直径增加至4801.0nm。然而，在有红激光存在下，所述直径增加至仅255.0nm。因此，这些数据证实，用激光辐照防止了血红蛋白的聚集。
二硫苏糖醇诱导的胰岛素聚集。胰岛素购自ICN，并且通过与100mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)混合而制备胰岛素储备溶液(0.5mg/ml)。通过二硫苏糖醇(DTT，20mM)还原胰岛素(0.1mg/ml)的二硫键，这导致胰岛素在40℃聚集。在Perkin Elmer分光光度计中，在40℃的热处理以后，通过在360nm的吸收来测量蛋白的聚集。在有和没有激光存在下测量胰岛素的聚集。用功率密度为0.63瓦/cm2且在632.8nm波长操作的He‑Ne激光器辐照试验样品。对照样品经过相同的条件，除了没有实施激光辐照。结果显示在图3中，并且表明，与未辐照的对照样品相比，用激光辐照使胰岛素聚集体的形成减少约10％。
柠檬酸合酶的热聚集。柠檬酸合酶购自Sigma‑Aldrich，并且通过与100mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)混合而制备0.5mg/ml储备溶液。柠檬酸合酶在45℃容易从天然状态转化成它的聚集状态。通过在100mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)中，在Perkin Elmer分光光度计中，测量在360nm的光密度(OD)，来测量所述蛋白(0.1mg/ml)的聚集分布。用功率密度为0.63瓦/cm2且在632.8nm波长操作的He‑Ne激光器辐照试验样品。对照样品经过相同的条件，除了没有实施激光辐照。结果显示在图3中，并且表明，与未辐照的对照样品相比，用激光辐照使蛋白聚集体的形成减少约40％。
因此，显而易见的是，用激光辐照含有蛋白的样品导致防止蛋白的聚集。这样的聚集防止模仿分子伴侣辅助的折叠。在这种情况下，水分子的有序状态可以提供疏水模板，以维持所述蛋白的完整性。这样，本发明的方法可用于减少热不稳定的生物分子的聚集。
实施例3‑红光激光器功率对柠檬酸合酶聚集的作用的对比
进行了对比研究以显示红光激光器功率对柠檬酸合酶聚集的作用。通过在45℃测量360nm波长的辐射的吸收，来确定柠檬酸合酶的热聚集。将对照样品(在没有激光处理存在下)的聚集视作100％聚集，同时相对于对照样品的100％聚集，计算试验样品的经过处理的蛋白的聚集。图5显示了在以632.8nm、5mW功率操作、功率密度为0.63瓦/cm2的红光激光器存在下的60％聚集。然而，当相同的红光激光器的功率增加3倍至15mW(功率密度为1.9瓦/cm2)时，试验样品的聚集为约145％。因此，增加对试验样品的能量输入超过为了解折叠蛋白而增加活化能所需的能量输入，看起来会产生增加聚集的热能。这样，用于防止蛋白聚集的合适方法使用低功率红光激光器。
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本公开内容不受在本申请中描述的具体实施方案限制。如本领域技术人员显而易见的，可以做出许多修改和变化，而不脱离本发明的精神和范围。除了在本文中阐述的那些以外，本领域技术人员根据前面的描述会明白在本公开内容范围内的功能上等效的方法和装置。这样的修改和变化意图落入所附权利要求的范围内。本公开内容仅以所附权利要求以及这样的权利要求所具有的全部范围的等同替换进行限制。应当理解，本公开内容不限于具体的方法、试剂、化合物组合物或生物学系统，它们当然可以变化。还应当理解，在本文中使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，而不用于限制。
另外，在以马库什(Markush)组的方式描述本公开内容的特征或方面的情况下，本领域技术人员会认识到，本公开内容由此也依据马库什组的任何单个成员或多个成员的亚组描述。
本领域技术人员会理解，为了任何和所有的目的，特别地依据提供书面描述，在本文中公开的所有范围也包括它们的任何和所有的可能子范围和子范围的组合。任何列出的范围可以容易地视作足以描述和实现将同一范围分成至少相等的两份、三份、四份、五份、十份等。作为一个非限制性实例，在本文中讨论的每个范围可以容易地分成较低的三分之一、中间的三分之一、较高的三分之一等。如本领域技术人员还理解的，诸如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等的所有表述包括叙述的数字，并且指随后可以分成如上讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员理解的，一个范围包括各个单个的成员。因此，例如，具有1‑3种蛋白的组是指具有1、2或3种蛋白的组等。类似地，具有1‑5种蛋白的组是指具有1、2、3、4或5种蛋白的组等。
尽管在本文中已经公开了各个方面和实施方案，但是其它的方面和实施方案对本领域技术人员是显而易见的。在本文中公开的各个方面和实施方案是用于举例说明的目的而不用于限制，其中真实的范围和精神由所附权利要求指示。
在本文中引用的所有参考文献通过引用以其整体并入并用于所有目的，其程度如同将各个单个出版物、专利或专利申请明确地且单个地通过引用以其整体并入用于所有目的一样。