用于防治植物病原性真菌的生物杀真菌剂组合物.pdf

本发明涉及一种生物杀真菌剂组合物，其来自从葡萄皮获得的智利细菌分离株(对应于普城沙雷菌(Serratia？plymuthica)CCGG2742)的生物学纯培养物，其用作防治真菌植物病害(尤其是果实易被灰霉菌(Botrytis？cinerea)感染)的环境友好型生物防治剂，有效抑制所述植物病原性真菌的分生孢子萌发和菌丝体增殖。所述生物杀真菌剂组合物还保护植物叶子和果实免受所述真菌的感染，并且可以潜在地用于其它植物病原性真菌和微生物的生物防治中。

权利要求书普城沙雷菌(Serratia plymuthica)细菌菌株，其中所述细菌菌株是CCGG2742，其由国际保藏机构西班牙瓦伦西亚大学西班牙典型培养物保藏中心(Colecciónde Cultivos Tipo，CECT))指定的登录号为7404。
生物杀真菌剂组合物，其包含权利要求1的细菌菌株或从其衍生的具有同样生物学特性的活性提取物以及农业可接受的载体。
根据权利要求2的生物杀真菌剂组合物，当将所述细菌菌株以106～108cfu(菌落形成单位)/cm2剂量接种葡萄时，其存活为103～105cfu/cm2。
根据权利要求2的生物杀真菌剂组合物，其在4℃～40℃温度范围内生长。
根据权利要求2的生物杀真菌剂组合物，其在pH 3～10的范围内生长。
根据权利要求2～5中任一项的生物杀真菌剂组合物用于防治由植物病原性真菌在植物或果实中造成之真菌感染的用途。
根据权利要求6的用途，其中所述植物病原性真菌属于灰霉菌属(Botrytis)。
根据权利要求7的用途，其中105～108cfu/mL的有效剂量的细菌菌株CCGG2742或从其衍生的提取物用于防治灰霉菌(Botrytis cinerea)。
根据权利要求6～8的用途，其用于保护收获前或收获后状态、储存、运输和保存期间的果实。
防止果实腐烂的方法，其中向所述果实喷洒权利要求2的生物杀真菌剂组合物。
根据权利要求10的方法，其中通过喷洒液体培养物或用水溶液悬浮的冻干粉末来施加所述生物杀真菌剂组合物。

说明书用于防治植物病原性真菌的生物杀真菌剂组合物
技术领域
本发明涉及真菌毒性细菌(特别是普城沙雷菌(Serratia plymuthica)CCGG2742野生型菌株)及其分泌的真菌毒性分子，其作为植物病原性真菌(特别是在收获前后导致果实灰腐的灰霉菌(Botrytis cinerea)真菌)的生物防治剂。该细菌可在收获前后以活菌形式使用，这是因为其是一种对动植物均不显示致病性的野生腐生微生物。同时，也可以使用所分泌分子的浓缩物或者单独使用纯的真菌毒性分子制剂。
发明概述
本发明提供了表征为普城沙雷菌CCGG2742的野生型细菌菌株及其作为生物杀真菌剂的用途。所述细菌菌株已保藏于西班牙瓦伦西亚大学的西班牙典型培养物保藏中心(Colecciónde Cultivos Tipo，CECT))。国际保藏机构指定的登录号为CECT7404(参见所附文件)。这种源自智利的野生型细菌从葡萄皮中分离出来，并具有杀死植物病原性真菌灰霉菌之不同分离株和野生型菌株的能力。该细菌的杀真菌能力是由于其分泌真菌毒性分子所致，所述真菌毒性分子与真菌相互作用、破坏真菌并因此抑制分生孢子萌发以及真菌菌丝体增殖。
许多目前使用的生物杀真菌剂对于人和植物具有潜在的致病性。相反，普城沙雷菌CCGG2742对于植物或果实不具有致病性也不具有毒性，并且还发现其对于动物和人也不具有致病性。实验室研究表明，在仅含有1.5％(重量/体积)琼脂(用以维持适当水平的湿度)的培养皿中，在20℃接种7天后观察，发现将其接种到豆类和葡萄植物叶子中不会造成这些宿主任何可见的变化。以同样的方式，当将高水平的细菌菌株接种物(2×1010cfu(菌落形成单位)/葡萄浆果)加至健康或有伤口的葡萄中，在如上述同样的条件下接种7天后未观察到任何影响。
目前的细菌生物杀真菌剂存在的另一个问题是：其在需要保护免受植物病原性真菌侵害的植物和果实表面的存活时间短。实验室研究表明，将CCGG2742菌株以106～108cfu/cm2剂量接种于葡萄上，在果皮表面达到103～105cfu/cm2的水平，并且如果葡萄有伤口，则菌群在20℃接种24小时后生长至105～107cfu/cm2，当将果实保存在4℃，则维持同样的水平达5～7天，保护免受灰霉菌的感染。
本发明的生物学试剂对应于从田间(一般在葡萄皮上)分离的并且已通过生物化学、微生物学，电子显微镜和16S rDNA测序技术鉴定的野生细菌。普城沙雷菌CCGG2742是源于智利的菌株，其对应于腐生生物，对动植物无致病性，因此其活细胞适于用作抗灰霉菌的生物杀真菌剂。
此外，本发明涉及含有所述细菌菌株或含有所述细菌菌株之提取物的组合物，或者涉及含有从其衍生之化合物(例如，所述细菌菌株分泌的真菌毒性分子)的溶液或混合物，所有这些都能够保护植物及其果实在收获前后期间免受植物病原性微生物的侵害。
本发明还包括从野生型菌株衍生的、具有基本相同之特征的突变体。
同样地，本发明涉及获得所述细菌菌株或其衍生物的方法，并且涉及其在保护植物(尤其是果实)中的应用。
此外，本发明提供了使用纯的普城沙雷菌CCGG2742细菌菌株防治植物中真菌病害的制剂。使用该细菌作为化学合成之杀真菌剂的天然替代物，从而为实现植物病原性真菌病害的防治或消除确保了更安全的环境。
最后，本发明提供了含有生物学活性之合适形式和量的所述细菌菌株的组合物。该混合物含有能够使细菌粘附到其所接种之植物上的无毒试剂、植物营养物和防腐剂。该混合物以液体悬液或冻干粉末的形式存在。
背景技术
由植物病原性真菌导致的病害被认为是世界范围内最有害且传播较广的病害。目前，这些病害的防治主要基于化学杀真菌剂的使用。由于缺乏有效的和环境更安全的替代物，尽管化学杀真菌剂对于植物和操作者和/或在喷洒区域工作的人具有高毒性，并且其几乎不被生物所降解，但是因为其对抗真菌病害相对有效的活性所以仍在大量使用。
灰霉菌是一种感染很多重要经济作物品种(包括果树、观赏植物和蔬菜)的植物病原性真菌。该真菌导致称为“灰霉病”的病害，造成草莓、覆盆子、苹果、梨、栗子、猕猴桃和葡萄等收获前后的主要问题。在葡萄中该真菌导致葡萄腐烂病(pudrición del racimo)，这被认为是目前在智利的水果出口市场上影响生产水平的最严重病害之一，因为其不仅在田间而且在储存和运输过程中均可造成巨大的损失(van Kan J.A.2006.Licensed to kill：the lifestyle of a necrotrophic plant pathogen，Trends Plant Sci.11，247‑253；Elad，Y.，Williamson，B.，Tudzynski，P.和Delen，N.编.2007.Botrytis：Biology，Pathology and Control.The Netherlands：Kluwer Academic Publishers)。
目前，这种重要的植物病原菌的防治主要通过化学杀真菌剂来实现。但是，在过去几年中，已描述了一些具有抗灰霉菌之抗真菌活性的微生物。一些最有前景的实例有其活性原理是称为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QST 713的细菌，其由加州戴维新的AgraQuest Inc，公司在菜园土壤样本中发现。这种杀真菌剂在多个国家(包括智利)注册。其具有低毒性，并且其作为商品在美国用于病害(例如粉孢子(葡萄白粉菌(Uncinula necator))，灰霉菌导致的灰腐和葡萄中的酸腐)防治。
美国专利No.5，869,038描述了荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、液化沙雷菌(Serratia liquefaciens)、普城沙雷菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)和多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)的细菌分离株，其有效地抑制导致白菜收获后病害的灰霉菌和甘蓝链格孢菌(Alternaria brassicicola)真菌的发生。该专利所述的普城沙雷菌对应于菌株CL43，其不同于本发明中的细菌菌株，并且为了具有合适的抑制真菌发生的效果，其通常与先前提及的细菌混合使用。相反，细菌菌株CCGG2742作为纯培养物，有效地抑制灰霉菌，并且不必为了用作杀真菌剂而与其它细菌混合。
美国专利No.6,004,774公开了抑制致病性植物真菌和细菌发生的枯草芽孢杆菌菌株，并描述了治疗或保护植物免受真菌和细菌感染的方法。
美国专利No.6,077,506涉及一种新的显示广谱抗真菌和抗细菌能力的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细菌菌株。此外还描述了使用该苏云金芽孢杆菌细菌菌株或其产生的抗生素防治广谱的植物病原性细菌和真菌。
WO 00/57706公开了成团泛菌(Pantoea agglomerans)细菌菌株基本上纯的生物培养物，其用作生物防治造成果实腐烂之真菌的拮抗剂。这些拮抗剂具有非常高的效力，并且与那些最常使用的合成抗真菌剂相当。该拮抗剂有效地对抗由灰霉菌、指状青霉菌(Penicillimn digitatum)、扩展青霉菌(Penicillium expansum)、意大利青霉菌(Penicillium italicum)和匍枝根霉菌(Rhizopus stolonifer)导致的腐烂。
WO 02/072795公开了一组细菌，其为抗御植物病原性真菌和细菌的拮抗剂。这些分离的细菌有多粘芽孢杆菌、绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、普城沙雷菌、和枯草芽孢杆菌菌种。在该情形中，所述细菌菌株普城沙雷菌VKPM B‑7957也不同于本发明的细菌菌株，因为当作为纯培养物使用时，此细菌抗植物病原性真菌的效力很低，并且其必须与其它具有杀真菌活性的细菌混合使用以增强其效果。
WO 03/000051公开了一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)细菌菌株SB3086的生物学纯培养物用作生物杀真菌剂。
将活生物体用作生物防治剂具有一些局限性，例如抗植物病原体的有效范围窄，随时间不稳定，这造成活生物体在环境中的存在时间短，因而导致非常低的生物杀虫剂活性。当使用标准储存条件时，很多所使用的细菌菌株在几周内死亡，或者在田间使用典型条件(具有较高的温度和对于活跃生长之微生物有害的紫外线)下几小时内死亡。在应使用所述微生物的同样位置培养所述微生物的尝试已取得一些效果。但是，培养物污染的严重问题以及生物防治剂需在晚间施用(以防紫外线和温度影响)的需要使系统复杂，并且造价昂贵。
这表明目前尚没有设计出能够抑制真菌病害造成之植物损害的有效的且环境友好的生物防治方法，因此，减少目前大量使用的合成化学杀真菌剂的使用向科学家提出了巨大的挑战，也是农业的巨大需求。
因此，本发明的一个目的是提供具有生物杀真菌活性的有效的、环境安全的生物学试剂，用于防治由植物病原性真菌和微生物(特别是灰霉菌)造成的植物病害。
附图说明
图1是普城沙雷菌CCGG2742细胞的扫描电镜照片。左下角的短线表示1μm。
图2是普城沙雷菌CCGG2742的显微镜照片。用1％磷钨酸钾进行负染。
图3是普城沙雷菌CCGG2742超薄切片的显微镜照片。
图4示意普城沙雷菌CCGG2742在不同温度下的生长图示。
图5示意普城沙雷菌CCGG2742在不同pH值缓冲的培养基中的生长图示。
图6显示生物杀真菌剂细菌对灰霉菌菌丝体的作用。
图7显示普城沙雷菌CCGG2742的16S rDNA的部分核苷酸序列。
图8显示作为生物防治剂的细菌于20℃在果实中孵育的效果。
图9显示作为生物防治剂的细菌于4℃在果实中孵育的效果。
发明详述
所述细菌菌株CCGG2742对应于普城沙雷菌菌种。通过微生物测定和生化测定得出的其特征示于表1、2和3中。其在Luria Bertani(LB)琼脂中以及在补充有麦芽提取物(20g/L)的琼脂中产生无色/白色菌落，无色素沉着。
表1.普城沙雷菌CCGG2742的形态学和生理学特征
  类型  芽孢杆菌  革兰氏菌株  阴性  运动力  +  色素产生  ‑  4℃生长  +
表2.表征普城沙雷菌CCGG2742的生化测试。括号中是测试名称，测试结果标注为阳性(+)或阴性(‑)。

表3.普城沙雷菌CCGG2742的碳水化合物发酵。标注了阳性(+)和阴性(‑)反应。此外，括号中注明了每个测试所使用的缩略语。


此外，测定了普城沙雷菌CCGG2742对各种抗生素的敏感性，结果示于表4中，其中标注了所测试之抗生素及其浓度，并且其中根据抗生素所属的家族对其进行了分类。
表4.普城沙雷菌CCGG2742对各种抗生素的敏感性。标注了对每种抗生素的敏感性(S)或抗性(R)。


在光学显微镜水平，培养物包含运动的革兰氏阴性杆菌，而在扫描电镜水平，可以清晰地观察到杆菌形态，其长0.7～1.5μm，宽0.6～0.8μm(图1)。扫描电镜分析不能检测到细菌附器的存在。但是，使用负染技术和细菌超薄切片，在透射电镜下可以检测到鞭毛的存在(图2和3)，这与运动力测试非常相符。
确定了该细菌菌株的最佳生长温度范围，为4℃～37℃，超出上述温度范围则不生长。此一结果的可视示意图可见于图4，其中每个条件下细菌的生长(在DO600nm下测量)表示为孵育12小时时的情形。生长温度范围相当宽，这是一个非常重要的实验信息，因为细菌可以在果实收获前的时期用作生物杀真菌剂，其中田间温度可从冬天很低的温度到夏天很高的温度。此外，果实在收获后通常储存在低温下，一些植物病原性真菌(如灰霉菌)可以在低温下生长，于是在这种储存条件下发生果实腐烂。因此，极为重要的是，所述细菌可以在低温下生长，从而拓宽了此参数的范围，并且能够将其用作收获后的生物杀真菌剂。
而且，所述细菌能够在宽的pH范围下生长(图5)，这同样是一个有利的性质，因而在用作生物杀真菌剂时提供了更广的造用性。为了测定pH对细菌生长的影响，绘制了以多种不同pH值调节的培养基中的生长曲线。图5显示了针对培养基中存在之不同质子浓度的细菌菌株孵育12小时时的生长情形。已确定最佳细菌生长的pH为4～9，并包括两个端值。
图6显示了普城沙雷菌CCGG2742抗灰霉菌的拮抗效果。在(A)和(B)中，观察到细菌释放的真菌毒性分子(其扩散在琼脂中)产生抑菌斑，并阻止真菌生长。在(A)中，使用不含活性组分的平板作为阴性对照。
除了对该细菌进行微生物学和生化表征以外，还通过确定16S rDNA的核苷酸序列及其生物信息学分析对其进行分子表征。图7显示普城沙雷菌CCGG2742的16S rDNA的部分核苷酸序列(994个核苷酸)。使用Blast将该序列与数据库中已有序列进行比对，结果如下：
表5：使用BlastN，普城沙雷菌CCGG2742之16S rDNA比对结果。标注了软件计算出的参数值。

因此，微生物学、生物化学、电镜和16S rDNA测序均证实了：从智利采集的葡萄皮中分离出的菌株是一个新的普城沙雷菌细菌菌株，我们将其命名为CCGG2742。
实验部分
普城沙雷菌CCGG2742新菌株的增殖方法
该细菌可在固体和液体培养基中增殖。下文所述的培养基适于细菌细胞的快速生长，并有助于真菌毒性分子的分泌：
i)麦芽提取物20g/L
ii)LB(Luria Bertani)培养基。该培养基含有酵母提取物(5g/L)、胰化蛋白胨(10g/L)和NaCl(10g/L)。pH须调至7.5。
在任意这些培养基中，在加入细菌接种物后，在20℃最短孵育12小时。对于固体培养基而言，加入15g/L琼脂。
确定针对植物和果实的有害或病原性作用
根据所得实验结果，普城沙雷菌CCGG2742对植物(大豆和葡萄)叶子或果实(葡萄)不显示病原性作用。
实验方法如下：将不同稀释度(约1×106～2×1012cfu/mL)的培养在LB中的10μL细菌培养物滴加接种未经碰触的葡萄(无损伤)表皮上。同时，针对另一葡萄浆果，通过穿刺果实表皮(注射细菌)来接种同样体积(10μL)、同样稀释度的培养物。葡萄浆果接种7天后未观察到接种有活细菌的果实有任何形式的外部或内部变化。这些实验使用白色和粉色葡萄浆果一式三份进行。作为对照的葡萄浆果在上述同样条件下接种，只是不接种细菌而接种10μL无菌LB培养基。在20℃整个孵育期间，果实保持在含1.5％琼脂(用于维持湿度)的玻璃皿中。
确定普城沙雷菌CCGG2742的最佳生长温度和pH条件
使用麦芽提取物培养基(ME；麦芽提取物20g/L，蛋白胨1g/L)在如下温度下确定细菌菌株的生长温度范围：4、10、20、25、30、35、37和40℃(图4)。将来自培养16小时、600nm下光密度(DO600nm)为0.8的培养物的1毫升细菌接种物接种到含有50mL ME的Nefelo Erlenmeyer瓶中，使其持续振摇(200rpm)。针对每个实验采用的温度，记录不同时间的DO600nm，在0～12小时期间每1小时记录一次，并记录24、48和72小时的数值。用分光光度计(Spectronic 20，Bausch&Lomb)测量DO600nm值。在30℃测定细菌菌株生长的pH范围，除了使用缓冲液而非蒸馏水来配制ME培养基之外，使用与确定温度范围时同样的方法。对于pH 3、4、5和7，使用磷酸‑柠檬酸缓冲液；对于pH 9，使用Tris‑HCl缓冲液；对于pH 10，使用甘氨酸‑NaOH缓冲液(图5)(Gomori G.1955.Preparation of buffers for use in enzyme studies.Methodsin Enzymology.Colowick S.，Kaplan N.编1：138‑146)。使用生长12小时的测量结果制作细菌生长的温度和pH范围的示意图。每个生长曲线都一式三份制作。
抑制菌丝体生长的生物测定
生物测定中使用的灰霉菌Bc149和Bc55L细菌菌株属于真菌病毒学实验室(Laboratorio de Virología de Hongos)‑USACH，其从葡萄分离出来。这些细菌菌株保存在琼脂马铃薯‑葡萄糖(PDA；Oxoid)中，直至进行生物测定。
抑制菌丝体生长的生物测定在补充有2％甘油的琼脂麦芽提取物(MEA；麦芽提取物20g/L，蛋白胨1g/L，琼脂15g/L)中进行。取一块直径7mm的灰霉菌Bc149菌丝体接种到培养皿中心。将细菌接种到一端(图6A)或者距培养皿中心4cm的4个不同位置(图6B)。接种物包含总共约1×106CFU的细菌菌株。在20℃下观察7天生长情况。作为对照，不接种细菌菌株进行同样的实验。这些测定均一式三份进行。
普城沙雷菌菌株的杀真菌效果
用105～108cfu/mL接种大豆和葡萄叶子。在20℃孵育12小时，然后使用分生孢子浓缩悬液(104～106个分生孢子)将植物病原性真菌喷洒到植物上。孵育4～8天后，与未添加植物病原性真菌孢子的对照以及未接种细菌的叶子相比，确定植物的感染程度或损伤情况。所述实验均一式三份进行。当以保护性方式施加所述细菌时观察到有效的适当保护。当与病原体同时施加时、向植物施加病原体0、12或24小时后施用同样有效。
为了评价细菌作为直接用于果实之生物防治剂的效果，使用智利圣地亚哥首都大区Colina收获的Thompson无籽品种葡萄串。葡萄串未接受收获后处理，重500～620g。根据表6详细列出的实验条件，直接接种实验条件1和2使用的葡萄串。将实验条件3～9以及对照使用的葡萄串用0.5％次氯酸钠溶液清洗一次，然后用无菌蒸馏水清洗3次，然后在无菌环境下干燥。然后将每串葡萄保存在一个塑料盒中，分别根据各实验条件进行处理。
表6.每个实验条件下对葡萄串进行处理。根据每个实验条件，葡萄串上存在的普城沙雷菌CCGG2742之总cfi或灰霉菌Bc55L之总分生孢子数详列如下。


＊对应于在0小时接种处理后24小时的接种处理。
本实验在两个温度下进行：20℃(图8)，其中观察15天病原体生长情况；4℃(图9)，其中观察40天病原体生长情况。每个实验条件均一式三份施加。在这两个温度条件下，细菌菌株CCGG2742有效地保护果实免受灰霉菌的感染。这是与美国专利No.5，869,038所述之CL43菌株的另一个重要区别。在4℃进行实验时，CL43菌株的抗真菌效力明显下降。
孢子和细菌细胞的施加必须使用油性溶剂(其能使分生孢子和细菌粘附到植物上)。其必须重悬到含有0.5％Pelgel(Liphatech，Milwaukee，WI)作为粘附组分的水溶液中。Pelgel是羧甲基纤维素和阿拉伯胶的混合物。除了提供与分生孢子和细菌的粘附特性以外，其还允许粘附到植物表面，并且其可用作营养物。
细菌杀真菌剂的储存和维持
可使用一般的细菌学技术在实验室中无限期地维持细菌菌株CCGG2742。短期保存(1～3个月)通过将细菌接种到具有营养性琼脂斜面的试管中、并将试管保持在4℃冰箱中来实现。对于6个月到1年的长期保存，需要在‑80℃将浓缩的细菌悬液冻存于30～50％(体积/体积)甘油中。最后，如果要使细菌保存更长时间，必须使用冻干技术。此细菌的培养物完全可进行冻干处理，冻干物可在室温下保持非常稳定的形式至少1年。