一种基于荧光共振能量转移技术的白三烯B4受体1拮抗剂药物筛选模型技术领域
本发明属于药理学领域，利用细胞稳定转染和均相时间分辨荧光检测技术，构建了白三
烯B4受体1拮抗剂药物的筛选模型，用于待测样品对BLT1的拮抗作用的高通量检测。
背景技术
白三烯B4受体1(BLT1)是一种G蛋白偶联受体，在花生四烯酸代谢途径中发挥着重
要作用。白三烯(LT)通过激活BLT1在支气管哮喘、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化及多
发性硬化等疾病进程中发挥着重要的作用。
IP3是一种重要的第二信使，介导胞内Ca2+通道开放，增加胞内Ca2+浓度，引起生理反
应。胞内IP3是PIP2经PKC催化产生，PKC可在GPCRs与GTP结合蛋白Gαq相互作用后
而激活。这些G蛋白是由Gα，Gβ和Gγ三种亚基组成的异三聚体分子。激动剂介导的GPCRs
激活可导致GTP结合上Gα亚基，引起构象改变，导致三聚体解离成Gα和Gβγ。解离后，Gαq
参与PKC的激活。IP3不稳定，在胞内逐步降解为IP2、IP1。IP1在LiCl存在下可稳定存在。
测量胞内IP1是检测待测化合物对于GPCRs介导的PKC激活作用的方法。
IP1assay是一种均相时间分辨荧光共振能量转移免疫分析方法，以检测在GPCRs调控
下PKC活性变化后产生的IP1。该方法基于d2标记的IP1示踪剂与样本IP1竞争结合Eu3+-
穴状物标记的IP1特异性抗体的结合位点。当抗体结合了d2-IP1示踪剂，337nm处的激光可
激发Eu3+-穴状物分子，其发出的能量被转移到示踪剂的d2分子上，而发出665nm的荧光，
在665nm处的荧光强度随着待测样品中的IP1含量的增多而减弱，因此信号强度与样品中IP1
浓度成反比。对于Gαq耦联的受体，细胞受到激动剂作用而激活会导致IP1水平增加，同时
665nm处的荧光强度减弱。加入拮抗剂后该反应逆转，导致信号增强。
发明内容
本发明的目的在于建立稳转细胞株白三烯受体BLT1拮抗剂高通量筛选模型，具有灵敏度
高、步骤少、无损失、结果准确的特点。
本发明的技术方案：确定稳转细胞株白三烯受体BLT1拮抗剂药物筛选模型构建条件，运
用IP1assay免疫分析法验证激动剂对稳转细胞株BLT1受体的激动作用，以及拮抗剂对稳转
细胞株BLT1受体的拮抗作用。
步骤一：白三烯受体BLT1拮抗剂筛选模型的建立与优化。
步骤二：阳性药验证模型可靠性。
步骤三：高通量筛选模型验证。
附图说明：
图1：IP1标准稀释液在Paradigm中的读值。(n＝3，![]()
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图2：LTB4作用激动BLT1稳转细胞产生的量效曲线。(n＝3，![]()
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图3：LY293111拮抗BLT1稳转细胞产生的量效曲线。(n＝3，![]()
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具体实施方式
以下结合附图说明本发明的具体实施方式：
一、白三烯受体BLT1拮抗剂筛选模型的建立
1、实验材料
CHO-K1/Gal5/BLT1细胞株、F12、10％FBS、2μL/mLHygromycin、StimulationBuffer
(SB)、CO2培养箱、384孔板、ParadigmTMDetectionPlatform。
2、实验步骤
(1)细胞培养
1)T25中培养的细胞贴壁度要达到80％，达到对数生长期。
2)将贴壁细胞经EDTA消化、离心后重悬，对细胞计数。
3)用培养基稀释细胞悬液，使细胞密度达到3×106cells/mL，将此细胞悬液移入T25培
养瓶中，在37℃/5％CO2环境下培养细胞。
4)用于确定细胞数、验证阳性药及筛选BLT1拮抗剂试验的CHO-K1细胞应是复苏后
至少传代3次且达到稳定生长状态的细胞。于实验前将其用PBS润洗细胞一次，接着用0.5mM
EDTA消化，离心，去除上层液体，最后将细胞用适量SB重悬至所需细胞密度。
(2)标准曲线的测定及最佳细胞数确定
1)配制IP-one标准稀释液：P1标准溶液(试剂盒自带)逐级稀释为最终浓度的2倍。
2)配制激动剂LTB4梯度稀释液：用BLT1激动剂LTB4刺激细胞产生IP1，根据最终
拟合曲线得到的EC50和窗口值确定最佳细胞数。(见图1)。
3)配制不同浓度的细胞稀释液：用IP1StimulationBuffer将(1).4)中重悬好的细
胞分别稀释为15000cells/μL、20000cells/μL、25000cells/μL。
4)加样：a：将(2).1)中稀释好的IP1溶液加入384白板中，每孔14μl，三个复孔；
b：将(2).2)中稀释好的LTB4溶液按每个浓度3个复孔，7μl每孔加入384孔板中，接着
向其中分别加入(2).3)配制好的不同浓度的细胞稀释液7μl。此时标准曲线和反应孔反应
体积均为14μl。将TopSeal-A膜贴于板面并37℃孵育1h。
5)终止试剂：用Lysisbuffer(LB)将IP1-d2及anti-IP1稀释33倍，按1∶1混匀平
衡室温后加入各孔，每孔6μL。将384孔板在500rpm下离心5s，使20μL试剂混合均匀以
充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放于室温下继续孵育1h。
6)检测：孵育时间到达后，揭去TopSeal-A膜，将板放于设定好程序的ParadigmTM
DetectionPlatform上检测。处理数据，确定最佳细胞数和激动剂ET-1的EC50和EC80。(见图
2)
(3)拮抗剂验证
1)配制BLT1拮抗剂LY293111梯度稀释液：拮抗剂LY293111母液浓度为4.6mM，用
IP1StimulationBuffer逐级稀释为终浓度的5倍。
2)配制含最佳细胞数的溶液：用SB将(1).4)中重悬好的细胞稀释为(2).6)中得
到的最佳细胞浓度(14000cells/well)。(见图2)
3)加样：将(3).1)中稀释好的LY293111溶液按每个浓度3个复孔，3.5μL每孔加
入384孔板中。将(3).2)配制的细胞溶液按每孔7μL加入384孔板中。将384孔板在500
rpm下离心5s，使10.5μL试剂混合均匀以充分反应。为防止试剂蒸发造成损失，将TopSeal-A
膜贴于板面并将板放于室温下使之孵育30min。
4)将LTB4母液稀释成(2).6)中测定的EC80，每孔3.5μl加入对应的含塔索罗辛的
384孔板中。将384孔板在500rpm下离心5s，使14μL试剂混合均匀以充分反应。为防止
试剂蒸发造成损失，将TopSeal-A膜贴于板面并将板放于37℃/5％CO2下使之孵育45min。
5)按(2).5)配制终止试剂。向每孔加入6μLIP1-d2/anti-IP1溶液(1∶1)。将384
孔板在500rpm下离心5s，使20μL试剂混合均匀以充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将
板放于室温下继续孵育1h。
6)孵育时间到达后，揭去TopSeal-A膜，将板放于设定好程序的ParadigmTMDetection
Platform上检测。处理数据，确定拮抗剂的IC50。(见图3)
二、数据处理
1、根据最终拟合曲线得到的EC50和窗口值确定最佳细胞数。
2、根据LTB4作用激动BLT1稳转细胞产生的量效曲线处理数据，确定最佳细胞数和激动
剂ET-1的EC50和EC80。
3、根据LY293111拮抗BLT1稳转细胞产生的量效曲线，确定拮抗剂的IC50。
实验结果
确定稳转细胞株白三烯受体BLT1拮抗剂药物筛选模型构建条件，每孔细胞数为20000
cells/μL，即14000cells/well时，所得到激动剂EC50与报道值最接近且窗口值最大。(见图1、
2)通过该模型验证了激动剂对稳转细胞株BLT1受体的激动作用，其EC50为30.92nM。同时
验证了拮抗剂对稳转细胞株BLT1受体的拮抗作用，其IC50为1971nM。(见图3)