高耐酸植物乳杆菌ZDY2013.pdf

本发明公开了一株具有很强耐酸性的植物乳杆菌ZDY2013保藏地点为武汉市中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2014170。本发明植物乳杆菌分离于福建省农家自制酸豆角，为革兰氏阳性菌，生长速度快，极耐酸耐胆盐，能在胃肠液中保持较高的存活率，并能抑制食源性致病菌的增长。此外，还能调节肠道菌群多样性，改善宿主胃肠道健康。

1.耐酸植物乳杆菌ZDY2013，于2014年4月28日保藏在中国典型
培养物保藏中心，编号：CCTCCNO:M2014170。

高耐酸植物乳杆菌ZDY2013

技术领域

本发明属于微生物领域，公开一种新型的耐酸性很好的植物乳杆菌。

背景技术

植物乳杆菌是一种革兰氏阳性菌，最适生长温度为30-35℃，兼性厌氧。菌体呈短杆状，不产芽孢，在MRS琼脂平板培养基中呈乳白色不透明，圆形，光滑的菌落。植物乳杆菌为同型发酵乳酸菌，能利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖等，在发酵过程中只产生乳酸，是典型的兼性厌氧菌，有很强的的发酵碳水化合物的能力，较耐盐。植物乳杆菌与人类的生活密切相关，被广泛用于乳制品、肉类、蔬菜以及果汁中，能通过胃肠道并定植于肠道发挥益生作用。植物乳杆菌已被广泛应用于食品发酵、乳酸发酵和医疗保健。

发明内容

本发明的目的在于提供一种性能优良的植物乳杆菌。

本发明从传统发酵酸豆角中分离出植物乳杆菌，具有良好的益生性能，极高的耐酸耐胆盐性，耐胃肠液，抑菌性和抗药性；并且能调节肠道菌群，降低肠道中的条件致病菌，提高乳杆菌和双歧杆菌的比例，促进肠道健康，发挥益生菌的优良性能。

本发明耐酸植物乳杆菌ZDY2013(LactobacillusplantarumZDY2013)，于2014年4月28日保藏在中国典型培养物保藏中心(中国武汉武汉大学)，编号：CCTCCNO:M2014170。

本发明耐酸植物乳杆菌ZDY2013可以在MRS琼脂平板培养基上生长，为革兰氏阳性杆菌，属于兼性厌氧生长，不产芽孢。为维持时间稳定地保存本发明植物乳杆菌的优良性能，将其保存在含有15％甘油的混合保存液中，于-80℃冻存，或将其保存在10％的脱脂乳中进行冻干保存。

为了对微生物进行鉴定和分类，对本发明所述植物乳杆菌ZDY2013进行了16SrDNA序列分析，结果为，与植物乳杆菌N3114显示出最高的同源性(99％)，显示出与植物乳杆菌最高的分子系统学上的亲缘关系。因此，将此微生物鉴定为植物乳杆菌，并命名为植物乳杆菌ZDY2013。于2014年4月28日保存于武汉市中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2014170。植物乳杆菌ZDY2013的16SrDNA测序结果显示的碱基序列如本说明附件中的碱基序列表所示。

本发明的植物乳杆菌ZDY2013作为益生菌，不仅极耐酸耐盐，且具有抑菌性，能调节肠道微生态，促进宿主健康。是一株性能优良的菌种。因此具有很高的研究价值和应用价值。

有益效果：本发明植物乳杆菌相比常规植物乳杆菌具有很高的耐酸耐胆盐能力，对胃肠液的耐受能力，以及对肠道上皮细胞优异的粘附力，还具有调理肠道微生态的作用。本发明所述植物乳杆菌对抗生素具有一定的耐受性，其生长代谢过程中所产生的的有机酸，过氧化氢和生物素能抑制肠道致病菌的生长。从另一个侧面来说，本发明所述植物乳杆菌可用于制作治疗和预防肠道疾病的组合物，还可以用于食品和饲料的防腐。

附图说明

图1植物乳杆菌典型株ATCC8014和植物乳杆菌ZDY2013的生长曲线

图2植物乳杆菌典型株ATCC8014和植物乳杆菌ZDY2013的耐酸性

图3植物乳杆菌ZDY2013体外模拟胃肠道转运后的存活率

图4植物乳杆菌ZDY2013发酵上清液对致病菌的抑菌圈直径

具体实施方式

以下结合实例来进一步解释本发明，但实施例仅用于说明本发明，而本发明的应用范围不能以任何方式由这些实施例所限制。

实施例1：植物乳杆菌ZDY2013的分离与鉴定

从福建省永安市乡镇收集农户自家天然发酵的酸豆角样品，并及时将样品带回实验室进行乳酸菌分离。将酸豆角发酵液以10^-1的梯度稀释，涂布于MRS(加溴甲酚紫作为指示剂)琼脂平板上，厌氧培养24h，挑取使培养基变黄的单菌落，在平板上划线分离，反复进行纯化培养，用革兰氏染色法观察菌落形态选出革兰氏阳性菌。将分离得到的菌株液体培养后，用PH计检测培养24h时pH值，筛选出产酸能力强的菌株。用接种环挑取单一的菌落作为模板，进行菌落PCR。将阳性PCR产物送至公司测序，见序列表。

将16SrDNA序列与数据库进行比对分析，所分离菌株的碱基序列与植物乳杆菌N3114具有很高的同源性(99％)，因此被确认为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌ZDY2013，于2014年4月28日保存于武汉市中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2014170。经纯培养24小时后植物乳杆菌ZDY2013的培养上清液pH值为3.4，能产生大量有机酸。革兰氏染色结果呈阳性，可观察得出ZDY2013为棒状短杆菌。

如图1两条生长曲线所示，与植物乳杆菌典型株LactobaccillusplantarumATCC8014相比，植物乳杆菌ZDY2013具有更好的生长性能，生长速度更快，生物量更高，更长的稳定期。

实施例2：耐酸性评价

将植物乳杆菌的单菌落接种于5mLMRS培养基，37℃厌氧发酵18h，传代两次。以1％接种量分别接种于pH为6.5、5.0、3.5和2.0的MRS液体培养基中，测定初始活菌数以及随后的3h，6h，12h和24h的活菌数。

实验结果：

如图2所示，与植物乳杆菌典型株ATCC8014相对比可以发现，植物乳杆菌ZDY2013具有更强的耐酸能力，其能在较大的酸性范围(pH3.5-pH6.5)内生长，并且在pH2.0的MRS培养基中能维持3小时后无明显变化，6小时后活菌数无显著下降。这种长时间的耐酸性是植物乳杆菌典型株植物乳杆菌ATCC8014所不具有的。同时也说明ZDY2013具有长时间在胃肠道中存活的能力。其应用在生产加工中时，对加工条件的酸碱性要求更低。

实施例3：体外模拟胃肠液转运

将植物乳杆菌接种于模拟胃液，pH调为3.0，孵育90min，计数活菌数和存活率，将培养液离心用生理盐水洗一次后加入模拟十二指肠液，孵育10min，计数活菌数和存活率，将培养液离心用生理盐水洗一次，离心加入模拟肠液，孵育120min，计数活菌数和存活率。实验结果：

见图3，结果表明，植物乳杆菌ZDY2013在经胃液，十二指肠液和肠液连续孵育后存活率达到65.84％，活菌数高于益生菌在胃肠道中定植和发挥益生功能的最低要求溶度(10⁶cfu/mL)。综合耐酸性实例和模拟胃肠转运实例，可得出植物乳杆菌ZDY2013具有更好的耐受性，在低pH和胆汁中能存活，顺利通过胃和十二指肠，保持足够高的活力到达小肠。

实施例4:发酵上清液的抑菌能力

将植物乳杆菌的单菌落接种于5mLMRS培养基，37℃厌氧发酵18h，传代两次。离心得上清液。将牛津杯置于MRS琼脂平板上，加入200uL发酵上清液。厌氧培养24h，用卡尺测定其抑菌圈的直径。

实验结果：如图4所示植物乳杆菌ZDY2013的发酵上清液对八种食源性致病菌都具有抑制作用。对单增李斯特的抑制效果最明显。抑菌圈直径分别为，单增李斯特菌(L.monocytogenes，28.33±0.76mm)，铜绿假单胞菌(P.aeruginosa，21.83±0.58mm)，鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium，19.17±0.29mm)，阪崎肠杆菌(E.sakazakii，14.17±0.20mm),大肠杆菌(E.coliO157:H7，18.00±0.50mm)，宋内氏志贺氏菌(S.sonnei，14.33±0.58mm)，蜡样芽胞杆菌(B.cereus，17.83±0.29)，和金黄色葡萄球菌(S.aureus，12.33±0.29mm)。

实施例5：调节胃肠道微生态抑制肠道致病菌。

20只小白鼠随机分为两组，实验组和对照组。实验组每天灌胃200uL菌悬液，对照组等剂量的生理盐水。14天后取结肠和盲肠内容物，以及粪便。用实时荧光定量PCR技术分析肠道菌群的变化。

实验结果：荧光定量PCR结果显示(如表1)，

表1

肠道七大类菌群的定量检测结果(倍数大于1表示数量上升，小于1表示数量下降)。小鼠在接受完植物乳杆菌ZDY2013连续灌胃14天的处理后，与对照组相比，肠道和粪便中的微生态发生了明显的改变，主要趋势为有益菌数量上升，条件致病菌数量下降，肠道健康得到明显的改善。有益菌数量的增加，具有维持肠道内菌群平衡，提高机体免疫力，促进营养物质吸收等多种功能。