一种高纯度放线菌素D的提纯方法技术领域
本发明具体涉及一种高纯度放线菌素D的提纯方法。
背景技术
放线菌素D(ActinomycinD，AMD，别名更生霉素)最早就是从放线菌
S.melanochromogenesNo.1779或者S.Parvullus中分离得到的，属于放线菌
素家族的一员，这类化合物由多种链霉菌属的微生物产生。该类化合物结构
中往往都含有一个能使之显红色或者黄色的杂三环发色团Actinocin：2－氨
基－4，6－二甲基吩嗯嗪－(3)－氧－1，9－二羧酸，差别在于其上连接的
环状五肽结构因放线菌素的种类不同而不同。
AMD己广泛用于恶性肿瘤的临床治疗，是较为理想的抗肿瘤药物，也
是国家基本医疗保险药物品种之一。结合手术治疗和放射治疗，AMD对肾
母细胞瘤、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、霍奇金病及绒毛膜癌的治疗有效，
对睾丸肿瘤也有一定疗效，尤其是对儿童肾母细胞瘤(Wilm’stumor)有很好
的治疗效果，总体治疗率可以达到70～80％，对于没有明显肿瘤转移的病患
治愈率可以上升到80～90％。此外，还常与其他药物联合用于肿瘤的治疗与
研究。放线菌素D与氨甲喋呤联合用药治疗妊娠期绒膜癌，治愈率可达到
70～90％，并对已转移的肿瘤也有很好的抑制效果。放线菌素D与氨甲喋呤、
长春新碱以及苯基丁酸氮芥联合用药可以有效治疗睾丸肿瘤，放线菌素D与
博来霉素等药物联合治疗卵巢癌可使五年生存率达到87.5％。
目前AMD研究主要集中在其作用机理和化学结构的改造。作用机理研
究主要为AMD与核酸的作用，认为其发挥抗菌、抗肿瘤、抗病毒的主要机
理是干扰核酸的合成。此外，研究发现AMD还能通过诱导细胞分化、诱导
细胞凋亡，抑制一些蛋白酶活性及影响细胞周期等而发挥其抗肿瘤活性。对
AMD的化学改造可以分为两类，一类是在吩嗯嗪酮环上的改造，另一类则
是环五肽的结构改造。研究发现AMD的抗瘤谱比较有限，并且具有较大毒
性从而严重影响了其使用剂量和使用范围。因此，为了满足临床的需要，迫
切需要生产高纯度的AMD。
AMD的分离提纯方法描述见于CN200610019395、CN201110366034等。
CN200610019395记载的更新霉素(即放线菌素D和放线菌素S3混合物)通
过结晶进一步提纯方法；CN201110366034描述方法HPLC方法只能生产实验
室用低数量的AMD，以及纯AMD的回收率低。其它主要采用正相层析如硅
胶或氧化铝柱层析法同样存在分离周期长、回收率低、分离效果差等问题。
因此，在技术上需要有生产AMD以及分离和纯化AMD的改进方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题，在于提供一种高纯度放线菌素D的提纯方
法。
本发明是这样实现的：一种高纯度放线菌素D的提纯方法，其操作方
法如下：以链霉菌发酵产生的放线菌素D粗提物为原料，将粗提物用强极
性溶剂配成样品溶液，上反相柱吸附，层析柱预先用20％(V/V)强极性溶
剂的水溶液3倍柱体积平衡，用强极性溶剂的水溶液作解析液进行梯度洗脱
或恒定浓度洗脱；所述反相柱填料为纳米微球材料。
优选地，所述纳米微球材料为以聚苯乙烯/二乙烯基苯聚合物为基质的
PS40-300；或以聚二乙烯基苯/丙烯酸酯聚合物为基质的PSN40-300。
优选地，所述反相柱填料的粒径为40um，孔径为![]()
优选地，所述反相柱填料的用量为放线菌素D粗提物重量的80-120倍体
积。
优选地，所述强极性溶剂为甲醇、乙醇。
优选地，所述解析液的浓度为40％-80％(V/V)。
优选地，所述梯度洗脱的梯度为体积比40:60，60:40，80:20的强极性溶
剂-水的溶剂系统
优选地，所述恒定浓度为65％(V/V)。
本发明的优点在于：对AMD粗提物的分离度高，获得的目标产物纯度
高，分离纯化过程条件温和、分离过程高效便捷、分离制备量大，适合自动
化生产，具有很高的经济效益。
附图说明
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
图1是本发明中链霉菌发酵产生的AMD粗提物的HPLC图谱。
图2是本发明中实施例1制得的AMD的中压制备图谱。
图3是本发明中实施例1制得的高纯度AMD的HPLC图谱。
具体实施方式
一种高纯度放线菌素D的提纯方法，其操作方法如下：以链霉菌发酵产
生的放线菌素D粗提物为原料，将粗提物用强极性溶剂配成样品溶液，上反
相柱吸附，层析柱预先用20％(V/V)强极性溶剂的水溶液3倍柱体积平衡，
用强极性溶剂的水溶液作解析液进行梯度洗脱或恒定浓度洗脱。所述强极性
溶剂为甲醇、乙醇；所述解析液的浓度为40％-80％(V/V)；所述梯度洗脱
的梯度为体积比强极性溶剂：水＝40:60，60:40，80:20的强极性溶剂-水的
溶剂系统；所述恒定浓度为65％(V/V)(体积分数)。
所述反相柱填料为纳米微球材料；所述纳米微球材料为以聚苯乙烯/二
乙烯基苯聚合物为基质的PS40-300；或以聚二乙烯基苯/丙烯酸酯聚合物为
基质的PSN40-300。所述反相柱填料的用量为放线菌素D粗提物重量的
80-120倍体积；所述纳米微球材料的粒径为40um，孔径为![]()
严格控制
填料粒径大小和孔径结构，高度的粒径均一性使填料具有高分辨率、高载量、
高回收率、低反压，集中洗脱等特点。高的机械强度保证了高耐压性能，全
pH范围(pH1-14)耐受性，提供了更多的选择可能性，更高的化学稳定性，
具有更彻底的清洗能力，同时克服了硅胶色谱填料的pH适用范围窄、使用
寿命短等缺点。
放线菌素D粗提物的获取：链霉菌发酵结束后，发酵液通过大孔吸附树
脂吸附，乙醇洗脱，收集乙醇浓缩至无醇味后，加入乙酸丁酯与水(1：1)
配制的溶液，萃取3次，收集乙酸丁酯相，浓缩得到粗提物。
以下结合实施例对本发明作进一步地说明。
实施例一
将放线菌素D粗提物50g，用乙醇200ml充分溶解，过滤，得样品溶液。
层析柱装有纳米微粒PS40-300(粒径40um，孔径![]()
)5L，层析柱预先用20％
乙醇的水溶液3倍柱体积平衡，样品溶液上反相柱吸附，然后用65％甲醇的
水溶液洗脱，用HPLC方法测定收集液，合并纯度大于95％的AMD收集液，
收率70.2％。
实施例二
将放线菌素D粗提物50g，用乙醇200ml充分溶解，过滤，得样品溶液。
层析柱装有纳米微粒PSN40-300(粒径40um，孔径![]()
)5L，层析柱预先用
20％乙醇的水溶液3倍柱体积平衡，样品溶液上反相柱吸附，然后用40％乙
醇的水溶液3倍柱体积解析，最后用体积比40:60，60:40，80:20的乙醇－水
溶液梯度洗脱，HPLC方法测定收集液，合并纯度大于95％的AMD收集液，
收率57.5％。
实施例三
将放线菌素D粗提物100g，用乙醇500ml充分溶解，过滤，得样品溶液。
层析柱装有纳米微粒PS40-300(粒径40um，孔径![]()
)10L，层析柱预先用
20％乙醇的水溶液3倍柱体积平衡，样品溶液上反相柱吸附，然后用65％乙
醇的水溶液解析，用HPLC方法测定收集液，合并纯度大于95％的AMD收集
液，收率61.4％。
请参阅图1-3所示，上述实施例洗脱获得的洗脱物采用HPLC和中压液相
色谱仪检测，HPLC检测条件为：C18色谱柱；体积比7:3的甲醇/水为流动
相，检测波长254nm；中压液相色谱仪：EZPurifyIII，上海利穗有限公司。
本发明的反相填料严格控制粒径大小和孔径结构，高度的粒径均一性使
其具有高分辨率，高载量，高回收率，低反压，集中洗脱等特点，高的机械
强度保证了高耐压性能，全pH范围(pH1-14)耐受性，提供了更多的选择
可能性，更高的化学稳定性，具有更彻底的清洗能力，同时克服了硅胶色谱
填料pH适用范围窄、使用寿命短等缺点。本发明分离纯化过程条件温和、
分离过程高效便捷、分离制备量大、分离度高，且提纯后获得的目标产物纯
度高，同时本发明适合自动化生产，具有很高的经济效益。