一种奶牛专用乳酸菌的制备方法.pdf

本发明公开了一种奶牛专用乳酸菌的制备方法，主要包含如下步骤：瘤胃乳酸菌的提取、菌株环境抗逆性的鉴定、分离株耐药性及抑菌试验、乳酸菌的扩大培养及活菌制剂的配制。与现有技术相比，本发明具有在动物胃肠道能长期定居、繁殖活性强、且抗生素的抑制效果不明显，能有效的发挥生物活性作用等特点。

1.一种奶牛专用乳酸菌的制备方法，其特征在于主要包含如下步骤：
a、瘤胃乳酸菌的提取：
利用乳酸菌选择SL培养基从健康奶牛的瘤胃液进行菌群的分离鉴定，分离出乳酸
菌菌株；
b、菌株环境抗逆性的鉴定：
分离株乳酸菌的环境抗逆性鉴定与筛选：将a步骤中分离出的菌株先通过
API50CHL生化鉴定试剂盒鉴定到种，根据生长特性选取其中的28～34株菌株，在pH2～
4、0.2～0.4％的胆盐、25℃—40℃环境下进行培养，筛选出2～4株生长良好，具有较
强的环境抗逆性的嗜乳酸杆菌及发酵乳杆菌；
c、分离株耐药性及抑菌试验：
耐药试验：将筛选出的具有良好环境抗逆性的菌株进行扩大培养，并在培养基中
添加阿洛西林、青霉素、氨苄青霉素、阿莫西林、新霉素、庆大霉素、链霉素、恩诺
沙星、氟苯尼考、林肯霉素、红霉素中的至少一种抗生素，筛选出对以上药物耐受超
过百分之八十的菌株；
之后进行抑菌实验：对牛源致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的拮抗抑制作用的
实验；将大肠杆菌或金黄色葡萄球菌涂抹在实验培养基上，再在培养基上接种筛选出
的乳酸菌，观察抑菌斑的大小为抑菌圈直径分别为18.3mm和16.4mm；
d、乳酸菌的扩大培养及活菌制剂的配制：
用大麦芽汁400～600mL、水400～600mL，胰蛋白胨8～12g，酵母膏5～10g，碳
酸钙2～4g，分别制成固体和液体培养基，将分离株接种后置于5％CO₂培养箱培养18～
30h，乳酸菌扩大培养浓度分别可以到达3.5×10⁸CFU/mL、1.2×10⁷CFU/mL。
2.根据权利要求1所述的奶牛专用乳酸菌的制备方法，其特征在于：乳酸菌扩大
培养浓度为2×10¹⁰CFU/mL。
3.一种奶牛专用乳酸菌的使用方法，所述奶牛专用乳酸菌由权利要求1所述的方
法制备，具体使用方法如下：每头奶牛每天口服3～8mL，连用12～18天，犊牛口服1～
3mL，连用8～12天，经测定血清钙及CD4⁺、CD8⁺、IFN-r免疫指标均高于对照组，犊
牛腹泻发病率与对照组相比降低60％，表明乳酸菌制剂对围产期奶牛和初生犊牛均有
明显的保健作用。

一种奶牛专用乳酸菌的制备方法

技术领域

本发明属于乳酸菌制备领域，尤其涉及一种奶牛专用乳酸菌的制备方法。

背景技术

反刍动物胃肠道聚集着丰富的微生物菌群，乳酸菌是主要的固有优势菌群，在营
养物质的消化吸收及抗肠道感染中发挥重要的生理作用。大量研究表明，乳酸菌产生
的乳酸能降低肠道PH，酸化肠道，提高钙、磷、铁的利用率和维持维生素D的吸收率，
其分泌的细菌素对革兰氏阳性菌及阴性菌产生广泛的抑制作用；乳酸菌的代谢产物还
能激活巨噬细胞、NK细胞和B细胞。提高机体抗感染免疫功能，因此，乳酸菌作为胃
肠道优势菌常用于动物微生态活菌制剂的细菌之一，但不同来源的乳酸菌其对环境的
适应性差异较大，来自非宿主胃肠道乳酸菌和环境与食品源的乳酸菌在特定动物胃肠
道的定居时间较短呈一过性增殖，而同一种动物胃肠道乳酸菌经过对宿主胃肠道的适
应性选择，能适应胃肠道环境且大量繁殖，从而发挥其生物活性作用。

乳酸菌是反刍动物胃肠道中的优势益生菌群，具有多种生物活性与功能，是人用
乳酸菌乳及动物饲用微生态活菌制剂的主要菌株之一，但目前商品化的畜用益生素所
含的乳酸菌多来源于土壤、水源、植物及乳制品，其乳酸菌在动物胃肠道不能长期定
居、繁殖活性差、且受抗生素的抑制，不能有效的发挥生物活性作用。

因此，一种具有在动物胃肠道能长期定居、繁殖活性强、且抗生素的抑制效果不
明显，能有效的发挥生物活性作用等特点。

发明内容

本发明的目的是提供一种奶牛专用乳酸菌的制备方法。

本发明涉及一种奶牛专用乳酸菌的制备方法，其特征在于主要包含如下步骤：

a、瘤胃乳酸菌的提取：

利用乳酸菌选择SL培养基从健康奶牛的瘤胃液进行菌群的分离鉴定，分离出乳酸
菌菌株；

b、菌株环境抗逆性的鉴定：

将a步骤中分离出的菌株先通过API50CHL生化鉴定试剂盒鉴定到种，根据生长特
性选取其中的28～34株菌株，在pH2～4、0.2～0.4％的胆盐、25℃—40℃环境下进行
培养，筛选出2～4株生长良好，具有较强的环境抗逆性的嗜乳酸杆菌及发酵乳杆菌；

c、分离株耐药性及抑菌试验：

耐药试验：将筛选出的具有良好环境抗逆性的菌株进行扩大培养，并在培养基中
添加阿洛西林(AZL)、青霉素(P)、氨苄青霉素(Amp)、阿莫西林(AMC)、新霉素(N)、
庆大霉素(CN)、链霉素(STR)、恩诺沙星(ENR)、氟苯尼考(FFC)、林肯霉素(CD)、
红霉素(E)中的至少一种抗生素，筛选出对以上药物耐受超过百分之八十的菌株；

抑菌实验：对牛源致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的拮抗抑制作用的实验；将
大肠杆菌或金黄色葡萄球菌涂抹在实验培养基上，再在培养基上接种筛选出的乳酸菌，
观察抑菌斑的大小为抑菌圈直径分别为18.3mm和16.4mm，说明筛选出的菌株对大肠
杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用强；

d、乳酸菌的扩大培养及活菌制剂的配制：

用大麦芽汁400～600mL、水400～600mL，胰蛋白胨8～12g，酵母膏5～10g，碳
酸钙2～4g，分别制成固体和液体培养基，将分离株接种后置于5％CO₂培养箱培养18～
30h，乳酸菌扩大培养浓度分别可以到达3.5×10⁸CFU/mL、1.2×10⁷CFU/mL，应用时将
乳酸菌活菌数配制为2×10¹⁰CFU/mL。

上述培养基选用SL培养基，SL培养基配方如下：10g酪蛋白水解物；5g酵母提
取物；2g柠檬酸二铵；25g乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)；0.58gMgSO4·7H₂O；15g琼脂；
20g葡萄糖；1.0ml吐温80；6g磷酸氢二钾；0.03gFeSO₄·7H₂O；0.15gMnSO₄·4H₂O。
以上用量为1000ml培养基的用量。溶解琼脂在400～600mL的沸水中，溶解其他组分
在400～600mL的水中，用冰醋酸调pH＝5.4，并混合已融化的琼脂，进一步煮沸5分
钟，倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭菌的试管，这样无需进一步灭菌，避免重
复融化和冷却。

一种奶牛专用乳酸菌的使用方法，上述奶牛专用乳酸菌的制备方法所制备的奶牛
专用乳酸菌，具体使用方法如下：每头奶牛每天口服3～8mL，连用12～18天，犊牛
口服1～3mL，连用8～12天，经测定血清钙及CD4⁺、CD8⁺、IFN-r免疫指标均高于对
照组，犊牛腹泻发病率与对照组相比降低60％，表明乳酸菌制剂对围产期奶牛和初生
犊牛均有明显的保健作用。

与现有技术相比，本发明具有在动物胃肠道能长期定居、繁殖活性强、且抗生素
的抑制效果不明显，能有效的发挥生物活性作用等特点。

具体实施方式

实施例1：一种奶牛专用乳酸菌的制备方法，其特征在于主要包含如下步骤：

a、瘤胃乳酸菌的提取：

利用乳酸菌选择SL培养基从健康奶牛的瘤胃液进行菌群的分离鉴定，分离出乳酸
菌菌株；

b、菌株环境抗逆性的鉴定：

将a步骤中分离出的菌株先通过API50CHL生化鉴定试剂盒鉴定到种，根据生长特
性选取其中的30株菌株，在pH2、0.2％的胆盐、25℃—40℃环境下进行培养，筛选出
3株生长良好，具有较强的环境抗逆性的嗜乳酸杆菌及发酵乳杆菌；

c、分离株耐药性及抑菌试验：

耐药试验：将筛选出的具有良好环境抗逆性的菌株进行扩大培养，并在培养基中
添加阿洛西林(AZL)、青霉素(P)、氨苄青霉素(Amp)、阿莫西林(AMC)、新霉素(N)、
庆大霉素(CN)、链霉素(STR)、恩诺沙星(ENR)、氟苯尼考(FFC)、林肯霉素(CD)、
红霉素(E)中的至少一种抗生素，筛选出对以上药物耐受超过百分之八十的菌株；

抑菌实验：对牛源致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的拮抗抑制作用的实验；将
大肠杆菌或金黄色葡萄球菌涂抹在实验培养基上，再在培养基上接种筛选出的乳酸菌，
观察抑菌斑的大小为抑菌圈直径分别为18.3mm和16.4mm，说明筛选出的菌株对大肠
杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用强；

d、乳酸菌的扩大培养及活菌制剂的配制：

用大麦芽汁400～600mL、水400～600mL，胰蛋白胨10g，酵母膏5g，碳酸钙2g，
分别制成固体和液体培养基，将分离株接种后置于5％CO₂培养箱培养18～30h，乳酸菌
扩大培养浓度分别可以到达3.5×10⁸CFU/mL、1.2×10⁷CFU/mL，实际应用时将乳酸菌
活菌数配制为2×10¹⁰CFU/mL为优。

上述培养基选用SL培养基，SL培养基配方如下：10g酪蛋白水解物；5g酵母提
取物；2g柠檬酸二铵；25g乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)；0.58gMgSO4·7H₂O；15g琼脂；
20g葡萄糖；1.0ml吐温80；6g磷酸氢二钾；0.03gFeSO₄·7H₂O；0.15gMnSO₄·4H₂O。
以上用量为1000ml培养基的用量。溶解琼脂在400～600mL的沸水中，溶解其他组分
在400～600mL的水中，用冰醋酸调pH＝5.4，并混合已融化的琼脂，进一步煮沸5分
钟，倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭菌的试管，这样无需进一步灭菌，避免重
复融化和冷却。

实施例2：一种奶牛专用乳酸菌的制备方法，其特征在于主要包含如下步骤：

a、瘤胃乳酸菌的提取：

利用乳酸菌选择SL培养基从健康奶牛的瘤胃液进行菌群的分离鉴定，分离出乳酸
菌菌株；

b、菌株环境抗逆性的鉴定：

将a步骤中分离出的菌株先通过API50CHL生化鉴定试剂盒鉴定到种，根据生长特
性选取其中的30株菌株，在pH2、0.3％的胆盐、25℃—40℃环境下进行培养，筛选出
4株生长良好，具有较强的环境抗逆性的嗜乳酸杆菌及发酵乳杆菌；

c、分离株耐药性及抑菌试验：

耐药试验：将筛选出的具有良好环境抗逆性的菌株进行扩大培养，并在培养基中
添加阿洛西林(AZL)、青霉素(P)、氨苄青霉素(Amp)、阿莫西林(AMC)、新霉素(N)、
庆大霉素(CN)、链霉素(STR)、恩诺沙星(ENR)、氟苯尼考(FFC)、林肯霉素(CD)、
红霉素(E)中的至少一种抗生素，筛选出对以上药物耐受超过百分之八十的菌株；

抑菌实验：对牛源致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的拮抗抑制作用的实验；将
大肠杆菌或金黄色葡萄球菌涂抹在实验培养基上，再在培养基上接种筛选出的乳酸菌，
观察抑菌斑的大小为抑菌圈直径分别为18.3mm和16.4mm，说明筛选出的菌株对大肠
杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用强；

d、乳酸菌的扩大培养及活菌制剂的配制：

用大麦芽汁400～600mL、水400～600mL，胰蛋白胨11g，酵母膏8g，碳酸钙3g，
分别制成固体和液体培养基，将分离株接种后置于5％CO₂培养箱培养18～30h，乳酸菌
扩大培养浓度分别可以到达3.5×10⁸CFU/mL、1.2×10⁷CFU/mL，实际应用时将乳酸菌
活菌数配制为2×10¹⁰CFU/mL为优。

上述培养基选用SL培养基，SL培养基配方如下：10g酪蛋白水解物；5g酵母提
取物；2g柠檬酸二铵；25g乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)；0.58gMgSO4·7H₂O；15g琼脂；
20g葡萄糖；1.0ml吐温80；6g磷酸氢二钾；0.03gFeSO₄·7H₂O；0.15gMnSO₄·4H₂O。
以上用量为1000ml培养基的用量。溶解琼脂在400～600mL的沸水中，溶解其他组分
在400～600mL的水中，用冰醋酸调pH＝5.4，并混合已融化的琼脂，进一步煮沸5分
钟，倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭菌的试管，这样无需进一步灭菌，避免重
复融化和冷却。

实施例3：一种奶牛专用乳酸菌的制备方法，其特征在于主要包含如下步骤：

a、瘤胃乳酸菌的提取：

利用乳酸菌选择SL培养基从健康奶牛的瘤胃液进行菌群的分离鉴定，分离出乳酸
菌菌株；

b、菌株环境抗逆性的鉴定：

将a步骤中分离出的菌株先通过API50CHL生化鉴定试剂盒鉴定到种，根据生长特
性选取其中的30株菌株，在pH3、0.4％的胆盐、25℃—40℃环境下进行培养，筛选出
2株生长良好，具有较强的环境抗逆性的嗜乳酸杆菌及发酵乳杆菌；

c、分离株耐药性及抑菌试验：

耐药试验：将筛选出的具有良好环境抗逆性的菌株进行扩大培养，并在培养基中
添加阿洛西林(AZL)、青霉素(P)、氨苄青霉素(Amp)、阿莫西林(AMC)、新霉素(N)、
庆大霉素(CN)、链霉素(STR)、恩诺沙星(ENR)、氟苯尼考(FFC)、林肯霉素(CD)、
红霉素(E)中的至少一种抗生素，筛选出对以上药物耐受超过百分之八十的菌株；

抑菌实验：对牛源致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的拮抗抑制作用的实验；将
大肠杆菌或金黄色葡萄球菌涂抹在实验培养基上，再在培养基上接种筛选出的乳酸菌，
观察抑菌斑的大小为抑菌圈直径分别为18.3mm和16.4mm，说明筛选出的菌株对大肠
杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用强；

d、乳酸菌的扩大培养及活菌制剂的配制：

用大麦芽汁400～600mL、水400～600mL，胰蛋白胨11g，酵母膏7g，碳酸钙4g，
分别制成固体和液体培养基，将分离株接种后置于5％CO₂培养箱培养18～30h，乳酸菌
扩大培养浓度分别可以到达3.5×10⁸CFU/mL、1.2×10⁷CFU/mL，实际应用时将乳酸菌
活菌数配制为2×10¹⁰CFU/mL为优。

上述培养基选用SL培养基，SL培养基配方如下：10g酪蛋白水解物；5g酵母提
取物；2g柠檬酸二铵；25g乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)；0.58gMgSO4·7H₂O；15g琼脂；
20g葡萄糖；1.0ml吐温80；6g磷酸氢二钾；0.03gFeSO₄·7H₂O；0.15gMnSO₄·4H₂O。
以上用量为1000ml培养基的用量。溶解琼脂在400～600mL的沸水中，溶解其他组分
在400～600mL的水中，用冰醋酸调pH＝5.4，并混合已融化的琼脂，进一步煮沸5分
钟，倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭菌的试管，这样无需进一步灭菌，避免重
复融化和冷却。

实施例4：一种奶牛专用乳酸菌的制备方法，其特征在于主要包含如下步骤：

a、瘤胃乳酸菌的提取：

利用乳酸菌选择SL培养基从健康奶牛的瘤胃液进行菌群的分离鉴定，分离出乳酸
菌菌株；

b、菌株环境抗逆性的鉴定：

将a步骤中分离出的菌株先通过API50CHL生化鉴定试剂盒鉴定到种，根据生长特
性选取其中的32株菌株，在pH4、0.3％的胆盐、25℃—40℃环境下进行培养，筛选出
3株生长良好，具有较强的环境抗逆性的嗜乳酸杆菌及发酵乳杆菌；

c、分离株耐药性及抑菌试验：

耐药试验：将筛选出的具有良好环境抗逆性的菌株进行扩大培养，并在培养基中
添加阿洛西林(AZL)、青霉素(P)、氨苄青霉素(Amp)、阿莫西林(AMC)、新霉素(N)、
庆大霉素(CN)、链霉素(STR)、恩诺沙星(ENR)、氟苯尼考(FFC)、林肯霉素(CD)、
红霉素(E)中的至少一种抗生素，筛选出对以上药物耐受超过百分之八十的菌株；

抑菌实验：对牛源致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的拮抗抑制作用的实验；将
大肠杆菌或金黄色葡萄球菌涂抹在实验培养基上，再在培养基上接种筛选出的乳酸菌，
观察抑菌斑的大小为抑菌圈直径分别为18.3mm和16.4mm，说明筛选出的菌株对大肠
杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用强；

d、乳酸菌的扩大培养及活菌制剂的配制：

用大麦芽汁400～600mL、水400～600mL，胰蛋白胨9g，酵母膏6g，碳酸钙2g，
分别制成固体和液体培养基，将分离株接种后置于5％CO₂培养箱培养18～30h，乳酸菌
扩大培养浓度分别可以到达3.5×10⁸CFU/mL、1.2×10⁷CFU/mL，实际应用时将乳酸菌
活菌数配制为2×10¹⁰CFU/mL为优。

上述培养基选用SL培养基，SL培养基配方如下：10g酪蛋白水解物；5g酵母提
取物；2g柠檬酸二铵；25g乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)；0.58gMgSO4·7H₂O；15g琼脂；
20g葡萄糖；1.0ml吐温80；6g磷酸氢二钾；0.03gFeSO₄·7H₂O；0.15gMnSO₄·4H₂O。
以上用量为1000ml培养基的用量。溶解琼脂在400～600mL的沸水中，溶解其他组分
在400～600mL的水中，用冰醋酸调pH＝5.4，并混合已融化的琼脂，进一步煮沸5分
钟，倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭菌的试管，这样无需进一步灭菌，避免重
复融化和冷却。

实施例5：一种奶牛专用乳酸菌的制备方法，其特征在于主要包含如下步骤：

a、瘤胃乳酸菌的提取：

利用乳酸菌选择SL培养基从健康奶牛的瘤胃液进行菌群的分离鉴定，分离出乳酸
菌菌株；

b、菌株环境抗逆性的鉴定：

将a步骤中分离出的菌株先通过API50CHL生化鉴定试剂盒鉴定到种，根据生长特
性选取其中的32株菌株，在pH2.5、0.4％的胆盐、25℃—40℃环境下进行培养，筛选
出4株生长良好，具有较强的环境抗逆性的嗜乳酸杆菌及发酵乳杆菌；

c、分离株耐药性及抑菌试验：

耐药试验：将筛选出的具有良好环境抗逆性的菌株进行扩大培养，并在培养基中
添加阿洛西林(AZL)、青霉素(P)、氨苄青霉素(Amp)、阿莫西林(AMC)、新霉素(N)、
庆大霉素(CN)、链霉素(STR)、恩诺沙星(ENR)、氟苯尼考(FFC)、林肯霉素(CD)、
红霉素(E)中的至少一种抗生素，筛选出对以上药物耐受超过百分之八十的菌株；

抑菌实验：对牛源致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的拮抗抑制作用的实验；将
大肠杆菌或金黄色葡萄球菌涂抹在实验培养基上，再在培养基上接种筛选出的乳酸菌，
观察抑菌斑的大小为抑菌圈直径分别为18.3mm和16.4mm，说明筛选出的菌株对大肠
杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用强；

d、乳酸菌的扩大培养及活菌制剂的配制：

用大麦芽汁400～600mL、水400～600mL，胰蛋白胨10g，酵母膏10g，碳酸钙2g，
分别制成固体和液体培养基，将分离株接种后置于5％CO₂培养箱培养18～30h，乳酸菌
扩大培养浓度分别可以到达3.5×10⁸CFU/mL、1.2×10⁷CFU/mL，实际应用时将乳酸菌
活菌数配制为2×10¹⁰CFU/mL为优。

上述培养基选用SL培养基，SL培养基配方如下：10g酪蛋白水解物；5g酵母提
取物；2g柠檬酸二铵；25g乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)；0.58gMgSO4·7H₂O；15g琼脂；
20g葡萄糖；1.0ml吐温80；6g磷酸氢二钾；0.03gFeSO₄·7H₂O；0.15gMnSO₄·4H₂O。
以上用量为1000ml培养基的用量。溶解琼脂在400～600mL的沸水中，溶解其他组分
在400～600mL的水中，用冰醋酸调pH＝5.4，并混合已融化的琼脂，进一步煮沸5分
钟，倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭菌的试管，这样无需进一步灭菌，避免重
复融化和冷却。

实施例6：一种奶牛专用乳酸菌的制备方法，其特征在于主要包含如下步骤：

a、瘤胃乳酸菌的提取：

利用乳酸菌选择SL培养基从健康奶牛的瘤胃液进行菌群的分离鉴定，分离出乳酸
菌菌株；

b、菌株环境抗逆性的鉴定：

将a步骤中分离出的菌株先通过API50CHL生化鉴定试剂盒鉴定到种，根据生长特
性选取其中的28株菌株，在pH3.5、0.2％的胆盐、25℃—40℃环境下进行培养，筛选
出3株生长良好，具有较强的环境抗逆性的嗜乳酸杆菌及发酵乳杆菌；

c、分离株耐药性及抑菌试验：

耐药试验：将筛选出的具有良好环境抗逆性的菌株进行扩大培养，并在培养基中
添加阿洛西林(AZL)、青霉素(P)、氨苄青霉素(Amp)、阿莫西林(AMC)、新霉素(N)、
庆大霉素(CN)、链霉素(STR)、恩诺沙星(ENR)、氟苯尼考(FFC)、林肯霉素(CD)、
红霉素(E)中的至少一种抗生素，筛选出对以上药物耐受超过百分之八十的菌株；

抑菌实验：对牛源致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的拮抗抑制作用的实验；将
大肠杆菌或金黄色葡萄球菌涂抹在实验培养基上，再在培养基上接种筛选出的乳酸菌，
观察抑菌斑的大小为抑菌圈直径分别为18.3mm和16.4mm，说明筛选出的菌株对大肠
杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用强；

d、乳酸菌的扩大培养及活菌制剂的配制：

用大麦芽汁400～600mL、水400～600mL，胰蛋白胨8g，酵母膏10g，碳酸钙3g，
分别制成固体和液体培养基，将分离株接种后置于5％CO₂培养箱培养18～30h，乳酸菌
扩大培养浓度分别可以到达3.5×10⁸CFU/mL、1.2×10⁷CFU/mL，实际应用时将乳酸菌
活菌数配制为2×10¹⁰CFU/mL为优。

上述培养基选用SL培养基，SL培养基配方如下：10g酪蛋白水解物；5g酵母提
取物；2g柠檬酸二铵；25g乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)；0.58gMgSO4·7H₂O；15g琼脂；
20g葡萄糖；1.0ml吐温80；6g磷酸氢二钾；0.03gFeSO₄·7H₂O；0.15gMnSO₄·4H₂O。
以上用量为1000ml培养基的用量。溶解琼脂在400～600mL的沸水中，溶解其他组分
在400～600mL的水中，用冰醋酸调pH＝5.4，并混合已融化的琼脂，进一步煮沸5分
钟，倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭菌的试管，这样无需进一步灭菌，避免重
复融化和冷却。

实施例7：一种奶牛专用乳酸菌的制备方法，其特征在于主要包含如下步骤：

a、瘤胃乳酸菌的提取：

利用乳酸菌选择SL培养基从健康奶牛的瘤胃液进行菌群的分离鉴定，分离出乳酸
菌菌株；

b、菌株环境抗逆性的鉴定：

将a步骤中分离出的菌株先通过API50CHL生化鉴定试剂盒鉴定到种，根据生长特
性选取其中的28株菌株，在pH3、0.3％的胆盐、25℃—40℃环境下进行培养，筛选出
4株生长良好，具有较强的环境抗逆性的嗜乳酸杆菌及发酵乳杆菌；

c、分离株耐药性及抑菌试验：

耐药试验：将筛选出的具有良好环境抗逆性的菌株进行扩大培养，并在培养基中
添加阿洛西林(AZL)、青霉素(P)、氨苄青霉素(Amp)、阿莫西林(AMC)、新霉素(N)、
庆大霉素(CN)、链霉素(STR)、恩诺沙星(ENR)、氟苯尼考(FFC)、林肯霉素(CD)、
红霉素(E)中的至少一种抗生素，筛选出对以上药物耐受超过百分之八十的菌株；

抑菌实验：对牛源致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的拮抗抑制作用的实验；将
大肠杆菌或金黄色葡萄球菌涂抹在实验培养基上，再在培养基上接种筛选出的乳酸菌，
观察抑菌斑的大小为抑菌圈直径分别为18.3mm和16.4mm，说明筛选出的菌株对大肠
杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用强；

d、乳酸菌的扩大培养及活菌制剂的配制：

用大麦芽汁400～600mL、水400～600mL，胰蛋白胨11g，酵母膏8g，碳酸钙4g，
分别制成固体和液体培养基，将分离株接种后置于5％CO₂培养箱培养18～30h，乳酸菌
扩大培养浓度分别可以到达3.5×10⁸CFU/mL、1.2×10⁷CFU/mL，实际应用时将乳酸菌
活菌数配制为2×10¹⁰CFU/mL为优。

上述培养基选用SL培养基，SL培养基配方如下：10g酪蛋白水解物；5g酵母提
取物；2g柠檬酸二铵；25g乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)；0.58gMgSO4·7H₂O；15g琼脂；
20g葡萄糖；1.0ml吐温80；6g磷酸氢二钾；0.03gFeSO₄·7H₂O；0.15gMnSO₄·4H₂O。
以上用量为1000ml培养基的用量。溶解琼脂在400～600mL的沸水中，溶解其他组分
在400～600mL的水中，用冰醋酸调pH＝5.4，并混合已融化的琼脂，进一步煮沸5分
钟，倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭菌的试管，这样无需进一步灭菌，避免重
复融化和冷却。

实施例8：一种奶牛专用乳酸菌的制备方法，其特征在于主要包含如下步骤：

a、瘤胃乳酸菌的提取：

利用乳酸菌选择SL培养基从健康奶牛的瘤胃液进行菌群的分离鉴定，分离出乳酸
菌菌株；

b、菌株环境抗逆性的鉴定：

将a步骤中分离出的菌株先通过API50CHL生化鉴定试剂盒鉴定到种，根据生长特
性选取其中的34株菌株，在pH2、0.4％的胆盐、25℃—40℃环境下进行培养，筛选出
2株生长良好，具有较强的环境抗逆性的嗜乳酸杆菌及发酵乳杆菌；

c、分离株耐药性及抑菌试验：

耐药试验：将筛选出的具有良好环境抗逆性的菌株进行扩大培养，并在培养基中
添加阿洛西林(AZL)、青霉素(P)、氨苄青霉素(Amp)、阿莫西林(AMC)、新霉素(N)、
庆大霉素(CN)、链霉素(STR)、恩诺沙星(ENR)、氟苯尼考(FFC)、林肯霉素(CD)、
红霉素(E)中的至少一种抗生素，筛选出对以上药物耐受超过百分之八十的菌株；

抑菌实验：对牛源致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的拮抗抑制作用的实验；将
大肠杆菌或金黄色葡萄球菌涂抹在实验培养基上，再在培养基上接种筛选出的乳酸菌，
观察抑菌斑的大小为抑菌圈直径分别为18.3mm和16.4mm，说明筛选出的菌株对大肠
杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用强；

d、乳酸菌的扩大培养及活菌制剂的配制：

用大麦芽汁400～600mL、水400～600mL，胰蛋白胨12g，酵母膏8g，碳酸钙3g，
分别制成固体和液体培养基，将分离株接种后置于5％CO₂培养箱培养18～30h，乳酸菌
扩大培养浓度分别可以到达3.5×10⁸CFU/mL、1.2×10⁷CFU/mL，实际应用时将乳酸菌
活菌数配制为2×10¹⁰CFU/mL为优。

上述培养基选用SL培养基，SL培养基配方如下：10g酪蛋白水解物；5g酵母提
取物；2g柠檬酸二铵；25g乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)；0.58gMgSO4·7H₂O；15g琼脂；
20g葡萄糖；1.0ml吐温80；6g磷酸氢二钾；0.03gFeSO₄·7H₂O；0.15gMnSO₄·4H₂O。
以上用量为1000ml培养基的用量。溶解琼脂在400～600mL的沸水中，溶解其他组分
在400～600mL的水中，用冰醋酸调pH＝5.4，并混合已融化的琼脂，进一步煮沸5分
钟，倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭菌的试管，这样无需进一步灭菌，避免重
复融化和冷却。

实施例9：一种奶牛专用乳酸菌的制备方法，其特征在于主要包含如下步骤：

a、瘤胃乳酸菌的提取：

利用乳酸菌选择SL培养基从健康奶牛的瘤胃液进行菌群的分离鉴定，分离出乳酸
菌菌株；

b、菌株环境抗逆性的鉴定：

将a步骤中分离出的菌株先通过API50CHL生化鉴定试剂盒鉴定到种，根据生长特
性选取其中的34株菌株，在pH4、0.3％的胆盐、25℃—40℃环境下进行培养，筛选出
4株生长良好，具有较强的环境抗逆性的嗜乳酸杆菌及发酵乳杆菌；

c、分离株耐药性及抑菌试验：

耐药试验：将筛选出的具有良好环境抗逆性的菌株进行扩大培养，并在培养基中
添加阿洛西林(AZL)、青霉素(P)、氨苄青霉素(Amp)、阿莫西林(AMC)、新霉素(N)、
庆大霉素(CN)、链霉素(STR)、恩诺沙星(ENR)、氟苯尼考(FFC)、林肯霉素(CD)、
红霉素(E)中的至少一种抗生素，筛选出对以上药物耐受超过百分之八十的菌株；

抑菌实验：对牛源致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的拮抗抑制作用的实验；将
大肠杆菌或金黄色葡萄球菌涂抹在实验培养基上，再在培养基上接种筛选出的乳酸菌，
观察抑菌斑的大小为抑菌圈直径分别为18.3mm和16.4mm，说明筛选出的菌株对大肠
杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用强；

d、乳酸菌的扩大培养及活菌制剂的配制：

用大麦芽汁400～600mL、水400～600mL，胰蛋白胨12g，酵母膏5g，碳酸钙3g，
分别制成固体和液体培养基，将分离株接种后置于5％CO₂培养箱培养18～30h，乳酸菌
扩大培养浓度分别可以到达3.5×10⁸CFU/mL、1.2×10⁷CFU/mL，实际应用时将乳酸菌
活菌数配制为2×10¹⁰CFU/mL为优。

上述培养基选用SL培养基，SL培养基配方如下：10g酪蛋白水解物；5g酵母提
取物；2g柠檬酸二铵；25g乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)；0.58gMgSO4·7H₂O；15g琼脂；
20g葡萄糖；1.0ml吐温80；6g磷酸氢二钾；0.03gFeSO₄·7H₂O；0.15gMnSO₄·4H₂O。
以上用量为1000ml培养基的用量。溶解琼脂在400～600mL的沸水中，溶解其他组分
在400～600mL的水中，用冰醋酸调pH＝5.4，并混合已融化的琼脂，进一步煮沸5分
钟，倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭菌的试管，这样无需进一步灭菌，避免重
复融化和冷却。

实施例10：一种奶牛专用乳酸菌的制备方法，其特征在于主要包含如下步骤：

a、瘤胃乳酸菌的提取：

利用乳酸菌选择SL培养基从健康奶牛的瘤胃液进行菌群的分离鉴定，分离出乳酸
菌菌株；

b、菌株环境抗逆性的鉴定：

将a步骤中分离出的菌株先通过API50CHL生化鉴定试剂盒鉴定到种，根据生长特
性选取其中的30株菌株，在pH2.5、0.2％的胆盐、25℃—40℃环境下进行培养，筛选
出3株生长良好，具有较强的环境抗逆性的嗜乳酸杆菌及发酵乳杆菌；

c、分离株耐药性及抑菌试验：

耐药试验：将筛选出的具有良好环境抗逆性的菌株进行扩大培养，并在培养基中
添加阿洛西林(AZL)、青霉素(P)、氨苄青霉素(Amp)、阿莫西林(AMC)、新霉素(N)、
庆大霉素(CN)、链霉素(STR)、恩诺沙星(ENR)、氟苯尼考(FFC)、林肯霉素(CD)、
红霉素(E)中的至少一种抗生素，筛选出对以上药物耐受超过百分之八十的菌株；

抑菌实验：对牛源致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的拮抗抑制作用的实验；将
大肠杆菌或金黄色葡萄球菌涂抹在实验培养基上，再在培养基上接种筛选出的乳酸菌，
观察抑菌斑的大小为抑菌圈直径分别为18.3mm和16.4mm，说明筛选出的菌株对大肠
杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用强；

d、乳酸菌的扩大培养及活菌制剂的配制：

用大麦芽汁400～600mL、水400～600mL，胰蛋白胨12g，酵母膏10g，碳酸钙2g，
分别制成固体和液体培养基，将分离株接种后置于5％CO₂培养箱培养18～30h，乳酸菌
扩大培养浓度分别可以到达3.5×10⁸CFU/mL、1.2×10⁷CFU/mL，实际应用时将乳酸菌
活菌数配制为2×10¹⁰CFU/mL为优。

上述培养基选用SL培养基，SL培养基配方如下：10g酪蛋白水解物；5g酵母提
取物；2g柠檬酸二铵；25g乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)；0.58gMgSO4·7H₂O；15g琼脂；
20g葡萄糖；1.0ml吐温80；6g磷酸氢二钾；0.03gFeSO₄·7H₂O；0.15gMnSO₄·4H₂O。
以上用量为1000ml培养基的用量。溶解琼脂在400～600mL的沸水中，溶解其他组分
在400～600mL的水中，用冰醋酸调pH＝5.4，并混合已融化的琼脂，进一步煮沸5分
钟，倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭菌的试管，这样无需进一步灭菌，避免重
复融化和冷却。

实施例11：一种奶牛专用乳酸菌的使用方法，上述奶牛专用乳酸菌的制备方法所
制备的奶牛专用乳酸菌，具体使用方法如下：每头奶牛每天口服5mL，连用12天，犊
牛口服1mL，连用12天，经测定血清钙及CD4⁺、CD8⁺、IFN-r免疫指标均高于对照组，
犊牛腹泻发病率与对照组相比降低60％，表明乳酸菌制剂对围产期奶牛和初生犊牛均
有明显的保健作用。

实施例12：一种奶牛专用乳酸菌的使用方法，上述奶牛专用乳酸菌的制备方法所
制备的奶牛专用乳酸菌，具体使用方法如下：每头奶牛每天口服3mL，连用15天，犊
牛口服2mL，连用8天，经测定血清钙及CD4⁺、CD8⁺、IFN-r免疫指标均高于对照组，
犊牛腹泻发病率与对照组相比降低60％，表明乳酸菌制剂对围产期奶牛和初生犊牛均
有明显的保健作用。

实施例13：一种奶牛专用乳酸菌的使用方法，上述奶牛专用乳酸菌的制备方法所
制备的奶牛专用乳酸菌，具体使用方法如下：每头奶牛每天口服7mL，连用13天，犊
牛口服3mL，连用9天，经测定血清钙及CD4⁺、CD8⁺、IFN-r免疫指标均高于对照组，
犊牛腹泻发病率与对照组相比降低60％，表明乳酸菌制剂对围产期奶牛和初生犊牛均
有明显的保健作用。

实施例14：一种奶牛专用乳酸菌的使用方法，上述奶牛专用乳酸菌的制备方法所
制备的奶牛专用乳酸菌，具体使用方法如下：每头奶牛每天口服6mL，连用16天，犊
牛口服3mL，连用11天，经测定血清钙及CD4⁺、CD8⁺、IFN-r免疫指标均高于对照组，
犊牛腹泻发病率与对照组相比降低60％，表明乳酸菌制剂对围产期奶牛和初生犊牛均
有明显的保健作用。

实施例15：一种奶牛专用乳酸菌的使用方法，上述奶牛专用乳酸菌的制备方法所
制备的奶牛专用乳酸菌，具体使用方法如下：每头奶牛每天口服4mL，连用18天，犊
牛口服2mL，连用10天，经测定血清钙及CD4⁺、CD8⁺、IFN-r免疫指标均高于对照组，
犊牛腹泻发病率与对照组相比降低60％，表明乳酸菌制剂对围产期奶牛和初生犊牛均
有明显的保健作用。