一种来源于绿色巴夫藻的DELTA9延伸酶新基因.pdf

多不饱和脂肪酸，如二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）等，是人体必需的重要营养物质。针对于能够自然合成大量多不饱和脂肪酸的一种微藻-绿色巴夫藻(Pavlova viridis)，本申请使用了保守区序列扩增和RACE相结合的方法克隆获得了一种新的delta9延伸酶的基因。该基因的获得为进一步认识和利用极有现实意义的EPA和DHA的生物合成过程提供了依据。

1.一种从微藻中克隆得到脂肪酸延伸酶基因的方法，其特征在于，首先分离得到微藻的mRNA并反转录为cDNA，随后以之为模板，根据延伸酶基因保守序列设计简并引物从而扩增得到保守区基因；接下来分别对其5’末端和3’末端进行末端扩增获得全基因序列后，通过普通PCR的方法获得表达基因。 2.一种来自于绿色巴夫藻的delta9延伸酶基因的开放阅读框序列，其特征在于，其序列如SEQID.No.1所示。

一种来源于绿色巴夫藻的delta9延伸酶新基因

技术领域

本申请属于基因克隆分离的技术领域，尤其涉及于一种来源于微藻的有关多不饱和脂肪酸合成的延伸酶基因及其分离方法。

背景技术

多不饱和脂肪酸是人体必需的重要的营养物质，微藻因富含多不饱和脂肪酸而成为重要的生物资源。绿色巴夫藻(Pavlovaviridis)含有丰富的多不饱和脂肪酸，是进行多不饱和脂肪酸相关合成基因识别与克隆的良好实验材料。

RACE全称rapid-amplificationofcDNAends，是一种常用的通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。本实验采用RACE技术来获得目的mRNA片段的全长序列。

在微藻的多不饱和脂肪酸的体内合成途径中，起到最关键作用的是多不饱和脂肪酸去饱和酶和多不饱和脂肪酸延伸酶两大酶类。但由于其为与内质网结合的膜蛋白，上述酶类在分子水平上的研究受到很大限制。其中，delta9延伸酶是催化亚麻酸（C18：3n-3）生成EtrA(C20:3n-3)的关键酶，后者可进一步被delta8去饱和酶催化生成二十碳四烯酸，该途径区别于常见的delta6途径，存在于某些微藻中，是EPA和DHA生物合成途径的重要补充。其中，delta9延伸是该途径的限速步骤。目前在微藻中已经有数个来自于不同物种的delta9延伸酶获得了分离和识别，但不同物种的同源酶显然都存在序列上和结构上的差异，进而导致其酶活性和功能的不同。因此，从绿色巴夫藻中分离得到其delta9延伸酶的同源酶是对该部分研究资源的很好补充，本申请就试图从这个角度展开相关的工作。

发明内容

绿色巴夫藻(Pavlova.viridis)为常用微藻，购自中国科学院青岛海洋研究所。

绿色巴夫藻delta9延伸酶基因的分离过程为：

(1)利用本领域常规的mRNA提取分离手段获得绿色巴夫藻的总mRNA，并使用引物OligodT以本领域常规手段将之反转录为cDNA;

(2)使用cDNA作为模板，根据delta9延伸酶同源基因的保守性设计引物P9F、P9R来进行保守区基因的扩增,其引物序列为:P9F：5’-GCCACCTACAGTTTGTCCGCGA-3’;P9R:5’-GGTGATGTCCGCTTCATCGAGA-3’;PCR反应条件为：94^oC3min；94^oC30s,60^oC30s,72^oC1min,30个循环；72^oC10min;所获PCR产物大小约为360bp；

(3)3’末端的扩增反应以cDNA为模板、使用SMARTRACEcDNA扩增试剂盒来进行，使用的扩增引物分别是：UPM(10×universalprimermix);elo9-3CTAACTACGGCGCGACGGCA。梯度PCR反应程序为:94^oC3min;94^oC30s,72^oC3min,5个循环；94^oC30s,70^oC30s,72^oC3min,5个循环；94^oC30s，68^oC30s，72^oC3min，30个循环；72^oC10min。所获PCR产物大小约为420bp.

（4）5’末端的扩增反应使用总mRNA为模板并使用SMARTRACEcDNA扩增试剂盒来进行，使用的引物分别为：UPM5’(10×universalprimermix);GSP1CAAGTTCTAGGCGTCCT;GSP2

GTAACCCGTGAGCTCGC。反应程序为：加入GSP1于mRNA中后以94^oC3min;94^oC30s,60^oC30s,72^oC1min反应1个循环；随后加入TdT于37oC反应30min获得特定末端产物；然后向体系中加入UPM5’和GSP2,以如下程序完成反应：94^oC3min;94^oC30s,72^oC3min,5个循环；94^oC30s,70^oC30s,72^oC3min,5个循环；94^oC30s，68^oC30s，72^oC3min，30个循环；72^oC10min。所获目的片段约为590bp。

以上所有的片段均连入pMD18T载体后进行测序后拼接。

(5)开放阅读框的扩增：在经过拼接获得了表达基因的全长之后，分别设计上下游引物ATGGCGACCGAAGGGATGC和CTACTCGGTTTTCATTAAAG，经PCR扩增获得完整的delta9延伸酶开放阅读框片段。PCR反应条件为：94^oC3min；94^oC30s,58^oC30s,72^oC1min,30个循环；72^oC10min;片段大小为816bp。

最终所得来自绿色巴夫藻的推定的多不饱和脂肪酸delta9延伸酶的全长多核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。该基因所编码的氨基酸序列与来自于Pavlovasalina的delta9延伸酶的活性区域具有较高的序列相似性（如图1所示），并经过在毕赤酵母中的异源表达功能验证，证实其为一种多不饱和脂肪酸delta9延伸酶。

本申请首次从绿色巴夫藻的基因组中分离获得了多不饱和脂肪酸delta9延伸酶基因，丰富了该类酶的重要的基因资源，为进一步研究该酶的体内和体外的作用机制奠定了基础。

附图说明

图1

SEQIDNo.1与来自Pavlovasalina的delta9延伸酶基因的比对结果

具体实施方式

绿色巴夫藻delta9延伸酶基因的分离过程为：

(1)利用本领域常规的mRNA提取分离手段获得绿色巴夫藻的总mRNA，并使用引物OligodT以本领域常规手段将之反转录为cDNA;

(2)使用cDNA作为模板，根据delta9延伸酶同源基因的保守性设计引物P9F、P9R来进行保守区基因的扩增,其引物序列为:P9F：5’-GCCACCTACAGTTTGTCCGCGA-3’;P9R:5’-GGTGATGTCCGCTTCATCGAGA-3’;PCR反应条件为：94^oC3min；94^oC30s,60^oC30s,72^oC1min,30个循环；72^oC10min;所获PCR产物大小约为360bp；

(3)3’末端的扩增反应以cDNA为模板、使用SMARTRACEcDNA扩增试剂盒来进行，使用的扩增引物分别是：UPM(10×universalprimermix);elo9-3CTAACTACGGCGCGACGGCA。梯度PCR反应程序为:94^oC3min;94^oC30s,72^oC3min,5个循环；94^oC30s,70^oC30s,72^oC3min,5个循环；94^oC30s，68^oC30s，72^oC3min，30个循环；72^oC10min。所获PCR产物大小约为420bp.

（4）5’末端的扩增反应使用总mRNA为模板并使用SMARTRACEcDNA扩增试剂盒来进行，使用的引物分别为：UPM5’(10×universalprimermix);GSP1CAAGTTCTAGGCGTCCT;GSP2

GTAACCCGTGAGCTCGC。反应程序为：加入GSP1于mRNA中后以94^oC3min;94^oC30s,60^oC30s,72^oC1min反应1个循环；随后加入TdT于37oC反应30min获得特定末端产物；然后向体系中加入UPM5’和GSP2,以如下程序完成反应：94^oC3min;94^oC30s,72^oC3min,5个循环；94^oC30s,70^oC30s,72^oC3min,5个循环；94^oC30s，68^oC30s，72^oC3min，30个循环；72^oC10min。所获目的片段约为590bp。

以上所有的片段均连入pMD18T载体后进行测序后拼接。

(5)开放阅读框的扩增：在经过拼接获得了表达基因的全长之后，分别设计上下游引物ATGGCGACCGAAGGGATGC和CTACTCGGTTTTCATTAAAG，经PCR扩增获得完整的delta9延伸酶开放阅读框片段。PCR反应条件为：94^oC3min；94^oC30s,58^oC30s,72^oC1min,30个循环；72^oC10min;片段大小为816bp。

（6）delta9延伸酶功能的验证

获得表达基因片段之后，随后通过本领域常用的亚克隆手段将该片段连接到载体pPIC3.5k,得到毕赤酵母表达质粒pPIC3.5k-delta-9,随后将该质粒与空载体分别电转化入毕赤酵母中得到GS115-9和GS115-pPIC3.5K。挑取阳性转化子接种到装有5mlBMGY液体培养基的试管中，29oC,180rpm摇床培养过夜。然后吸取500μl过夜培养的菌液接种至50mlBMGY液体培养基的三角瓶中，正常条件培养至OD600达到4-6。离心收集菌体，稀释4-6倍将菌体转移至BMMY液体培养基中，使初始的菌密度值达到1.0。向培养基中加入终浓度为0.5%的甲醇100μM的底物亚麻酸开始诱导。要每隔半天添加甲醇维持0.5%的诱导浓度。培养96h后离心收集菌体，超声法提取脂肪酸并进行甲酯化，气相色谱分析脂肪酸组成变化。脂肪酸变化的结果如表1所示。通过表1的结果可以看出，重组菌具备了将亚麻酸合成二十碳三烯酸(n3族)的能力，表明我们所克隆得到的基因为一种新的脂肪酸delta9延伸酶的编码基因。

表1重组毕赤酵母的长链脂肪酸组成（数值为含量百分比）

ND表示测量不到

以上所述BMGY培养基的组成为1%酵母粉，2%蛋白胨，1%甘油，外加十分之一体积的13.4%YNB，4*10^-5%生物素以及1/10体积的pH6.0的磷酸盐缓冲液。

以上所述BMMY培养基的组成为1%酵母粉，2%蛋白胨，外加十分之一体积的13.4%YNB，4*10^-5%生物素以及1/10体积的pH6.0的磷酸盐缓冲液。

说明书氨基酸和核苷酸序列表

SEQIDNO.1:

P.viridis的多不饱和脂肪酸delta9延伸酶的基因序列

ATGGCGACCGAAGGGATGCCGGCGATAACGCTATCTGGCTCTCGCCCGGGGGAACGCTGAAGGAATTGGCGGGGAGGTGCTCTACTTTTCGCTTGGATCTGCTCCGCGAGCTTATCCTCAAGCGCTTTTGTGGACAAGCGCAAGGGCGCATAGGGCAACGGCGATCGCGTACAACATCCCATCTCATGTGCGGTTTCTCGCTGGTATGCTTCGTGTGCCAGATGGAGGCTCTCGGCCTTTATCGCGGCCACCTACAGTTTGTCCGCGAGCTCACGGGTTACAGCGTGGTCCAGCTCTACCAGGACGCCTAGAACTTGAGCCCATCCCCTGCATTCGCGATTACCGGTACTCAGCGGTGGCGTTCCACTACTCAAAGTACGTGGAGTACATGGACACAGCGTGGCTAGTGCTGAAGGGCAAGCCCGTCTCGTTCCTGCAGGGCTTCCACCACTTCGGCGCCGCGTGCGACACCTACTTTGGCATCACGTTTCAGAACGAGGGCACCTACGTCTTTGTGCTGCTCAACGCATTCATCCACACAATCATGTACACTAACTACGGCGCGACGGCAGCGGGCATCAAAATCTCGATGAAGCGGACATCACCCTCATGCAGATCACGCAGTTCCTGCTGGGCTTCGCGCTCGTCTACCCGTACATTTTCCTCGGCTCCTTCCGTGCGTTGCCCGAGCTCGAGTCGAGCCTCCAGATCAACTGCGTACGTACTATGGTGCTCTTCCTCTTCCCATTTCGTTCTACCACGACAACTATTAGCACGCTCAGGCCAAACTCTCGAACTTTAATGAAAACCGAGTAG

SEQIDNO.1:

P.viridis的多不饱和脂肪酸delta9延伸酶的基因序列

ATGGCGACCGAAGGGATGCCGGCGATAACGCTATCTGGCTCTCGCCCGGGGGAACGCTGAAGGAATTGGCGGGGAGGTGCTCTACTTTTCGCTTGGATCTGCTCCGCGAGCTTATCCTCAAGCGCTTTTGTGGACAAGCGCAAGGGCGCATAGGGCAACGGCGATCGCGTACAACATCCCATCTCATGTGCGGTTTCTCGCTGGTATGCTTCGTGTGCCAGATGGAGGCTCTCGGCCTTTATCGCGGCCACCTACAGTTTGTCCGCGAGCTCACGGGTTACAGCGTGGTCCAGCTCTACCAGGACGCCTAGAACTTGAGCCCATCCCCTGCATTCGCGATTACCGGTACTCAGCGGTGGCGTTCCACTACTCAAAGTACGTGGAGTACATGGACACAGCGTGGCTAGTGCTGAAGGGCAAGCCCGTCTCGTTCCTGCAGGGCTTCCACCACTTCGGCGCCGCGTGCGACACCTACTTTGGCATCACGTTTCAGAACGAGGGCACCTACGTCTTTGTGCTGCTCAACGCATTCATCCACACAATCATGTACACTAACTACGGCGCGACGGCAGCGGGCATCAAAATCTCGATGAAGCGGACATCACCCTCATGCAGATCACGCAGTTCCTGCTGGGCTTCGCGCTCGTCTACCCGTACATTTTCCTCGGCTCCTTCCGTGCGTTGCCCGAGCTCGAGTCGAGCCTCCAGATCAACTGCGTACGTACTATGGTGCTCTTCCTCTTCCCATTTCGTTCTACCACGACAACTATTAGCACGCTCAGGCCAAACTCTCGAACTTTAATGAAAACCGAGTAG