包含编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶和/或丙酮酸正磷酸双激酶的构建体的转基因植物.pdf

包含编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶和 / 或丙酮酸正磷酸双激 酶的构建体的转基因植物
    本发明涉及用于制备转基因植物的遗传构建体。 该构建体在叶衰老期间具有引起 氮素再动员的能力， 使得氮可从叶转移到植物的其它部位。本发明提供用这种构建体转化 的植物细胞和转基因植物本身。 本发明还涉及产生转基因植物的方法和在衰老植物中提高 氮素再动员 (nitrogen remobilisation) 的速度的方法。本发明还涉及已用遗传构建体转 化的收获的植物叶 ( 例如烟草叶 ) 和包含这类收获的植物叶的吸烟制品。
     叶衰老是植物发育的一个阶段， 期间， 细胞在细胞死亡前经历独特的代谢和结构 变化。生理学和遗传学研究表明衰老是一个被高度调节的过程。叶经过衰老的进程因由叶 绿体解体所造成的叶绿素丧失并随之变黄而十分明显。例如， 可通过溶剂提取和分光光度 测定或通过叶绿素含量测定仪， 测量这个发育阶段特有的下降的叶叶绿素水平。与对同一 植物 ( 优选生长在恒定条件下 ) 所记录的较早的叶叶绿素水平相比， 叶叶绿素水平下降表 明衰老。
     分子研究表明， 衰老与基因表达的改变有关。编码参与光合作用的蛋白质的 mRNA 水平在衰老期间下降， 而编码被认为参与衰老的蛋白质的基因的 mRNA 水平升高。衰老是一 个极有组织的过程， 受称为衰老相关基因 (SAG) 的基因调节。叶衰老包括蛋白质、 核酸和膜 的降解， 以及由这种降解所致的营养物随后转运到植物的其它部位， 例如发育中的种子、 叶 或贮藏器官。植物衰老的一个问题是衰老叶中存在的许多有用的矿物质和营养物将保留 在叶中， 随着叶死亡， 实际上会损失掉。例如， 衰老叶中存在的氮 ( 可呈氨基酸上的氨基形 式 )， 如果不离开垂死的叶， 则将会浪费掉。
     因此， 在植物中， 尤其在它们变衰老时， 加强氮素再动员在作物生产中可具有重要 应用。首先， 从叶中再动员起来的氮可转运到较幼嫩的叶以及发育中的种子中。因此， 氮从 衰老叶中离去的效率的提高可潜在地增加植物种子和较幼嫩部分的氮供应， 从而提高作物 产量和氮利用效率。在世界人口增加但作物产量的增加不足以满足需要时， 这显然是有价 值的目标。 一种潜在的目标作物是欧洲油菜 (Brassica napus)( 油料种子油菜 )， 其由于营 养组织的氮素再动员差而造成氮效率低下。另一种目标作物是小麦， 因为增加籽粒蛋白含 量的潜在益处非常大。 籽粒蛋白含量不仅仅影响小麦的营养价值， 而且还决定籽粒使用率， 并由此决定市场价值。例如， 籽粒蛋白含量增加引起面包体积加大。同样， 在烟草工业中提 高氮素再动员的能力可能十分有用， 因为已知烟草叶中残留的氮有助于形成亚硝胺类。
     酶 烯 醇 丙 酮 酸 磷 酸 羧 激 酶 (PEPCK 或 PCK)[EC 4.1.1.49] 和 丙 酮 酸 正 磷 酸 双 激酶 (PPDK)[EC 2.7.9.1] 是已知的。PPDK 存在于原核生物和真核生物两者中， 就序列 和三级结构而言， 在细菌和高等植物之间是保守的 (Pocalyko 等， 1990， Biochemistry， 29， 10757-10765)。 该 酶 在 下 列 反 应 中 催 化 丙 酮 酸 的 可 逆 磷 酸 化 形 成 磷 酸 烯 醇 丙 酮 酸 (PEP)(Carroll 等， 1990， Federation of European Biochemical Societies， 274， 178-180 ； Hatch 和 Slack， 1968， Biochemical Journal， 106， 141-146) ： 丙酮酸 +Pi+ATP ＝ PEP+PPi+AMP。在 C3 和 C4 植物两者中， PPDK 基因具有独特的结构， 其中由同一基因产生两 种转录物。 较长的转录物编码叶绿体蛋白质， 其第一外显子编码叶绿体转运肽， 而较短的转
     录物由较长转录物的第一内含子内的独立启动子转录， 因此缺乏编码叶绿体转运肽的第一 外显子。这种较短的转录物产生 PPDK 的胞质同工型。已在玉米、 水稻、 C3 和 C4 黄花菊属 (Flaveria) 品种和鼠耳芥 (Arabidopsis thaliana) 中报道了这种基因结构。
     烯醇丙酮酸磷酸羧激酶 (PCK) 在下列反应中催化 ADP、 二氧化碳和磷酸烯醇丙酮 酸之间形成 ATP 和草酰乙酸的可逆反应 ： 草酰乙酸 +ATP ＝ PEP+ADP+CO2。研究表明， PCK 存 在于多种植物组织细胞的细胞溶胶中。这些组织包括发育中的种子、 藻丝和根。在植物中， PCK 出现在其中含氮化合物代谢高的组织中。
     本发明人构建了多个遗传构建体， 其中将编码酶 PCK 和 / 或 PPDK 的基因单独或共 同置于启动子的控制下， 以便测定这些基因的过表达对衰老叶中的氮素再动员有哪些作用 ( 如果有的话 )。
     根据本发明的第一个方面， 提供包含与至少一个编码序列有效连接的衰老特异性 启动子的遗传构建体， 所述编码序列编码至少一种具有烯醇丙酮酸磷酸羧激酶 (PCK) 活性 和 / 或丙酮酸正磷酸双激酶 (PPDK) 活性的多肽。
     根据本发明的第二个方面， 提供包含与至少一个编码序列有效连接的启动子的遗 传构建体， 所述编码序列编码至少一种具有烯醇丙酮酸磷酸羧激酶 (PCK) 活性和丙酮酸正 磷酸双激酶 (PPDK) 活性的多肽。 本发明人认为在衰老期间， PCK 和 PPDK 两种酶可在叶的氮素再动员期间各种氨基 酸的互变中起作用。虽然本发明人不希望受假设的束缚， 但是在图 18 中举例说明了说明 PCK 和 PPDK 可如何影响氮素再动员的推测的生化途径。 因此， 本发明人认为在衰老期间， 单 独或同时刺激植物内的这两种酶的过表达可在氮素再动员中起作用。
     作为他们研究的结果， 本发明人预料不到地发现， 编码 PCK 和 / 或 PPDK 的本发明 的构建体， 引起衰老叶氮素再动员速度的提高。 本发明人假设， 氮可以氨基酸的形式从衰老 叶移送到植物的较幼嫩部分， 例如植物种子。此外， 本发明人还发现， 当这些酶在衰老叶中 过表达时， 营养性植物生长的量提高 ( 这相当于作物产量提高 )。因此本发明人认为， 本发 明的构建体可用于制备转基因植物， 所述转基因植物可能能够显示衰老叶的氮素再动员速 度提高和 / 或生长速度提高。
     第一个方面或第二个方面的遗传构建体中的启动子可能能够诱导 RNA 聚合酶与 编码具有 PCK 和 / 或 PPDK 活性的至少一种多肽的至少一个编码区结合并开始转录。
     存在于第二个方面的构建体中的启动子可以是组成型、 非组成型或组织特异性 的。 合适启动子的实例包括花椰菜花叶病毒 35S 启动子 ( 完整启动子或截短启动子 )、 核酮 糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶启动子、 豌豆质体蓝素启动子、 胭脂氨酸合成酶启动子、 叶绿素 r/ b 结合启动子、 高分子量麦谷蛋白启动子、 α， β- 麦醇溶蛋白启动子、 大麦醇溶蛋白启动子 或 patatin 启动子。
     存在于第二个方面的构建体中的启动子可以是衰老特异性启动子。
     “衰老特异性启动子” (SAG) 可以是与控制衰老相关基因的表达有关的启动子。因 此， 该启动子可基本上唯一地在渐老组织中限制与之有效连接的编码序列 ( 即基因 ) 的表 达。 因此， 衰老特异性启动子可以是这样的启动子， 其能够在植物组织中以发育调节的方式 优先促进基因表达， 使得 3’ 蛋白质编码区的表达基本上只在植物组织正在经历衰老时发 生。应理解的是， 衰老趋于发生在植物较老的部分 ( 例如较老的叶 )， 而不发生在植物较幼
     嫩的部分， 例如种子。
     已知表达多种衰老相关基因的植物的一个实例是拟南芥 (Arabidopsis)。因 此， 第一个方面或第二个方面的构建体中的启动子可从拟南芥的衰老相关基因中分离出。 Gepstein 等人 (The Plant Journal， 2003， 36， 629-642) 使用拟南芥作为模型对 SAG 及其启 动子进行了详细研究。遗传构建体可包含得自该论文所公开的任何 SAG 的启动子。例如， 合适的启动子可选自 SAG12、 SAG13、 SAG101、 SAG21 和 SAG18 或者其功能变体或功能片段。
     优选的启动子是 SAG12 和 SAG13 启动子。 在一个实施方案中， 启动子是技术人员已 知的 SAG12 启动子或者其功能变体或片段 (Gan 和 Amasino， 1997， Plant Physiology， 113 ： 313-319)。编码 SAG12 启动子的 DNA 序列在本文中称为 SEQ ID No.16， 见下 ：
     TCGAGACCCGATTGTTATTTTTAGACTGAGACAAAAAAGTAGAATCGTTGATTGTTAAAATTTA
     AAATTAGTTTCATTACGTTTCGATAAAAAAATGATTAGTTTATCATAGCTTAATTATAGCATTG
     ATTTCTAAATTTGTTTTTTGACCACCCTTTTTTCTCTCTTTGGTGTTTTCTTAACATTAGAAGA
     ACCCATAACAATGTACGTTCAAATTAATTAAAAACAATATTTCCAAGTTTTATATACGAAACTT
     GTTTTTTTTAATGAAAACAGTTGAATAGTTGATTATGAATTAGTTAGATCAATACTCAATATAT
     GATCAATGATGTATATATATGAACTCAGTTGTTATACAAGAAATGAAAATGCTATTTAAATACA
     GATCATGAAGTGTTAAAAAGTGTCAGAATATGACATGAAGCGTTTTGTCCTACCGGGTATTCGA GTTATAGGTTTGGATCTCTCAAGAATATTTTGGGCCATACTAGTTATATTTGGGCTTAAGCGTT TTGCAAAGAGACGAGGAAGAAAGATTGGGTCAAGTTAACAAAACAGAGACACTCGTATTAGTTG GTACTTTGGTAGCAAGTCGATTTATTTGCCAGTAAAAACTTGGTACACAACTGACAACTCGTAT CGTTATTAGTTTGTACTTGGTACCTTTGGTTCAAGAAAAAGTTGATATAGTTAAATCAGTTGTG TTCATGAGGTGATTGTGATTTAATTTGTTGACTAGGGCGATTCCTTCACATCACAATAACAAAG TTTTATAGATTTTTTTTTTATAACATTTTTGCCACGCTTCGTAAAGTTTGGTATTTACACCGCA TTTTTCCCTGTACAAGAATTCATATATTATTTATTTATATACTCCAGTTGACAATTATAAGTTT ATAACGTTTTTACAATTATTTAAATACCATGTGAAGATCCAAGAATATGTCTTACTTCTTCTTT GTGTAAGAAAACTAACTATATCACTATAATAAAATAATTCTAATCATTATATTTGTAAATATGC AGTTATTTGTCAATTTTGAATTTAGTATTTTAGACGTTATCACTTCAGCCAAATATGATTTGGA TTTAAGTCCAAAATGCAATTTCGTACGTATCCCTCTTGTCGTCTAATGATTATTTCAATATTTC TTATATTATCCCTAACTACAGAGCTACATTTATATTGTATTCTAATGACAGGGAAACCTTCATA GAGATTCAGATAGATGAAATTGGTGGGAAACATCATTGAACAGGAAACTTTTAGCAAATCATAT CGATTTATCTACAAAAGAATACGTAGCGTAATGAAGTCCACTTGTTGTGAATGACTATGATTTG ATCAAATTAGTTAATTTTGTCGAATCATTTTTCTTTTTGATTTGATTAAGCTTTTAACTTGCAC GAATGGTTCTCTTGTGAATAAACAGAATCTTTGAATTCAAACTATTTGATTAGTGAAAAGACAA AAGAAGATTCCTTGTTTTTATGTGATTAGTGATTTTGATGCATGAAAGGTACCTACGTACTACA AGAAAAATAAACATGTACGTAACTACGTATCAGCATGTAAAAGTATTTTTTTCCAAATAATTTA TACTCATGATAGATTTTTTTTTTTTGAAATGTCAATTAAAAATGCTTTCTTAAATATTAATTTT AATTAATTAAATAAGGAAATATATTTATGCAAAACATCATCAACACATATCCAACTTCGAAAAT CTCTATAGTACACAAGTAGAGAAATTAAATTTTACTAGATACAAACTTCCTAATCATCAAATAT AAATGTTTACAAAACTAATTAAACCCACCACTAAAATTAACTAAAAATCCGAGCAAAGTGAGTG AACAAGACTTGATTTCAGGTTGATGTAGGACTAAAATGACTACGTATCAAACATCAACGATCATTTAGTTATGTATGAATGAATGTAGTCATTACTTGTAAAACAAAAATGCTTTGATTTGGATCAAT
     CACTTCATGTGAACATTAGCAATTACATCAACCTTATTTTCACTATAAAACCCCATCTCAGTAC
     CCTTCTGAAGTAATCAAATTAAGAGCAAAAGTCATTTAACTTAGG
     SEQ ID NO ： 16
     因此， 本发明构建体中的启动子可包含基本上如 SEQ ID No.16 所示的核苷酸序列 或者其功能变体或功能片段。SAG12 启动子序列可获自鼠耳芥， 参见 US 5,689,042。这个 启动子序列可存在于本发明的每个遗传构建体中， 如图 3 所示。在启动子是 SAG12 的实施 方案中， 应理解的是， 启动子可包含 SEQ ID No ： 16 的碱基 1-2093 中的每一个。然而， 启动 子的功能变体或功能片段也可用于本发明的遗传构建体。
     “启动子的功能变体或功能片段” 可以是启动子的衍生物或部分， 其在功能上足以 启动与之有效连接的任何编码区的表达。例如， 在启动子是以 SAG12 为基础的实施方案中， 技术人员应了解的是可对 SEQ ID No ： 16 进行修饰， 或者可能只需要 SAG12 启动子的部分， 使之仍可启动构建体的基因表达。
     可通过评价转录酶是否与推定的启动子区结合， 然后引起编码区转录成具有 PCK 和 / 或 PPDK 活性的多肽， 来容易地鉴定启动子的功能变体和功能片段。 或者， 可通过在与编 码区结合时对启动子进行诱变， 并评价是否可产生基因表达， 来检测这类功能变体和片段。 在衰老期间， 第一个方面的遗传构建体可能能够引起至少一种具有 PCK 活性和 / 或 PPDK 活性的多肽的表达。因此， 遗传构建体可包含至少一个编码序列， 其编码 (i) 烯醇 丙酮酸磷酸羧激酶 (PCK) 或者其功能变体或片段， 和 / 或 (ii) 丙酮酸正磷酸双激酶 (PPDK) 或者其功能变体或片段。如实施例中所述， 本发明人开发出以具有 PCK 和 / 或 PPDK 活性的 多肽为基础的一系列遗传构建体， 这些遗传构建体示于图 3。
     在第一个方面的遗传构建体的第一个实施方案中， 启动子可诱导编码具有 PCK 活 性的多肽的编码序列的表达。这在本文中称为 “PCK 构建体” ， 见图 3。因此， 在第一个实施 方案中， 遗传构建体可包含衰老特异性启动子和编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶 (PCK) 或者其 功能变体或片段的编码序列。遗传构建体可不编码具有 PPDK 活性的多肽。
     在第一个方面的构建体的第二个实施方案中， 启动子可诱导编码具有 PPDK 活性 的多肽的编码序列的表达。这在本文中称为 “PPDK 构建体” ， 见图 3。在第二个实施方案中， 遗传构建体可包含衰老特异性启动子和编码丙酮酸正磷酸双激酶 (PPDK) 或者其功能变体 或片段的编码序列。遗传构建体可不编码具有 PCK 活性的多肽。
     在第一个方面的构建体的第三个实施方案中， 启动子可诱导编码既具有 PCK 活性 又具有 PPDK 活性的多肽的单一编码序列的表达。 这称为 “PCK/PPDK 构建体 1” 。 在第三个实 施方案中， 遗传构建体可包含衰老特异性启动子和编码 (i) 烯醇丙酮酸磷酸羧激酶 (PCK) 或者其功能变体或片段以及 (ii) 丙酮酸正磷酸双激酶 (PPDK) 或者其功能变体或片段的编 码序列。第三个实施方案的构建体可编码具有双重活性 ( 即 PCK 和 PPDK 酶促活性两者 ) 的单一转录物。PCK 编码区可位于 PPDK 编码区的 3’ 侧。然而， 优选 PCK 编码区位于 PPDK 编码区的 5’ 侧。
     在第一个方面的构建体的第四个实施方案中， 启动子可诱导以下序列的表达 ： (i) 编码具有 PCK 活性的第一多肽的第一编码序列， 和 (ii) 编码具有 PPDK 活性的第二多肽的 第二编码序列。这称为 “PCK/PPDK 构建体 2” 。因此， 在第四个实施方案中， 遗传构建体可包
     含至少一个衰老特异性启动子和 (i) 编码 PCK 或者其功能变体或片段的第一编码序列， 以 及 (ii) 编码 PPDK 或者其功能变体或片段的第二编码序列， 即编码两种转录物， 一种酶一种 转录物。
     如实施例 6 中所述， 本发明人发现在宿主细胞中过表达 PCK 或 PPDK( 例如通过用 “PCK 构建体” 或 “PPDK 构建体” 转化 ) 引起在衰老叶中氮素再动员加强。此外， 他们发现 PCK 和 PPDK 单一构建体导致营养生长增加。
     如实施例 8 中所述， 本发明人发现在宿主细胞中同时过表达 PCK 和 PPDK 两者 ( 例 如通过用 “PCK 构建体” 和 “PPDK 构建体” 两者转化 ) 在诱导衰老叶中的氮素再动员方面出 乎意料地有效。因此， 氮可被转运到衰老叶以外 ( 例如作为转运氨基酸 )。合适的转运氨基 酸可以是谷氨酰胺和 / 或天冬酰胺。此外， 在衰老期间同时过表达 PCK 和 PPDK 还可提高生 长速度， 这可导致营养生长增加。因此， 第一个方面的构建体可包含编码 PCK 和 PPDK 两者 或者其功能变体或片段的编码序列。
     应理解的是， 第二个方面的构建体包含编码 PCK 和 PPDK 两者或者其功能变体或片 段的编码序列。可作为具有双重活性的单一多肽， 或作为两个多肽， 一个具有 PCK 活性， 另 一个具有 PPDK 活性， 来编码两种酶。
     烯醇丙酮酸磷酸羧激酶 (PCK) 或者其功能变体或片段和丙酮酸正磷酸双激酶 (PPDK) 或者其功能变体或片段各自可来源于任何合适的来源， 例如植物。每种酶的编 码序列可来源于合适的植物源， 例如来自拟南芥。因此， 编码具有 PCK 活性的多肽的编 码序列可来源于拟南芥。此外， 编码具有 PPDK 活性的多肽的编码序列可来源于拟南芥 属 (Arabidopsis spp.)、 玉蜀黍属 (Zea spp.)、 黄花菊属 (Flaveria spp.) 或白花菜属 (Cleome spp.)。 编码具有 PPDK 活性的多肽的编码序列可来源于鼠耳芥、 玉米 (Zea mays)、 Flaveria trinervia、 黄顶菊 (Flaveria bidentis)、 Flaveria brownie 或白花菜 (Cleome gynandra)。
     据认为在鼠耳芥中有三种编码 PCK 的基因。本文如下提供编码拟南芥烯醇丙酮酸 磷酸羧激酶 (PCK) 的一个实施方案的基因组 DNA 序列 ( 包括内含子和外显子 ) 作为 SEQ ID No ： 17 ：
     ATGTCGGCCGGTAACGGAAATGCTACTAACGGTGACGGAGGGTTTAGTTTCCCTAAAGGACCGG
     TGATGCCGAAGATAACGACCGGAGCAGCAAAGAGAGGTAGCGGAGTCTGCCACGACGATAGTGG
     TCCGACGGTGAATGCCACAACCATCGATGAGCTTCATTCGTTACAGAAGAAACGTTCTGCTCCT
     ACCACACCGATCAACCAAAACGCCGCCGCTGCTTTTGCCGCCGTCTCCGAGGAGGAGCGTCAGA
     AGATTCAGCTTCAATCTATCAGGTCCTTATAATAACTTCACATATACAGATTATTCATACGTTA
     CTTTTGTTTATAACATACTTTATATCGAATTAAGGAAGATTATTGCGTTTTCGTGTCCGATCAT
     TTTCATGGAAAAAGTGTCTTTTAGCTAAATATATGGTGTAGTATTAAATATTTCTGACGTGATA
     TACACTAAACTTGAAAATTTTCAATTACTATTTCTTCCTTTAATTCGGCAATATAATTTGTTTT
     TGTTTATTTTTGGATTAGACATTTATGGACAAGTTAATGCGCTATTGTGACTATTACCAGAAAA
     TAATACTTTAATGTACATGACACGTGTTTAAAACGACACGTGGAAACTAATTTTGATTAATTGT
     GAAACAGTGCATCGTTAGCATCGTTAACGAGAGAGTCAGGACCAAAGGTGGTGAGAGGAGATCC
     GGCGGAGAAGAAGACCGATGGTTCAACTACTCCGGCGTACGCTCACGGCCAACATCATTCTATC
     TTTTCTCCGGCTACTGGTGCTGTCAGTGATAGCTCCTTGAAGTTTACTCACGTCCTCTACAATCTTTCGCCTGCAGGTCAACAAATAAACCTAGAATCCGAATCTGAATATTGATAAATGTTTCTGCA ACGAGTTTGATAGATTTGGTTTGTGATTTTGTTGTTTGTAGAGCTTTATGAGCAAGCTATTAAG TATGAGAAAGGTTCGTTTATCACTTCTAATGGAGCTTTGGCGACGCTTTCTGGTGCTAAGACTG GTCGTGCTCCCAGAGATAAGCGTGTTGTTAGAGATGCTACTACTGAGGATGAGCTTTGGTGGGG AAAGTGAGTATTCCTAATCTCGATTTTGATTGATGGAGTTTTTGGGTTTATGCTCTGTTTTCGT TTATTGATTTTGGAGTTTGATTTTGATTTTAGGGGTTCGCCGAATATCGAAATGGATGAACATA CTTTCATGGTGAACAGAGAAAGAGCTGTTGATTACTTGAATTCCTTGGAAAAGGTATTAAATTT TGAAAACTTTAATCAATGTTGTTGAGTGTAGAACTTTTGATCTAAGTTTATGAAATTTCTGTTG TTGTTGGGGTTTTTAGGTCTTTGTCAATGACCAATACTTAAACTGGGATCCAGAGAACAGAATC AAAGTCAGGATTGTCTCAGCTAGAGCTTACCATTCATTGTTTATGCACAACATGTAAGTAAAAT CATTATTGACTCCTTGTATGTCAATCCATTATTGTGGGTGAAAGAAAACAACAAATTAGTAACT GGGGAGGGTGTCAGGTGTATCCGACCAACTCAGGAGGAGCTTGAGAGCTTTGGTACTCCGGATT TTACTATATACAATGCTGGGCAGTTTCCATGTAATCGTTACACTCATTACATGACTTCGTCCAC TAGCGTAGACCTTAATCTGGCTAGGAGGGAAATGGTTATACTTGGTACTCAGTATGCTGGGGAA ATGAAGAAGGGTCTTTTCAGTGTGATGCATTACCTTATGCCTAAGCGTCGTATTCTCTCCCTTC ATTCTGGATGCAATATGGGAAAAGATGGAGATGTTGCTCTCTTCTTTGGACTTTCAGGTATAGT AGAGACAGTACCAACTATGGTGTTGGGTGATGATGGAAGGAACGATAAATCAAATGATACAATA CAATTACTGCTGAACTGACTTGAGAACTGCTTGCCTCTTTGTTGAGTTTAGCGGGTGAATTGAG ATTGATGATTGTGTTTTTTGTTTTCTATGAATGATGATTTTAGGTACCGGGAAGACAACGCTGT CTACTGATCACAACAGGTATCTTATTGGAGATGATGAGCATTGTTGGACTGAGACTGGTGTTTC GAACATTGAGGGTGGGTGCTATGCTAAGTGTGTTGATCTTTCGAGGGAGAAGGAGCCTGATATC TGGAACGCTATCAAGTTTGGAACAGGTAGAAAGACAGTACGTTGGAATTGTTTTTGAGAAAAAA ACATAAAGCAGTGATATAACAATAAGATTCTGATCTTGTTGCAGTTTTGGAAAATGTTGTGTTT GATGAGCACACCAGAGAAGTGGATTACTCTGATAAATCTGTTACAGGTAAAACAATTGTTATTT CTTTCATTCTCTTCGTCCTCACAATTAACAGAATGATCATTTTCGATTCTCTTTGGTTGCAGAG AACACACGTGCTGCCTACCCAATTGAGTTCATTCCAAATGCGAAAATACCTTGTGTTGGTCCAC ACCCGACAAATGTGATACTTCTGGCTTGTGATGCCTTTGGTGTTCTCCCACCTGTGAGCAAGCT GAATCTGGCACAAACCATGTACCACTTCATCAGTGGTTACACTGCTCTGGTAAGGCCAAAGTAA AAGTCTTTATTTTGCACATCGTCTTCATAAATTTCAAAAGCATAACCAAAGATGTGCAACATAT ATAGGTTGCTGGCACAGAGGATGGTATCAAGGAGCCAACAGCAACATTCTCAGCTTGCTTTGGT GCAGCTTTCATAATGTTGCATCCCACAAAGTATGCAGCTATGTTAGCTGAGAAGATGAAGTCAC AAGGTGCTACTGGTTGGCTCGTCAACACTGGTTGGTCTGGTGGCAGGTATATATGTCCTTCTAT GGAAATCGATACAACAAAACGCTGCCTTGTAACACATGTTTGTAGGCTATTAACATGATCTGTA ATGTTTTATTTCCTGCAGTTATGGTGTTGGAAACAGAATCAAGCTGGCATACACTAGAAAGATC ATCGATGCAATCCATTCGGGCAGTCTCTTGAAGGCAAACTACAAGAAAACCGAAATCTTTGGAT TTGAAATCCCAACTGAGATCGAAGGGATACCTTCAGAGATCTTGGACCCCGTCAACTCCGTAAG TTTCTGCAAATCTGTATAATGTAATTGCTTAAGTGATGATGAACAATTTTTTGTTGATTTGGGT TTAATGAAAATGCAGTGGTCTGATAAGAAGGCACACAAAGATACTCTGGTGAAACTGGGAGGTC TGTTCAAGAAGAACTTCGAGGTTTTTGCTAACCATAAGATTGGTGTGATGGTAAGCTTACGGAGGAGATTCTCGCTGCTGGTCCTATCTTTTAG
     SEQ ID No ： 17
     本文如下提供编码拟南芥烯醇丙酮酸磷酸羧激酶 (PCK) 的 cDNA 序列 ( 仅外显子 ) 作为 SEQ ID No ： 18 ：
     ATGTCGGCCGGTAACGGAAATGCTACTAACGGTGACGGAGGGTTTAGTTTCCCTAAAGGA
     CCGGTGATGCCGAAGATAACGACCGGAGCAGCAAAGAGAGGTAGCGGAGTCTGCCACGAC
     GATAGTGGTCCGACGGTGAATGCCACAACCATCGATGAGCTTCATTCGTTACAGAAGAAA
     CGTTCTGCTCCTACCACACCGATCAACCAAAACGCCGCCGCTGCTTTTGCCGCCGTCTCC
     GAGGAGGAGCGTCAGAAGATTCAGCTTCAATCTATCAGTGCATCGTTAGCATCGTTAACG
     AGAGAGTCAGGACCAAAGGTGGTGAGAGGAGATCCGGCGGAGAAGAAGACCGATGGTTCA
     ACTACTCCGGCGTACGCTCACGGCCAACATCATTCTATCTTTTCTCCGGCTACTGGTGCT
     GTCAGTGATAGCTCCTTGAAGTTTACTCACGTCCTCTACAATCTTTCGCCTGCAGAGCTT
     TATGAGCAAGCTATTAAGTATGAGAAAGGTTCGTTTATCACTTCTAATGGAGCTTTGGCG
     ACGCTTTCTGGTGCTAAGACTGGTCGTGCTCCCAGAGATAAGCGTGTTGTTAGAGATGCT
     ACTACTGAGGATGAGCTTTGGTGGGGAAAGGGTTCGCCGAATATCGAAATGGATGAACAT
     ACTTTCATGGTGAACAGAGAAAGAGCTGTTGATTACTTGAATTCCTTGGAAAAGGTCTTT GTCAATGACCAATACTTAAACTGGGATCCAGAGAACAGAATCAAAGTCAGGATTGTCTCA GCTAGAGCTTACCATTCATTGTTTATGCACAACATGTGTATCCGACCAACTCAGGAGGAG CTTGAGAGCTTTGGTACTCCGGATTTTACTATATACAATGCTGGGCAGTTTCCATGTAAT CGTTACACTCATTACATGACTTCGTCCACTAGCGTAGACCTTAATCTGGCTAGGAGGGAA ATGGTTATACTTGGTACTCAGTATGCTGGGGAAATGAAGAAGGGTCTTTTCAGTGTGATG CATTACCTTATGCCTAAGCGTCGTATTCTCTCCCTTCATTCTGGATGCAATATGGGAAAA GATGGAGATGTTGCTCTCTTCTTTGGACTTTCAGGTACCGGGAAGACAACGCTGTCTACT GATCACAACAGGTATCTTATTGGAGATGATGAGCATTGTTGGACTGAGACTGGTGTTTCG AACATTGAGGGTGGGTGCTATGCTAAGTGTGTTGATCTTTCGAGGGAGAAGGAGCCTGAT ATCTGGAACGCTATCAAGTTTGGAACAGTTTTGGAAAATGTTGTGTTTGATGAGCACACC AGAGAAGTGGATTACTCTGATAAATCTGTTACAGAGAACACACGTGCTGCCTACCCAATT GAGTTCATTCCAAATGCGAAAATACCTTGTGTTGGTCCACACCCGACAAATGTGATACTT CTGGCTTGTGATGCCTTTGGTGTTCTCCCACCTGTGAGCAAGCTGAATCTGGCACAAACC ATGTACCACTTCATCAGTGGTTACACTGCTCTGGTTGCTGGCACAGAGGATGGTATCAAG GAGCCAACAGCAACATTCTCAGCTTGCTTTGGTGCAGCTTTCATAATGTTGCATCCCACA AAGTATGCAGCTATGTTAGCTGAGAAGATGAAGTCACAAGGTGCTACTGGTTGGCTCGTC AACACTGGTTGGTCTGGTGGCAGTTATGGTGTTGGAAACAGAATCAAGCTGGCATACACT AGAAAGATCATCGATGCAATCCATTCGGGCAGTCTCTTGAAGGCAAACTACAAGAAAACC GAAATCTTTGGATTTGAAATCCCAACTGAGATCGAAGGGATACCTTCAGAGATCTTGGAC CCCGTCAACTCCTGGTCTGATAAGAAGGCACACAAAGATACTCTGGTGAAACTGGGAGGT CTGTTCAAGAAGAACTTCGAGGTTTTTGCTAACCATAAGATTGGTGTGATGGTAAGCTTA CGGAGGAGATTCTCGCTGCTGGTCCTATCTTTTAG SEQ ID No ： 18因此， 编码具有 PCK 活性的多肽的编码序列可包含基本上如 SEQ ID No ： 17 或 SEQ ID No.18 所示的核酸序列或者其功能变体或片段。
     本文如下提供拟南芥 PCK 的多肽序列作为 SEQ ID No ： 19 ：
     MSAGNGNATNGDGGFSFPKGPVMPKITTGAAKRGSGVCHDDSGPTVNATTIDELHSLQKK
     RSAPTTPINQNAAAAFAAVSEEERQKIQLQSISASLASLTRESGPKVVRGDPAEKKTDGS
     TTPAYAHGQHHSIFSPATGAVSDSSLKFTHVLYNLSPAELYEQAIKYEKGSFITSNGALA
     TLSGAKTGRAPRDKRVVRDATTEDELWWGKGSPNIEMDEHTFMVNRERAVDYLNSLEKVF
     VNDQYLNWDPENRIKVRIVSARAYHSLFMHNMCIRPTQEELESFGTPDFTIYNAGQFPCN
     RYTHYMTSSTSVDLNLARREMVILGTQYAGEMKKGLFSVMHYLMPKRRILSLHSGCNMGK
     DGDVALFFGLSGTGKTTLSTDHNRYLIGDDEHCWTETGVSNIEGGCYAKCVDLSREKEPD
     IWNAIKFGTVLENVVFDEHTREVDYSDKSVTENTRAAYPIEFIPNAKIPCVGPHPTNVIL
     LACDAFGVLPPVSKLNLAQTMYHFISGYTALVAGTEDGIKEPTATFSACFGAAFIMLHPT
     KYAAMLAEKMKSQGATGWLVNTGWSGGSYGVGNRIKLAYTRKIIDAIHSGSLLKANYKKT
     EIFGFEIPTEIEGIPSEILDPVNSWSDKKAHKDTLVKLGGLFKKNFEVFANHKIGVMVSL
     RRRFSLLVLSF SEQ ID No ： 19
     因此， 具有 PCK 活性的多肽可包含基本上如 SEQ ID No ： 19 所示的氨基酸序列或者 其功能变体或片段。
     据认为拟南芥至少有两种形式的 PPDK， 叶绿体形式和胞质形式， 这两种形式由同 一基因编码， 其中该基因 5′端的少量剪接变化产生了这两种形式。 本文如下提供编码两种 形式的拟南芥丙酮酸正磷酸双激酶 (PPDK) 的基因组 DNA 序列 ( 包括内含子和外显子 ) 作 为 SEQ ID No ： 20 ：
     ATGACAAGTATGATCGTGAAGACAACGCCGGAGCTCTTCAAAGGAAATGGAGTGTTCCGTACGG
     ATCATCTCGGAGAAAACCGAATGGTTAGTCGATCAAACCGGCTAGGTGATGGATCAAACCGTTT
     CCCTAGAACCGGTACAATCCATTGCCAACGGTTAAGCATAGCAAAGACCGGTTTGCATCGTGAG
     ACGAAGGCTCGAGCCATACTTAGCCCTGTGTCCGATCCGGCCGCTTCCATAGCCCAAAAGGTAA
     GCCTTTCCATTTCAATCATTCTGGTGTATTTTCACCATAAAATTTTATACACTTTTTTATTACG
     TTTTGTTTTATGATTCTGACGTGAGATTCTTGAGAGAAACTATCACCGATCATTGGGTCGAACC
     ATCTAGCAGCTCAATTATTATCGGTTATAACCCTACCGGTTATAGAATACAAAACAGGTTACGC
     CATTGTGACATTTGCTTTGTGATCTTGTGAGACGATTAATTATTTGATGTTGATTGGTTTCGTT
     ACTCTTGTTTAAACAATCGAACGGTTCAAACTAATACACACATGTGATGTGAGATCATTTCGGT
     AGTAATACCAAATAGCGTCTGGCCTAAATTATGAAAGTACTATTTTGAATTAAATTATTGTGGA
     AACATGAACTTATTTAAATTCAAGTATTTTCGAAATTTGTAATAAAAAAAAACTTTTCCTCTAG
     ATTCATTAGCCCTACTTTTCGTAGAAACAACTTTAATGTATTCAAAGACCACTTTGCTGCTTAA
     GTCAGACTCTTGTGCCACTTGGTAGATCCACCAATGCCACGTTTTGTTATTGTGCCAAAGAATA
     CGTGAATATGTCCAAACGGCAATCAAATTCTTGGCGTAAAACACAAAAATTATGATACTAGTTT
     AAATCCACAATTCACCTTCACCATAAAGAATTCATGTATTAGAGATGGTATGACAAGAACTGGT
     TGAATTTGATGACATTTGTTTGCTATTGTTTTGGTTAAGTAAAAGTTTTGTTAAAAAGGAAAAT
     AGCATCGGTAGTGGCAGATAGCAAGTGTGTGAGTGAGATCAGATATGGTTGACACATCTATGAC
     GAGTCATCGCAACGAAACTTCTTTAATTTTGGTCAATTATATTACAATTTAGCATTTCGAGGTT GGAATTTTGGAATGATCTCTTGATAAGATAATAATGTATTTTTGATGACGTATCCATCAAAACT ATAAATGATTTATATTAAATATGAAATTTCGACTGTATACAAGTTTTTATATTATAAAATTATT CGATGTACATATGATCATAATAACTTTACTATATATATAGATACGTATATGTGTTCTTAAACTT GCACAAACATTTCTGCAATCTAAACCTCAATCAAAACAAACAAACAAAAAACCATGATGCAGCG AGTATTCACCTTTGGAAAAGGAAGAAGCGAAGGCAACAAGGGCATGAAGTCCTTGGTATGTTAC CAATACCATCATCATGATCATATCAATTCATTAATAATTTAGTGTTTGCTATTTTCAAGAACCA TTTATCAAAAATGTTAATTGTTGTTGTGTATGAAGTTGGGAGGGAAAGGAGCCAACCTGGCGGA GATGGCTAGCATAGGCTTGTCGGTGCCGCCGGGGCTAACCATATCGACGGAGGCTTGTCAGCAG TATCAGATCGCCGGCAAAAAGCTTCCAGAAGGTTTATGGGAAGAGATCTTAGAAGGTCTTAGCT TCATCGAACGTGACATTGGAGCTTCCCTCGCTGATCCCTCCAAGCCACTCCTCCTCTCTGTTCG CTCCGGCGCCGCCGTAAGTTAATTATAACTTTTTTTCTTGACTATTTTTATTTTAAGGATTTTT TCTAATGTTAAATTTCTGTTTTTTTTTCTTTCTATGTTTTCTTTAATCTTTTGAAGATTTTTTG ACGCAGATTTTGACTTGTTAGATTTCTTTTATTGAAGTTGAGATCCAAATATTTTTTTGGTTAT TTTGCCATTTGGCCGTTTTTGGAAGAGTTTAAAATGTACTAGATAGAAAATGAATAAGTTTTGT GGCTATTGAAAGACCTAATGATTTTGGTATTCAAACTATAACGTAGAAAATGAAGATCTTTCGT TTATCTATTTTTAAAACAGAACTACATTGACTTGTCTTTGATCGATATTTTGCATTGTAGATCT CAATGCCTGGTATGATGGACACTGTACTTAACCTTGGCTTGAACGACCAAGTCGTCGTTGGTCT GGCCGCAAAAAGCGGAGAGCGTTTTGCTTACGATTCGTTCCGGCGTTTTCTTGATATGTTTGGT GATGTTGTAAGTCCTCTGTTTTTCAATACTATTTCAGGTAACTTGCATGACAAGAAAATTCTTT GACCTACCTTATAATTGTTTTCTTGATCAATAAAAGGTGATGGGAATTCCACACGCCAAGTTTG AAGAGAAGTTAGAGAGAATGAAGGAGAGGAAAGGAGTTAAAAATGACACTGACTTAAGCGCGGC TGATCTCAAGGAATTGGTTGAGCAGTACAAGAGTGTTTACTTAGAGGCCAAGGGTCAAGAGTTT CCTTCAGGTTTGTTTTGATTCCTACTTGAGGTCAAGTGATAAAAATTAGTTATTAGTTACAAAT GTTTAAACGGGGTTAATTGCAGATCCAAAGAAGCAATTGGAGCTAGCGATTGAAGCGGTATTCG ATTCTTGGGATAGCCCGAGAGCGAACAAGTACAGAAGTATTAACCAGATAACTGGATTGAAAGG AACCGCGGTTAACATTCAGTGTATGGTGTTTGGAAACATGGGGGACACTTCAGGGACTGGTGTT CTCTTCACTAGGAACCCTAGCACAGGAGAGAAGAAGCTTTATGGCGAGTTTCTAGTTAATGCTC AGGTTTGGCATCTATCACAATGTGTGAATCTCATATCAACAAGTAAGCCCATACTCATTAAATA TTGGTTTTGGGACAGGGAGAGGATGTGGTTGCAGGGATAAGAACACCAGAAGATTTGGATACAA TGAAGAGATTTATGCCTGAGGCTTACGCTGAACTTGTTGAGAACTGCAACATCTTAGAAAGACA TTACAAAGACATGATGGTTGATACACATAAACAATACTTCAATTAGTCCTCATCAACAATTCTT TAGTAATTTAAACAAAATCTCAAATGTGTATTGCAGGATATTGAATTCACAGTACAAGAAGAGA GATTGTGGATGCTGCAATGCAGAGCGGGTAAGCGAACGGGTAAAGGCGCCGTGAAGATAGCAGT TGATATGGTAGGTGAAGGGCTTGTTGAGAAATCTTCTGCTATCAAAATGGTGGAGCCTCAACAT CTTGATCAACTACTTCACCCACAGGTACAAACTCAAATATTCATCTTCTTCTTTTTTCATAGTC ATAAACTTGATGTTGAAACCAAAATTCGAAACTTACTGGTAATGATTGGTTCACTTGAACAAGA ACTAATGGGTTTAAGACGTTTAGGGTTTAGGAGTAAAAGCAGAGATGATTGTCTGACACGTAAC CGATGAATAGGGTTTGGAAATTTTGATTCAGAGGTCAATGAAGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTAT为 SEQ
     TGATGGATTAGTTTCATGATCCATCGGGGTATCGTGAAAAAGTGGTGGCCAAAGGCTTACCTGC GTCACCAGGAGCGGCGGTTGGACAGGTTGTGTTCACGGCGGAGGAAGCCGAAGCTTGGCATTCT CAGGGTAAAACTGTGATTCTGGTTCGAACTGAGACAAGCCCTGACGATGTGGGAGGTATGCACG CAGCGGAAGGTATATTGACGGCTAGAGGAGGAATGACGTCACACGCGGCTGTTGTTGCTCGCGG TTGGGGAAAATGTTGCATTGCTGGTTGTTCCGAGATTCGTGTCGACGAGAACCACAAGGTTTTT GGATTCGATTTTAGAAACTTGTCATATAAGTTAGGGGAAGATTGTTTCTAAAGTTAGGGTTTAA AAATTTTCAGGTTCTATTGATTGGAGATTTGACGATTAATGAAGGCGAATGGATCTCAATGAAC GGATCAACCGGTGAGGTTATATTAGGGAAACAAGCATTGGCTCCTCCGGCTTTAAGTCCAGATT TGGAGACTTTCATGTCCTGGGCTGATGCAATCAGACGTCTCAAGGTGTTTATGAGTTTCTGTTC CTTTAACTTGTTTGATATTTTTAAACTTTCTAACTCAAATGTTCGATGACCGATAAGGTTATGG CGAATGCGGATACACCTGAAGACGCCATTGCAGCTAGGAAAAACGGAGCTCAAGGAATCGGGCT TTGTAGGACAGAGCATATGGTAACTCCTCCTCTGTACTTGATTTCATGTTTTTGATGATTTAGA TTGTTTGTATCCAAATGTTTAATGTTGTCTTTGGTTTGGTTTTTAAGTTCTTTGGAGCAGATAG GATTAAAGCAGTGAGAAAGATGATAATGGCGGTAACAACAGAGCAAAGGAAAGCTTCTCTCGAC ATCTTGCTTCCTTACCAACGTTCGGATTTCGAAGGGATCTTCCGTGCTATGGATGGTAAATGTT TTGAGTCGTCTCTCTAAAATGTATCACAACTTAAAACATGCCTAAACCTTTTTATTTTTCTAGG TTTACCGGTAACAATCCGTTTGTTAGACCCTCCGCTTCACGAGTTTCTCCCGGAAGGCGACTTG GACAACATTGTACATGAGCTAGCTGAAGAAACTGGTGTGAAAGAAGATGAAGTCTTGTCACGGA TAGAGAAACTCTCTGAAGTGAATCCAATGCTTGGTTTCCGCGGTTGCAGGTTTCTTACTCTCTT TGTTTCTCTCTGTCTCTTTGCACCTGAAGAACAATCTGATGATCGGTAAACTTGTACGTTATAG GCTCGGAATATCGTATCCAGAGCTAACGGAGATGCAAGCGCGTGCAATTTTTGAAGCTGCAGCG TCAATGCAGGACCAAGGTGTTACTGTCATTCCTGAGATTATGGTTCCACTTGTAGGAACTCCTC AGGAATTGGGTCACCAAGTTGATGTAATTCGTAAAGTTGCAAAGAAAGTATTTGCTGAGAAGGG TCATACCGTGAGCTACAAGGTTGGGACAATGATTGAGATCCCTCGAGCCGCGCTCATTGCAGAT GAGGTAAATGTAACAAGACACAAAATGTGTTTTAGGCACTTGAAACCATGTTGCTATTTGCTAA GTAGGAACCTTTTTCTTTTGACAGATTGCGAAAGAGGCGGAGTTTTTCTCGTTCGGGACAAACG ACTTGACGCAGATGACGTTTGGATACAGTAGAGACGATGTCGGCAAGTTTCTACCGATTTACCT CGCCAAAGGAATCTTACAGCACGACCCTTTTGAGGTATAATGACTACCATTTCGTTTGCTCTCT ATCCATAGGATAAAATCTTGATAGCCATTTTTTTGTGTTTGGACCAGGTTCTTGATCAGCAAGG TGTAGGGCAATTGATCAAGATGGCGACAGAAAAAGGACGAGCAGCTAGGCCTAGCCTCAAGGTT GGGATATGTGGAGAACATGGAGGAGATCCATCTTCTGTGGGATTCTTTGCTGAAGCAGGACTTG ACTATGTCTCTTGTTCTCCTTTCAGGTAATTGATTAATTTCCAAACCAATAAACACTTTTTTTA CAACACTATTGTATAACTCAGATTGATGTAATTTTGGGATTTCTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGT TGTTGTTGCAGGGTTCCAATTGCAAGGCTTGCAGCTGCTCAAGTAGTTGTTGCATGA SEQ ID No ： 20 本文如下提供编码胞质形式的拟南芥丙酮酸正磷酸双激酶 (PPDK) 的 cDNA 序列作 ID No ： 21 ： ATGATGCAGCGAGTATTCACCTTTGGAAAAGGAAGAAGCGAAGGCAACAAGGGCATGAAG TCCTTGTTGGGAGGGAAAGGAGCCAACCTGGCGGAGATGGCTAGCATAGGCTTGTCGGTGCCGCCGGGGCTAACCATATCGACGGAGGCTTGTCAGCAGTATCAGATCGCCGGCAAAAAG CTTCCAGAAGGTTTATGGGAAGAGATCTTAGAAGGTCTTAGCTTCATCGAACGTGACATT GGAGCTTCCCTCGCTGATCCCTCCAAGCCACTCCTCCTCTCTGTTCGCTCCGGCGCCGCC ATCTCAATGCCTGGTATGATGGACACTGTACTTAACCTTGGCTTGAACGACCAAGTCGTC GTTGGTCTGGCCGCAAAAAGCGGAGAGCGTTTTGCTTACGATTCGTTCCGGCGTTTTCTT GATATGTTTGGTGATGTTGTGATGGGAATTCCACACGCCAAGTTTGAAGAGAAGTTAGAG AGAATGAAGGAGAGGAAAGGAGTTAAAAATGACACTGACTTAAGCGCGGCTGATCTCAAG GAATTGGTTGAGCAGTACAAGAGTGTTTACTTAGAGGCCAAGGGTCAAGAGTTTCCTTCA GATCCAAAGAAGCAATTGGAGCTAGCGATTGAAGCGGTATTCGATTCTTGGGATAGCCCG AGAGCGAACAAGTACAGAAGTATTAACCAGATAACTGGATTGAAAGGAACCGCGGTTAAC ATTCAGTGTATGGTGTTTGGAAACATGGGGGACACTTCAGGGACTGGTGTTCTCTTCACT AGGAACCCTAGCACAGGAGAGAAGAAGCTTTATGGCGAGTTTCTAGTTAATGCTCAGGTT TGGCATCTATCACAATGTGTGAATCTCATATCAACAAGGATAAGAACACCAGAAGATTTG GATACAATGAAGAGATTTATGCCTGAGGCTTACGCTGAACTTGTTGAGAACTGCAACATC TTAGAAAGACATTACAAAGACATGATGGATATTGAATTCACAGTACAAGAAGAGAGATTG TGGATGCTGCAATGCAGAGCGGGTAAGCGAACGGGTAAAGGCGCCGTGAAGATAGCAGTT GATATGGTAGGTGAAGGGCTTGTTGAGAAATCTTCTGCTATCAAAATGGTGGAGCCTCAA CATCTTGATCAACTACTTCACCCACAGTTTCATGATCCATCGGGGTATCGTGAAAAAGTG GTGGCCAAAGGCTTACCTGCGTCACCAGGAGCGGCGGTTGGACAGGTTGTGTTCACGGCG GAGGAAGCCGAAGCTTGGCATTCTCAGGGTAAAACTGTGATTCTGGTTCGAACTGAGACA AGCCCTGACGATGTGGGAGGTATGCACGCAGCGGAAGGTATATTGACGGCTAGAGGAGGA ATGACGTCACACGCGGCTGTTGTTGCTCGCGGTTGGGGAAAATGTTGCATTGCTGGTTGT TCCGAGATTCGTGTCGACGAGAACCACAAGGTTCTATTGATTGGAGATTTGACGATTAAT GAAGGCGAATGGATCTCAATGAACGGATCAACCGGTGAGGTTATATTAGGGAAACAAGCA TTGGCTCCTCCGGCTTTAAGTCCAGATTTGGAGACTTTCATGTCCTGGGCTGATGCAATC AGACGTCTCAAGGTTATGGCGAATGCGGATACACCTGAAGACGCCATTGCAGCTAGGAAA AACGGAGCTCAAGGAATCGGGCTTTGTAGGACAGAGCATATGATTGTTTGTATCCAAATG TTTAATGTTGTCTTTGGTTTGGTTTTTAAGTTCTTTGGAGCAGATAGGATTAAAGCAGTG AGAAAGATGATAATGGCGGTAACAACAGAGCAAAGGAAAGCTTCTCTCGACATCTTGCTT CCTTACCAACGTTCGGATTTCGAAGGGATCTTCCGTGCTATGGATGGTTTACCGGTAACA ATCCGTTTGTTAGACCCTCCGCTTCACGAGTTTCTCCCGGAAGGCGACTTGGACAACATT GTACATGAGCTAGCTGAAGAAACTGGTGTGAAAGAAGATGAAGTCTTGTCACGGATAGAG AAACTCTCTGAAGTGAATCCAATGCTTGGTTTCCGCGGTTGCAGGCTCGGAATATCGTAT CCAGAGCTAACGGAGATGCAAGCGCGTGCAATTTTTGAAGCTGCAGCGTCAATGCAGGAC CAAGGTGTTACTGTCATTCCTGAGATTATGGTTCCACTTGTAGGAACTCCTCAGGAATTG GGTCACCAAGTTGATGTAATTCGTAAAGTTGCAAAGAAAGTATTTGCTGAGAAGGGTCAT ACCGTGAGCTACAAGGTTGGGACAATGATTGAGATCCCTCGAGCCGCGCTCATTGCAGAT GAGATTGCGAAAGAGGCGGAGTTTTTCTCGTTCGGGACAAACGACTTGACGCAGATGACG TTTGGATACAGTAGAGACGATGTCGGCAAGTTTCTACCGATTTACCTCGCCAAAGGAATCTTACAGCACGACCCTTTTGAGGTTCTTGATCAGCAAGGTGTAGGGCAATTGATCAAGATG
     GCGACAGAAAAAGGACGAGCAGCTAGGCCTAGCCTCAAGGTTGGGATATGTGGAGAACAT
     GGAGGAGATCCATCTTCTGTGGGATTCTTTGCTGAAGCAGGACTTGACTATGTCTCTTGT
     TCTCCTTTCAGGGTTCCAATTGCAAGGCTTGCAGCTGCTCAAGTAGTTGTTGCATGA
     SEQ ID No ： 21
     本文如下提供编码叶绿体形式的拟南芥丙酮酸正磷酸双激酶 (PPDK) 的 cDNA 序列 作为 SEQ ID No ： 22 ：
     ATGACAAGTATGATCGTGAAGACAACGCCGGAGCTCTTCAAAGGAAATGGAGTGTTCCGT
     ACGGATCATCTCGGAGAAAACCGAATGGTTAGTCGATCAAACCGGCTAGGTGATGGATCA
     AACCGTTTCCCTAGAACCGGTACAATCCATTGCCAACGGTTAAGCATAGCAAAGACCGGT
     TTGCATCGTGAGACGAAGGCTCGAGCCATACTTAGCCCTGTGTCCGATCCGGCCGCTTCC
     ATAGCCCAAAAGCGAGTATTCACCTTTGGAAAAGGAAGAAGCGAAGGCAACAAGGGCATG
     AAGTCCTTGTTGGGAGGGAAAGGAGCCAACCTGGCGGAGATGGCTAGCATAGGCTTGTCG
     GTGCCGCCGGGGCTAACCATATCGACGGAGGCTTGTCAGCAGTATCAGATCGCCGGCAAA
     AAGCTTCCAGAAGGTTTATGGGAAGAGATCTTAGAAGGTCTTAGCTTCATCGAACGTGAC
     ATTGGAGCTTCCCTCGCTGATCCCTCCAAGCCACTCCTCCTCTCTGTTCGCTCCGGCGCC GCCATCTCAATGCCTGGTATGATGGACACTGTACTTAACCTTGGCTTGAACGACCAAGTC GTCGTTGGTCTGGCCGCAAAAAGCGGAGAGCGTTTTGCTTACGATTCGTTCCGGCGTTTT CTTGATATGTTTGGTGATGTTGTGATGGGAATTCCACACGCCAAGTTTGAAGAGAAGTTA GAGAGAATGAAGGAGAGGAAAGGAGTTAAAAATGACACTGACTTAAGCGCGGCTGATCTC AAGGAATTGGTTGAGCAGTACAAGAGTGTTTACTTAGAGGCCAAGGGTCAAGAGTTTCCT TCAGATCCAAAGAAGCAATTGGAGCTAGCGATTGAAGCGGTATTCGATTCTTGGGATAGC CCGAGAGCGAACAAGTACAGAAGTATTAACCAGATAACTGGATTGAAAGGAACCGCGGTT AACATTCAGTGTATGGTGTTTGGAAACATGGGGGACACTTCAGGGACTGGTGTTCTCTTC ACTAGGAACCCTAGCACAGGAGAGAAGAAGCTTTATGGCGAGTTTCTAGTTAATGCTCAG GTTTGGCATCTATCACAATGTGTGAATCTCATATCAACAAGGATAAGAACACCAGAAGAT TTGGATACAATGAAGAGATTTATGCCTGAGGCTTACGCTGAACTTGTTGAGAACTGCAAC ATCTTAGAAAGACATTACAAAGACATGATGGATATTGAATTCACAGTACAAGAAGAGAGA TTGTGGATGCTGCAATGCAGAGCGGGTAAGCGAACGGGTAAAGGCGCCGTGAAGATAGCA GTTGATATGGTAGGTGAAGGGCTTGTTGAGAAATCTTCTGCTATCAAAATGGTGGAGCCT CAACATCTTGATCAACTACTTCACCCACAGTTTCATGATCCATCGGGGTATCGTGAAAAA GTGGTGGCCAAAGGCTTACCTGCGTCACCAGGAGCGGCGGTTGGACAGGTTGTGTTCACG GCGGAGGAAGCCGAAGCTTGGCATTCTCAGGGTAAAACTGTGATTCTGGTTCGAACTGAG ACAAGCCCTGACGATGTGGGAGGTATGCACGCAGCGGAAGGTATATTGACGGCTAGAGGA GGAATGACGTCACACGCGGCTGTTGTTGCTCGCGGTTGGGGAAAATGTTGCATTGCTGGT TGTTCCGAGATTCGTGTCGACGAGAACCACAAGGTTCTATTGATTGGAGATTTGACGATT AATGAAGGCGAATGGATCTCAATGAACGGATCAACCGGTGAGGTTATATTAGGGAAACAA GCATTGGCTCCTCCGGCTTTAAGTCCAGATTTGGAGACTTTCATGTCCTGGGCTGATGCA ATCAGACGTCTCAAGGTTATGGCGAATGCGGATACACCTGAAGACGCCATTGCAGCTAGGAAAAACGGAGCTCAAGGAATCGGGCTTTGTAGGACAGAGCATATGATTGTTTGTATCCAA
     ATGTTTAATGTTGTCTTTGGTTTGGTTTTTAAGTTCTTTGGAGCAGATAGGATTAAAGCA
     GTGAGAAAGATGATAATGGCGGTAACAACAGAGCAAAGGAAAGCTTCTCTCGACATCTTG
     CTTCCTTACCAACGTTCGGATTTCGAAGGGATCTTCCGTGCTATGGATGGTTTACCGGTA
     ACAATCCGTTTGTTAGACCCTCCGCTTCACGAGTTTCTCCCGGAAGGCGACTTGGACAAC
     ATTGTACATGAGCTAGCTGAAGAAACTGGTGTGAAAGAAGATGAAGTCTTGTCACGGATA
     GAGAAACTCTCTGAAGTGAATCCAATGCTTGGTTTCCGCGGTTGCAGGCTCGGAATATCG
     TATCCAGAGCTAACGGAGATGCAAGCGCGTGCAATTTTTGAAGCTGCAGCGTCAATGCAG
     GACCAAGGTGTTACTGTCATTCCTGAGATTATGGTTCCACTTGTAGGAACTCCTCAGGAA
     TTGGGTCACCAAGTTGATGTAATTCGTAAAGTTGCAAAGAAAGTATTTGCTGAGAAGGGT
     CATACCGTGAGCTACAAGGTTGGGACAATGATTGAGATCCCTCGAGCCGCGCTCATTGCA
     GATGAGATTGCGAAAGAGGCGGAGTTTTTCTCGTTCGGGACAAACGACTTGACGCAGATG
     ACGTTTGGATACAGTAGAGACGATGTCGGCAAGTTTCTACCGATTTACCTCGCCAAAGGA
     ATCTTACAGCACGACCCTTTTGAGGTTCTTGATCAGCAAGGTGTAGGGCAATTGATCAAG
     ATGGCGACAGAAAAAGGACGAGCAGCTAGGCCTAGCCTCAAGGTTGGGATATGTGGAGAA
     CATGGAGGAGATCCATCTTCTGTGGGATTCTTTGCTGAAGCAGGACTTGACTATGTCTCT
     TGTTCTCCTTTCAGGGTTCCAATTGCAAGGCTTGCAGCTGCTCAAGTAGTTGTTGCATGA
     SEQ ID No ： 22
     因此， 编码具有 PPDK 活性的多肽的编码序列可包含基本上如 SEQ ID No ： 20、 SEQ ID No.21 或 SEQ ID No.22 所示的核酸序列或者其功能变体或片段。
     本文如下提供胞质形式的拟南芥 PPDK 的多肽序列作为 SEQ ID No ： 23 ：
     MMQRVFTFGKGRSEGNKGMKSLLGGKGANLAEMASIGLSVPPGLTISTEACQQYQIAGKK
     LPEGLWEEILEGLSFIERDIGASLADPSKPLLLSVRSGAAISMPGMMDTVLNLGLNDQVV
     VGLAAKSGERFAYDSFRRFLDMFGDVVMGIPHAKFEEKLERMKERKGVKNDTDLSAADLK
     ELVEQYKSVYLEAKGQEFPSDPKKQLELAIEAVFDSWDSPRANKYRSINQITGLKGTAVN
     IQCMVFGNMGDTSGTGVLFTRNPSTGEKKLYGEFLVNAQVWHLSQCVNLISTRIRTPEDL
     DTMKRFMPEAYAELVENCNILERHYKDMMDIEFTVQEERLWMLQCRAGKRTGKGAVKIAV
     DMVGEGLVEKSSAIKMVEPQHLDQLLHPQFHDPSGYREKVVAKGLPASPGAAVGQVVFTA
     EEAEAWHSQGKTVILVRTETSPDDVGGMHAAEGILTARGGMTSHAAVVARGWGKCCIAGC
     SEIRVDENHKVLLIGDLTINEGEWISMNGSTGEVILGKQALAPPALSPDLETFMSWADAI
     RRLKVMANADTPEDAIAARKNGAQGIGLCRTEHMIVCIQMFNVVFGLVFKFFGADRIKAV
     RKMIMAVTTEQRKASLDILLPYQRSDFEGIFRAMDGLPVTIRLLDPPLHEFLPEGDLDNI
     VHELAEETGVKEDEVLSRIEKLSEVNPMLGFRGCRLGISYPELTEMQARAIFEAAASMQD
     QGVTVIPEIMVPLVGTPQELGHQVDVIRKVAKKVFAEKGHTVSYKVGTMIEIPRAALIAD
     EIAKEAEFFSFGTNDLTQMTFGYSRDDVGKFLPIYLAKGILQHDPFEVLDQQGVGQLIKM
     ATEKGRAARPSLKVGICGEHGGDPSSVGFFAEAGLDYVSCSPFRVPIARLAAAQVVVA
     SEQ ID No ： 23
     本文如下提供叶绿体形式的拟南芥 PPDK 的多肽序列作为 SEQ ID No ： 24 ：
     MTSMIVKTTPELFKGNGVFRTDHLGENRMVSRSNRLGDGSNRFPRTGTIHCQRLSIAKTGLHRETKARAILSPVSDPAASIAQKRVFTFGKGRSEGNKGMKSLLGGKGANLAEMASIGLS
     VPPGLTISTEACQQYQIAGKKLPEGLWEEILEGLSFIERDIGASLADPSKPLLLSVRSGA
     AISMPGMMDTVLNLGLNDQVVVGLAAKSGERFAYDSFRRFLDMFGDVVMGIPHAKFEEKL
     ERMKERKGVKNDTDLSAADLKELVEQYKSVYLEAKGQEFPSDPKKQLELAIEAVFDSWDS
     PRANKYRSINQITGLKGTAVNIQCMVFGNMGDTSGTGVLFTRNPSTGEKKLYGEFLVNAQ
     VWHLSQCVNLISTRIRTPEDLDTMKRFMPEAYAELVENCNILERHYKDMMDIEFTVQEER
     LWMLQCRAGKRTGKGAVKIAVDMVGEGLVEKSSAIKMVEPQHLDQLLHPQFHDPSGYREK
     VVAKGLPASPGAAVGQVVFTAEEAEAWHSQGKTVILVRTETSPDDVGGMHAAEGILTARG
     GMTSHAAVVARGWGKCCIAGCSEIRVDENHKVLLIGDLTINEGEWISMNGSTGEVILGKQ
     ALAPPALSPDLETFMSWADAIRRLKVMANADTPEDAIAARKNGAQGIGLCRTEHMIVCIQ
     MFNVVFGLVFKFFGADRIKAVRKMIMAVTTEQRKASLDILLPYQRSDFEGIFRAMDGLPV
     TIRLLDPPLHEFLPEGDLDNIVHELAEETGVKEDEVLSRIEKLSEVNPMLGFRGCRLGIS
     YPELTEMQARAIFEAAASMQDQGVTVIPEIMVPLVGTPQELGHQVDVIRKVAKKVFAEKG
     HTVSYKVGTMIEIPRAALIADEIAKEAEFFSFGTNDLTQMTFGYSRDDVGKFLPIYLAKG
     ILQHDPFEVLDQQGVGQLIKMATEKGRAARPSLKVGICGEHGGDPSSVGFFAEAGLDYVS
     CSPFRVPIARLAAAQVVVA
     SEQ ID No ： 24
     因此， 具有 PPDK 活性的多肽可包含基本上如 SEQ ID No ： 23 或 SEQ ID No.24 所示 的氨基酸序列或者其功能变体或片段。 因为几乎唯一地在包含编码 PPDK 的基因组 DNA 的细 胞系中， 观察到最大的 PPDK 丰度， 因此似乎内含子可能对 PPDK 表达具有积极作用。因此， 在一个实施方案中， 构建体可包含编码 PPDK 和 / 或 PCK 的基因的 cDNA。
     本发明的遗传构建体可呈表达盒的形式， 其可适用于在宿主细胞中表达至少一个 编码序列。 本发明的遗传构建体无需整合到载体中便可导入宿主细胞。 例如， 可将可以是核 酸分子的遗传构建体掺入脂质体或病毒颗粒内。或者， 可通过合适的方法 ( 例如直接胞吞 摄取 ) 将纯化的核酸分子 ( 例如不含组蛋白的 DNA 或裸 DNA) 直接插入宿主细胞中。可通 过转染、 感染、 显微注射、 细胞融合、 原生质体融合或弹道轰击 (ballistic bombardment)， 将遗传构建体直接导入宿主受试者 ( 例如植物 ) 的细胞。或者， 可使用基因枪将本发明的 遗传构建体直接导入宿主细胞中。或者， 可将遗传构建体包含在用于在合适的宿主细胞中 表达的重组载体内。
     因此， 在第三个方面， 提供包含第一个方面或第二个方面的遗传构建体的重组载 体。
     重组载体可以是质粒、 黏粒或噬菌体。这类重组载体高度可用于用本发明的遗传 构建体转化宿主细胞和复制其中的表达盒， 。 技术人员应了解的是， 本发明的遗传构建体可 与的许多类型的骨架载体组合用于表达目的。 骨架载体可以是二元载体 (binary vector)， 例如可在大肠杆菌 (E.coli) 和根癌土壤杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) 两者中复制 的二元载体。例如， 合适的载体可以是 pBIN 质粒， 例如 pBIN19。然而， 优选的骨架载体以 pBINPLUS 为基础 (F.A.van Engelen 等， Transgenic Research(1995)4， 288-290) 且具有 SAG12 启动子的 BNP1380000001。
     除启动子 ( 例如衰老相关启动子 ) 以外， 重组载体还可包括多种其它功能元件和至少一个编码序列 ( 编码 PCK 和 / 或 PPDK)。例如， 可设计重组载体， 使得载体在宿主细胞 的细胞溶胶中自主复制。在这种情况下， 在重组载体中可能需要诱导或调节 DNA 复制的元 件。或者， 可设计重组载体， 使得重组载体整合到宿主细胞的基因组中。在这种情况下， 设 想有利于目标整合 ( 例如通过同源重组 ) 的 DNA 序列。
     重组载体还可包含编码在克隆方法中可用作选择标记的基因的 DNA， 即能够选出 已被转染或转化的细胞， 并且能够选出包含整合异源 DNA 的载体的细胞。载体还可包含参 与调节编码序列的表达或者用于将表达的多肽靶向宿主细胞某一组成部分 ( 例如叶绿体 ) 的 DNA。因此， 第三个方面的载体可包含至少一个选自以下的其它元件 ： 选择标记基因 ( 例 如抗生素抗性基因 )、 多肽终止信号和蛋白质靶向序列 ( 例如叶绿体转运肽 )。
     合适的标记基因的实例包括抗生素抗性基因， 例如赋予卡那霉素、 遗传霉素 (G418) 和潮霉素 (npt-II、 hyg-B) 抗性的基因 ； 除草剂抗性基因， 例如赋予草丁膦和磺胺类 除草剂抗性的基因 ( 分别为 bar 和 suI ； EP-A-242246、 EP-A-0249637) ； 以及筛选标记， 例如 β- 葡糖醛酸糖苷酶 (GB2197653)、 萤光素酶和绿色荧光蛋白 (GFP)。标记基因可受第二启 动子 ( 其可以不是衰老相关启动子 ) 控制， 所述第二启动子允许在细胞 ( 其可在种子中或 不在种子中 ) 中表达， 从而允许在植物发育的任何阶段选出含有标记的细胞或组织。合适 的第二启动子是土壤杆菌属 (Agrobacterium) 的胭脂氨酸合成酶基因的启动子和来源于 编码 35S 花椰菜花叶病毒 (CaMV) 转录物的基因的启动子。然而， 可以采用任何其它合适的 第二启动子。
     可采用图 1 中描述的克隆方法， 制备本发明的遗传构建体的各个实施方案， 可将 该方法概括如下。可使用合适的引物， 通过 PCR 从基因组或 cDNA 模板扩增编码 PCK 和 PPDK 的基因的基因组形式和 cDNA 形式。可采用琼脂糖凝胶电泳检查 PCR 产物。然后， 可将 PCR 产物与合适的载体连接用于克隆目的， 例如 pCR4 Blunt-TOPO 载体 (Invitrogen)。可使包 含 PCR 产物的载体在合适的宿主 ( 例如大肠杆菌 ) 中生长。然后使用合适的引物通过 PCR 筛选大肠杆菌菌落， 并用合适的引物对具有正确的限制性内切酶消化谱的质粒中的插入片 段进行测序。
     可培养携带 TOPO-cDNA(PCK 或 PPDK) 或 TOPO-gDNA(PCK 或 PPDK) 的大肠杆菌菌 落以产生适量的各种质粒， 然后可对质粒进行纯化。随后可消化质粒释放编码 PPDK 或 PCK 的 DNA 片段， 然后可将该片段克隆至包含合适启动子 ( 例如 SAG 启动子 ) 的载体， 例如 pBNP 质粒。所得 PPDK 构建体称为 BNP-PPDKcDNA 和 BNP-PPDKgDNA， 所得 PCK 构建体称为 pALBNP1(cDNA) 和 pALBNP2(gDNA)。
     第三个方面的载体的实施方案基本上可如图 3 所示。
     在第四个方面， 提供提高试验植物叶中的 PCK 和 / 或 PPDK 浓度至高于培养在相同 条件下的野生型植物中相应的 PCK 和 / 或 PPDK 浓度的方法， 所述方法包括改变试验植物的 植物代谢以便在叶衰老开始后使 PCK 和 / 或 PPDK 在植物叶中的水平得到提高。
     在第五个方面， 提供降低试验植物叶中的氮浓度至低于培养在相同条件下的野生 型植物中相应的氮浓度的方法， 所述方法包括改变试验植物的植物代谢以便在叶衰老开始 后使 PCK 和 / 或 PPDK 在植物叶中的水平得到提高。
     在第六个方面， 提供与培养在相同条件下的野生型植物相应的生长速度相比提高 试验植物的生长速度的方法， 所述方法包括改变试验植物的植物代谢以便在叶衰老开始后使 PCK 和 / 或 PPDK 在植物叶中的水平得到提高。
     实施例中给出了测定植物叶中的氮水平和植物生长速度的方法。第四个方面、 第 五个方面或第六个方面的方法可包括用第一个方面或第二个方面的遗传构建体或第三个 方面的载体转化试验植物细胞。可通过任何合适的方法将遗传构建体或载体导入宿主细 胞。
     在第七个方面， 提供包含第一个方面或第二个方面的遗传构建体或第三个方面的 重组载体的细胞。
     细胞可以是植物细胞。因为本发明人已观察到， PCK 和 / 或 PPDK 两者在宿主细胞 中过表达在诱导衰老叶中的氮素再动员方面出乎意料地有效， 所以第七个方面的细胞可包 含一个或多个第一个方面或第二个方面的构建体或者一个或多个第三个方面的载体， 使得 PCK 和 / 或 PPDK 两者均过表达。
     例如， 宿主细胞可只用第一个方面的遗传构建体的第一个实施方案 ( 即 PCK 构建 体 ) 转化。或者， 宿主细胞可只用第二个方面的遗传构建体的第二个实施方案 ( 即 PPDK 构 建体 ) 转化。在另一个实施方案中， 宿主细胞可用第一个方面的遗传构建体的第一和第二 个实施方案转化， 使得 PCK 和 PPDK 两者在宿主细胞中表达。或者， 宿主细胞可用第一个方 面的构建体的第三或第四个实施方案 ( 即 PCK/PPDK 构建体 1 或 2) 转化， 使得 PCK 和 PPDK 两者在宿主细胞中表达。还设想宿主细胞可用第二个方面的编码 PCK 和 PPDK 两者的构建 体转化。
     细胞可采用已知技术用本发明的遗传构建体或载体转化。 用于将遗传构建体导入 宿主细胞的合适方法可包括通过本领域已知方法 ( 例如 EP-A-0116718 和 EP-A-0270822 所 述方法 )， 利用土壤杆菌属所携带的卸甲 Ti- 质粒载体。 另一种方法可以是转化植物原生质 体， 这涉及先除去细胞壁并导入核酸， 然后重整细胞壁。随后可使转化细胞生长成植物。
     第八个方面， 提供包含第一个方面或第二个方面的遗传构建体或者第三个方面的 载体的转基因植物。
     第 八 个 方 面 的 转 基 因 植 物 可 包 括 十 字 花 科 (Brassicaceae)， 例如芸苔属 (Brassica spp.)。植物可以是欧洲油菜 ( 油料种子油菜 )。
     第八个方面的转基因植物的其它实例包括禾本科 (Poales)， 例如 Triticeae spp。 植物可以是小麦属 (Triticum spp.)( 小麦 )。 提高小麦的籽粒蛋白含量可导致包含小麦的 食品 ( 例如面包 ) 的体积增加。
     第八个方面的合适转基因植物的其它实例包括茄科 (Solanaceae) 植物， 其包 括 例 如 曼 陀 罗、 茄 子、 茄 参 (mandrake)、 颠 茄 (deadly nightshade、 belladonna)、 辣椒 (capsicum、 paprika、 chilli pepper)、 马铃薯和烟草。合适的茄科属的一个实例是烟草属 (Nicotiana)。烟草属合适的品种可称为烟草植物， 简称烟草。用第一个方面或第二个方面 的遗传构建体或者第三个方面的载体转化植物的各种方法是已知的， 均可用于本发明。
     例如， 可如下转化烟草。 采用基本上按 Horsch 等 (Science 227 ： 1229-1231， 1985) 所述的叶盘共培养方法转化烟草 (Nicotiana tabacum)。可从 7 周大的烟草植物采摘最幼 嫩的两片扩展叶， 可在 8％ DomestosTM 中进行表面灭菌 10 分钟后， 用无菌蒸馏水洗涤 6 次。 可用 6 号木塞钻孔器切取叶盘， 并放于含有合适二元载体 ( 按照本发明 ) 的土壤杆菌悬液 中约 2 分钟。 可在两张无菌滤纸间将叶盘轻轻吸干。 可将 10 个叶盘放在 LS 3％蔗糖 +2μMBAP+0.2μMNAA 平板上， 然而将其在生长室中培育 2 天。可将叶盘转移到补充了 500g/l 凯 福隆和 100g/l 卡那霉素的 LS+3％蔗糖 +2μM BAP+0.2μM NAA 的平板中。2 周后， 可将叶 盘转移到上述培养基的新平板上。再过 2 周后， 可将叶盘转移到含有补充了 500mg/l 凯福 隆和 100mg/l 卡那霉素的 LS+3％蔗糖 +0.5μM BAP 的平板上。 每两周可将叶盘转移到新鲜 培养基中。 在芽出现时， 可切下芽， 并将芽转移到补充了 500mg/l 凯福隆的 LS+3％蔗糖的广 口瓶中。大约 4 周后， 可将广口瓶中的芽转移到 LS+3％蔗糖 +250mg/l 凯福隆中。再过 3-4 周后， 可将植物转移到 LS+3％蔗糖 ( 无抗生素 )， 并生根。一旦植物生根， 便将其转移到温 室的土壤中。
     在 第 九 个 方 面， 提 供 获 自 第 八 个 方 面 的 转 基 因 植 物 的 植 物 繁 殖 产 品 (plant propagation product)。
     “植物繁殖产品” 可以是取自植物中的任何植物物质， 自其可产生其它植物。植物 繁殖产品可适宜为种子。
     在本发明的第十个方面， 提供产生转基因植物的方法， 所述转基因植物以比培养 在相同条件下的相应野生型植物高的速度再动员氮素， 所述方法包括以下步骤 ：
     i) 用第一个方面或第二个方面的遗传构建体或者第三个方面的载体转化植物细 胞； 和
     ii) 从转化细胞再生植物。
     在第十一个方面， 提供产生具有比培养在相同条件下的相应野生型植物快的生长 速度的转基因植物的方法， 所述方法包括以下步骤 ：
     i) 用第一个方面或第二个方面的遗传构建体或者第三个方面的载体转化植物细 胞； 和
     ii) 从转化细胞再生植物。
     优选且有利的是， 本发明的方法不会损害所产生的试验植物的健康或适应性。优 选所述方法包括用第一个方面或第二个方面的遗传构建体或者第三个方面的载体转化试 验植物， 优选植物叶。本发明人观察到， 在宿主细胞中过表达 PCK 和 PPDK 两者有效诱导在 衰老叶中的氮素再动员。 因此， 优选的是， 第十个方面和第十一个方面的方法包括用本发明 的一个或多个构建体转化试验植物使得 PCK 和 PPDK 两者过表达。例如， 试验植物可用本发 明第一个方面的遗传构建体的第一个实施方案 ( 即 PCK 构建体 ) 转化， 并再用第一个方面 的构建体的第二个实施方案 ( 即 PPDK 构建体 ) 转化。因此， 这两个构建体的转化导致两种 酶的过表达。或者， 试验植物可用本发明第一个方面的构建体的第三或第四个实施方案转 化， 每个所述构建体都编码 PCK 和 PPDK。 或者， 试验植物可用本发明第二个方面的构建体转 化， 其既编码 PCK 又编码 PPDK。
     本发明人观察到， 已用编码 PCK 和 PPDK 两者的构建体转化的试验植物的植物叶显 示在开始衰老时氮素再动员增加， 使得该叶中的氮浓度下降。 此外， 本发明人观察到营养生 长速度增加。虽然本发明人不受假说束缚， 但是本发明人认为叶中氮浓度的降低可诱导生 长速度提高， 从而诱导作物产量提高。
     在本发明的第十二个方面， 提供与采自培养在相同条件下的野生型植物的收获叶 中相应的氮水平相比含有较低氮水平的收获叶， 其中所述叶自第八个方面的转基因植物收 获， 或者由第十个方面或第十一个方面的方法产生。在本发明的第十三个方面， 提供包含获自突变体烟草植物的氮降低的烟草的吸烟 制品， 所述突变体能够降低衰老叶中的氮浓度。
     氮降低的烟草可包括其中氮浓度小于培养在相同条件下的野生型植物中的相应 浓度的烟草。这类吸烟制品可包含获自突变型烟草植物的烟草， 所述烟草植物可用本发明 第一个方面或第二个方面的遗传构建体或者第三个方面的载体转化。
     本文使用的术语 “吸烟制品” 可包括可点燃抽吸的产品， 例如不论是以烟草、 烟草 衍生物、 膨胀烟丝、 再造烟叶为基料还是以烟叶代用品为基料的卷烟、 香烟、 雪茄和小雪茄， 以及加热无燃烧产品。
     应理解的是， 本发明提供基本上包含本文提及的任何序列的氨基酸序列或核酸序 列 ( 包括其功能变体或功能片段 ) 的任何核酸或肽或其变体、 衍生物或类似物。术语 “基 本上的氨基酸 / 多核苷酸 / 多肽序列” 、 “功能变体” 和 “功能片段” ， 可以是与本文提及的任 一个序列的氨基酸 / 多核苷酸 / 多肽序列有至少 40％序列同一性的序列， 例如与 SEQ ID No.17 规定的基因 ( 其编码 PCK 酶的一个实施方案 ) 有 40％同一性， 或与 SEQ ID No.19 规 定的多肽 ( 即 PCK 酶的一个实施方案 ) 有 40％同一性， 或与 SEQ ID No.21 规定的基因 ( 其 编码 PPDK 酶的一个实施方案 ) 有 40％同一性， 或与 SEQ ID No.23 规定的多肽 ( 即 PPDK 酶 的一个实施方案 ) 有 40％同一性。 还设想了与所提及的任何序列具有以下序列同一性的氨基酸 / 多核苷酸 / 多肽序 列： 大于 65％、 更优选大于 70％、 甚至更优选大于 75％、 还更优选大于 80％的序列同一性。 优选氨基酸 / 多核苷酸 / 多肽序列与所提及的任何序列有至少 85％同一性， 更优选与本文 提及的任何序列有至少 90 ％同一性、 甚至更优选至少 92 ％同一性、 甚至更优选至少 95 ％ 同一性、 甚至更优选至少 97％同一性、 甚至更优选至少 98％同一性和最优选至少 99％同一 性。
     技术人员应了解如何计算 2 个氨基酸 / 多核苷酸 / 多肽序列之间的百分比同一 性。为了计算 2 个氨基酸 / 多核苷酸 / 多肽序列间的百分比同一性， 首先必须准备好 2 个 序列的比对， 接着计算序列同一性值。 2 个序列的百分比同一性可根据以下方面采用不同的 值： (i) 用于比对序列的方法， 例如 ClustalW、 BLAST、 FASTA、 Smith-Waterman( 在不同的程 序中执行 )， 或来自 3D 比较的结构比对 ； 和 (ii) 比对方法所采用的参数， 例如局部与整体 比对、 所采用配对计分矩阵 ( 例如 BLOSUM62、 PAM250、 Gonnet 等 ) 和空位罚分， 例如功能型 和常数。
     如果完成了比对， 则有许多不同的计算 2 个序列之间的百分比同一性的方法。例 如， 可将相同的数目除以 ： (i) 最短序列的长度 ； (ii) 比对的长度 ； (iii) 序列的平均长度 ； (iv) 非空位位置的数目 ； 或 (iv) 突出端以外的等同位置的数目。 此外， 应理解的是， 百分比 同一性还是强烈地长度依赖性的。因此， 序列对越短， 可预期偶尔发生的序列同一性越高。
     因此， 应理解的是， 蛋白质或 DNA 序列的准确比对是一个复杂过程。常用的多重比 对程序 ClustalW(Thompson 等， 1994， Nucleic Acids Research， 22， 4673-4680 ； Thompson 等， 1997， Nucleic Acids Research， 24， 4876-4882) 是用于产生本发明蛋白质或 DNA 的多 重比对的优选方法。 ClustalW 的合适参数可为如下 ： 对于 DNA 比对 ： 空位开发罚分＝ 15.0， 空位延伸罚分＝ 6.66， 矩阵＝同一性。 对于蛋白质比对 ： 空位开发罚分＝ 10.0， 空位延伸罚 分＝ 0.2， 矩阵＝ Gonnet。对于 DNA 和蛋白质比对 ： ENDGAP ＝ -1， GAPDIST ＝ 4。本领域技
     术人员应清楚， 对于最佳序列比对可能需要改变这些参数和其它参数。
     优选然后按 (N/T)*100 由这类比对计算出 2 个氨基酸 / 多核苷酸 / 多肽序列之 间的百分比同一性计算值， 其中 N 为序列具有相同残基的位置的数目， T 为所比较的包括空 位但不包括突出端的位置总数。因此， 用于计算 2 个序列之间的百分比同一性的最优选的 方法包括 (i) 应用 ClustalW 程序， 采用一组合适参数 ( 例如上述参数 ) 准备序列比对 ； 和 (ii) 将 N 值和 T 值代入下列公式 ： 序列同一性＝ (N/T)*100。
     用于鉴定类似序列的备选方法为本领域技术人员所知。例如， 基本相似的核苷酸 序列可由与 SEQ ID Nos.16、 17、 18、 20、 21、 22 所示序列或其互补序列在严格条件下杂交的 序列编码。所谓严格条件， 意指核苷酸在 3x 氯化钠 / 柠檬酸钠 (SSC) 中于约 45℃与滤器结 合的 DNA 或 RNA 杂交， 接着在 0.2x SSC/0.1％ SDS 中于约 20-65℃洗涤至少一次。或者， 基 本相似的多肽可因至少 1 个但少于 5、 10、 20、 50 或 100 个氨基酸而不同于 SEQ ID Nos.19、 23 或 24 所示序列。
     由于遗传密码的简并性所致， 显然， 任何核酸序列可在基本上不影响由其编码的 蛋白质的序列的情况下被改变或变动， 以提供其功能变体。合适的核苷酸变体是以下核 苷酸变体， 其具有通过编码相同氨基酸的不同密码子在序列内的取代从而产生沉默改变 (silent change) 而改变的序列。其它合适的变体是具有同源核苷酸序列但包含通过不同 密码子的取代而改变的全部或部分序列的变体， 所述密码子编码与其取代的氨基酸具有类 似生物物理学性质的侧链的氨基酸以产生保守改变。例如小的非极性疏水氨基酸， 包括甘 氨酸、 丙氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸、 缬氨酸、 脯氨酸和甲硫氨酸。大的非极性疏水氨基酸包括 苯丙氨酸、 色氨酸和酪氨酸。 极性的中性氨基酸包括丝氨酸、 苏氨酸、 半胱氨酸、 天冬酰胺和 谷氨酰胺。带正电荷的 ( 碱性 ) 氨基酸包括赖氨酸、 精氨酸和组氨酸。带负电荷的 ( 酸性 ) 氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。因此应理解的是， 氨基酸可被具有相似生物物理学性质的 氨基酸置换， 技术人员已知编码这些氨基酸的核苷酸序列。
     本文所述的全部特征 ( 包括任何随附的权利要求、 摘要和附图 ) 和 / 或所公开的 任何方法或过程的全部步骤都可以任何组合与任何上述方面组合， 其中这些特征和 / 或步 骤的至少一些是互为排斥的组合除外。
     为了更好地理解本发明， 并显示可如何实施本发明的实施方案， 现参照附图举例 说明， 其中 ：
     图 1 表示用于克隆遗传构建体 BNP-PPDKcDNA 和 BNP-PPDKgDNA 的方案， 其中 ： (a) 拟南芥 PPDK 胞质同工型的 cDNA 和基因组 DNA 形式的 PCR 扩增 ； (b) 插入克隆载体 pCR 4Blunt-TOPO ； (c) 用 AvrII 和 BamHI 限制性内切核酸酶消化克隆载体 ( 左侧 ) 以释放 PPDK， 以及含有靶标 SAG12 的载体 pBNP( 右侧 ) ； (d) 将 PPDK 与 pBNP 连接， 琼脂糖凝胶显示通过 用 AvrII 和 BamHI 对构建体的限制性内切核酸酶消化产生的 DNA 片段 ； 和 (e) 通过土壤杆 菌介导的转化将构建体导入拟南芥生态型 Columbia 0 中 ；
     图 2a 表示用于构建本发明表达载体的质粒 pCR4BLUNT-TOPO， 图 2b 是利用 AvrII 和 BamHI 消化将编码 PPDK 的 cDNA 或 gDNA 插入 pCR4BLUNT-TOPO 的一览表 ；
     图 3a 表示含有 SAG12 启动子的质粒 pBNP， 图 3b 是利用 AvrII 和 BamHI 消化将 PPDK 插入片段 (cDNA 或 gDNA) 导入 pBNP 中， 以及利用 XbaI 和 SacI 消化将 PCK 插入片段 (cDNA 或 gDNA) 导入 pBNP 产生本发明实施方案的载体的一览表 ；图 4 表示通过蛋白质印迹选择转基因 SAG12-PPDK 鼠耳芥细胞系。上图表示 SAG12-PPDK cDNA 细胞系， 下图表示 SAG12-PPDKgDNA 细胞系 ；
     图 5 表示从第五周起野生型、 ΔPPDK 和 5 个独立的 SAG12-PPDKgDNA 品系的 PPDK 丰度的定量测定 ；
     图 6 表示在 (b)K326 和 (c)Burley 21 烟草品系中对 SAG12-PPDK(cDNA 和 gDNA) 的选择 ；
     图 7 表示在 K326 烟草成熟叶中 PPDK 的过表达 ；
     图 8 表示鼠耳芥的不同细胞系即野生型、 ΔPPDK 和 SAG12-PPDKgDNA 随时间而变 化的莲座叶丛照片 ；
     图 9 表示第 9 周的拟南芥繁殖组织质量 ；
     图 10 表示自播种后第 3 周到第 9 周野生型和 SAG12-PPDgDNA 植物总的植物鲜质 量 ( 即莲座叶丛加繁殖组织 ) ；
     图 11 第 7 周时野生型、 ΔPPDK 和 SAG12-PPDKgDNA 植物叶中的氮含量 ；
     图 12 表示野生型、 ΔPPDK 和 SAG12-PPDK 植物单粒种子的氮含量 ；
     图 13 表示野生型、 ΔPPDK 和 SAG12-PPDKgDNA 拟南芥细胞系叶中的总游离氨基酸 含量 ；
     图 14 表示不同烟草细胞系的种子质量， 零拷贝＝野生型， G4(gDNA)、 G10、 G8 和 C10(cDNA) 是 SAG12-PPDK 品系 ；
     图 15 表示不同烟草细胞系的种子氮含量， 零拷贝＝野生型， G4(gDNA)、 G10、 G8 和 C10(cDNA) 是 SAG12-PPDK 品系 ；
     图 16 为 PCK/PPDK 双重插入片段的蛋白质印迹结果。所有品系都显示与 SAG12 启 动子活性相关的较高水平的 PCK， 尤其在第 7 周 ；
     图 17 表示与对照 7 相比， 转化植物中 PCK 和 PPDK 两者的表达导致莲座叶丛质量 增加 ； 和
     图 18 表示假设的生化途径， 表明了可通过转运氨基酸天冬酰胺和谷氨酰胺的 PCK- 和 PPDK- 依赖性形成产生氮素再动员。 实施例 实施例 1-SAG12 启动子拟南芥 PPDK 植物转化构建体的产生
     如图 3 所示， 制备一系列的 SAG12PPDK 和 PCK 表达载体， 然后分析其在转化植物中 提高表达 PPDK 和 PCK 的能力。在一个实施方案中， 构建体可编码 PCK 或者其功能变体或片 段， 而不编码 PPDK。 在另一个实施方案中， 构建体可编码 PPDK 或者其功能变体或片段， 而不 编码 PCK。然而， 在又一个实施方案中， 构建体可编码 PCK 或者其功能变体或片段以及 PPDK 或者其功能变体或片段。首先， 如下所述分离鼠耳芥 PPDK 基因的基因组 DNA。
     基因组 DNA 的分离
     按 照 推 荐 的 方 案， 使 用 DNeasy 植 物 微 型 试 剂 盒 (DNeasy Plant Mini Kit) (Qiagen) 从叶中提取鼠耳芥生态型 Columbia 0 的基因组 DNA(gDNA)。使用表 1 概括的引 物序列， 将基因组 DNA 用作下述 PCR 反应的模板。
     表1： 引物序列
     SEQ ID No. 1 2 7 3 4 5 6 10 12 11 8 9 13 15 14 25 26AAT CCT AGG ATG ATG CAG CGA GTA TTC ACC AAT GGA TCC TCA TGC AAC AAC TAC TTG AGC AGC CCT CGC CAA AGG AAT CTT AC CTT GGC TTG AAC GAC CAA GTC GGT TGC AGG GAT AGG AAC ACC CGT CTG ATT GCA TCA GCC CAG CCT GAG GAG TTC CTA CAA GTG TGC CTG CTT GCC GAA TAT C CAG AAA AGC GGC CAT TTT CCA CCA CCG GCC CAC AGT CGA TGA CAA GAC CGG CAA CAG GAT TCA ACC CCA TCT CAG TAC CCT TCT G CTC AAC CTT CCA CCG TGT GAT TCT ACG GTG CCA AAT TCG CCG A ACC GGT GTG CTT CCT CTT GAA ATTTCTAGAATGTCGGCCGGTAACGGAAATG ATTGAGCTCCTAAAAGATAGGACCAGCAGCGRNA 的分离和 cDNA 的合成
     由 7 天大的拟南芥子叶提取总 RNA。使用不含 RNA 酶的装置在冰浴上进行 RNA 提 取， 用焦碳酸二乙酯 (DEPC， Sigma-Aldrich) 处理的水制备溶液。每 1 升水加入 1ml DEPC， 在通风橱中将混合物搅拌过夜， 然后高压灭菌。 使用 TriPure 分离试剂 (TriPure Isolation Reagent)(Roche) 提取 RNA。 将 200mg 组织在液氮用研钵和研杵研磨， 加入 1mlTriPure 分离 试剂， 并按照所推荐的方案进行。将 RNA 沉淀重新悬浮于预加热至 60℃达 10 分钟的 20μl RNA Secure(Ambion) 中。在 4℃下将样品以 13,000rpm 离心 5 分钟， 将上清液转移到干净 的 1.5ml 微量离心管中以除去污染的碎片。
     利用 Eppendorf Biophotometer 分光光度计， 通过在 260 和 280nm 下读取读数， 用分光光度法测定 RNA 的量和纯度 (Maniatis 等， 1982， Molecular cloning ： a laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory)。 还 使 用 1.5 ％ (w/v) 琼 脂 糖 (Melford Laboratories) 于 0.5x TBE 中， 利用琼脂糖凝胶电泳对 RNA 进行检查。 将样品悬浮于 1x RNA 样品缓冲液中， 使用 0.5x TBE 作为运行缓冲液， 在 80V 下进行电泳。 4x 工作浓度的 RNA 样品 缓冲液包含 0.002％ (w/v) 溴化乙锭 (Sigma-Aldrich)、 含有 180mM Tris-HCl、 180mM 硼酸和 8mM EDTA(pH 8.3) 的 2x TBE(2x Tris- 硼酸 -EDTA 缓冲液 (2x TBE)、 13％菲可 400(Ficoll 400)(Sigma-Aldrich)、 0.01％溴酚蓝和 7M 脲 (Ficher Scientific)。
     使用 2μg RNA、 1μg 寡聚 dT(15) 引物 (Roche)、 1x 莫洛尼鼠白血病毒 (MMLV) 缓冲 液 (Promega)、 0.4mM dNTPs(Bioline)、 40 单位重组 RNasin 核糖核酸酶抑制剂 (Promega)、 200 单位 MMLV 反转录酶 (Promega) 和不含核酸酶的水至 25μl 的最终体积， 来进行 RNA 反 转录以合成 cDNA。将样品在 42℃下温育 1 小时。
     拟南芥 PPDK 的扩增
     使用表 1 所示的含有 AvrII 限制位点的正向引物 (AtCytFWD-AvrII， SEQ ID No.1) 和含有 BamHI 限制位点的反向引物 (AtCytREV-BamHI， SEQ ID No.2)， 通过 PCR 由基因组 或 cDNA 模板扩增编码 PPDK 的胞质同工型的基因的基因组形式和 cDNA 形式。PCR 反应混 合物包含 1x HF 缓冲液 (NEB)、 2mM 氯化镁 (MgCl2， NEB)、 0.5mM dNTPs(Bioline)、 100ng 模 板 (cDNA 或 基 因 组 DNA)、 0.5μM 各 引 物 和 1 单 位 Phusion 高 保 真 DNA 聚 合 酶 (Phusion High-Fidelity DNA Polymerase)(NEB)。 使用 Techne 热循环仪 (Techne Thermal Cycler)， 以 98℃ 30 秒钟的起始变性步骤， 接着 98℃ 10 秒钟、 55℃ 30 秒钟和 72℃ 2 分钟的 30 个循 环以及 72℃ 5 分钟的最终延伸步骤， 进行热循环。
     一旦分离 / 制成拟南芥 PPDK 的 cDNA 和 gDNA， 便采用图 1 概述的方案， 将其用来产 生各种构建体。将拟南芥 PPDK 的胞质同工型的 cDNA 和基因组 DNA 形式与 pBNP 载体中的 衰老诱导型 SAG12 启动子融合， 从而在衰老期间过表达 PPDK。
     (a) 使用含有 AvrII 和 BamHI 限制位点的引物， 对拟南芥 PPDK 的胞质同工型的 cDNA 和基因组 DNA 形式进行 PCR 扩增， 分别产生 2.4 和 4.3kb 产物。
     (b) 插入克隆载体 pCR 4Blunt-TOPO 中。对 PPDK 插入片段进行整体测序， 发现与 预期序列相同。
     (c) 用 AvrII 和 BamHI 对克隆载体和目标载体 pBNP 进行限制性内切核酸酶消化。
     (d) 与 BNP 连接， 琼脂糖凝胶显示通过用 AvrII 和 BamHI 对构建体的限制性内切核 酸酶消化产生的 DNA 片段。预期 cDNA 构建体的条带大小为 14.8kb 和 2.4kb， gDNA 构建体 的为 14.8kb 和 4.4kb。
     (e) 通过土壤杆菌介导的转化将构建体导入拟南芥生态型 Columbia 0 中。跨连 接位点对构建体进行测序。编码新霉素磷酸转移酶的基因 nptII 赋予植物卡那霉素抗性。 LB 和 RB ： 分别为 T-DNA 的左缘和右缘 ； nos Pro ： 胭脂氨酸合成酶启动子 ； nos t ： 胭脂氨酸 合成酶终止子 ； SAG12Pro ： 拟南芥 SAG12 基因的启动子。
     下面将参照图 1 详细描述构建体的产生 ：
     克隆至 pCR4 Blunt-TOPO 载体
     使用 1 ％ (w/v) 琼脂糖、 0.5μg ml-1 溴化乙锭 (Sigma-Aldrich) 在 0.5xTBE 中， 用琼脂糖凝胶电泳对 PCR 产物进行检查。将样品悬浮于 1xDNA 样品缓冲液 (6x 工作浓度的DNA 样品缓冲液， 包含 50mM Tris( 羟甲基 ) 氨基甲烷 (Tris-HCl， Melford Laboratories)、 60％甘油和 0.25％ (w/v) 溴酚蓝 (Sigma-Aldrich)， 使用 0.5x TBE 作为运行缓冲液， 在 80V 下进行电泳。
     按 照 推 荐 的 方 案， 使 用 QIAQuick PCR 纯 化 试 剂 盒 (Qiagen)， 对 2.6kb 的 PPDK cDNA 条带和 4.4kb 的 PPDK 基因组 DNA 条带进行了纯化， 并使用 30μl 分子生物级水 (BDH Laboratory Supplies) 洗脱。 按照推荐的方案， 使 PCR 产物连接 ( 平端 ) 至 pCR4Blunt-TOPO 载体 (Invitrogen) 中。按照推荐的方法， 将克隆反应物 (2μl) 转化至 50μl 亚克隆效率 DH5a 大肠杆菌 (sub-cloning efficiency DH5a E.coli)(Invitrogen)。 在包含 10g l-1 细菌 用胰蛋白胨 (BD)、 5g l-1 细菌用酵母提取物 (Oxoid) 和 85mM 氯化钠 (Fisher Scientific) 的 Luria-Bertani(LB) 琼脂 (Luria Bertani 培养液 (LB 培养液 ) 中使转化的大肠杆菌细 胞于 37℃生长过夜。在高压灭菌前用 10M 氢氧化钠调节 pH 至 7.0。通过将 1.5％ (w/v) 琼 脂 (BD) 加入含有 50μg ml-1 卡那霉素 (Melford Laboratories) 的 LB 培养液中来制备 LB 琼脂。
     使 用 1x NH4 缓 冲 液 (Bioline)、 2.5mM MgCl2(Bioline)、 0.5mMdNTPs(Bioline)、 0.3μM 各引物 (AtCytFWD-AvrII 和 AtCytREV-BamHI) 即 SEQ ID No 1 和 2 以及 0.5 单位 BioTaq NA 聚合酶 (Bioline)， 通过 PCR 筛选大肠杆菌菌落。 以 95℃ 5 分钟的起始变性步骤， 接着 95℃ 30 秒钟、 55℃ 30 秒钟和 72℃ 4 分 30 秒的 30 个循环以及 72℃ 5 分钟的最终延伸 步骤， 进行了热循环。 如上所述使用 1％ (w/v) 琼脂糖凝胶电泳， 对 PCR 产物进行了检查。 在 -1 37℃的振荡培养箱中， 使含有所需插入片段的菌落在 5ml 含有 50μg ml 卡那霉素的 LB 培 养液中生长过夜。按照推荐的方案， 使用 QIAPrep Spin Miniprep 试剂盒 (Qiagen) 提取质 粒 DNA。 DNA 用含 10 单位 BamHI(NEB1) 的 1x BamHI 缓冲液于 37℃消化 1 小时。 如上所述使 用 1％ (w/v) 琼脂糖凝胶电泳对消化物进行了检查。 使用表 1 所示引物 AtCytFWD-AvrII(SEQ ID No.1)、 AtPPDKSeqF1(SEQ ID No.3)、 AtPPDKSeqF2(SEQ ID No.4)、 AtPPDKSeqR1(SEQ ID No.5)、 AtPPDKSeqR2(SEQ ID No.6) 和 AtCytREV-BamHI(SEQ ID No.2)， 应用 3730DNA 分析 仪 (Applied Biosystems)， 对具有正确的限制性内切酶消化谱的质粒中的插入片段进行了 测序。用 BioEdit(Ibis Biosciences) 对序列进行了分析。
     这些构建体称为 TOPO-PPDKcDNA 和 TOPO-PPDKgDNA， 如图 2a 和图 2b 所示。
     pBNP 构建体的的克隆
     将 PPDK 连接至衰老诱导型启动子 SAG12 控制下的 BNP1380000001 二元载体中。 含有 SAG12 的骨架质粒 BNP1380000001 基于 pBINPLUS(F.A.van Engelen 等， Transgenic Research(1995)4， 288-290)， 如图 3a 所示。首先， 使用携带 TOPO-cDNA 或 TOPO-gDNA 的大 -1 将这些培养物在振荡的 37℃ 肠杆菌菌落接种 25ml 含有 50μg ml 卡那霉素的 LB 培养液。 培养箱中温育过夜， 按照推荐的方案， 使用质粒 Midi 试剂盒 (Plasmid Midi Kit)(Qiagen) 提取质粒 DNA。使用质粒 Midi 试剂盒， 从 100ml 含有 50μg ml-1 卡那霉素的培养物中纯化 出 pBNP1380000001 载体。
     然后， 通过限制性内切酶 AvrII 和 BamHI 对这些质粒进行消化。将消化反应 物 于 37 ℃ 温 育 过 夜， 消 化 反 应 物 包 含 2μg DNA(BNP) 或 4μg DNA(TOPO-PPDKcDNA 和 TOPO-PPDKgDNA)、 1x 缓冲液 2、 10 单位 AvrII 和 10 单位 BamHI。使用结晶紫样品缓冲液 (250μM 结晶紫 (Hopkin and Williams) 和 30 ％ (w/v) 蔗糖 (Fisher Scientific))， 并将含有 25μM 结晶紫的 0.5x TBE 用作运行缓冲液， 使用 0.8％ (w/v) 琼脂糖、 0.5x TBE 和 25μM 结晶紫 (Hopkin and Williams) 在 50V 下进行电泳约 2 小时， 通过结晶紫琼脂糖凝胶 电泳对样品进行分离 (Rand， 1996， 在凝胶电泳期间， 结晶紫可用来观察 DNA 条带， 并改进克 隆效率。Elsevier Trends Journals Technical Tips Online)。将按照推荐的方案采用 QIAQuick 凝胶提取试剂盒 (Qiagen) 的凝胶条带提取法， 用来提取 14.4kb BNP、 2.6kb PPDK cDNA 和 4.4kb PPDK 基因组 DNA 片段。 利用使用溴化乙锭的 1％琼脂糖凝胶电泳， 检查片段， 并确定相对于 HyperLadder I(Bioline) 的量。
     由于基因组 DNA 片段 (4.4kb) 和 TOPO 骨架 (3.9kb) 的大小相似， 因此对凝胶提取 的基因组 DNA 片段进行磷酸酶处理以防止与任何污染的 TOPO 骨架连接。将虾碱性磷酸酶 (SAP， 1 单位， Roche) 加入含 1μg 凝胶提取的基因组 DNA 片段的 1x 去磷酸化缓冲液 (Roche) 中， 将反应物于 37℃温育 30 分钟， 然后于 65℃灭活 10 分钟。使用 10 ∶ 1 摩尔比的 cDNA 或基因组 DNA 片段与消化的 BNP、 1x 连接缓冲液 (NEB) 和 1 单位 T4DNA 连接酶 (NEB) 进行 连接反应。按照推荐的方案， 将连接反应物于 16℃温育过夜， 将 2μl 用来转化文库效率的 DH5_E.coli(library-efficiency DH5_E.coli)(Invitrogen)。
     将转化的大肠杆菌转移到含有 50μg ml-1 卡那霉素的 LB 琼脂中， 并于 37 ℃温 育 过 夜。 使 用 1x NH4 缓 冲 液、 2.5mM MgCl2、 0.5mMdNTPs、 0.3μM 的 表 1 所 示 的 各 引 物 (AtPPDKexon15FWD(SEQ ID No.7) 和 BNPnostREV(SEQ ID No.8) 和 0.5 单位 BioTaq DNA 聚合酶， 通过 PCR 筛选大肠杆菌菌落。以 95℃ 5 分钟的起始变性步骤， 接着 95℃ 30 秒钟、 55℃ 30 秒钟和 72℃ 3 分钟的 30 个循环以及 72℃ 5 分钟的最终延伸步骤， 进行了热循环。 如上应用 1％ (w/v) 琼脂糖凝胶电泳对 PCR 产物进行检查。在 37℃振荡培养箱中， 使含有 -1 所需插入片段的菌落在 5ml 含有 50μg ml 卡那霉素的 LB 培养液中生长过夜。按照推荐 的方案， 使用 QIAPrep Spin Miniprep 试剂盒提取质粒 DNA。将 DNA 用含 10 单位 BamHI 和 10 单位 StuI 的 1x BamHI 缓冲液于 37℃消化 1 小时后， 如上所述进行了 1％ (w/v) 琼脂糖 凝胶电泳。选出具有正确限制性内切酶消化谱的分别由 cDNA 和基因组 DNA 连接产生的一 个菌落， 并使用上述表 1 所示引物 BNP-SAG12FWD(SEQ ID No.9) 进行了测序。
     这些构建体称为 BNP-PPDKcDNA 和 BNP-PPDKgDNA， 如图 3a 和图 3b 所示。
     实施例 2- 鼠耳芥用 BNP-PPDKcDNA 和 BNP-PPDKgDNA 进行转化
     使 用 下 列 质 粒 通 过 电 穿 孔 转 化 根 癌 土 壤 杆 菌 菌 株 GV3101-R ： 图 3 所示 BNP-PPDKcDNA 和 BNP-PPDKgDNA， 实施例 1 中描述了所述质粒的制备。 -1
     从 含 有 25mg l 利 福 平 (Sigma-Aldrich) 的 LB 培 养 液 的 培 养 物 中 制 备 电 转 感受态 (Electrocompetent) 土壤杆菌属， 所述培养物生长在 30 ℃下， 且采用 Eppendorf Biophotometer 分 光 光 度 计 在 600nm 下 测 定 的 光 密 度 为 0.4-0.6。 将 500ml 的 培 养 物 以 4000g 离心 15 分钟， 弃去上清液后， 将细胞重新悬浮于 500ml 冷的 10 ％甘油 (Fisher Scientific) 中。 使用 250ml 甘油， 接着 10ml 甘油和最终 2ml 甘油重复离心和重新悬浮。 将 细胞等分成 50μl 等分样品， 在液氮中速冻， 并保存在 -80℃下。使用 BioRad Gene Pulser 进行电穿孔。将质粒 DNA(200ng) 加入预先冷却的电穿孔小槽 (Gene Pulser Cuvette， BioRad) 中的 50μl 上述土壤杆菌细胞中， 将细胞在冰浴上温育 5 分钟。 采用脉冲 2.5mV、 阻 抗 400ohm 和电容 25μF 以及 1ml SOC(Super Optimal Broth， Catabolite Repression 包 含 20g/l 细菌用胰蛋白胨、 5g/l 细菌用酵母提取物、 85mM 氯化钠和 250mM 氯化钾 )， 对该小槽进行电穿孔。用 10M 氢氧化钠调节至 pH 7.0 后高压灭菌。用前加入无菌氯化镁到 10mM 的终浓度， 并加入无菌葡萄糖 (Fisher Scientific) 至 20mM 的终浓度。将细胞在振荡培养 箱中于 30℃温育 2 小时后， 转移到含有 50μgml-1 卡那霉素和 50μg ml-1 利福平的 LB 琼脂 中。
     在 30℃下温育 2 天后， 通过 PCR， 然后通过限制性内切酶消化来筛选菌落。将 PCR 筛选呈阳性且具有预期的限制酶切消化谱的菌落接种到 5ml 含有 50μl ml-1 卡那霉素和 50μl ml-1 利福平的 LB 培养液中， 并在振荡培养箱中于 30℃温育过夜。次日， 将 600μl 该 培养物用来接种到 500ml 上述 LB 培养液， 在振荡培养箱中于 30℃温育 30 小时后用于花序 浸渍 (floral dipping)。
     将 4 周大的拟南芥植物用于花序浸渍。将所有构建体转化成野生型生态型 Columbia 0。将上述制备的土壤杆菌培养物在 4 ℃下以 5,000g 离心 15 分钟， 将细胞沉 淀重新悬浮于 250ml 无菌 5 ％蔗糖 (Fisher Scientific) 溶液 (w/v) 和 0.05 ％ Silwett L-77(OSi Specialties) 中。 轻轻搅动同时， 将植物浸入细胞悬液约 10 秒钟， 然后盖上薄膜 (clingfilm)， 避开直射光 24 小时。在此之后， 使植物恢复到正常生长方案， 收获种子。
     转基因鼠耳芥的选择
     按照 Harrison 等人 ((2006)， Plant Methods， 2， 19) 的方法， 在 50μgml-1 卡那霉 素 (Dufecha Biochemie) 中选出转化植物的种子。 使具有抗生素抗性的 T1 植物生长至结籽 并自花授粉。如上所述选出种子， 并选出具有 3 ∶ 1 抗性∶非抗性比的 T2 品系作为携带单 一拷贝的转基因。再次使这些植物自花授粉， 并如上选择。选出产生 100％抗性子代 (T3) 的 T2 品系作为纯合品系， 并用于所有实验。应用孟德尔遗传学原理选出对于转基因而言是 纯合的并包含单一转基因拷贝的 T2 代植物。对于用 SAG12-PPDKcDNA 和 SAG12-PPDKgDNA 转化的植物， 各选出 5 个独立的单一插入片段纯合品系。
     实施例 3- 用 BNP-PPDKcDNA 和 BNP-PPDKgDNA 转化烟草。
     使用质粒 BNP、 BNP-PPDKcDNA 和 BNPPPDKgDNA， 如实施例 2 所述通过电穿孔转化 电转感受态根癌土壤杆菌菌株 LBA4404。电穿孔后， 将 1ml LB 培养液加入经电穿孔的细 胞中， 然后将其在振荡培养箱中于 28℃温育 2 小时后， 转移到含有 50μg ml-1 卡那霉素和 100μgml-1 大观霉素 (Sigma-Aldrich) 的 LB 琼脂中。在 28℃下温育 2 天后， 将一个菌落用 -1 -1 来接种 50ml 含有 50μg ml 卡那霉素和 100μg ml 大观霉素的 LB 培养液。将该培养物 在振荡培养箱中于 28℃温育 3 天。通过限制性内切酶消化， 提取质粒 DNA 并进行分析， 将 -1 -1 50μl 培养物用于接种 50ml 含有 50μg ml 卡那霉素和 100μg ml 大观霉素的 LB 培养 液中。将该培养物在振荡培养箱中于 28℃温育过夜。
     将烟草栽培品种 Burley 21 和 K326 自种子生长， 从 8 周大的植物上切取最幼嫩 的叶， 在 8％ (v/v)Domestos 浓漂白液 (Domestos thick bleach)(Domestos) 中灭菌 10 分 钟后， 在无菌蒸馏水中漂洗。使用 6 号木塞钻孔器钻取叶盘， 然后将叶盘放入 25ml 土壤杆 菌培养物中 2 分钟。然后将叶盘面朝下放入含有 2.2μM 6- 苄氨基嘌呤 (BAP) 和 0.27μM a- 萘乙酸 (NAA) 的 MS 培养基上。将这些培养基放入 22℃生长室中 2 天。然后将叶盘转移 到含有 500μg ml-1 凯福隆 (clarofan)(Roussel Laboratories)( 非共培育对照 ) 或 500μg ml-1 凯福隆和 100μg ml-1 卡那霉素的上述选择性 MS 培养基中。每 14 天将叶盘转移到上 述新鲜的选择性 MS 培养基中， 持续 6 周。然后从叶盘上取出愈伤组织和芽块， 并放入含有0.5μM BAP、 500μg ml-1 凯福隆和 100μg ml-1 卡那霉素的 LS 培养基上。2 周后， 将芽转移 -1 到装有含 0.5μM BAP、 500μg ml 凯福隆和无卡那霉素的 LS 培养基的 150ml 广口瓶中。
     在随后的 3 周后， 将优势芽转移到含有 250μg ml-1 凯福隆和无 BAP 或卡那霉素的 LS 培养基上。再过 3 周后， 通过将芽尖转移到无抗生素或 BAP 的 LS 培养基， 来进一步清洗 芽。当长出充足的根时， 将植物转移到温室的土壤中。
     转基因烟草的选择
     采用定量 PCR(Q-PCR) 确定 T0 和 T1 植物的转基因拷贝数。可能的话， 选择单一插 入片段 T0 和纯合的 T1 植物用于分析。对转基因检测， 使用表 1 所示的引物 BNP-1271F(SEQ ID No.10) 和 BNP-1334R(SEQ ID No.11)， 并使用退火至 nptII 转基因上的 Vic/TAMARA 标记 的探针 BNP1291TV(SEQ ID No.12)。对于内部定量， 使用引物 NtCyc-184F(SEQ ID No.13) 和 NtCyc-316R(SEQ ID No.14)， 并使用退火至编码亲环蛋白的内源基因的 FAM/TAMARA 标记 的探针 NtCyc-267T(SEQ ID No.15)。通过比较 Ct 方法 (Comparitive Ct method， ΔΔCt 方法， Bubner 和 Baldwin(2004)， Plant Cell Reports， 23， 263-271) 进行定量。反应混 合物包含 1x Universal Master Mix(ABI)、 0.9μM 各引物、 0.2μM 各探针 ( 对于 BNP 和 NtCyc 引物和探针采用单独的反应 ) 以及约 500ng 基因组 DNA 模板， 其按照推荐的方案， 使 用 DNeasy 植物微型试剂盒 (Qiagen) 从叶组织提取。在 7900HT 快速实时 PCR 系统 (7900HT Fast Real-Time PCR System， Applied Biosystems) 中以 95℃ 10 分钟的起始变性步骤， 接 着 95℃ 15 秒钟和 60℃ 1 分钟的 40 个循环进行热循环。 运用所提供的 SDS2.2 软件 (Applied Biosystems) 对数据进行分析。
     在 转 化 的 T0 代 K326 和 Burley 21 烟 草 的 组 织 培 养 中 再 生 后， 应用定量 PCR(Q-PCR) 选择携带转基因单一拷贝的植物。 选择单一插入片段植物以降低转基因沉默的 可能性。使用与编码新霉素磷酸转移酶的 nptII 转基因互补的寡核苷酸进行 Q-PCR。该基 因存在于转移到构建体 pBNP、 BNP-PPDKcDNA 和 BNP-PPDKgDNA 的植物基因组中的 T-DNA 的 左缘和右缘之间。用 pBNP 转化的植物只用作空载体对照， 以确保通过组织培养的再生在用 空载体转化的植物和用含有 PPDK 编码序列的载体转化的植物之间是一致的。在再生和证 实发生了成功转化的 Q-PCR 检查之后， 弃去这些植物。
     对于每个构建体 (SAG12-PPDKcDNA 和 SAG12-PPDKgDNA) 和各栽培品种 (K326 和 Burley 21)， 选择了 6 种植物。不可能只选出单一插入片段植物， 因此如果无法获得 6 种单 一插入片段植物时， 则选出具有可能的最低拷贝数的植物。 使这些植物自花授粉， 并收获种 子。
     对于各种选出的 T0 植物， 使 14 个子代生长， 重复 Q-PCR 以选出纯合植物。纯合植 物的使用应确保转基因在后代中的稳定性。对于各 T0 亲本， 选出 4 个携带转基因的子代。 然而， 对于每个 T0 亲本不可能总是选出纯合子代。 如果亲本拷贝数高于 2， 则选择具有较低 拷贝数的植物以降低转基因沉默的可能性， 而且还简化了 T2 代纯合子的选择 ( 如有必要 )。 这样， 对于各构建体和各栽培品种， 选择具有低转基因拷贝数的得自 5 个独立品系的 4 个生 物重复 (biological replicate)( 同胞 ) 用于所有的其它实验。
     实施例 4- 转化拟南芥植物中 PPDK 蛋白的检测和定量测定蛋白质提取
     在液氮下， 使用微型研杵 (micropestle) 在 1.5ml 微量离心管中研磨拟南芥叶 组织 (100mg)， 加入 400μl 提取缓冲液 ( 磷酸钾缓冲液 ( 加蛋白酶抑制剂混合物 (PIC，Sigma))。按照推荐的方案， 使用 Bio-Rad 蛋白质测定试剂 (Bio-Rad)， 通过 Bradford 测定 法测定蛋白质浓度 (Jones 等， 1989， Journal of Chemical Ecology， 15， 979-992)。
     聚丙烯酰胺凝胶电泳
     在含有 10％ (v/v) 丙烯酰胺 (37.5 ∶ 1 丙烯酰基∶双丙烯酰基， Severn Biotech Ltd)、 50 ％ (v/v) 免疫印迹分离缓冲液 ( 参见 2.10 节 )、 0.05 ％ (w/v) 过二硫酸铵 (APS， AnalaR) 和 0.05％ (v/v)N， N， N’ N’ 四甲基乙二胺 (TEMED， Severn Biotech Ltd) 的分离 胶中， 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 分离蛋白质。成层胶包含 5％上述丙烯酰胺、 50％ (v/v) 免疫印迹成层缓冲液、 0.06％ (w/v)APS 和 0.1％ (v/v)TEMED。使用 1x 免疫印迹样品 缓冲液 (66mM Tris-HCl、 10％ (v/v) 甘油、 0.7mM SDS、 0.7Mβ- 巯基乙醇 (BDH Laboratory Supplies) 和 0.05％ (w/v) 溴酚蓝和免疫印迹运行缓冲液 (25mM Tris-HCl、 0.29mM 甘氨酸 (Fisher Scientific) 和 3.5mM SDS， 以 70mA 的电流对 20μg 提取的蛋白质进行电泳 1 小 时 30 分钟。
     同时运行一式两份胶。 第一份用于免疫印迹分析 ( 下文中予以描述 )， 第二份按照 推荐的方案， 用 GelCode Blue Safe 蛋白质染料 (Thermo Scientific) 染色。使用凝胶干 燥膜 (Gel Drying Film)(Promega) 将已染色的凝胶干燥。
     免疫印迹分析
     使用 Protean Extra-Thick 印迹纸 (Blot Paper)(Bio-Rad) 和免疫印迹转移缓冲 液 (48mM Tris-HCl、 39mM 甘氨酸、 1.3mM SDS 和 20％ (v/v) 甲醇 (Fisher Scientific))， 在 Semi-Dry Blotter(Bio-Ra d) 上以 15V 达 1 小时将用于免疫印迹分析的凝胶中的蛋白质转 印到 Protan BA83 硝酸纤维素膜 (Schleicher and Schuell) 上。 在印迹证实蛋白质转印后， 将丽春红染料 (0.5％ (w/v) 丽春红 S(Fluka) 和 1％ (w/v) 冰醋酸 (Fisher Scientific)) 涂在膜上， 然后将膜在蒸馏水中漂洗。
     使用含 1％ (w/v) 干脱脂奶粉 (Marvel) 和 0.1％ (v/v) 聚氧乙烯失水山梨醇单月 桂酸酯 ( 吐温 20(TWEEN 20)， Sigma-Aldrich) 的磷酸缓冲盐溶液 (PBS ： 1.5mM 正磷酸二氢 钾 (KH2PO4， AnalaR)、 8.1mM 正磷酸氢二钠、 2.7mM 氯化钾和 137mM 氯化钠 )， 每天新鲜配制 用于 PPDK 免疫印迹分析的封闭缓冲液。使用盐酸调节至 pH 7.4。在室温下， 将膜在振荡器 上在封闭缓冲液中温育 1 小时。使用 1 ∶ 10,000 稀释的兔抗 PPDK 抗体 (Chris Chastain， Minnesota State University) 进行初次杂交， 接着在封闭缓冲液中洗涤 3 次各 5 分钟。 使 用 1 ∶ 1000 稀释的驴抗兔生物素化完整抗体 (GE Healthcare) 进行第二次杂交， 接着如 上洗涤 3 次。使用 1 ∶ 1000 稀释的链霉抗生物素 - 生物素化辣根过氧化物酶复合物 (GE Healthcare)， 进行第三次杂交， 接着在含有 0.1％ (v/v) 吐温 20 的 PBS 中洗涤 3 次各 5 分 钟。
     然后将膜在蒸馏水中漂洗 3 次。按照推荐的方案， 使用 Western Lightning 化学 发光试剂 (Western Lightning Chemiluminescence Reagent)(Enhanced Luminol， Perkin Elmer) 进行检测。
     参照图 4， 图中显示通过蛋白质印迹选择转基因 SAG12-PPDK 拟南芥细胞系。从 8 周大的鼠耳芥野生型、 ΔPPDK SAG12-PPDKcDNA 和 SAG12-PPDKgDNA 植物的叶组织中提取蛋 白质， 并进行免疫印迹分析以选择表达较高水平 PPDK 的品系。重组玉米 PPDK(30μg) 用作 阳性对照。在野生型或 PPDK 突变型植物 (ΔPPDK) 中未检测出 PPDK。与 SAG12-PPDKcDNA相比， SAG12-PPDKgDNA 植物表达较高水平的 PPDK。对 5 个 SAG12-PPDKgDNA 品系进行了全 部的后续分析。
     在 野 生 型 和 ΔPPDK 植 物 中 无 法 检 出 PPDK， 在 一 些 SAG12-PPDKcDNA 植 物 中 可 检 出 低 水 平 的 PPDK， 而 在 所 有 SAG12-PPDKgDNA 品 系 中 均 可 检 出 PPDK。 与 野 生 型 或 SAG12-PPDKcDNA 品系相比， 在这 3 个品系中检测出高得多的 PPDK 量。因此， 内含子的存在 似乎对 PPDK 表达水平具有积极作用， 选择 SAG12-PPDKgDNA 品系用于所有的其它实验。
     对野生型、 ΔPPDK 和 SAG12-PPDKgDNA 植物进行了针对 PPDK 的免疫印迹， 以测定 SAG12-PPDKgDNA 植物中 PPDK 蓄积的开始和程度。
     参照图 5， 图中显示从第五周起野生型、 ΔPPDK 和 5 个独立的 SAG12-PPDKgDNA 品 系的 PPDK 丰度的定量测定。 对于从第 5 周到第 9 周的每个时间点， 将 PPDK 丰度计算为野生 型的百分比。数据显示为这 5 个时间点的平均值。误差棒表示 1SEM。将 SAG12-PPDKgDNA 品系按递增的 PPDK 丰度的顺序排列。应用 ANOVA 检验基因型间的差异 (F ＝ 4.775， df ＝ 6， p ＝ 0.001)。与野生型显著不同的品系是 G12.3(p ＝ 0.005) 和 G16.1(p ＝ 0.004)。
     从自播种后 3 周到 9 周以一周一次的间隔收获的叶组织中提取蛋白质。从第五周 起在野生型植物中检出少量的 PPDK， 这证实了转录物中所观察到的增加导致蛋白质丰度的 提高。在 SAG12-PPDKgDNA 植物中， 在第 5 周还发现开始 PPDK 蓄积， 但 PPDK 丰度高于野生 型的 PPDK 丰度。在 ΔPPDK 植物中， 在任何阶段都未检出 PPDK 蛋白。 还使允许定量测定叶蛋白质提取物中的 PPDK 的方法最优化。对不同量的重组玉 米 PPDK 蛋白进行了 SDS-PAGE 和免疫印迹分析。 应用 AlphaEase 成像软件计算出条带强度， 并绘制标准曲线。应用 SigmaPlot 软件计算出回归线， 该软件随后用于计算植物叶样品中 的 PPDK 的量。由于免疫印迹检测水平可改变， 因此对每个免疫印迹有必要包括至少 3 个标 准品以供不同免疫印迹间的真实比较。用于定量测定不同提取物中的 PPDK 丰度的该项技 术被用来选择和比较不同的转基因品系。
     参照重组玉米 PPDK 蛋白的已知标准品， 计算出每个时间点上各个品系至少 4 个生 物重复的 PPDK 蛋白丰度。 分析表明， 从第五周起， SAG12-PPDKgDNA 的 PPDK 丰度高于野生型 的 PPDK 丰度。对于各 SAG12-PPDKgDNA 品系， 从第五周起在每个时间点将 PPDK 丰度计算为 野生型的百分比， 从这些值得到的平均值对衰老期间各 SAG12-PPDKgDNA 品系中的 PPDK 蓄 积进行量化。这就允许按照递增的 PPDK 丰度对 SAG12-PPDKgDNA 品系排序， 如图 5 所示。
     由于在转基因植物中大量蓄积的蛋白质可经历灭活， 因此升高的蛋白质丰度并不 一定意味着增加酶活性。在暗中， PPDK 进行可逆的磷酸化， 导致其失活。针对磷酸化形式 的 PPDK( 磷酸 -PPDK) 产生的抗体， 可供特异性检测无活性形式的 PPDK， 而之前所使用的 抗体 ( 抗 PPDK) 不论磷酸化状态都测出 PPDK(Chastain 等， 2002， Plant Physiology， 128， 1368-1378)。对于最初用抗 PPDK 抗体探测然后剥离和再探测的免疫印迹， 在从播种后 3 周 到 9 周的时程中， 抗磷酸 PPDK 抗体被用来检测无活性的 PPDK。
     出人意料的是， 在野生型植物中在多个免疫印迹上只可检出非常低水平的无活性 PPDK( 磷酸化 PPDK)， 且只在衰老的晚期检出。在 SAG12-PPDKgDNA 植物中， 取决于使之失活 的时间点， 检出较高水平的 PPDK。然而， 尽管总 PPDK 的高丰度， 但在 PPDK 丰度开始提高后 不久的时间点上， 检出非常少的无活性 PPDK 或未检出无活性 PPDK。这些结果表明， 虽然在 SAG12-PPDKgDNA 植物中可发生一些 PPDK 失活， 但是至少在衰老早期， 丰度增加的酶促活性
     PPDK 存在于 SAG12-PPDK 植物中。
     实施例 5- 转化的烟草植物中 PPDK 蛋白的检测和定量测定
     在液氮下， 使用微型研杵将烟草叶组织 (100mg) 在 1.5ml 微量离心管中研磨， 加入 400μl 提取缓冲液 (Overcoat 缓冲液 (PIC))。按照推荐的方案， 使用 Bio-Rad 蛋白质测定 试剂 (Bio-Rad)， 通过 Bradford 测定法测定蛋白质浓度 (Jones 等， 1989)。如实施例 4 所 述， 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 对蛋白质进行分离。如实施例 4 所述， 通过免疫印迹 对蛋白质进行分析并定量测定 PPDK 蛋白。
     对自通过剥离和于 30℃避光温育而诱导衰老的 K326 和 Burley 21T1 代烟草叶提 取的叶蛋白质进行了针对 PPDK 的免疫印迹。以这种方式诱导衰老， 使得在植物达到成熟 前， 可鉴定出具有最高 PPDK 丰度的转基因品系， 并弃去其它品系。在 K326 植物中， 在3个 SAG12-PPDKgDNA 品系 (G4、 G8 和 G10) 以及在 1 个 SAG12-PPDKcDNA 品系 (C10) 中， 检出高 丰度的 PPDK。在 Burley 21 植物中， 在 4 个 SAG12-PPDKgDNA 品系 (G3、 G7、 G15 和 G23) 中 有丰富 PPDK， 但 PPDK 不以与 K326 品系一样的高丰度存在。具有最高 PPDK 丰度的 K326 和 Burley 21 的各 4 个品系均用于所有的进一步分析。 由于几乎唯一在 SAG12-PPDKgDNA 品系 中观察到最高 PPDK 丰度， 因此似乎内含子对 PPDK 表达具有积极作用。 参照图 6， 图中显示如下对 SAG12-PPDK K326 和 Burley 21 烟草品系进行选择 ：
     (b) 选择转基因 K326 品系的 PPDK 免疫印迹。在 6 周大植物的绿叶中通过剥离并 于 30℃避光温育 3 天诱导衰老。提取蛋白质， 并进行免疫印迹分析以选出表达较高水平的 PPDK 的品系。重组玉米 PPDK(50μg) 用作阳性对照。用各亲本 T0 植物的一个子代显示一 个代表性免疫印迹。将亲本品系 SAG12-PPDKgDNA G4、 G8 和 G10 和 SAG12-PPDKcDNA 品系 C10 的植物用于所有后续分析。
     (c) 与在 (b) 部分中对 K326 所进行的一样进行选择转基因 Burley21 品系的 PPDK 免疫印迹。将亲本品系 SAG12-PPDKgDNA G3、 G7、 G15 和 G23 的植物用于所有后续分析。
     对野生型、 零拷贝 ( 阴性分离子 )、 SAG12-PPDKgDNA K326、 SAG12-PPDKcDNA K326 和 SAG12-PPDKgDNA Burley 21 烟草进行了针对 PPDK 的免疫印迹以测定 PPDK 表达的开始， 并定量测定转化植物中 PPDK 过表达的程度。从 3 个月大植物的 K326 野生型和转化植物叶 1( 最老 ) 至 8( 嫩 ) 提取蛋白质， 并进行了针对 PPDK 的免疫印迹。
     参照图 7， 图中显示在 K326 烟草成熟叶中 PPDK 的过表达。根据免疫印迹计算出 PPDK 丰度。数据显示为零拷贝植物的 10 个生物重复的平均值和各 SAG12-PPDK 品系的 4 个 生物重复的平均值。误差棒表示 1SEM。将 SAG12-PPDK 品系以递增的 PPDK 丰度的顺序排 列。使用 ANOVA 检验基因型间的差异 (F ＝ 6.995， df ＝ 4， p ＝ 0.001)。与零拷贝植物显 著不同的品系是 G10(p ＝ 0.006)、 G8(p ＝ 0.003) 和 C10(p ＝ 0.000)。
     在野生型植物较老叶中， PPDK 丰度较高， 这就表明 PPDK 在烟草以及拟南芥衰老期 间天然被增量调节。在转化的 K326 植物中， 较老叶中的 PPDK 丰度也较高， 且比野生型植物 的高得多。在具有最高 PPDK 丰度的转化品系的较幼嫩叶中， PPDK 的丰度也较高。对零拷贝 植物 ( 阴性分离子 ) 和转化植物的 ‘成熟’ 叶中提取的蛋白质进行了免疫印迹。成熟叶是 收获期的叶， 并且是衰老晚期的叶。定量测定了 PPDK 丰度。与零拷贝植物相比， 所有 4 个
     独立的转化品系成熟叶中的 PPDK 丰度较高。对于 K326 烟草， 在衰老期间使用 SAG12 启动 子的 PPDK 过表达是成功的。实施例 6- 转化拟南芥植物的表型分析
     拟南芥植物生长的分析
     参 照 图 8， 图 中 清 楚 显 示， 鼠 耳 芥 中 PPDKgDNA 的 过 表 达 产 生 具 有 较 大 莲 座 叶 丛 的 植 物。 在 播 种 后 3、 5、 7 和 9 周， 给 野 生 型、 ΔPPDK 和 SAG12-PPDKgDNA 植 物 拍 照。 SAG12-PPDKgDNA 植物比野生型大。在 PPDK 植物和野生型植物之间不存在可辨别的差异。
     使用 Mettler Toledo AB104-S 天平测定莲座叶丛和繁殖组织的鲜质量， 精确到 0.1mg。从利用 Edwards Super Modulyo 冷冻干燥器冷冻干燥过夜的样品， 测定莲座叶丛组 织的干质量， 精确到 0.1mg。
     参照图 9， 图中显示第 9 周的繁殖组织质量。 观察到对 PPDK 的剂量反应， 其中 PPDK 丰度较高的品系具有较高的繁殖组织质量。 将总繁殖组织 ( 茎、 茎生叶、 花和长角果 ) 称重。 值为 3 个生物重复的平均值。误差棒表示 1SEM。将转基因 SAG12-PPDKgDNA 品系以 PPDK 丰度递增的顺序排列。应用 ANOVA 检验基因型间的差异 (F ＝ 8.062， df ＝ 6， p ＝ 0.001)。 所有 SAG12-PPDKgDNA 品系与野生型显著不同 (G9.4p ＝ 0.031， G5.4p ＝ 0.000， G19.2p ＝ 0.000， G12.3p ＝ 0.001， G16.1p ＝ 0.001)。具有较高 PPDK 丰度的品系趋于具有较高的繁 殖组织质量， 虽然这种趋势不是绝对的。 还计算出繁殖组织占植物总鲜质量的百分比， 但当 应用 ANOVA 检验时， 与野生型、 ΔPPDK 或 SAG12-PPDKgDNA 植物无显著差异 (F ＝ 0.544， df ＝ 6， p ＝ 0.767， 数据未显示 )。
     然而， 占植物总质量百分比的繁殖组织的比例不改变， 这就表明整体来看植物较 大， 营养组织和繁殖组织之间的资源分配未发生改变。还在 ΔPPDK 植物中测定了植物总的 鲜质量和繁殖组织质量， 并且与野生型无显著不同。 还测定了莲座叶丛干质量， 对于植物总 的鲜质量和繁殖组织质量， 发现与野生型相比， SAG12-PPDKgDNA 植物具有显著较高的质量。
     参 照 图 10， 图 中 显 示 播 种 后 自 第 3 周 到 第 9 周 野 生 型 和 SAG12-PPDgDNA 植 物 的植物总鲜质量 ( 莲座叶丛加繁殖组织 )。将数据表示为野生型的 3 个生物重复和 SAG12-PPDKgDNA 的 15 个生物重复 (5 个独立品系各 3 株植物 ) 的平均值。 误差棒表示 1SEM。 应用斯氏 t 检验 (student’ s t-test) 在各个时间点， 对野生型和 SAG12-PPDKgDNA 植物总质 量进行了比较。在第 9 周的 SAG12-PPDKgDNA 植物中， 莲座叶丛质量显著较高 (p ＝ 0.032)。
     由于 SAG12 启动子所致， 在第 5 周开始 PPDK 过表达前没有显著差异。所有 5 个独 立的 SAG12-PPDKgDNA 品系的莲座叶丛干质量都增加。至于繁殖组织质量， 观察到对 PPDK 丰度的剂量反应， 其中较高 PPDK 含量的品系具有较高的质量。还在 ΔPPDK 植物中测定了 莲座叶丛干质量， 与野生型植物没有显著不同。
     拟南芥叶表面积的测定
     通过采取单片成熟叶 ( 通过是第 10 叶 ) 样品， 如上所述测定叶质量和整个莲座叶 丛质量， 并对放在直尺旁的叶拍照， 来测定莲座叶丛的表面积。 应用 ImageJ 软件 (National Institutes of Health) 测量叶表面积， 并由此计算整个莲座叶丛的表面积。
     在 PPDK 过表达开始后， 在 SAG12-PPDKgDNA 植物中， 莲座叶丛表面积增加。尽管在 第六周和第七周， SAG12-PPDKgDNA 植物的表面积显著较大， 但在第 8 和 9 周时， 表面积与野 生型无显著不同。表面积的这种大的降低可能是由于与野生型相比 SAG12-PPDKgDNA 植物 中营养物再动员增加所致。ΔPPDK 植物的表面积与野生型植物无显著不同。
     叶绿素浓度的测定使用 CCM-200 手提式叶绿素仪 (Opti-Sciences)， 测定相对单位的叶绿素含量。
     拟南芥的荧光测定
     使用 Hansatech FMS2 荧光计测定了 FV/FM 比率。使用生产商提供的叶夹， 使叶在 测定前进行暗适应过夜。为了确定在 SAG12-PPDKgDNA 或 ΔPPDK 植物中衰老的开始相对于 野生型植物是否改变， 测定了 FV/FM 比率。FV/FM 是光系统 II 的量子效率估值， 当发生光 抑制时便下降。 其是衰老开始的有用的衡量值， 因为光合作用下降发生在衰老的早期， 在检 出叶绿素含量下降之前。在播种后 4 周 ( 当叶变大到足以测定 FV/FM 时 ) 到 9 周的时程 内测定了 FV/FM。在野生型、 SAG12-PPDKgDNA 和 ΔPPDK 植物中， 在第 7 周时 FV/FM 最大， 随后下降， 这就表明开始衰老的时机在所有 3 种基因型中是相同的。然而， 与野生型相比， SAG12-PPDKgDNA 植物中第 8 周的 FV/FM 显著较高， 这就表明在衰老晚期光合活性延长。
     氮含量
     使用 Edwards Super Modulyo 冷冻干燥器将用于氮分析的组织冷冻干燥。将拟南 芥叶组织 (25mg) 或烟草叶组织 (100mg) 包装在无氮称量纸 (Elementar Ahalysensysteme GmbH) 中。 利 用 快 速 N III 氮 分 析 仪 (Rapid N III Nitrogen Analyzer)(Elementar Analysensysteme GmbH)， 使 用 推 荐 的 设 置 测 定 氮 含 量 占 干 重 的 百 分 比。 将 天 冬 氨 酸 (Sigma-Aldrich) 用 作 标 准 品。 在 播 种 后 3-9 周 的 时 程 内， 测 定 了 拟 南 芥 野 生 型、 SAG12-PPDKgDNA 和 ΔPPDK 植物的叶氮含量。
     参照图 11， 图中显示第 7 周野生型、 ΔPPDK 和 SAG12-PPDKgDNA 植物叶的氮含 量。将数据表示为野生型和 ΔPPDK 的 8 个生物重复及 SAG12-PPDKgDNA 品系各 4 个生物 重复的平均值。误差棒为 1SEM。将 SAG12-PPDKgDNA 品系以 PPDK 丰度递增的顺序排列。 应用 ANOVA 检验基因型间的差异 (F ＝ 6.047， df ＝ 6， p ＝ 0.000)。ΔPPDK 植物和所有 的 SAG12-PPDKgDNA 品系与野生型显著不同 (ΔPPDK p ＝ 0.004， G9.4p ＝ 0.000， G5.4p ＝ 0.000， G19.2p ＝ 0.001， G12.3p ＝ 0.007， G16.1p ＝ 0.006)。
     与 野 生 型 相 比， 在 所 有 5 个 独 立 的 SAG12-PPDKgDNA 品 系 中， 自第 7 周后叶氮 素 显 著 较 低， 这 就 支 持 提 高 PPDK 丰 度 在 衰 老 期 间 可 提 高 氮 素 再 动 员 的 效 率 的 假 说。 SAG12-PPDKgDNA 植物中， PPDK 表达和活性在第 6 周达到峰值， 这就表明在 PPDK 丰度的升 高与叶氮素可测量的降低之间存在延时， 这可能归因于将蛋白质氨基酸转化成转运氨基酸 ( 天冬酰胺和谷氨酰胺 ) 并将其运输到叶外所耗费的时间。
     拟南芥种子的分析
     测定了野生型、 SAG12-PPDKgDNA 和 ΔPPDK 鼠耳芥植物种子中的单粒种子质量和 氮含量。
     参照图 12， 图中表示野生型、 ΔPPDK 和 SAG12-PPDK 植物的单粒种子的氮含量。 SAG12-PPDKgDNA 植物的种子氮含量有显著增加。 将数据表示为野生型和 ΔPPDK 的 8 个生物 重复及各 SAG12-PPDKgDNA 品系的 4 个生物重复的平均值。 误差棒为 1SEM。 SAG12-PPDKgDNA 品系以 PPDK 丰度递增的顺序排列。应用 ANOVA 检验基因型间的差异 (F ＝ 6.704， df ＝ 6， p ＝ 0.000)。与野生型显著不同的品系为 G19.2(p ＝ 0.000)、 G12.3(p ＝ 0.005) 和 G16.1(p ＝ 0.002)。具有较高 PPDK 丰度的品系趋于具有较高的种子氮质量。因此， 与野生型相比， 在所有 5 个独立的 SAG12-PPDKgDNA 品系中单粒种子质量增加， 并且观察到对 PPDK 丰度的 剂量反应， 其中 PPDK 丰度较高的植物具有较高的种子质量。还对从各植物收获的总的种子进行称重， 在野生型和 SAG12-PPDKgDNA 植物之间无显著差异， 因此增加 SAG12-PPDK 植物的 种子大小不会损害种子总收成。
     拟南芥叶组织的游离氨基酸含量
     在液氮下， 使用微型研杵 (Eppendorf)， 将叶组织 (100mg) 在 1.5ml 微量离心管中 研磨， 并加入 300μl 无菌去离子水。在 4℃下， 将样品以 13,000rpm 进行离心 5 分钟。按照 推荐的方案， 使用 Bio-Rad 蛋白质测定试剂 (Bio-Rad)， 通过 Bradford 测定法测定蛋白质浓 度 (Jones 等， 1989)。 按照推荐的方案， 使用 EZfaast 氨基酸样品测试试剂盒 (Phenomenex)， 制备用于氨基酸分析的样品。将样品重新悬浮于含 10mM 甲酸铵 (BDH 实验室供应 ) 的 50％ 无菌蒸馏水和 50％超级别甲醇 (Romil) 中。
     然后采用 Q Trap LC/MS/MS(Applied Biosystems/MDS SCIEX) 与 EZfaast 250x 3.0mm AAA-MS 柱 (Phenomenex) 以及将含 10mM 甲酸铵的 50 ％ (v/v) 无菌蒸馏水溶液和 50％ (v/v) 超级别甲醇用作流动相， 对样品进行液相色谱 - 质谱法 (LC-MS)。 按阳离子模式 与 EZfaast 试剂盒 (Phemonenex) 中推荐的条件使用质谱仪。运用所供应的 Analyst 软件 (Applied Biosystems/MDS SCIEX) 对结果进行分析。
     在自播种后第 3 周到第 9 周的时程内， 在野生型、 SAG12-PPDKgDNA 和 ΔPPDK 拟南 芥植物叶中测定了总游离氨基酸含量。
     参照图 13， 图中显示过表达 PPDK 的拟南芥叶中的总游离氨基酸含量增加。 将数据 表示为野生型和 ΔPPDK 的 6 个生物重复及各 SAG12-PPDKgDNA 品系的 4 个生物重复的平均 值。误差棒为 1SEM。将 SAG12-PPDKgDNA 品系以 PPDK 丰度递增的顺序排列。与野生型相 比， 所有 5 个 SAG12-PPDKgDNA 品系具有较高的总氨基酸含量， 但变化大， 当应用 ANOVA 检验 时差异不显著 (F ＝ 1.314， df ＝ 6， p ＝ 0.289)。
     在 第 7 周， 即叶氮含量变得显著低于野生型的氮含量的同一时间和 SAG12-PPDKgDNA 植物叶中 PPDK 丰度最高后的一周， 与野生型植物相比， SAG12-PPDKgDNA 植物中的总游离氨基酸含量显著较高。在所有 5 个独立的 SAG12-PPDKgDNA 品系中出现增 加， 尽管变化大， 且各品系和野生型之间的差异不显著。这种增加表明在该时间点上， 氨基 酸的产生以比可发生的氨基酸输出大的速率进行， 因此氨基酸在叶中蓄积。 与野生型相比， ΔPPDK 植物中的总游离氨基酸没有明显不同。
     还测定了转运氨基酸 ( 谷氨酰胺和天冬酰胺 )， 用占总游离氨基酸的百分比表示。 在第 7 周和第 8 周， SAG12-PPDKgDNA 植物中的转运氨基酸含量显著高于野生型植物的转运 氨基酸含量。 增加出现在所有 5 个独立的 SAG12-PPDKgDNA 品系中， 尽管变化大， 且各品系和 野生型之间的差异并不显著。因此， 除 SAG12-PPDKgDNA 植物中的总游离氨基酸含量增加以 外， 转运氨基酸的含量还与总量成比例地增加。这再次表明， 在这些时间点上， 谷氨酰胺和 天冬酰胺的产生超过叶的输出能力， 这就支持在衰老期间升高的 PPDK 丰度提高导致形成 转运氨基酸的氨基酸互变效率的假说。在 ΔPPDK 植物中， 未观察到与野生型有显著差异。
     实施例 7- 转化烟草植物的表型分析
     烟草叶氮含量的分析
     测定了阴性分离子和 SAG12-PPDK K326 烟草的成熟叶中的叶氮含量。成熟叶是已 准备收获用于烟草生产的叶。对于 4 个独立 SAG12-PPDK 品系中的一些， SAG12-PPDK 植物 的叶氮含量低于阴性分离子植物的叶氮含量。将成熟叶用来测定叶氮含量， 因为这些叶处于可以收获用于烟草生产的阶段。 然而， 成熟叶中叶氮含量的差异很小的事实并不一定意味着氮素再动员不会增加。在 SAG12-PPDKgDNA 拟南芥植物开始衰老的时程中， 叶氮含量显著低于野生型， 但到衰老后期， 差异小得多。 因此， 烟草中叶氮含量的差异有可能出现在衰老较早期， 并且有可能到测定叶 氮含量时该差异缩小。
     烟草叶氨基酸含量的分析
     测定了 K326 烟草成熟叶的氨基酸含量， 该成熟叶通过剥离和避光于 30℃温育 3 天 来诱导衰老。这就允许对在诱导衰老之前和之后的同一叶之间进行比较。通过叶剥离和避 光温育对衰老的诱导显示基因表达图式与年龄相关性衰老的最大重叠。
     在 K326 烟草中， 在诱导阴性分离子植物和 SAG12-PPDK 植物衰老后总氨基酸含量 增加。将增加计算为诱导衰老前总氨基酸含量的百分比。对于 SAG12-PPDK 品系 C10， 增加 显著小于阴性分离子植物的增加， 但其它 SAG12-PPDK 品系与阴性分离子植物都没有显著 性差异。因此在诱导暗诱导衰老后， 在衰老期间 PPDK 的过表达似乎对总氨基酸含量几乎无 影响。在诱导衰老后， K326 烟草中的转运氨基酸 ( 谷氨酰胺和天冬酰胺 ) 含量也增加， 但 这种增加发生在阴性分离子和 SAG12-PPDK 品系两者中， 而且在诱导衰老后， 基因型之间在 增加程度上没有显著差异。
     烟草种子的分析
     测定了 K326 烟草的单粒种子质量， 对于所有 4 个独立的转基因品系， 与阴性分离 子植物相比， 单粒种子质量在 SAG12-PPDKgDNA 和 SAG12-PPDKcDNA 植物中显著较高。还测 定每个种子荚的种子质量， 并且在 SAG12-PPDKgDNA 和 SAG12-PPDKcDNA 植物中显著较高。
     参照图 14， 图中显示在 SAG12-PPDK K326 烟草中种子大小增加。通过给约 1000 粒种子拍照、 计数和称重， 来计算 K326 零拷贝 ( 对于 SAG12-PPDK 插入片段为阴性分离子的 植物 ) 和 SAG12-PPDK 植物的每粒种子质量。将数据表示为零拷贝植物的 10 个生物重复的 平均值和各 SAG12-PPDK 品系的 4 个生物重复的平均值。误差棒为 1SEM。SAG12-PPDK 品系 以成熟叶中递增的 PPDK 丰度的顺序排列。SAG12-PPDK 植物的种子质量较大。应用 ANOVA 检验基因型间的差异 (F ＝ 4.870， df ＝ 4， p ＝ 0.006)。与零拷贝植物显著不同的品系是 G8(p ＝ 0.005) 和 C10(p ＝ 0.002)。
     对于所有 4 个独立的 SAG12-PPDKgDNA 和 SAG12-PPDKcDNA 品系， 种子的百分比氮 含量较高， 但是差异并不显著。然而， 在 SAG12-PPDKgDNA 和 SAG12-PPDKcDNA 植物中， 每粒 种子的氮质量显著较高。
     参照图 15， 图中清楚表明， SAG12-PPDK K326 烟草的种子氮含量增加。从种子质量 和种子氮含量数据计算 K326 零拷贝和 SAG12-PPDK 植物单粒种子的氮质量。将数据表示为 零拷贝植物的 10 个生物重复的平均值和各 SAG12-PPDK 品系的 4 个生物重复的平均值。误 差棒为 1SEM。SAG12-PPDK 品系以成熟叶中递增的 PPDK 丰度的顺序排列。SAG12-PPDK 植物 中单粒种子的氮质量较高。应用 ANOVA 检验基因型之间的差异 (F ＝ 7.807， df ＝ 4， p＝ 0.001)。与零拷贝植物显著不同的品系是 G8(p ＝ 0.000) 和 C10(p ＝ 0.000)。
     这就表明 SAG12-PPDKgDNA 和 SAG12-PPDKcDNA K326 烟草植物中供应给种子的氮 增加。在 K326 植物中， 观察到对 PPDK 的剂量反应。成熟叶中 PPDK 丰度较高的植物具有较 高的种子单粒种子质量、 较高的种子质量 / 种子荚和增加的单粒种子的氮质量。这强有力地支持 PPDK 的氮素再动员中的作用， 因为 PPDK 含量增加似乎与供应给种子的氮的增加有 关。
     总的来说， 在 SAG12-PPDK K326 烟草中单粒种子质量 ( 图 14) 和氮质量 / 种子 ( 图 15) 两者均增加， 这就表明氮素再动员通过 PPDK 的过表达而增加。因此， 对于拟南芥 SAG12-PPDKgDNA 植物， 可预期渐老叶中转运氨基酸含量增加。然而， 在拟南芥中测定了天 然衰老叶的氨基酸含量， 而在烟草中， 衰老是通过叶剥离和避光温育而诱导的。 由于暗诱导 和年龄相关性衰老发生的过程不同， 烟草叶中发生的过程未必与拟南芥叶中发生的过程类 似。
     实施例 8- 过表达 PCK 和 PPDK 的拟南芥植物的产生
     通过使 PCK 的编码区和基因组克隆与 BNP1380000001 二元载体 ( 如实施例 1 和 2 中所述将其转化到鼠耳芥中 ) 内的衰老相关基因 12(SAG12) 启动子融合， 来实现拟南芥 PCK(At4g37870.1) 在衰老期间的过表达。
     如实施例 1 有关 PPDK 中所述， 采用 PCR， 先从拟南芥 cDNA 中分离出 At PCK 编码序 列， 并从拟南芥基因组 DNA 中分离出基因组序列。另一方面， 设计出 PCR 引物以促进基因随 后与 BNP1380000001 载体连接 ( 参见图 3a)， 所述 PCR 引物包括鼠耳芥 (At)PCK 基因的起始 密码子和终止密码子， 且亦如表 1 所示， 在正向引物 AtPCK-Xba IFOR(SEQ ID No.25) 中包 括 XbaI 限制位点， 而在反应向引物 AtPCK-SacIREV(SEQ ID No.26) 中包括 SacI 限制位点。 按照实施例 1， 制备用于各 PCR 反应的 cDNA 和基因组 DNA 模板。PCR 反应混合物 包含 1x HF 缓冲液 (NEB)、 2mM 氯化镁 (NEB)、 0.5mM dNTPs(Bioline)、 100ng 模板 (cDNA 或 基因组 DNA)、 0.5μM 各引物和 1 单位 Phusion 高保真 DNA 聚合酶 (NEB)。采用 Techne 热 循环仪如下进行热循环 ： 98℃ 30 秒钟的起始变性步骤， 接着 35 个以下循环 ： 98℃ 10 秒钟、 60℃ 30 秒钟以及对于编码区 72℃ 2 分 30 秒而对于基因组克隆 4 分 30 秒的延伸时间。最 后步骤包括 72℃ 10 分钟的最后延伸。
     这些 PCR 产物产生编码序列 (cDNA) 的 2kb 条带和 PCK 基因组序列的 3.5kb 条带， 并进行了 PEG 沉淀。与实施例 1 对 PPDK 所述一样， 按照推荐的方案， 将扩增的 DNA 连接 ( 平端 ) 至 pCR4Blunt-TOPO 载体 (Invitrogen) 中。然后将质粒转化至文库效率 (Library Efficiency)DH5α 大肠杆菌细胞中。卡那霉素 (50μg ml-1) 用作选择性抗生素。对于编 码区和基因组克隆两者， 使用引物 AtPCK-Xba IFOR(SEQ ID No.25) 和 AtPCK-Sac IREV(SEQ ID No.26) 两者， 通过菌落 PCR 选出阳性菌落。使阳性菌落在 37℃振荡培养箱中在 5ml 含 -1 有 50μg ml 卡那霉素的 LB 培养液中生长过夜。
     使用 QIAprep Spin Miniprep 试剂盒 (Qiagen Ltd)， 分离质粒 DNA， 通过依次的限 制酶切消化对插入片段大小进行分析。这通过用 10 单位 XbaI 和 1x XbaI 缓冲液于 37℃ 消化 1μg DNA 2 小时， 然后加入 10 单位 SacI 和 1x SacI 缓冲液于 37℃过夜来进行。使 用 AtPCK-XbaIFOR/AtPCK-Sac IREV， 对含有正确插入片段的质粒 DNA 进行了测序。应用 BioEdit 分析序列， 并应用 BLASTX 验证扩增的 AtPCK 编码序列和基因组序列。
     为了使 AtPCK 编码区和基因组克隆与图 3a 所示的 pBNP 载体连接， 使用分别代表 -1 两种质粒的大肠杆菌菌落接种 25ml 含有 50μg ml 卡那霉素的 LB 培养液。将培养物于
     37℃振荡过夜后， 使用 QIAfilter 质粒 midi 试剂盒 (Qiagen Ltd) 纯化质粒 DNA。以相同方 式但从 100ml 含有 50μg ml-1 卡那霉素的培养物中纯化 pBNP 载体。 对所有纯化的质粒 DNA进行与上述相同的顺序酶消化。 对于含有编码区和基因组克隆的质粒， 消化 3μg DNA， 对于 pBNP 载体， 消化 1μg DNA。通过结晶紫凝胶电泳分离样品， 使用 Qiaquick 凝胶提取试剂盒 (Qiagen Ltd) 纯化产物。14.4kb pBNP 载体产物用碱性磷酸酶处理以防止自身连接， 利用 XbaI/SacI 消化， 使编码区和基因组克隆插入片段与 pBNP 载体连接。将文库效率 DH5α 大 肠杆菌细胞用 2μl 连接反应物转化， 使用 AtPCK-Xba IFOR 和 AtPCK-Sac IREV 通过 PCR 筛 选阳性菌落。
     使用 QIAprep Spin Miniprep 试剂盒 (Qiagen Ltd)， 从含有所需插入片段的菌落 中提取质粒 DNA， 将 DNA 随后用 10 单位 XbaI、 15 单位 SacI 和 1x XbaI 缓冲液于 37℃消化 2 小时。选出 pBNP 载体中的编码序列和基因组序列插入片段 ( 其具有正确的预期限制性内 切酶消化谱 ) 的各两个分离菌落， 然后使用 BNP-SAG12FWD 引物 (SEQ ID No.9) 测序。应用 BioEdit 程序对序列进行分析。所产生的构建体称为 pALBNP1( 编码序列 ) 和 pALBNP2( 基 因组序列 )， 如图 3b 所示。
     产生了 5 个纯合的单一插入片段品系， 并通过如实施例 3 所述的免疫印迹法， 使 用 PCK 特异性抗体证实了 PCK 过表达。使用针对 PCK 氨基酸序列设计的合成肽， 在兔中 产生多克隆抗血清。序列为化学合成的 (i)DEHCWTETGVSNIEG(SEQ ID No.27)， 和 (ii) CVDLSREKEPDIWNA(SEQ ID No.28)， 然后与匙孔血蓝蛋白偶联， 随后共同注射到兔中。使用 抗体得到的结果见图 16， 图中显示转化植物具有高水平的 PCK 蛋白。
     通过将单一 SAG12-PCK 转化子 (3)1 和 (19)4 与强 SAG12-PPDK 过表达品系杂交， 产生 SAG12-PCK-PPDK 细胞系。对具有高水平的 PCK 和 PPDK 两者的植物的分析显示莲座叶 丛质量提高， 如图 17 所示。
     最后， 虽然本发明人不希望受假设的束缚， 但图 18 表示推测的生化途径， 说明了 PCK 和 PPDK 可如何影响氮素再动员。
     PCK/PPDK 双重构建体
     本发明人观察到， 当转化到植物中时， 图 3 所示 PCK 和 PPDK 单一构建体引起衰老 叶的氮素再动员速度提高， 而且当这些酶在衰老叶中过表达时， 营养性植物生长的量也提 高 ( 这相当于作物产量提高 )。 本发明人因此决定制备两种双重构建体， 其中将编码 PCK 和 PPDK 的基因两者插入 SAG12 启动子控制下的 pBNP130000001 中。
     利用 XbaI/SacI 消化， 通过连接编码 BNP-PPDKgDNA 的 PPDK 编码 gDNA 片段下游 ( 即 3’ 端 ) 的 PCK 的 gDNA， 制备了第一种双重构建体。因此， 质粒中的 SAG12 启动子负责 PPDK 基因和 PCK 基因两者的表达。
     叶衰老是植物发育的一个阶段， 期间， 细胞在细胞死亡前经历独特的代谢和结构 变化。生理学和遗传学研究表明衰老是一个被高度调节的过程。叶经过衰老的进程因由叶 绿体解体所造成的叶绿素丧失并随之变黄而十分明显。例如， 可通过溶剂提取和分光光度 测定或通过叶绿素含量测定仪， 测量这个发育阶段特有的下降的叶叶绿素水平。与对同一 植物 ( 优选生长在恒定条件下 ) 所记录的较早的叶叶绿素水平相比， 叶叶绿素水平下降表 明衰老。
     分子研究表明， 衰老与基因表达的改变有关。编码参与光合作用的蛋白质的 mRNA 水平在衰老期间下降， 而编码被认为参与衰老的蛋白质的基因的 mRNA 水平升高。衰老是一 个极有组织的过程， 受称为衰老相关基因 (SAG) 的基因调节。叶衰老包括蛋白质、 核酸和膜 的降解， 以及由这种降解所致的营养物随后转运到植物的其它部位， 例如发育中的种子、 叶 或贮藏器官。植物衰老的一个问题是衰老叶中存在的许多有用的矿物质和营养物将保留 在叶中， 随着叶死亡， 实际上会损失掉。例如， 衰老叶中存在的氮 ( 可呈氨基酸上的氨基形 式 )， 如果不离开垂死的叶， 则将会浪费掉。
     因此， 在植物中， 尤其在它们变衰老时， 加强氮素再动员在作物生产中可具有重要 应用。首先， 从叶中再动员起来的氮可转运到较幼嫩的叶以及发育中的种子中。因此， 氮从 衰老叶中离去的效率的提高可潜在地增加植物种子和较幼嫩部分的氮供应， 从而提高作物 产量和氮利用效率。在世界人口增加但作物产量的增加不足以满足需要时， 这显然是有价 值的目标。 一种潜在的目标作物是欧洲油菜 (Brassica napus)( 油料种子油菜 )， 其由于营 养组织的氮素再动员差而造成氮效率低下。另一种目标作物是小麦， 因为增加籽粒蛋白含 量的潜在益处非常大。 籽粒蛋白含量不仅仅影响小麦的营养价值， 而且还决定籽粒使用率， 并由此决定市场价值。例如， 籽粒蛋白含量增加引起面包体积加大。同样， 在烟草工业中提 高氮素再动员的能力可能十分有用， 因为已知烟草叶中残留的氮有助于形成亚硝胺类。
     酶 烯 醇 丙 酮 酸 磷 酸 羧 激 酶 (PEPCK 或 PCK)[EC 4.1.1.49] 和 丙 酮 酸 正 磷 酸 双 激酶 (PPDK)[EC 2.7.9.1] 是已知的。PPDK 存在于原核生物和真核生物两者中， 就序列 和三级结构而言， 在细菌和高等植物之间是保守的 (Pocalyko 等， 1990， Biochemistry， 29， 10757-10765)。 该 酶 在 下 列 反 应 中 催 化 丙 酮 酸 的 可 逆 磷 酸 化 形 成 磷 酸 烯 醇 丙 酮 酸 (PEP)(Carroll 等， 1990， Federation of European Biochemical Societies， 274， 178-180 ； Hatch 和 Slack， 1968， Biochemical Journal， 106， 141-146) ： 丙酮酸 +Pi+ATP ＝ PEP+PPi+AMP。在 C3 和 C4 植物两者中， PPDK 基因具有独特的结构， 其中由同一基因产生两 种转录物。 较长的转录物编码叶绿体蛋白质， 其第一外显子编码叶绿体转运肽， 而较短的转
     录物由较长转录物的第一内含子内的独立启动子转录， 因此缺乏编码叶绿体转运肽的第一 外显子。这种较短的转录物产生 PPDK 的胞质同工型。已在玉米、 水稻、 C3 和 C4 黄花菊属 (Flaveria) 品种和鼠耳芥 (Arabidopsis thaliana) 中报道了这种基因结构。
     烯醇丙酮酸磷酸羧激酶 (PCK) 在下列反应中催化 ADP、 二氧化碳和磷酸烯醇丙酮 酸之间形成 ATP 和草酰乙酸的可逆反应 ： 草酰乙酸 +ATP ＝ PEP+ADP+CO2。研究表明， PCK 存 在于多种植物组织细胞的细胞溶胶中。这些组织包括发育中的种子、 藻丝和根。在植物中， PCK 出现在其中含氮化合物代谢高的组织中。
     本发明人构建了多个遗传构建体， 其中将编码酶 PCK 和 / 或 PPDK 的基因单独或共 同置于启动子的控制下， 以便测定这些基因的过表达对衰老叶中的氮素再动员有哪些作用 ( 如果有的话 )。
     根据本发明的第一个方面， 提供包含与至少一个编码序列有效连接的衰老特异性 启动子的遗传构建体， 所述编码序列编码至少一种具有烯醇丙酮酸磷酸羧激酶 (PCK) 活性 和 / 或丙酮酸正磷酸双激酶 (PPDK) 活性的多肽。
     根据本发明的第二个方面， 提供包含与至少一个编码序列有效连接的启动子的遗 传构建体， 所述编码序列编码至少一种具有烯醇丙酮酸磷酸羧激酶 (PCK) 活性和丙酮酸正 磷酸双激酶 (PPDK) 活性的多肽。 本发明人认为在衰老期间， PCK 和 PPDK 两种酶可在叶的氮素再动员期间各种氨基 酸的互变中起作用。虽然本发明人不希望受假设的束缚， 但是在图 18 中举例说明了说明 PCK 和 PPDK 可如何影响氮素再动员的推测的生化途径。 因此， 本发明人认为在衰老期间， 单 独或同时刺激植物内的这两种酶的过表达可在氮素再动员中起作用。
     作为他们研究的结果， 本发明人预料不到地发现， 编码 PCK 和 / 或 PPDK 的本发明 的构建体， 引起衰老叶氮素再动员速度的提高。 本发明人假设， 氮可以氨基酸的形式从衰老 叶移送到植物的较幼嫩部分， 例如植物种子。此外， 本发明人还发现， 当这些酶在衰老叶中 过表达时， 营养性植物生长的量提高 ( 这相当于作物产量提高 )。因此本发明人认为， 本发 明的构建体可用于制备转基因植物， 所述转基因植物可能能够显示衰老叶的氮素再动员速 度提高和 / 或生长速度提高。
     第一个方面或第二个方面的遗传构建体中的启动子可能能够诱导 RNA 聚合酶与 编码具有 PCK 和 / 或 PPDK 活性的至少一种多肽的至少一个编码区结合并开始转录。
     存在于第二个方面的构建体中的启动子可以是组成型、 非组成型或组织特异性 的。 合适启动子的实例包括花椰菜花叶病毒 35S 启动子 ( 完整启动子或截短启动子 )、 核酮 糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶启动子、 豌豆质体蓝素启动子、 胭脂氨酸合成酶启动子、 叶绿素 r/ b 结合启动子、 高分子量麦谷蛋白启动子、 α， β- 麦醇溶蛋白启动子、 大麦醇溶蛋白启动子 或 patatin 启动子。
     存在于第二个方面的构建体中的启动子可以是衰老特异性启动子。
     “衰老特异性启动子” (SAG) 可以是与控制衰老相关基因的表达有关的启动子。因 此， 该启动子可基本上唯一地在渐老组织中限制与之有效连接的编码序列 ( 即基因 ) 的表 达。 因此， 衰老特异性启动子可以是这样的启动子， 其能够在植物组织中以发育调节的方式 优先促进基因表达， 使得 3’ 蛋白质编码区的表达基本上只在植物组织正在经历衰老时发 生。应理解的是， 衰老趋于发生在植物较老的部分 ( 例如较老的叶 )， 而不发生在植物较幼
     作为他们研究的结果， 本发明人预料不到地发现， 编码 PCK 和 / 或 PPDK 的本发明 的构建体， 引起衰老叶氮素再动员速度的提高。 本发明人假设， 氮可以氨基酸的形式从衰老 叶移送到植物的较幼嫩部分， 例如植物种子。此外， 本发明人还发现， 当这些酶在衰老叶中 过表达时， 营养性植物生长的量提高 ( 这相当于作物产量提高 )。因此本发明人认为， 本发 明的构建体可用于制备转基因植物， 所述转基因植物可能能够显示衰老叶的氮素再动员速 度提高和 / 或生长速度提高。
     第一个方面或第二个方面的遗传构建体中的启动子可能能够诱导 RNA 聚合酶与 编码具有 PCK 和 / 或 PPDK 活性的至少一种多肽的至少一个编码区结合并开始转录。
     存在于第二个方面的构建体中的启动子可以是组成型、 非组成型或组织特异性 的。 合适启动子的实例包括花椰菜花叶病毒 35S 启动子 ( 完整启动子或截短启动子 )、 核酮 糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶启动子、 豌豆质体蓝素启动子、 胭脂氨酸合成酶启动子、 叶绿素 r/ b 结合启动子、 高分子量麦谷蛋白启动子、 α， β- 麦醇溶蛋白启动子、 大麦醇溶蛋白启动子 或 patatin 启动子。
     存在于第二个方面的构建体中的启动子可以是衰老特异性启动子。
     “衰老特异性启动子” (SAG) 可以是与控制衰老相关基因的表达有关的启动子。因 此， 该启动子可基本上唯一地在渐老组织中限制与之有效连接的编码序列 ( 即基因 ) 的表 达。 因此， 衰老特异性启动子可以是这样的启动子， 其能够在植物组织中以发育调节的方式 优先促进基因表达， 使得 3’ 蛋白质编码区的表达基本上只在植物组织正在经历衰老时发 生。应理解的是， 衰老趋于发生在植物较老的部分 ( 例如较老的叶 )， 而不发生在植物较幼
     嫩的部分， 例如种子。
     已知表达多种衰老相关基因的植物的一个实例是拟南芥 (Arabidopsis)。因 此， 第一个方面或第二个方面的构建体中的启动子可从拟南芥的衰老相关基因中分离出。 Gepstein 等人 (The Plant Journal， 2003， 36， 629-642) 使用拟南芥作为模型对 SAG 及其启 动子进行了详细研究。遗传构建体可包含得自该论文所公开的任何 SAG 的启动子。例如， 合适的启动子可选自 SAG12、 SAG13、 SAG101、 SAG21 和 SAG18 或者其功能变体或功能片段。
     优选的启动子是 SAG12 和 SAG13 启动子。 在一个实施方案中， 启动子是技术人员已 知的 SAG12 启动子或者其功能变体或片段 (Gan 和 Amasino， 1997， Plant Physiology， 113 ： 313-319)。编码 SAG12 启动子的 DNA 序列在本文中称为 SEQ ID No.16， 见下 ：
     TCGAGACCCGATTGTTATTTTTAGACTGAGACAAAAAAGTAGAATCGTTGATTGTTAAAATTTA
     AAATTAGTTTCATTACGTTTCGATAAAAAAATGATTAGTTTATCATAGCTTAATTATAGCATTG
     ATTTCTAAATTTGTTTTTTGACCACCCTTTTTTCTCTCTTTGGTGTTTTCTTAACATTAGAAGA
     ACCCATAACAATGTACGTTCAAATTAATTAAAAACAATATTTCCAAGTTTTATATACGAAACTT
     GTTTTTTTTAATGAAAACAGTTGAATAGTTGATTATGAATTAGTTAGATCAATACTCAATATAT
     GATCAATGATGTATATATATGAACTCAGTTGTTATACAAGAAATGAAAATGCTATTTAAATACA
     GATCATGAAGTGTTAAAAAGTGTCAGAATATGACATGAAGCGTTTTGTCCTACCGGGTATTCGA GTTATAGGTTTGGATCTCTCAAGAATATTTTGGGCCATACTAGTTATATTTGGGCTTAAGCGTT TTGCAAAGAGACGAGGAAGAAAGATTGGGTCAAGTTAACAAAACAGAGACACTCGTATTAGTTG GTACTTTGGTAGCAAGTCGATTTATTTGCCAGTAAAAACTTGGTACACAACTGACAACTCGTAT CGTTATTAGTTTGTACTTGGTACCTTTGGTTCAAGAAAAAGTTGATATAGTTAAATCAGTTGTG TTCATGAGGTGATTGTGATTTAATTTGTTGACTAGGGCGATTCCTTCACATCACAATAACAAAG TTTTATAGATTTTTTTTTTATAACATTTTTGCCACGCTTCGTAAAGTTTGGTATTTACACCGCA TTTTTCCCTGTACAAGAATTCATATATTATTTATTTATATACTCCAGTTGACAATTATAAGTTT ATAACGTTTTTACAATTATTTAAATACCATGTGAAGATCCAAGAATATGTCTTACTTCTTCTTT GTGTAAGAAAACTAACTATATCACTATAATAAAATAATTCTAATCATTATATTTGTAAATATGC AGTTATTTGTCAATTTTGAATTTAGTATTTTAGACGTTATCACTTCAGCCAAATATGATTTGGA TTTAAGTCCAAAATGCAATTTCGTACGTATCCCTCTTGTCGTCTAATGATTATTTCAATATTTC TTATATTATCCCTAACTACAGAGCTACATTTATATTGTATTCTAATGACAGGGAAACCTTCATA GAGATTCAGATAGATGAAATTGGTGGGAAACATCATTGAACAGGAAACTTTTAGCAAATCATAT CGATTTATCTACAAAAGAATACGTAGCGTAATGAAGTCCACTTGTTGTGAATGACTATGATTTG ATCAAATTAGTTAATTTTGTCGAATCATTTTTCTTTTTGATTTGATTAAGCTTTTAACTTGCAC GAATGGTTCTCTTGTGAATAAACAGAATCTTTGAATTCAAACTATTTGATTAGTGAAAAGACAA AAGAAGATTCCTTGTTTTTATGTGATTAGTGATTTTGATGCATGAAAGGTACCTACGTACTACA AGAAAAATAAACATGTACGTAACTACGTATCAGCATGTAAAAGTATTTTTTTCCAAATAATTTA TACTCATGATAGATTTTTTTTTTTTGAAATGTCAATTAAAAATGCTTTCTTAAATATTAATTTT AATTAATTAAATAAGGAAATATATTTATGCAAAACATCATCAACACATATCCAACTTCGAAAAT CTCTATAGTACACAAGTAGAGAAATTAAATTTTACTAGATACAAACTTCCTAATCATCAAATAT AAATGTTTACAAAACTAATTAAACCCACCACTAAAATTAACTAAAAATCCGAGCAAAGTGAGTG AACAAGACTTGATTTCAGGTTGATGTAGGACTAAAATGACTACGTATCAAACATCAACGATCATTTAGTTATGTATGAATGAATGTAGTCATTACTTGTAAAACAAAAATGCTTTGATTTGGATCAAT
     CACTTCATGTGAACATTAGCAATTACATCAACCTTATTTTCACTATAAAACCCCATCTCAGTAC
     CCTTCTGAAGTAATCAAATTAAGAGCAAAAGTCATTTAACTTAGG
     SEQ ID NO ： 16
     因此， 本发明构建体中的启动子可包含基本上如 SEQ ID No.16 所示的核苷酸序列 或者其功能变体或功能片段。SAG12 启动子序列可获自鼠耳芥， 参见 US 5,689,042。这个 启动子序列可存在于本发明的每个遗传构建体中， 如图 3 所示。在启动子是 SAG12 的实施 方案中， 应理解的是， 启动子可包含 SEQ ID No ： 16 的碱基 1-2093 中的每一个。然而， 启动 子的功能变体或功能片段也可用于本发明的遗传构建体。
     “启动子的功能变体或功能片段” 可以是启动子的衍生物或部分， 其在功能上足以 启动与之有效连接的任何编码区的表达。例如， 在启动子是以 SAG12 为基础的实施方案中， 技术人员应了解的是可对 SEQ ID No ： 16 进行修饰， 或者可能只需要 SAG12 启动子的部分， 使之仍可启动构建体的基因表达。
     可通过评价转录酶是否与推定的启动子区结合， 然后引起编码区转录成具有 PCK 和 / 或 PPDK 活性的多肽， 来容易地鉴定启动子的功能变体和功能片段。 或者， 可通过在与编 码区结合时对启动子进行诱变， 并评价是否可产生基因表达， 来检测这类功能变体和片段。 在衰老期间， 第一个方面的遗传构建体可能能够引起至少一种具有 PCK 活性和 / 或 PPDK 活性的多肽的表达。因此， 遗传构建体可包含至少一个编码序列， 其编码 (i) 烯醇 丙酮酸磷酸羧激酶 (PCK) 或者其功能变体或片段， 和 / 或 (ii) 丙酮酸正磷酸双激酶 (PPDK) 或者其功能变体或片段。如实施例中所述， 本发明人开发出以具有 PCK 和 / 或 PPDK 活性的 多肽为基础的一系列遗传构建体， 这些遗传构建体示于图 3。
     在第一个方面的遗传构建体的第一个实施方案中， 启动子可诱导编码具有 PCK 活 性的多肽的编码序列的表达。这在本文中称为 “PCK 构建体” ， 见图 3。因此， 在第一个实施 方案中， 遗传构建体可包含衰老特异性启动子和编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶 (PCK) 或者其 功能变体或片段的编码序列。遗传构建体可不编码具有 PPDK 活性的多肽。
     在第一个方面的构建体的第二个实施方案中， 启动子可诱导编码具有 PPDK 活性 的多肽的编码序列的表达。这在本文中称为 “PPDK 构建体” ， 见图 3。在第二个实施方案中， 遗传构建体可包含衰老特异性启动子和编码丙酮酸正磷酸双激酶 (PPDK) 或者其功能变体 或片段的编码序列。遗传构建体可不编码具有 PCK 活性的多肽。
     在第一个方面的构建体的第三个实施方案中， 启动子可诱导编码既具有 PCK 活性 又具有 PPDK 活性的多肽的单一编码序列的表达。 这称为 “PCK/PPDK 构建体 1” 。 在第三个实 施方案中， 遗传构建体可包含衰老特异性启动子和编码 (i) 烯醇丙酮酸磷酸羧激酶 (PCK) 或者其功能变体或片段以及 (ii) 丙酮酸正磷酸双激酶 (PPDK) 或者其功能变体或片段的编 码序列。第三个实施方案的构建体可编码具有双重活性 ( 即 PCK 和 PPDK 酶促活性两者 ) 的单一转录物。PCK 编码区可位于 PPDK 编码区的 3’ 侧。然而， 优选 PCK 编码区位于 PPDK 编码区的 5’ 侧。
     在第一个方面的构建体的第四个实施方案中， 启动子可诱导以下序列的表达 ： (i) 编码具有 PCK 活性的第一多肽的第一编码序列， 和 (ii) 编码具有 PPDK 活性的第二多肽的 第二编码序列。这称为 “PCK/PPDK 构建体 2” 。因此， 在第四个实施方案中， 遗传构建体可包
     含至少一个衰老特异性启动子和 (i) 编码 PCK 或者其功能变体或片段的第一编码序列， 以 及 (ii) 编码 PPDK 或者其功能变体或片段的第二编码序列， 即编码两种转录物， 一种酶一种 转录物。
     如实施例 6 中所述， 本发明人发现在宿主细胞中过表达 PCK 或 PPDK( 例如通过用 “PCK 构建体” 或 “PPDK 构建体” 转化 ) 引起在衰老叶中氮素再动员加强。此外， 他们发现 PCK 和 PPDK 单一构建体导致营养生长增加。
     如实施例 8 中所述， 本发明人发现在宿主细胞中同时过表达 PCK 和 PPDK 两者 ( 例 如通过用 “PCK 构建体” 和 “PPDK 构建体” 两者转化 ) 在诱导衰老叶中的氮素再动员方面出 乎意料地有效。因此， 氮可被转运到衰老叶以外 ( 例如作为转运氨基酸 )。合适的转运氨基 酸可以是谷氨酰胺和 / 或天冬酰胺。此外， 在衰老期间同时过表达 PCK 和 PPDK 还可提高生 长速度， 这可导致营养生长增加。因此， 第一个方面的构建体可包含编码 PCK 和 PPDK 两者 或者其功能变体或片段的编码序列。
     应理解的是， 第二个方面的构建体包含编码 PCK 和 PPDK 两者或者其功能变体或片 段的编码序列。可作为具有双重活性的单一多肽， 或作为两个多肽， 一个具有 PCK 活性， 另 一个具有 PPDK 活性， 来编码两种酶。
     烯醇丙酮酸磷酸羧激酶 (PCK) 或者其功能变体或片段和丙酮酸正磷酸双激酶 (PPDK) 或者其功能变体或片段各自可来源于任何合适的来源， 例如植物。每种酶的编 码序列可来源于合适的植物源， 例如来自拟南芥。因此， 编码具有 PCK 活性的多肽的编 码序列可来源于拟南芥。此外， 编码具有 PPDK 活性的多肽的编码序列可来源于拟南芥 属 (Arabidopsis spp.)、 玉蜀黍属 (Zea spp.)、 黄花菊属 (Flaveria spp.) 或白花菜属 (Cleome spp.)。 编码具有 PPDK 活性的多肽的编码序列可来源于鼠耳芥、 玉米 (Zea mays)、 Flaveria trinervia、 黄顶菊 (Flaveria bidentis)、 Flaveria brownie 或白花菜 (Cleome gynandra)。
     据认为在鼠耳芥中有三种编码 PCK 的基因。本文如下提供编码拟南芥烯醇丙酮酸 磷酸羧激酶 (PCK) 的一个实施方案的基因组 DNA 序列 ( 包括内含子和外显子 ) 作为 SEQ ID No ： 17 ：
     ATGTCGGCCGGTAACGGAAATGCTACTAACGGTGACGGAGGGTTTAGTTTCCCTAAAGGACCGG
     TGATGCCGAAGATAACGACCGGAGCAGCAAAGAGAGGTAGCGGAGTCTGCCACGACGATAGTGG
     TCCGACGGTGAATGCCACAACCATCGATGAGCTTCATTCGTTACAGAAGAAACGTTCTGCTCCT
     ACCACACCGATCAACCAAAACGCCGCCGCTGCTTTTGCCGCCGTCTCCGAGGAGGAGCGTCAGA
     AGATTCAGCTTCAATCTATCAGGTCCTTATAATAACTTCACATATACAGATTATTCATACGTTA
     CTTTTGTTTATAACATACTTTATATCGAATTAAGGAAGATTATTGCGTTTTCGTGTCCGATCAT
     TTTCATGGAAAAAGTGTCTTTTAGCTAAATATATGGTGTAGTATTAAATATTTCTGACGTGATA
     TACACTAAACTTGAAAATTTTCAATTACTATTTCTTCCTTTAATTCGGCAATATAATTTGTTTT
     TGTTTATTTTTGGATTAGACATTTATGGACAAGTTAATGCGCTATTGTGACTATTACCAGAAAA
     TAATACTTTAATGTACATGACACGTGTTTAAAACGACACGTGGAAACTAATTTTGATTAATTGT
     GAAACAGTGCATCGTTAGCATCGTTAACGAGAGAGTCAGGACCAAAGGTGGTGAGAGGAGATCC
     GGCGGAGAAGAAGACCGATGGTTCAACTACTCCGGCGTACGCTCACGGCCAACATCATTCTATC
     TTTTCTCCGGCTACTGGTGCTGTCAGTGATAGCTCCTTGAAGTTTACTCACGTCCTCTACAATCTTTCGCCTGCAGGTCAACAAATAAACCTAGAATCCGAATCTGAATATTGATAAATGTTTCTGCA ACGAGTTTGATAGATTTGGTTTGTGATTTTGTTGTTTGTAGAGCTTTATGAGCAAGCTATTAAG TATGAGAAAGGTTCGTTTATCACTTCTAATGGAGCTTTGGCGACGCTTTCTGGTGCTAAGACTG GTCGTGCTCCCAGAGATAAGCGTGTTGTTAGAGATGCTACTACTGAGGATGAGCTTTGGTGGGG AAAGTGAGTATTCCTAATCTCGATTTTGATTGATGGAGTTTTTGGGTTTATGCTCTGTTTTCGT TTATTGATTTTGGAGTTTGATTTTGATTTTAGGGGTTCGCCGAATATCGAAATGGATGAACATA CTTTCATGGTGAACAGAGAAAGAGCTGTTGATTACTTGAATTCCTTGGAAAAGGTATTAAATTT TGAAAACTTTAATCAATGTTGTTGAGTGTAGAACTTTTGATCTAAGTTTATGAAATTTCTGTTG TTGTTGGGGTTTTTAGGTCTTTGTCAATGACCAATACTTAAACTGGGATCCAGAGAACAGAATC AAAGTCAGGATTGTCTCAGCTAGAGCTTACCATTCATTGTTTATGCACAACATGTAAGTAAAAT CATTATTGACTCCTTGTATGTCAATCCATTATTGTGGGTGAAAGAAAACAACAAATTAGTAACT GGGGAGGGTGTCAGGTGTATCCGACCAACTCAGGAGGAGCTTGAGAGCTTTGGTACTCCGGATT TTACTATATACAATGCTGGGCAGTTTCCATGTAATCGTTACACTCATTACATGACTTCGTCCAC TAGCGTAGACCTTAATCTGGCTAGGAGGGAAATGGTTATACTTGGTACTCAGTATGCTGGGGAA ATGAAGAAGGGTCTTTTCAGTGTGATGCATTACCTTATGCCTAAGCGTCGTATTCTCTCCCTTC ATTCTGGATGCAATATGGGAAAAGATGGAGATGTTGCTCTCTTCTTTGGACTTTCAGGTATAGT AGAGACAGTACCAACTATGGTGTTGGGTGATGATGGAAGGAACGATAAATCAAATGATACAATA CAATTACTGCTGAACTGACTTGAGAACTGCTTGCCTCTTTGTTGAGTTTAGCGGGTGAATTGAG ATTGATGATTGTGTTTTTTGTTTTCTATGAATGATGATTTTAGGTACCGGGAAGACAACGCTGT CTACTGATCACAACAGGTATCTTATTGGAGATGATGAGCATTGTTGGACTGAGACTGGTGTTTC GAACATTGAGGGTGGGTGCTATGCTAAGTGTGTTGATCTTTCGAGGGAGAAGGAGCCTGATATC TGGAACGCTATCAAGTTTGGAACAGGTAGAAAGACAGTACGTTGGAATTGTTTTTGAGAAAAAA ACATAAAGCAGTGATATAACAATAAGATTCTGATCTTGTTGCAGTTTTGGAAAATGTTGTGTTT GATGAGCACACCAGAGAAGTGGATTACTCTGATAAATCTGTTACAGGTAAAACAATTGTTATTT CTTTCATTCTCTTCGTCCTCACAATTAACAGAATGATCATTTTCGATTCTCTTTGGTTGCAGAG AACACACGTGCTGCCTACCCAATTGAGTTCATTCCAAATGCGAAAATACCTTGTGTTGGTCCAC ACCCGACAAATGTGATACTTCTGGCTTGTGATGCCTTTGGTGTTCTCCCACCTGTGAGCAAGCT GAATCTGGCACAAACCATGTACCACTTCATCAGTGGTTACACTGCTCTGGTAAGGCCAAAGTAA AAGTCTTTATTTTGCACATCGTCTTCATAAATTTCAAAAGCATAACCAAAGATGTGCAACATAT ATAGGTTGCTGGCACAGAGGATGGTATCAAGGAGCCAACAGCAACATTCTCAGCTTGCTTTGGT GCAGCTTTCATAATGTTGCATCCCACAAAGTATGCAGCTATGTTAGCTGAGAAGATGAAGTCAC AAGGTGCTACTGGTTGGCTCGTCAACACTGGTTGGTCTGGTGGCAGGTATATATGTCCTTCTAT GGAAATCGATACAACAAAACGCTGCCTTGTAACACATGTTTGTAGGCTATTAACATGATCTGTA ATGTTTTATTTCCTGCAGTTATGGTGTTGGAAACAGAATCAAGCTGGCATACACTAGAAAGATC ATCGATGCAATCCATTCGGGCAGTCTCTTGAAGGCAAACTACAAGAAAACCGAAATCTTTGGAT TTGAAATCCCAACTGAGATCGAAGGGATACCTTCAGAGATCTTGGACCCCGTCAACTCCGTAAG TTTCTGCAAATCTGTATAATGTAATTGCTTAAGTGATGATGAACAATTTTTTGTTGATTTGGGT TTAATGAAAATGCAGTGGTCTGATAAGAAGGCACACAAAGATACTCTGGTGAAACTGGGAGGTC TGTTCAAGAAGAACTTCGAGGTTTTTGCTAACCATAAGATTGGTGTGATGGTAAGCTTACGGAGGAGATTCTCGCTGCTGGTCCTATCTTTTAG
     SEQ ID No ： 17
     本文如下提供编码拟南芥烯醇丙酮酸磷酸羧激酶 (PCK) 的 cDNA 序列 ( 仅外显子 ) 作为 SEQ ID No ： 18 ：
     ATGTCGGCCGGTAACGGAAATGCTACTAACGGTGACGGAGGGTTTAGTTTCCCTAAAGGA
     CCGGTGATGCCGAAGATAACGACCGGAGCAGCAAAGAGAGGTAGCGGAGTCTGCCACGAC
     GATAGTGGTCCGACGGTGAATGCCACAACCATCGATGAGCTTCATTCGTTACAGAAGAAA
     CGTTCTGCTCCTACCACACCGATCAACCAAAACGCCGCCGCTGCTTTTGCCGCCGTCTCC
     GAGGAGGAGCGTCAGAAGATTCAGCTTCAATCTATCAGTGCATCGTTAGCATCGTTAACG
     AGAGAGTCAGGACCAAAGGTGGTGAGAGGAGATCCGGCGGAGAAGAAGACCGATGGTTCA
     ACTACTCCGGCGTACGCTCACGGCCAACATCATTCTATCTTTTCTCCGGCTACTGGTGCT
     GTCAGTGATAGCTCCTTGAAGTTTACTCACGTCCTCTACAATCTTTCGCCTGCAGAGCTT
     TATGAGCAAGCTATTAAGTATGAGAAAGGTTCGTTTATCACTTCTAATGGAGCTTTGGCG
     ACGCTTTCTGGTGCTAAGACTGGTCGTGCTCCCAGAGATAAGCGTGTTGTTAGAGATGCT
     ACTACTGAGGATGAGCTTTGGTGGGGAAAGGGTTCGCCGAATATCGAAATGGATGAACAT
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    ACTTTCATGGTGAACAGAGAAAGAGCTGTTGATTACTTGAATTCCTTGGAAAAGGTCTTT GTCAATGACCAATACTTAAACTGGGATCCAGAGAACAGAATCAAAGTCAGGATTGTCTCA GCTAGAGCTTACCATTCATTGTTTATGCACAACATGTGTATCCGACCAACTCAGGAGGAG CTTGAGAGCTTTGGTACTCCGGATTTTACTATATACAATGCTGGGCAGTTTCCATGTAAT CGTTACACTCATTACATGACTTCGTCCACTAGCGTAGACCTTAATCTGGCTAGGAGGGAA ATGGTTATACTTGGTACTCAGTATGCTGGGGAAATGAAGAAGGGTCTTTTCAGTGTGATG CATTACCTTATGCCTAAGCGTCGTATTCTCTCCCTTCATTCTGGATGCAATATGGGAAAA GATGGAGATGTTGCTCTCTTCTTTGGACTTTCAGGTACCGGGAAGACAACGCTGTCTACT GATCACAACAGGTATCTTATTGGAGATGATGAGCATTGTTGGACTGAGACTGGTGTTTCG AACATTGAGGGTGGGTGCTATGCTAAGTGTGTTGATCTTTCGAGGGAGAAGGAGCCTGAT ATCTGGAACGCTATCAAGTTTGGAACAGTTTTGGAAAATGTTGTGTTTGATGAGCACACC AGAGAAGTGGATTACTCTGATAAATCTGTTACAGAGAACACACGTGCTGCCTACCCAATT GAGTTCATTCCAAATGCGAAAATACCTTGTGTTGGTCCACACCCGACAAATGTGATACTT CTGGCTTGTGATGCCTTTGGTGTTCTCCCACCTGTGAGCAAGCTGAATCTGGCACAAACC ATGTACCACTTCATCAGTGGTTACACTGCTCTGGTTGCTGGCACAGAGGATGGTATCAAG GAGCCAACAGCAACATTCTCAGCTTGCTTTGGTGCAGCTTTCATAATGTTGCATCCCACA AAGTATGCAGCTATGTTAGCTGAGAAGATGAAGTCACAAGGTGCTACTGGTTGGCTCGTC AACACTGGTTGGTCTGGTGGCAGTTATGGTGTTGGAAACAGAATCAAGCTGGCATACACT AGAAAGATCATCGATGCAATCCATTCGGGCAGTCTCTTGAAGGCAAACTACAAGAAAACC GAAATCTTTGGATTTGAAATCCCAACTGAGATCGAAGGGATACCTTCAGAGATCTTGGAC CCCGTCAACTCCTGGTCTGATAAGAAGGCACACAAAGATACTCTGGTGAAACTGGGAGGT CTGTTCAAGAAGAACTTCGAGGTTTTTGCTAACCATAAGATTGGTGTGATGGTAAGCTTA CGGAGGAGATTCTCGCTGCTGGTCCTATCTTTTAG SEQ ID No ： 18因此， 编码具有 PCK 活性的多肽的编码序列可包含基本上如 SEQ ID No ： 17 或 SEQ ID No.18 所示的核酸序列或者其功能变体或片段。
     本文如下提供拟南芥 PCK 的多肽序列作为 SEQ ID No ： 19 ：
     MSAGNGNATNGDGGFSFPKGPVMPKITTGAAKRGSGVCHDDSGPTVNATTIDELHSLQKK
     RSAPTTPINQNAAAAFAAVSEEERQKIQLQSISASLASLTRESGPKVVRGDPAEKKTDGS
     TTPAYAHGQHHSIFSPATGAVSDSSLKFTHVLYNLSPAELYEQAIKYEKGSFITSNGALA
     TLSGAKTGRAPRDKRVVRDATTEDELWWGKGSPNIEMDEHTFMVNRERAVDYLNSLEKVF
     VNDQYLNWDPENRIKVRIVSARAYHSLFMHNMCIRPTQEELESFGTPDFTIYNAGQFPCN
     RYTHYMTSSTSVDLNLARREMVILGTQYAGEMKKGLFSVMHYLMPKRRILSLHSGCNMGK
     DGDVALFFGLSGTGKTTLSTDHNRYLIGDDEHCWTETGVSNIEGGCYAKCVDLSREKEPD
     IWNAIKFGTVLENVVFDEHTREVDYSDKSVTENTRAAYPIEFIPNAKIPCVGPHPTNVIL
     LACDAFGVLPPVSKLNLAQTMYHFISGYTALVAGTEDGIKEPTATFSACFGAAFIMLHPT
     KYAAMLAEKMKSQGATGWLVNTGWSGGSYGVGNRIKLAYTRKIIDAIHSGSLLKANYKKT
     EIFGFEIPTEIEGIPSEILDPVNSWSDKKAHKDTLVKLGGLFKKNFEVFANHKIGVMVSL
     RRRFSLLVLSF SEQ ID No ： 19
     因此， 具有 PCK 活性的多肽可包含基本上如 SEQ ID No ： 19 所示的氨基酸序列或者 其功能变体或片段。
     据认为拟南芥至少有两种形式的 PPDK， 叶绿体形式和胞质形式， 这两种形式由同 一基因编码， 其中该基因 5′端的少量剪接变化产生了这两种形式。 本文如下提供编码两种 形式的拟南芥丙酮酸正磷酸双激酶 (PPDK) 的基因组 DNA 序列 ( 包括内含子和外显子 ) 作 为 SEQ ID No ： 20 ：
     ATGACAAGTATGATCGTGAAGACAACGCCGGAGCTCTTCAAAGGAAATGGAGTGTTCCGTACGG
     ATCATCTCGGAGAAAACCGAATGGTTAGTCGATCAAACCGGCTAGGTGATGGATCAAACCGTTT
     CCCTAGAACCGGTACAATCCATTGCCAACGGTTAAGCATAGCAAAGACCGGTTTGCATCGTGAG
     ACGAAGGCTCGAGCCATACTTAGCCCTGTGTCCGATCCGGCCGCTTCCATAGCCCAAAAGGTAA
     GCCTTTCCATTTCAATCATTCTGGTGTATTTTCACCATAAAATTTTATACACTTTTTTATTACG
     TTTTGTTTTATGATTCTGACGTGAGATTCTTGAGAGAAACTATCACCGATCATTGGGTCGAACC
     ATCTAGCAGCTCAATTATTATCGGTTATAACCCTACCGGTTATAGAATACAAAACAGGTTACGC
     CATTGTGACATTTGCTTTGTGATCTTGTGAGACGATTAATTATTTGATGTTGATTGGTTTCGTT
     ACTCTTGTTTAAACAATCGAACGGTTCAAACTAATACACACATGTGATGTGAGATCATTTCGGT
     AGTAATACCAAATAGCGTCTGGCCTAAATTATGAAAGTACTATTTTGAATTAAATTATTGTGGA
     AACATGAACTTATTTAAATTCAAGTATTTTCGAAATTTGTAATAAAAAAAAACTTTTCCTCTAG
     ATTCATTAGCCCTACTTTTCGTAGAAACAACTTTAATGTATTCAAAGACCACTTTGCTGCTTAA
     GTCAGACTCTTGTGCCACTTGGTAGATCCACCAATGCCACGTTTTGTTATTGTGCCAAAGAATA
     CGTGAATATGTCCAAACGGCAATCAAATTCTTGGCGTAAAACACAAAAATTATGATACTAGTTT
     AAATCCACAATTCACCTTCACCATAAAGAATTCATGTATTAGAGATGGTATGACAAGAACTGGT
     TGAATTTGATGACATTTGTTTGCTATTGTTTTGGTTAAGTAAAAGTTTTGTTAAAAAGGAAAAT
     AGCATCGGTAGTGGCAGATAGCAAGTGTGTGAGTGAGATCAGATATGGTTGACACATCTATGAC
     GAGTCATCGCAACGAAACTTCTTTAATTTTGGTCAATTATATTACAATTTAGCATTTCGAGGTT GGAATTTTGGAATGATCTCTTGATAAGATAATAATGTATTTTTGATGACGTATCCATCAAAACT ATAAATGATTTATATTAAATATGAAATTTCGACTGTATACAAGTTTTTATATTATAAAATTATT CGATGTACATATGATCATAATAACTTTACTATATATATAGATACGTATATGTGTTCTTAAACTT GCACAAACATTTCTGCAATCTAAACCTCAATCAAAACAAACAAACAAAAAACCATGATGCAGCG AGTATTCACCTTTGGAAAAGGAAGAAGCGAAGGCAACAAGGGCATGAAGTCCTTGGTATGTTAC CAATACCATCATCATGATCATATCAATTCATTAATAATTTAGTGTTTGCTATTTTCAAGAACCA TTTATCAAAAATGTTAATTGTTGTTGTGTATGAAGTTGGGAGGGAAAGGAGCCAACCTGGCGGA GATGGCTAGCATAGGCTTGTCGGTGCCGCCGGGGCTAACCATATCGACGGAGGCTTGTCAGCAG TATCAGATCGCCGGCAAAAAGCTTCCAGAAGGTTTATGGGAAGAGATCTTAGAAGGTCTTAGCT TCATCGAACGTGACATTGGAGCTTCCCTCGCTGATCCCTCCAAGCCACTCCTCCTCTCTGTTCG CTCCGGCGCCGCCGTAAGTTAATTATAACTTTTTTTCTTGACTATTTTTATTTTAAGGATTTTT TCTAATGTTAAATTTCTGTTTTTTTTTCTTTCTATGTTTTCTTTAATCTTTTGAAGATTTTTTG ACGCAGATTTTGACTTGTTAGATTTCTTTTATTGAAGTTGAGATCCAAATATTTTTTTGGTTAT TTTGCCATTTGGCCGTTTTTGGAAGAGTTTAAAATGTACTAGATAGAAAATGAATAAGTTTTGT GGCTATTGAAAGACCTAATGATTTTGGTATTCAAACTATAACGTAGAAAATGAAGATCTTTCGT TTATCTATTTTTAAAACAGAACTACATTGACTTGTCTTTGATCGATATTTTGCATTGTAGATCT CAATGCCTGGTATGATGGACACTGTACTTAACCTTGGCTTGAACGACCAAGTCGTCGTTGGTCT GGCCGCAAAAAGCGGAGAGCGTTTTGCTTACGATTCGTTCCGGCGTTTTCTTGATATGTTTGGT GATGTTGTAAGTCCTCTGTTTTTCAATACTATTTCAGGTAACTTGCATGACAAGAAAATTCTTT GACCTACCTTATAATTGTTTTCTTGATCAATAAAAGGTGATGGGAATTCCACACGCCAAGTTTG AAGAGAAGTTAGAGAGAATGAAGGAGAGGAAAGGAGTTAAAAATGACACTGACTTAAGCGCGGC TGATCTCAAGGAATTGGTTGAGCAGTACAAGAGTGTTTACTTAGAGGCCAAGGGTCAAGAGTTT CCTTCAGGTTTGTTTTGATTCCTACTTGAGGTCAAGTGATAAAAATTAGTTATTAGTTACAAAT GTTTAAACGGGGTTAATTGCAGATCCAAAGAAGCAATTGGAGCTAGCGATTGAAGCGGTATTCG ATTCTTGGGATAGCCCGAGAGCGAACAAGTACAGAAGTATTAACCAGATAACTGGATTGAAAGG AACCGCGGTTAACATTCAGTGTATGGTGTTTGGAAACATGGGGGACACTTCAGGGACTGGTGTT CTCTTCACTAGGAACCCTAGCACAGGAGAGAAGAAGCTTTATGGCGAGTTTCTAGTTAATGCTC AGGTTTGGCATCTATCACAATGTGTGAATCTCATATCAACAAGTAAGCCCATACTCATTAAATA TTGGTTTTGGGACAGGGAGAGGATGTGGTTGCAGGGATAAGAACACCAGAAGATTTGGATACAA TGAAGAGATTTATGCCTGAGGCTTACGCTGAACTTGTTGAGAACTGCAACATCTTAGAAAGACA TTACAAAGACATGATGGTTGATACACATAAACAATACTTCAATTAGTCCTCATCAACAATTCTT TAGTAATTTAAACAAAATCTCAAATGTGTATTGCAGGATATTGAATTCACAGTACAAGAAGAGA GATTGTGGATGCTGCAATGCAGAGCGGGTAAGCGAACGGGTAAAGGCGCCGTGAAGATAGCAGT TGATATGGTAGGTGAAGGGCTTGTTGAGAAATCTTCTGCTATCAAAATGGTGGAGCCTCAACAT CTTGATCAACTACTTCACCCACAGGTACAAACTCAAATATTCATCTTCTTCTTTTTTCATAGTC ATAAACTTGATGTTGAAACCAAAATTCGAAACTTACTGGTAATGATTGGTTCACTTGAACAAGA ACTAATGGGTTTAAGACGTTTAGGGTTTAGGAGTAAAAGCAGAGATGATTGTCTGACACGTAAC CGATGAATAGGGTTTGGAAATTTTGATTCAGAGGTCAATGAAGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTAT为 SEQ
    
    TGATGGATTAGTTTCATGATCCATCGGGGTATCGTGAAAAAGTGGTGGCCAAAGGCTTACCTGC GTCACCAGGAGCGGCGGTTGGACAGGTTGTGTTCACGGCGGAGGAAGCCGAAGCTTGGCATTCT CAGGGTAAAACTGTGATTCTGGTTCGAACTGAGACAAGCCCTGACGATGTGGGAGGTATGCACG CAGCGGAAGGTATATTGACGGCTAGAGGAGGAATGACGTCACACGCGGCTGTTGTTGCTCGCGG TTGGGGAAAATGTTGCATTGCTGGTTGTTCCGAGATTCGTGTCGACGAGAACCACAAGGTTTTT GGATTCGATTTTAGAAACTTGTCATATAAGTTAGGGGAAGATTGTTTCTAAAGTTAGGGTTTAA AAATTTTCAGGTTCTATTGATTGGAGATTTGACGATTAATGAAGGCGAATGGATCTCAATGAAC GGATCAACCGGTGAGGTTATATTAGGGAAACAAGCATTGGCTCCTCCGGCTTTAAGTCCAGATT TGGAGACTTTCATGTCCTGGGCTGATGCAATCAGACGTCTCAAGGTGTTTATGAGTTTCTGTTC CTTTAACTTGTTTGATATTTTTAAACTTTCTAACTCAAATGTTCGATGACCGATAAGGTTATGG CGAATGCGGATACACCTGAAGACGCCATTGCAGCTAGGAAAAACGGAGCTCAAGGAATCGGGCT TTGTAGGACAGAGCATATGGTAACTCCTCCTCTGTACTTGATTTCATGTTTTTGATGATTTAGA TTGTTTGTATCCAAATGTTTAATGTTGTCTTTGGTTTGGTTTTTAAGTTCTTTGGAGCAGATAG GATTAAAGCAGTGAGAAAGATGATAATGGCGGTAACAACAGAGCAAAGGAAAGCTTCTCTCGAC ATCTTGCTTCCTTACCAACGTTCGGATTTCGAAGGGATCTTCCGTGCTATGGATGGTAAATGTT TTGAGTCGTCTCTCTAAAATGTATCACAACTTAAAACATGCCTAAACCTTTTTATTTTTCTAGG TTTACCGGTAACAATCCGTTTGTTAGACCCTCCGCTTCACGAGTTTCTCCCGGAAGGCGACTTG GACAACATTGTACATGAGCTAGCTGAAGAAACTGGTGTGAAAGAAGATGAAGTCTTGTCACGGA TAGAGAAACTCTCTGAAGTGAATCCAATGCTTGGTTTCCGCGGTTGCAGGTTTCTTACTCTCTT TGTTTCTCTCTGTCTCTTTGCACCTGAAGAACAATCTGATGATCGGTAAACTTGTACGTTATAG GCTCGGAATATCGTATCCAGAGCTAACGGAGATGCAAGCGCGTGCAATTTTTGAAGCTGCAGCG TCAATGCAGGACCAAGGTGTTACTGTCATTCCTGAGATTATGGTTCCACTTGTAGGAACTCCTC AGGAATTGGGTCACCAAGTTGATGTAATTCGTAAAGTTGCAAAGAAAGTATTTGCTGAGAAGGG TCATACCGTGAGCTACAAGGTTGGGACAATGATTGAGATCCCTCGAGCCGCGCTCATTGCAGAT GAGGTAAATGTAACAAGACACAAAATGTGTTTTAGGCACTTGAAACCATGTTGCTATTTGCTAA GTAGGAACCTTTTTCTTTTGACAGATTGCGAAAGAGGCGGAGTTTTTCTCGTTCGGGACAAACG ACTTGACGCAGATGACGTTTGGATACAGTAGAGACGATGTCGGCAAGTTTCTACCGATTTACCT CGCCAAAGGAATCTTACAGCACGACCCTTTTGAGGTATAATGACTACCATTTCGTTTGCTCTCT ATCCATAGGATAAAATCTTGATAGCCATTTTTTTGTGTTTGGACCAGGTTCTTGATCAGCAAGG TGTAGGGCAATTGATCAAGATGGCGACAGAAAAAGGACGAGCAGCTAGGCCTAGCCTCAAGGTT GGGATATGTGGAGAACATGGAGGAGATCCATCTTCTGTGGGATTCTTTGCTGAAGCAGGACTTG ACTATGTCTCTTGTTCTCCTTTCAGGTAATTGATTAATTTCCAAACCAATAAACACTTTTTTTA CAACACTATTGTATAACTCAGATTGATGTAATTTTGGGATTTCTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGT TGTTGTTGCAGGGTTCCAATTGCAAGGCTTGCAGCTGCTCAAGTAGTTGTTGCATGA SEQ ID No ： 20 本文如下提供编码胞质形式的拟南芥丙酮酸正磷酸双激酶 (PPDK) 的 cDNA 序列作 ID No ： 21 ： ATGATGCAGCGAGTATTCACCTTTGGAAAAGGAAGAAGCGAAGGCAACAAGGGCATGAAG TCCTTGTTGGGAGGGAAAGGAGCCAACCTGGCGGAGATGGCTAGCATAGGCTTGTCGGTGCCGCCGGGGCTAACCATATCGACGGAGGCTTGTCAGCAGTATCAGATCGCCGGCAAAAAG CTTCCAGAAGGTTTATGGGAAGAGATCTTAGAAGGTCTTAGCTTCATCGAACGTGACATT GGAGCTTCCCTCGCTGATCCCTCCAAGCCACTCCTCCTCTCTGTTCGCTCCGGCGCCGCC ATCTCAATGCCTGGTATGATGGACACTGTACTTAACCTTGGCTTGAACGACCAAGTCGTC GTTGGTCTGGCCGCAAAAAGCGGAGAGCGTTTTGCTTACGATTCGTTCCGGCGTTTTCTT GATATGTTTGGTGATGTTGTGATGGGAATTCCACACGCCAAGTTTGAAGAGAAGTTAGAG AGAATGAAGGAGAGGAAAGGAGTTAAAAATGACACTGACTTAAGCGCGGCTGATCTCAAG GAATTGGTTGAGCAGTACAAGAGTGTTTACTTAGAGGCCAAGGGTCAAGAGTTTCCTTCA GATCCAAAGAAGCAATTGGAGCTAGCGATTGAAGCGGTATTCGATTCTTGGGATAGCCCG AGAGCGAACAAGTACAGAAGTATTAACCAGATAACTGGATTGAAAGGAACCGCGGTTAAC ATTCAGTGTATGGTGTTTGGAAACATGGGGGACACTTCAGGGACTGGTGTTCTCTTCACT AGGAACCCTAGCACAGGAGAGAAGAAGCTTTATGGCGAGTTTCTAGTTAATGCTCAGGTT TGGCATCTATCACAATGTGTGAATCTCATATCAACAAGGATAAGAACACCAGAAGATTTG GATACAATGAAGAGATTTATGCCTGAGGCTTACGCTGAACTTGTTGAGAACTGCAACATC TTAGAAAGACATTACAAAGACATGATGGATATTGAATTCACAGTACAAGAAGAGAGATTG TGGATGCTGCAATGCAGAGCGGGTAAGCGAACGGGTAAAGGCGCCGTGAAGATAGCAGTT GATATGGTAGGTGAAGGGCTTGTTGAGAAATCTTCTGCTATCAAAATGGTGGAGCCTCAA CATCTTGATCAACTACTTCACCCACAGTTTCATGATCCATCGGGGTATCGTGAAAAAGTG GTGGCCAAAGGCTTACCTGCGTCACCAGGAGCGGCGGTTGGACAGGTTGTGTTCACGGCG GAGGAAGCCGAAGCTTGGCATTCTCAGGGTAAAACTGTGATTCTGGTTCGAACTGAGACA AGCCCTGACGATGTGGGAGGTATGCACGCAGCGGAAGGTATATTGACGGCTAGAGGAGGA ATGACGTCACACGCGGCTGTTGTTGCTCGCGGTTGGGGAAAATGTTGCATTGCTGGTTGT TCCGAGATTCGTGTCGACGAGAACCACAAGGTTCTATTGATTGGAGATTTGACGATTAAT GAAGGCGAATGGATCTCAATGAACGGATCAACCGGTGAGGTTATATTAGGGAAACAAGCA TTGGCTCCTCCGGCTTTAAGTCCAGATTTGGAGACTTTCATGTCCTGGGCTGATGCAATC AGACGTCTCAAGGTTATGGCGAATGCGGATACACCTGAAGACGCCATTGCAGCTAGGAAA AACGGAGCTCAAGGAATCGGGCTTTGTAGGACAGAGCATATGATTGTTTGTATCCAAATG TTTAATGTTGTCTTTGGTTTGGTTTTTAAGTTCTTTGGAGCAGATAGGATTAAAGCAGTG AGAAAGATGATAATGGCGGTAACAACAGAGCAAAGGAAAGCTTCTCTCGACATCTTGCTT CCTTACCAACGTTCGGATTTCGAAGGGATCTTCCGTGCTATGGATGGTTTACCGGTAACA ATCCGTTTGTTAGACCCTCCGCTTCACGAGTTTCTCCCGGAAGGCGACTTGGACAACATT GTACATGAGCTAGCTGAAGAAACTGGTGTGAAAGAAGATGAAGTCTTGTCACGGATAGAG AAACTCTCTGAAGTGAATCCAATGCTTGGTTTCCGCGGTTGCAGGCTCGGAATATCGTAT CCAGAGCTAACGGAGATGCAAGCGCGTGCAATTTTTGAAGCTGCAGCGTCAATGCAGGAC CAAGGTGTTACTGTCATTCCTGAGATTATGGTTCCACTTGTAGGAACTCCTCAGGAATTG GGTCACCAAGTTGATGTAATTCGTAAAGTTGCAAAGAAAGTATTTGCTGAGAAGGGTCAT ACCGTGAGCTACAAGGTTGGGACAATGATTGAGATCCCTCGAGCCGCGCTCATTGCAGAT GAGATTGCGAAAGAGGCGGAGTTTTTCTCGTTCGGGACAAACGACTTGACGCAGATGACG TTTGGATACAGTAGAGACGATGTCGGCAAGTTTCTACCGATTTACCTCGCCAAAGGAATCTTACAGCACGACCCTTTTGAGGTTCTTGATCAGCAAGGTGTAGGGCAATTGATCAAGATG
     GCGACAGAAAAAGGACGAGCAGCTAGGCCTAGCCTCAAGGTTGGGATATGTGGAGAACAT
     GGAGGAGATCCATCTTCTGTGGGATTCTTTGCTGAAGCAGGACTTGACTATGTCTCTTGT
     TCTCCTTTCAGGGTTCCAATTGCAAGGCTTGCAGCTGCTCAAGTAGTTGTTGCATGA
     SEQ ID No ： 21
     本文如下提供编码叶绿体形式的拟南芥丙酮酸正磷酸双激酶 (PPDK) 的 cDNA 序列 作为 SEQ ID No ： 22 ：
     ATGACAAGTATGATCGTGAAGACAACGCCGGAGCTCTTCAAAGGAAATGGAGTGTTCCGT
     ACGGATCATCTCGGAGAAAACCGAATGGTTAGTCGATCAAACCGGCTAGGTGATGGATCA
     AACCGTTTCCCTAGAACCGGTACAATCCATTGCCAACGGTTAAGCATAGCAAAGACCGGT
     TTGCATCGTGAGACGAAGGCTCGAGCCATACTTAGCCCTGTGTCCGATCCGGCCGCTTCC
     ATAGCCCAAAAGCGAGTATTCACCTTTGGAAAAGGAAGAAGCGAAGGCAACAAGGGCATG
     AAGTCCTTGTTGGGAGGGAAAGGAGCCAACCTGGCGGAGATGGCTAGCATAGGCTTGTCG
     GTGCCGCCGGGGCTAACCATATCGACGGAGGCTTGTCAGCAGTATCAGATCGCCGGCAAA
     AAGCTTCCAGAAGGTTTATGGGAAGAGATCTTAGAAGGTCTTAGCTTCATCGAACGTGAC
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    ATTGGAGCTTCCCTCGCTGATCCCTCCAAGCCACTCCTCCTCTCTGTTCGCTCCGGCGCC GCCATCTCAATGCCTGGTATGATGGACACTGTACTTAACCTTGGCTTGAACGACCAAGTC GTCGTTGGTCTGGCCGCAAAAAGCGGAGAGCGTTTTGCTTACGATTCGTTCCGGCGTTTT CTTGATATGTTTGGTGATGTTGTGATGGGAATTCCACACGCCAAGTTTGAAGAGAAGTTA GAGAGAATGAAGGAGAGGAAAGGAGTTAAAAATGACACTGACTTAAGCGCGGCTGATCTC AAGGAATTGGTTGAGCAGTACAAGAGTGTTTACTTAGAGGCCAAGGGTCAAGAGTTTCCT TCAGATCCAAAGAAGCAATTGGAGCTAGCGATTGAAGCGGTATTCGATTCTTGGGATAGC CCGAGAGCGAACAAGTACAGAAGTATTAACCAGATAACTGGATTGAAAGGAACCGCGGTT AACATTCAGTGTATGGTGTTTGGAAACATGGGGGACACTTCAGGGACTGGTGTTCTCTTC ACTAGGAACCCTAGCACAGGAGAGAAGAAGCTTTATGGCGAGTTTCTAGTTAATGCTCAG GTTTGGCATCTATCACAATGTGTGAATCTCATATCAACAAGGATAAGAACACCAGAAGAT TTGGATACAATGAAGAGATTTATGCCTGAGGCTTACGCTGAACTTGTTGAGAACTGCAAC ATCTTAGAAAGACATTACAAAGACATGATGGATATTGAATTCACAGTACAAGAAGAGAGA TTGTGGATGCTGCAATGCAGAGCGGGTAAGCGAACGGGTAAAGGCGCCGTGAAGATAGCA GTTGATATGGTAGGTGAAGGGCTTGTTGAGAAATCTTCTGCTATCAAAATGGTGGAGCCT CAACATCTTGATCAACTACTTCACCCACAGTTTCATGATCCATCGGGGTATCGTGAAAAA GTGGTGGCCAAAGGCTTACCTGCGTCACCAGGAGCGGCGGTTGGACAGGTTGTGTTCACG GCGGAGGAAGCCGAAGCTTGGCATTCTCAGGGTAAAACTGTGATTCTGGTTCGAACTGAG ACAAGCCCTGACGATGTGGGAGGTATGCACGCAGCGGAAGGTATATTGACGGCTAGAGGA GGAATGACGTCACACGCGGCTGTTGTTGCTCGCGGTTGGGGAAAATGTTGCATTGCTGGT TGTTCCGAGATTCGTGTCGACGAGAACCACAAGGTTCTATTGATTGGAGATTTGACGATT AATGAAGGCGAATGGATCTCAATGAACGGATCAACCGGTGAGGTTATATTAGGGAAACAA GCATTGGCTCCTCCGGCTTTAAGTCCAGATTTGGAGACTTTCATGTCCTGGGCTGATGCA ATCAGACGTCTCAAGGTTATGGCGAATGCGGATACACCTGAAGACGCCATTGCAGCTAGGAAAAACGGAGCTCAAGGAATCGGGCTTTGTAGGACAGAGCATATGATTGTTTGTATCCAA
     ATGTTTAATGTTGTCTTTGGTTTGGTTTTTAAGTTCTTTGGAGCAGATAGGATTAAAGCA
     GTGAGAAAGATGATAATGGCGGTAACAACAGAGCAAAGGAAAGCTTCTCTCGACATCTTG
     CTTCCTTACCAACGTTCGGATTTCGAAGGGATCTTCCGTGCTATGGATGGTTTACCGGTA
     ACAATCCGTTTGTTAGACCCTCCGCTTCACGAGTTTCTCCCGGAAGGCGACTTGGACAAC
     ATTGTACATGAGCTAGCTGAAGAAACTGGTGTGAAAGAAGATGAAGTCTTGTCACGGATA
     GAGAAACTCTCTGAAGTGAATCCAATGCTTGGTTTCCGCGGTTGCAGGCTCGGAATATCG
     TATCCAGAGCTAACGGAGATGCAAGCGCGTGCAATTTTTGAAGCTGCAGCGTCAATGCAG
     GACCAAGGTGTTACTGTCATTCCTGAGATTATGGTTCCACTTGTAGGAACTCCTCAGGAA
     TTGGGTCACCAAGTTGATGTAATTCGTAAAGTTGCAAAGAAAGTATTTGCTGAGAAGGGT
     CATACCGTGAGCTACAAGGTTGGGACAATGATTGAGATCCCTCGAGCCGCGCTCATTGCA
     GATGAGATTGCGAAAGAGGCGGAGTTTTTCTCGTTCGGGACAAACGACTTGACGCAGATG
     ACGTTTGGATACAGTAGAGACGATGTCGGCAAGTTTCTACCGATTTACCTCGCCAAAGGA
     ATCTTACAGCACGACCCTTTTGAGGTTCTTGATCAGCAAGGTGTAGGGCAATTGATCAAG
     ATGGCGACAGAAAAAGGACGAGCAGCTAGGCCTAGCCTCAAGGTTGGGATATGTGGAGAA
     CATGGAGGAGATCCATCTTCTGTGGGATTCTTTGCTGAAGCAGGACTTGACTATGTCTCT
     TGTTCTCCTTTCAGGGTTCCAATTGCAAGGCTTGCAGCTGCTCAAGTAGTTGTTGCATGA
     SEQ ID No ： 22
     因此， 编码具有 PPDK 活性的多肽的编码序列可包含基本上如 SEQ ID No ： 20、 SEQ ID No.21 或 SEQ ID No.22 所示的核酸序列或者其功能变体或片段。
     本文如下提供胞质形式的拟南芥 PPDK 的多肽序列作为 SEQ ID No ： 23 ：
     MMQRVFTFGKGRSEGNKGMKSLLGGKGANLAEMASIGLSVPPGLTISTEACQQYQIAGKK
     LPEGLWEEILEGLSFIERDIGASLADPSKPLLLSVRSGAAISMPGMMDTVLNLGLNDQVV
     VGLAAKSGERFAYDSFRRFLDMFGDVVMGIPHAKFEEKLERMKERKGVKNDTDLSAADLK
     ELVEQYKSVYLEAKGQEFPSDPKKQLELAIEAVFDSWDSPRANKYRSINQITGLKGTAVN
     IQCMVFGNMGDTSGTGVLFTRNPSTGEKKLYGEFLVNAQVWHLSQCVNLISTRIRTPEDL
     DTMKRFMPEAYAELVENCNILERHYKDMMDIEFTVQEERLWMLQCRAGKRTGKGAVKIAV
     DMVGEGLVEKSSAIKMVEPQHLDQLLHPQFHDPSGYREKVVAKGLPASPGAAVGQVVFTA
     EEAEAWHSQGKTVILVRTETSPDDVGGMHAAEGILTARGGMTSHAAVVARGWGKCCIAGC
     SEIRVDENHKVLLIGDLTINEGEWISMNGSTGEVILGKQALAPPALSPDLETFMSWADAI
     RRLKVMANADTPEDAIAARKNGAQGIGLCRTEHMIVCIQMFNVVFGLVFKFFGADRIKAV
     RKMIMAVTTEQRKASLDILLPYQRSDFEGIFRAMDGLPVTIRLLDPPLHEFLPEGDLDNI
     VHELAEETGVKEDEVLSRIEKLSEVNPMLGFRGCRLGISYPELTEMQARAIFEAAASMQD
     QGVTVIPEIMVPLVGTPQELGHQVDVIRKVAKKVFAEKGHTVSYKVGTMIEIPRAALIAD
     EIAKEAEFFSFGTNDLTQMTFGYSRDDVGKFLPIYLAKGILQHDPFEVLDQQGVGQLIKM
     ATEKGRAARPSLKVGICGEHGGDPSSVGFFAEAGLDYVSCSPFRVPIARLAAAQVVVA
     SEQ ID No ： 23
     本文如下提供叶绿体形式的拟南芥 PPDK 的多肽序列作为 SEQ ID No ： 24 ：
     MTSMIVKTTPELFKGNGVFRTDHLGENRMVSRSNRLGDGSNRFPRTGTIHCQRLSIAKTGLHRETKARAILSPVSDPAASIAQKRVFTFGKGRSEGNKGMKSLLGGKGANLAEMASIGLS
     VPPGLTISTEACQQYQIAGKKLPEGLWEEILEGLSFIERDIGASLADPSKPLLLSVRSGA
     AISMPGMMDTVLNLGLNDQVVVGLAAKSGERFAYDSFRRFLDMFGDVVMGIPHAKFEEKL
     ERMKERKGVKNDTDLSAADLKELVEQYKSVYLEAKGQEFPSDPKKQLELAIEAVFDSWDS
     PRANKYRSINQITGLKGTAVNIQCMVFGNMGDTSGTGVLFTRNPSTGEKKLYGEFLVNAQ
     VWHLSQCVNLISTRIRTPEDLDTMKRFMPEAYAELVENCNILERHYKDMMDIEFTVQEER
     LWMLQCRAGKRTGKGAVKIAVDMVGEGLVEKSSAIKMVEPQHLDQLLHPQFHDPSGYREK
     VVAKGLPASPGAAVGQVVFTAEEAEAWHSQGKTVILVRTETSPDDVGGMHAAEGILTARG
     GMTSHAAVVARGWGKCCIAGCSEIRVDENHKVLLIGDLTINEGEWISMNGSTGEVILGKQ
     ALAPPALSPDLETFMSWADAIRRLKVMANADTPEDAIAARKNGAQGIGLCRTEHMIVCIQ
     MFNVVFGLVFKFFGADRIKAVRKMIMAVTTEQRKASLDILLPYQRSDFEGIFRAMDGLPV
     TIRLLDPPLHEFLPEGDLDNIVHELAEETGVKEDEVLSRIEKLSEVNPMLGFRGCRLGIS
     YPELTEMQARAIFEAAASMQDQGVTVIPEIMVPLVGTPQELGHQVDVIRKVAKKVFAEKG
     HTVSYKVGTMIEIPRAALIADEIAKEAEFFSFGTNDLTQMTFGYSRDDVGKFLPIYLAKG
     ILQHDPFEVLDQQGVGQLIKMATEKGRAARPSLKVGICGEHGGDPSSVGFFAEAGLDYVS
     CSPFRVPIARLAAAQVVVA
     SEQ ID No ： 24
     因此， 具有 PPDK 活性的多肽可包含基本上如 SEQ ID No ： 23 或 SEQ ID No.24 所示 的氨基酸序列或者其功能变体或片段。 因为几乎唯一地在包含编码 PPDK 的基因组 DNA 的细 胞系中， 观察到最大的 PPDK 丰度， 因此似乎内含子可能对 PPDK 表达具有积极作用。因此， 在一个实施方案中， 构建体可包含编码 PPDK 和 / 或 PCK 的基因的 cDNA。
     本发明的遗传构建体可呈表达盒的形式， 其可适用于在宿主细胞中表达至少一个 编码序列。 本发明的遗传构建体无需整合到载体中便可导入宿主细胞。 例如， 可将可以是核 酸分子的遗传构建体掺入脂质体或病毒颗粒内。或者， 可通过合适的方法 ( 例如直接胞吞 摄取 ) 将纯化的核酸分子 ( 例如不含组蛋白的 DNA 或裸 DNA) 直接插入宿主细胞中。可通 过转染、 感染、 显微注射、 细胞融合、 原生质体融合或弹道轰击 (ballistic bombardment)， 将遗传构建体直接导入宿主受试者 ( 例如植物 ) 的细胞。或者， 可使用基因枪将本发明的 遗传构建体直接导入宿主细胞中。或者， 可将遗传构建体包含在用于在合适的宿主细胞中 表达的重组载体内。
     因此， 在第三个方面， 提供包含第一个方面或第二个方面的遗传构建体的重组载 体。
     重组载体可以是质粒、 黏粒或噬菌体。这类重组载体高度可用于用本发明的遗传 构建体转化宿主细胞和复制其中的表达盒， 。 技术人员应了解的是， 本发明的遗传构建体可 与的许多类型的骨架载体组合用于表达目的。 骨架载体可以是二元载体 (binary vector)， 例如可在大肠杆菌 (E.coli) 和根癌土壤杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) 两者中复制 的二元载体。例如， 合适的载体可以是 pBIN 质粒， 例如 pBIN19。然而， 优选的骨架载体以 pBINPLUS 为基础 (F.A.van Engelen 等， Transgenic Research(1995)4， 288-290) 且具有 SAG12 启动子的 BNP1380000001。
     除启动子 ( 例如衰老相关启动子 ) 以外， 重组载体还可包括多种其它功能元件和至少一个编码序列 ( 编码 PCK 和 / 或 PPDK)。例如， 可设计重组载体， 使得载体在宿主细胞 的细胞溶胶中自主复制。在这种情况下， 在重组载体中可能需要诱导或调节 DNA 复制的元 件。或者， 可设计重组载体， 使得重组载体整合到宿主细胞的基因组中。在这种情况下， 设 想有利于目标整合 ( 例如通过同源重组 ) 的 DNA 序列。
     重组载体还可包含编码在克隆方法中可用作选择标记的基因的 DNA， 即能够选出 已被转染或转化的细胞， 并且能够选出包含整合异源 DNA 的载体的细胞。载体还可包含参 与调节编码序列的表达或者用于将表达的多肽靶向宿主细胞某一组成部分 ( 例如叶绿体 ) 的 DNA。因此， 第三个方面的载体可包含至少一个选自以下的其它元件 ： 选择标记基因 ( 例 如抗生素抗性基因 )、 多肽终止信号和蛋白质靶向序列 ( 例如叶绿体转运肽 )。
     合适的标记基因的实例包括抗生素抗性基因， 例如赋予卡那霉素、 遗传霉素 (G418) 和潮霉素 (npt-II、 hyg-B) 抗性的基因 ； 除草剂抗性基因， 例如赋予草丁膦和磺胺类 除草剂抗性的基因 ( 分别为 bar 和 suI ； EP-A-242246、 EP-A-0249637) ； 以及筛选标记， 例如 β- 葡糖醛酸糖苷酶 (GB2197653)、 萤光素酶和绿色荧光蛋白 (GFP)。标记基因可受第二启 动子 ( 其可以不是衰老相关启动子 ) 控制， 所述第二启动子允许在细胞 ( 其可在种子中或 不在种子中 ) 中表达， 从而允许在植物发育的任何阶段选出含有标记的细胞或组织。合适 的第二启动子是土壤杆菌属 (Agrobacterium) 的胭脂氨酸合成酶基因的启动子和来源于 编码 35S 花椰菜花叶病毒 (CaMV) 转录物的基因的启动子。然而， 可以采用任何其它合适的 第二启动子。
     可采用图 1 中描述的克隆方法， 制备本发明的遗传构建体的各个实施方案， 可将 该方法概括如下。可使用合适的引物， 通过 PCR 从基因组或 cDNA 模板扩增编码 PCK 和 PPDK 的基因的基因组形式和 cDNA 形式。可采用琼脂糖凝胶电泳检查 PCR 产物。然后， 可将 PCR 产物与合适的载体连接用于克隆目的， 例如 pCR4 Blunt-TOPO 载体 (Invitrogen)。可使包 含 PCR 产物的载体在合适的宿主 ( 例如大肠杆菌 ) 中生长。然后使用合适的引物通过 PCR 筛选大肠杆菌菌落， 并用合适的引物对具有正确的限制性内切酶消化谱的质粒中的插入片 段进行测序。
     可培养携带 TOPO-cDNA(PCK 或 PPDK) 或 TOPO-gDNA(PCK 或 PPDK) 的大肠杆菌菌 落以产生适量的各种质粒， 然后可对质粒进行纯化。随后可消化质粒释放编码 PPDK 或 PCK 的 DNA 片段， 然后可将该片段克隆至包含合适启动子 ( 例如 SAG 启动子 ) 的载体， 例如 pBNP 质粒。所得 PPDK 构建体称为 BNP-PPDKcDNA 和 BNP-PPDKgDNA， 所得 PCK 构建体称为 pALBNP1(cDNA) 和 pALBNP2(gDNA)。
     第三个方面的载体的实施方案基本上可如图 3 所示。
     在第四个方面， 提供提高试验植物叶中的 PCK 和 / 或 PPDK 浓度至高于培养在相同 条件下的野生型植物中相应的 PCK 和 / 或 PPDK 浓度的方法， 所述方法包括改变试验植物的 植物代谢以便在叶衰老开始后使 PCK 和 / 或 PPDK 在植物叶中的水平得到提高。
     在第五个方面， 提供降低试验植物叶中的氮浓度至低于培养在相同条件下的野生 型植物中相应的氮浓度的方法， 所述方法包括改变试验植物的植物代谢以便在叶衰老开始 后使 PCK 和 / 或 PPDK 在植物叶中的水平得到提高。
     在第六个方面， 提供与培养在相同条件下的野生型植物相应的生长速度相比提高 试验植物的生长速度的方法， 所述方法包括改变试验植物的植物代谢以便在叶衰老开始后使 PCK 和 / 或 PPDK 在植物叶中的水平得到提高。
     实施例中给出了测定植物叶中的氮水平和植物生长速度的方法。第四个方面、 第 五个方面或第六个方面的方法可包括用第一个方面或第二个方面的遗传构建体或第三个 方面的载体转化试验植物细胞。可通过任何合适的方法将遗传构建体或载体导入宿主细 胞。
     在第七个方面， 提供包含第一个方面或第二个方面的遗传构建体或第三个方面的 重组载体的细胞。
     细胞可以是植物细胞。因为本发明人已观察到， PCK 和 / 或 PPDK 两者在宿主细胞 中过表达在诱导衰老叶中的氮素再动员方面出乎意料地有效， 所以第七个方面的细胞可包 含一个或多个第一个方面或第二个方面的构建体或者一个或多个第三个方面的载体， 使得 PCK 和 / 或 PPDK 两者均过表达。
     例如， 宿主细胞可只用第一个方面的遗传构建体的第一个实施方案 ( 即 PCK 构建 体 ) 转化。或者， 宿主细胞可只用第二个方面的遗传构建体的第二个实施方案 ( 即 PPDK 构 建体 ) 转化。在另一个实施方案中， 宿主细胞可用第一个方面的遗传构建体的第一和第二 个实施方案转化， 使得 PCK 和 PPDK 两者在宿主细胞中表达。或者， 宿主细胞可用第一个方 面的构建体的第三或第四个实施方案 ( 即 PCK/PPDK 构建体 1 或 2) 转化， 使得 PCK 和 PPDK 两者在宿主细胞中表达。还设想宿主细胞可用第二个方面的编码 PCK 和 PPDK 两者的构建 体转化。
     细胞可采用已知技术用本发明的遗传构建体或载体转化。 用于将遗传构建体导入 宿主细胞的合适方法可包括通过本领域已知方法 ( 例如 EP-A-0116718 和 EP-A-0270822 所 述方法 )， 利用土壤杆菌属所携带的卸甲 Ti- 质粒载体。 另一种方法可以是转化植物原生质 体， 这涉及先除去细胞壁并导入核酸， 然后重整细胞壁。随后可使转化细胞生长成植物。
     第八个方面， 提供包含第一个方面或第二个方面的遗传构建体或者第三个方面的 载体的转基因植物。
     第 八 个 方 面 的 转 基 因 植 物 可 包 括 十 字 花 科 (Brassicaceae)， 例如芸苔属 (Brassica spp.)。植物可以是欧洲油菜 ( 油料种子油菜 )。
     第八个方面的转基因植物的其它实例包括禾本科 (Poales)， 例如 Triticeae spp。 植物可以是小麦属 (Triticum spp.)( 小麦 )。 提高小麦的籽粒蛋白含量可导致包含小麦的 食品 ( 例如面包 ) 的体积增加。
     第八个方面的合适转基因植物的其它实例包括茄科 (Solanaceae) 植物， 其包 括 例 如 曼 陀 罗、 茄 子、 茄 参 (mandrake)、 颠 茄 (deadly nightshade、 belladonna)、 辣椒 (capsicum、 paprika、 chilli pepper)、 马铃薯和烟草。合适的茄科属的一个实例是烟草属 (Nicotiana)。烟草属合适的品种可称为烟草植物， 简称烟草。用第一个方面或第二个方面 的遗传构建体或者第三个方面的载体转化植物的各种方法是已知的， 均可用于本发明。
     例如， 可如下转化烟草。 采用基本上按 Horsch 等 (Science 227 ： 1229-1231， 1985) 所述的叶盘共培养方法转化烟草 (Nicotiana tabacum)。可从 7 周大的烟草植物采摘最幼 嫩的两片扩展叶， 可在 8％ DomestosTM 中进行表面灭菌 10 分钟后， 用无菌蒸馏水洗涤 6 次。 可用 6 号木塞钻孔器切取叶盘， 并放于含有合适二元载体 ( 按照本发明 ) 的土壤杆菌悬液 中约 2 分钟。 可在两张无菌滤纸间将叶盘轻轻吸干。 可将 10 个叶盘放在 LS 3％蔗糖 +2μMBAP+0.2μMNAA 平板上， 然而将其在生长室中培育 2 天。可将叶盘转移到补充了 500g/l 凯 福隆和 100g/l 卡那霉素的 LS+3％蔗糖 +2μM BAP+0.2μM NAA 的平板中。2 周后， 可将叶 盘转移到上述培养基的新平板上。再过 2 周后， 可将叶盘转移到含有补充了 500mg/l 凯福 隆和 100mg/l 卡那霉素的 LS+3％蔗糖 +0.5μM BAP 的平板上。 每两周可将叶盘转移到新鲜 培养基中。 在芽出现时， 可切下芽， 并将芽转移到补充了 500mg/l 凯福隆的 LS+3％蔗糖的广 口瓶中。大约 4 周后， 可将广口瓶中的芽转移到 LS+3％蔗糖 +250mg/l 凯福隆中。再过 3-4 周后， 可将植物转移到 LS+3％蔗糖 ( 无抗生素 )， 并生根。一旦植物生根， 便将其转移到温 室的土壤中。
     在 第 九 个 方 面， 提 供 获 自 第 八 个 方 面 的 转 基 因 植 物 的 植 物 繁 殖 产 品 (plant propagation product)。
     “植物繁殖产品” 可以是取自植物中的任何植物物质， 自其可产生其它植物。植物 繁殖产品可适宜为种子。
     在本发明的第十个方面， 提供产生转基因植物的方法， 所述转基因植物以比培养 在相同条件下的相应野生型植物高的速度再动员氮素， 所述方法包括以下步骤 ：
     i) 用第一个方面或第二个方面的遗传构建体或者第三个方面的载体转化植物细 胞； 和
     ii) 从转化细胞再生植物。
     在第十一个方面， 提供产生具有比培养在相同条件下的相应野生型植物快的生长 速度的转基因植物的方法， 所述方法包括以下步骤 ：
     i) 用第一个方面或第二个方面的遗传构建体或者第三个方面的载体转化植物细 胞； 和
     ii) 从转化细胞再生植物。
     优选且有利的是， 本发明的方法不会损害所产生的试验植物的健康或适应性。优 选所述方法包括用第一个方面或第二个方面的遗传构建体或者第三个方面的载体转化试 验植物， 优选植物叶。本发明人观察到， 在宿主细胞中过表达 PCK 和 PPDK 两者有效诱导在 衰老叶中的氮素再动员。 因此， 优选的是， 第十个方面和第十一个方面的方法包括用本发明 的一个或多个构建体转化试验植物使得 PCK 和 PPDK 两者过表达。例如， 试验植物可用本发 明第一个方面的遗传构建体的第一个实施方案 ( 即 PCK 构建体 ) 转化， 并再用第一个方面 的构建体的第二个实施方案 ( 即 PPDK 构建体 ) 转化。因此， 这两个构建体的转化导致两种 酶的过表达。或者， 试验植物可用本发明第一个方面的构建体的第三或第四个实施方案转 化， 每个所述构建体都编码 PCK 和 PPDK。 或者， 试验植物可用本发明第二个方面的构建体转 化， 其既编码 PCK 又编码 PPDK。
     本发明人观察到， 已用编码 PCK 和 PPDK 两者的构建体转化的试验植物的植物叶显 示在开始衰老时氮素再动员增加， 使得该叶中的氮浓度下降。 此外， 本发明人观察到营养生 长速度增加。虽然本发明人不受假说束缚， 但是本发明人认为叶中氮浓度的降低可诱导生 长速度提高， 从而诱导作物产量提高。
     在本发明的第十二个方面， 提供与采自培养在相同条件下的野生型植物的收获叶 中相应的氮水平相比含有较低氮水平的收获叶， 其中所述叶自第八个方面的转基因植物收 获， 或者由第十个方面或第十一个方面的方法产生。在本发明的第十三个方面， 提供包含获自突变体烟草植物的氮降低的烟草的吸烟 制品， 所述突变体能够降低衰老叶中的氮浓度。
     氮降低的烟草可包括其中氮浓度小于培养在相同条件下的野生型植物中的相应 浓度的烟草。这类吸烟制品可包含获自突变型烟草植物的烟草， 所述烟草植物可用本发明 第一个方面或第二个方面的遗传构建体或者第三个方面的载体转化。
     本文使用的术语 “吸烟制品” 可包括可点燃抽吸的产品， 例如不论是以烟草、 烟草 衍生物、 膨胀烟丝、 再造烟叶为基料还是以烟叶代用品为基料的卷烟、 香烟、 雪茄和小雪茄， 以及加热无燃烧产品。
     应理解的是， 本发明提供基本上包含本文提及的任何序列的氨基酸序列或核酸序 列 ( 包括其功能变体或功能片段 ) 的任何核酸或肽或其变体、 衍生物或类似物。术语 “基 本上的氨基酸 / 多核苷酸 / 多肽序列” 、 “功能变体” 和 “功能片段” ， 可以是与本文提及的任 一个序列的氨基酸 / 多核苷酸 / 多肽序列有至少 40％序列同一性的序列， 例如与 SEQ ID No.17 规定的基因 ( 其编码 PCK 酶的一个实施方案 ) 有 40％同一性， 或与 SEQ ID No.19 规 定的多肽 ( 即 PCK 酶的一个实施方案 ) 有 40％同一性， 或与 SEQ ID No.21 规定的基因 ( 其 编码 PPDK 酶的一个实施方案 ) 有 40％同一性， 或与 SEQ ID No.23 规定的多肽 ( 即 PPDK 酶 的一个实施方案 ) 有 40％同一性。 还设想了与所提及的任何序列具有以下序列同一性的氨基酸 / 多核苷酸 / 多肽序 列： 大于 65％、 更优选大于 70％、 甚至更优选大于 75％、 还更优选大于 80％的序列同一性。 优选氨基酸 / 多核苷酸 / 多肽序列与所提及的任何序列有至少 85％同一性， 更优选与本文 提及的任何序列有至少 90 ％同一性、 甚至更优选至少 92 ％同一性、 甚至更优选至少 95 ％ 同一性、 甚至更优选至少 97％同一性、 甚至更优选至少 98％同一性和最优选至少 99％同一 性。
     技术人员应了解如何计算 2 个氨基酸 / 多核苷酸 / 多肽序列之间的百分比同一 性。为了计算 2 个氨基酸 / 多核苷酸 / 多肽序列间的百分比同一性， 首先必须准备好 2 个 序列的比对， 接着计算序列同一性值。 2 个序列的百分比同一性可根据以下方面采用不同的 值： (i) 用于比对序列的方法， 例如 ClustalW、 BLAST、 FASTA、 Smith-Waterman( 在不同的程 序中执行 )， 或来自 3D 比较的结构比对 ； 和 (ii) 比对方法所采用的参数， 例如局部与整体 比对、 所采用配对计分矩阵 ( 例如 BLOSUM62、 PAM250、 Gonnet 等 ) 和空位罚分， 例如功能型 和常数。
     如果完成了比对， 则有许多不同的计算 2 个序列之间的百分比同一性的方法。例 如， 可将相同的数目除以 ： (i) 最短序列的长度 ； (ii) 比对的长度 ； (iii) 序列的平均长度 ； (iv) 非空位位置的数目 ； 或 (iv) 突出端以外的等同位置的数目。 此外， 应理解的是， 百分比 同一性还是强烈地长度依赖性的。因此， 序列对越短， 可预期偶尔发生的序列同一性越高。
     因此， 应理解的是， 蛋白质或 DNA 序列的准确比对是一个复杂过程。常用的多重比 对程序 ClustalW(Thompson 等， 1994， Nucleic Acids Research， 22， 4673-4680 ； Thompson 等， 1997， Nucleic Acids Research， 24， 4876-4882) 是用于产生本发明蛋白质或 DNA 的多 重比对的优选方法。 ClustalW 的合适参数可为如下 ： 对于 DNA 比对 ： 空位开发罚分＝ 15.0， 空位延伸罚分＝ 6.66， 矩阵＝同一性。 对于蛋白质比对 ： 空位开发罚分＝ 10.0， 空位延伸罚 分＝ 0.2， 矩阵＝ Gonnet。对于 DNA 和蛋白质比对 ： ENDGAP ＝ -1， GAPDIST ＝ 4。本领域技
     术人员应清楚， 对于最佳序列比对可能需要改变这些参数和其它参数。
     优选然后按 (N/T)*100 由这类比对计算出 2 个氨基酸 / 多核苷酸 / 多肽序列之 间的百分比同一性计算值， 其中 N 为序列具有相同残基的位置的数目， T 为所比较的包括空 位但不包括突出端的位置总数。因此， 用于计算 2 个序列之间的百分比同一性的最优选的 方法包括 (i) 应用 ClustalW 程序， 采用一组合适参数 ( 例如上述参数 ) 准备序列比对 ； 和 (ii) 将 N 值和 T 值代入下列公式 ： 序列同一性＝ (N/T)*100。
     用于鉴定类似序列的备选方法为本领域技术人员所知。例如， 基本相似的核苷酸 序列可由与 SEQ ID Nos.16、 17、 18、 20、 21、 22 所示序列或其互补序列在严格条件下杂交的 序列编码。所谓严格条件， 意指核苷酸在 3x 氯化钠 / 柠檬酸钠 (SSC) 中于约 45℃与滤器结 合的 DNA 或 RNA 杂交， 接着在 0.2x SSC/0.1％ SDS 中于约 20-65℃洗涤至少一次。或者， 基 本相似的多肽可因至少 1 个但少于 5、 10、 20、 50 或 100 个氨基酸而不同于 SEQ ID Nos.19、 23 或 24 所示序列。
     由于遗传密码的简并性所致， 显然， 任何核酸序列可在基本上不影响由其编码的 蛋白质的序列的情况下被改变或变动， 以提供其功能变体。合适的核苷酸变体是以下核 苷酸变体， 其具有通过编码相同氨基酸的不同密码子在序列内的取代从而产生沉默改变 (silent change) 而改变的序列。其它合适的变体是具有同源核苷酸序列但包含通过不同 密码子的取代而改变的全部或部分序列的变体， 所述密码子编码与其取代的氨基酸具有类 似生物物理学性质的侧链的氨基酸以产生保守改变。例如小的非极性疏水氨基酸， 包括甘 氨酸、 丙氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸、 缬氨酸、 脯氨酸和甲硫氨酸。大的非极性疏水氨基酸包括 苯丙氨酸、 色氨酸和酪氨酸。 极性的中性氨基酸包括丝氨酸、 苏氨酸、 半胱氨酸、 天冬酰胺和 谷氨酰胺。带正电荷的 ( 碱性 ) 氨基酸包括赖氨酸、 精氨酸和组氨酸。带负电荷的 ( 酸性 ) 氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。因此应理解的是， 氨基酸可被具有相似生物物理学性质的 氨基酸置换， 技术人员已知编码这些氨基酸的核苷酸序列。
     本文所述的全部特征 ( 包括任何随附的权利要求、 摘要和附图 ) 和 / 或所公开的 任何方法或过程的全部步骤都可以任何组合与任何上述方面组合， 其中这些特征和 / 或步 骤的至少一些是互为排斥的组合除外。
     为了更好地理解本发明， 并显示可如何实施本发明的实施方案， 现参照附图举例 说明， 其中 ：
     图 1 表示用于克隆遗传构建体 BNP-PPDKcDNA 和 BNP-PPDKgDNA 的方案， 其中 ： (a) 拟南芥 PPDK 胞质同工型的 cDNA 和基因组 DNA 形式的 PCR 扩增 ； (b) 插入克隆载体 pCR 4Blunt-TOPO ； (c) 用 AvrII 和 BamHI 限制性内切核酸酶消化克隆载体 ( 左侧 ) 以释放 PPDK， 以及含有靶标 SAG12 的载体 pBNP( 右侧 ) ； (d) 将 PPDK 与 pBNP 连接， 琼脂糖凝胶显示通过 用 AvrII 和 BamHI 对构建体的限制性内切核酸酶消化产生的 DNA 片段 ； 和 (e) 通过土壤杆 菌介导的转化将构建体导入拟南芥生态型 Columbia 0 中 ；
     图 2a 表示用于构建本发明表达载体的质粒 pCR4BLUNT-TOPO， 图 2b 是利用 AvrII 和 BamHI 消化将编码 PPDK 的 cDNA 或 gDNA 插入 pCR4BLUNT-TOPO 的一览表 ；
     图 3a 表示含有 SAG12 启动子的质粒 pBNP， 图 3b 是利用 AvrII 和 BamHI 消化将 PPDK 插入片段 (cDNA 或 gDNA) 导入 pBNP 中， 以及利用 XbaI 和 SacI 消化将 PCK 插入片段 (cDNA 或 gDNA) 导入 pBNP 产生本发明实施方案的载体的一览表 ；图 4 表示通过蛋白质印迹选择转基因 SAG12-PPDK 鼠耳芥细胞系。上图表示 SAG12-PPDK cDNA 细胞系， 下图表示 SAG12-PPDKgDNA 细胞系 ；
     图 5 表示从第五周起野生型、 ΔPPDK 和 5 个独立的 SAG12-PPDKgDNA 品系的 PPDK 丰度的定量测定 ；
     图 6 表示在 (b)K326 和 (c)Burley 21 烟草品系中对 SAG12-PPDK(cDNA 和 gDNA) 的选择 ；
     图 7 表示在 K326 烟草成熟叶中 PPDK 的过表达 ；
     图 8 表示鼠耳芥的不同细胞系即野生型、 ΔPPDK 和 SAG12-PPDKgDNA 随时间而变 化的莲座叶丛照片 ；
     图 9 表示第 9 周的拟南芥繁殖组织质量 ；
     图 10 表示自播种后第 3 周到第 9 周野生型和 SAG12-PPDgDNA 植物总的植物鲜质 量 ( 即莲座叶丛加繁殖组织 ) ；
     图 11 第 7 周时野生型、 ΔPPDK 和 SAG12-PPDKgDNA 植物叶中的氮含量 ；
     图 12 表示野生型、 ΔPPDK 和 SAG12-PPDK 植物单粒种子的氮含量 ；
     图 13 表示野生型、 ΔPPDK 和 SAG12-PPDKgDNA 拟南芥细胞系叶中的总游离氨基酸 含量 ；
     图 14 表示不同烟草细胞系的种子质量， 零拷贝＝野生型， G4(gDNA)、 G10、 G8 和 C10(cDNA) 是 SAG12-PPDK 品系 ；
     图 15 表示不同烟草细胞系的种子氮含量， 零拷贝＝野生型， G4(gDNA)、 G10、 G8 和 C10(cDNA) 是 SAG12-PPDK 品系 ；
     图 16 为 PCK/PPDK 双重插入片段的蛋白质印迹结果。所有品系都显示与 SAG12 启 动子活性相关的较高水平的 PCK， 尤其在第 7 周 ；
     图 17 表示与对照 7 相比， 转化植物中 PCK 和 PPDK 两者的表达导致莲座叶丛质量 增加 ； 和
     图 18 表示假设的生化途径， 表明了可通过转运氨基酸天冬酰胺和谷氨酰胺的 PCK- 和 PPDK- 依赖性形成产生氮素再动员。 实施例 实施例 1-SAG12 启动子拟南芥 PPDK 植物转化构建体的产生
     如图 3 所示， 制备一系列的 SAG12PPDK 和 PCK 表达载体， 然后分析其在转化植物中 提高表达 PPDK 和 PCK 的能力。在一个实施方案中， 构建体可编码 PCK 或者其功能变体或片 段， 而不编码 PPDK。 在另一个实施方案中， 构建体可编码 PPDK 或者其功能变体或片段， 而不 编码 PCK。然而， 在又一个实施方案中， 构建体可编码 PCK 或者其功能变体或片段以及 PPDK 或者其功能变体或片段。首先， 如下所述分离鼠耳芥 PPDK 基因的基因组 DNA。
     基因组 DNA 的分离
     按 照 推 荐 的 方 案， 使 用 DNeasy 植 物 微 型 试 剂 盒 (DNeasy Plant Mini Kit) (Qiagen) 从叶中提取鼠耳芥生态型 Columbia 0 的基因组 DNA(gDNA)。使用表 1 概括的引 物序列， 将基因组 DNA 用作下述 PCR 反应的模板。
     表1： 引物序列
     SEQ ID No. 1 2 7 3 4 5 6 10 12 11 8 9 13 15 14 25 26AAT CCT AGG ATG ATG CAG CGA GTA TTC ACC AAT GGA TCC TCA TGC AAC AAC TAC TTG AGC AGC CCT CGC CAA AGG AAT CTT AC CTT GGC TTG AAC GAC CAA GTC GGT TGC AGG GAT AGG AAC ACC CGT CTG ATT GCA TCA GCC CAG CCT GAG GAG TTC CTA CAA GTG TGC CTG CTT GCC GAA TAT C CAG AAA AGC GGC CAT TTT CCA CCA CCG GCC CAC AGT CGA TGA CAA GAC CGG CAA CAG GAT TCA ACC CCA TCT CAG TAC CCT TCT G CTC AAC CTT CCA CCG TGT GAT TCT ACG GTG CCA AAT TCG CCG A ACC GGT GTG CTT CCT CTT GAA ATTTCTAGAATGTCGGCCGGTAACGGAAATG ATTGAGCTCCTAAAAGATAGGACCAGCAGCGRNA 的分离和 cDNA 的合成
     由 7 天大的拟南芥子叶提取总 RNA。使用不含 RNA 酶的装置在冰浴上进行 RNA 提 取， 用焦碳酸二乙酯 (DEPC， Sigma-Aldrich) 处理的水制备溶液。每 1 升水加入 1ml DEPC， 在通风橱中将混合物搅拌过夜， 然后高压灭菌。 使用 TriPure 分离试剂 (TriPure Isolation Reagent)(Roche) 提取 RNA。 将 200mg 组织在液氮用研钵和研杵研磨， 加入 1mlTriPure 分离 试剂， 并按照所推荐的方案进行。将 RNA 沉淀重新悬浮于预加热至 60℃达 10 分钟的 20μl RNA Secure(Ambion) 中。在 4℃下将样品以 13,000rpm 离心 5 分钟， 将上清液转移到干净 的 1.5ml 微量离心管中以除去污染的碎片。
     利用 Eppendorf Biophotometer 分光光度计， 通过在 260 和 280nm 下读取读数， 用分光光度法测定 RNA 的量和纯度 (Maniatis 等， 1982， Molecular cloning ： a laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory)。 还 使 用 1.5 ％ (w/v) 琼 脂 糖 (Melford Laboratories) 于 0.5x TBE 中， 利用琼脂糖凝胶电泳对 RNA 进行检查。 将样品悬浮于 1x RNA 样品缓冲液中， 使用 0.5x TBE 作为运行缓冲液， 在 80V 下进行电泳。 4x 工作浓度的 RNA 样品 缓冲液包含 0.002％ (w/v) 溴化乙锭 (Sigma-Aldrich)、 含有 180mM Tris-HCl、 180mM 硼酸和 8mM EDTA(pH 8.3) 的 2x TBE(2x Tris- 硼酸 -EDTA 缓冲液 (2x TBE)、 13％菲可 400(Ficoll 400)(Sigma-Aldrich)、 0.01％溴酚蓝和 7M 脲 (Ficher Scientific)。
     使用 2μg RNA、 1μg 寡聚 dT(15) 引物 (Roche)、 1x 莫洛尼鼠白血病毒 (MMLV) 缓冲 液 (Promega)、 0.4mM dNTPs(Bioline)、 40 单位重组 RNasin 核糖核酸酶抑制剂 (Promega)、 200 单位 MMLV 反转录酶 (Promega) 和不含核酸酶的水至 25μl 的最终体积， 来进行 RNA 反 转录以合成 cDNA。将样品在 42℃下温育 1 小时。
     拟南芥 PPDK 的扩增
     使用表 1 所示的含有 AvrII 限制位点的正向引物 (AtCytFWD-AvrII， SEQ ID No.1) 和含有 BamHI 限制位点的反向引物 (AtCytREV-BamHI， SEQ ID No.2)， 通过 PCR 由基因组 或 cDNA 模板扩增编码 PPDK 的胞质同工型的基因的基因组形式和 cDNA 形式。PCR 反应混 合物包含 1x HF 缓冲液 (NEB)、 2mM 氯化镁 (MgCl2， NEB)、 0.5mM dNTPs(Bioline)、 100ng 模 板 (cDNA 或 基 因 组 DNA)、 0.5μM 各 引 物 和 1 单 位 Phusion 高 保 真 DNA 聚 合 酶 (Phusion High-Fidelity DNA Polymerase)(NEB)。 使用 Techne 热循环仪 (Techne Thermal Cycler)， 以 98℃ 30 秒钟的起始变性步骤， 接着 98℃ 10 秒钟、 55℃ 30 秒钟和 72℃ 2 分钟的 30 个循 环以及 72℃ 5 分钟的最终延伸步骤， 进行热循环。
     一旦分离 / 制成拟南芥 PPDK 的 cDNA 和 gDNA， 便采用图 1 概述的方案， 将其用来产 生各种构建体。将拟南芥 PPDK 的胞质同工型的 cDNA 和基因组 DNA 形式与 pBNP 载体中的 衰老诱导型 SAG12 启动子融合， 从而在衰老期间过表达 PPDK。
     (a) 使用含有 AvrII 和 BamHI 限制位点的引物， 对拟南芥 PPDK 的胞质同工型的 cDNA 和基因组 DNA 形式进行 PCR 扩增， 分别产生 2.4 和 4.3kb 产物。
     (b) 插入克隆载体 pCR 4Blunt-TOPO 中。对 PPDK 插入片段进行整体测序， 发现与 预期序列相同。
     (c) 用 AvrII 和 BamHI 对克隆载体和目标载体 pBNP 进行限制性内切核酸酶消化。
     (d) 与 BNP 连接， 琼脂糖凝胶显示通过用 AvrII 和 BamHI 对构建体的限制性内切核 酸酶消化产生的 DNA 片段。预期 cDNA 构建体的条带大小为 14.8kb 和 2.4kb， gDNA 构建体 的为 14.8kb 和 4.4kb。
     (e) 通过土壤杆菌介导的转化将构建体导入拟南芥生态型 Columbia 0 中。跨连 接位点对构建体进行测序。编码新霉素磷酸转移酶的基因 nptII 赋予植物卡那霉素抗性。 LB 和 RB ： 分别为 T-DNA 的左缘和右缘 ； nos Pro ： 胭脂氨酸合成酶启动子 ； nos t ： 胭脂氨酸 合成酶终止子 ； SAG12Pro ： 拟南芥 SAG12 基因的启动子。
     下面将参照图 1 详细描述构建体的产生 ：
     克隆至 pCR4 Blunt-TOPO 载体
     使用 1 ％ (w/v) 琼脂糖、 0.5μg ml-1 溴化乙锭 (Sigma-Aldrich) 在 0.5xTBE 中， 用琼脂糖凝胶电泳对 PCR 产物进行检查。将样品悬浮于 1xDNA 样品缓冲液 (6x 工作浓度的DNA 样品缓冲液， 包含 50mM Tris( 羟甲基 ) 氨基甲烷 (Tris-HCl， Melford Laboratories)、 60％甘油和 0.25％ (w/v) 溴酚蓝 (Sigma-Aldrich)， 使用 0.5x TBE 作为运行缓冲液， 在 80V 下进行电泳。
     按 照 推 荐 的 方 案， 使 用 QIAQuick PCR 纯 化 试 剂 盒 (Qiagen)， 对 2.6kb 的 PPDK cDNA 条带和 4.4kb 的 PPDK 基因组 DNA 条带进行了纯化， 并使用 30μl 分子生物级水 (BDH Laboratory Supplies) 洗脱。 按照推荐的方案， 使 PCR 产物连接 ( 平端 ) 至 pCR4Blunt-TOPO 载体 (Invitrogen) 中。按照推荐的方法， 将克隆反应物 (2μl) 转化至 50μl 亚克隆效率 DH5a 大肠杆菌 (sub-cloning efficiency DH5a E.coli)(Invitrogen)。 在包含 10g l-1 细菌 用胰蛋白胨 (BD)、 5g l-1 细菌用酵母提取物 (Oxoid) 和 85mM 氯化钠 (Fisher Scientific) 的 Luria-Bertani(LB) 琼脂 (Luria Bertani 培养液 (LB 培养液 ) 中使转化的大肠杆菌细 胞于 37℃生长过夜。在高压灭菌前用 10M 氢氧化钠调节 pH 至 7.0。通过将 1.5％ (w/v) 琼 脂 (BD) 加入含有 50μg ml-1 卡那霉素 (Melford Laboratories) 的 LB 培养液中来制备 LB 琼脂。
     使 用 1x NH4 缓 冲 液 (Bioline)、 2.5mM MgCl2(Bioline)、 0.5mMdNTPs(Bioline)、 0.3μM 各引物 (AtCytFWD-AvrII 和 AtCytREV-BamHI) 即 SEQ ID No 1 和 2 以及 0.5 单位 BioTaq NA 聚合酶 (Bioline)， 通过 PCR 筛选大肠杆菌菌落。 以 95℃ 5 分钟的起始变性步骤， 接着 95℃ 30 秒钟、 55℃ 30 秒钟和 72℃ 4 分 30 秒的 30 个循环以及 72℃ 5 分钟的最终延伸 步骤， 进行了热循环。 如上所述使用 1％ (w/v) 琼脂糖凝胶电泳， 对 PCR 产物进行了检查。 在 -1 37℃的振荡培养箱中， 使含有所需插入片段的菌落在 5ml 含有 50μg ml 卡那霉素的 LB 培 养液中生长过夜。按照推荐的方案， 使用 QIAPrep Spin Miniprep 试剂盒 (Qiagen) 提取质 粒 DNA。 DNA 用含 10 单位 BamHI(NEB1) 的 1x BamHI 缓冲液于 37℃消化 1 小时。 如上所述使 用 1％ (w/v) 琼脂糖凝胶电泳对消化物进行了检查。 使用表 1 所示引物 AtCytFWD-AvrII(SEQ ID No.1)、 AtPPDKSeqF1(SEQ ID No.3)、 AtPPDKSeqF2(SEQ ID No.4)、 AtPPDKSeqR1(SEQ ID No.5)、 AtPPDKSeqR2(SEQ ID No.6) 和 AtCytREV-BamHI(SEQ ID No.2)， 应用 3730DNA 分析 仪 (Applied Biosystems)， 对具有正确的限制性内切酶消化谱的质粒中的插入片段进行了 测序。用 BioEdit(Ibis Biosciences) 对序列进行了分析。
     这些构建体称为 TOPO-PPDKcDNA 和 TOPO-PPDKgDNA， 如图 2a 和图 2b 所示。
     pBNP 构建体的的克隆
     将 PPDK 连接至衰老诱导型启动子 SAG12 控制下的 BNP1380000001 二元载体中。 含有 SAG12 的骨架质粒 BNP1380000001 基于 pBINPLUS(F.A.van Engelen 等， Transgenic Research(1995)4， 288-290)， 如图 3a 所示。首先， 使用携带 TOPO-cDNA 或 TOPO-gDNA 的大 -1 将这些培养物在振荡的 37℃ 肠杆菌菌落接种 25ml 含有 50μg ml 卡那霉素的 LB 培养液。 培养箱中温育过夜， 按照推荐的方案， 使用质粒 Midi 试剂盒 (Plasmid Midi Kit)(Qiagen) 提取质粒 DNA。使用质粒 Midi 试剂盒， 从 100ml 含有 50μg ml-1 卡那霉素的培养物中纯化 出 pBNP1380000001 载体。
     然后， 通过限制性内切酶 AvrII 和 BamHI 对这些质粒进行消化。将消化反应 物 于 37 ℃ 温 育 过 夜， 消 化 反 应 物 包 含 2μg DNA(BNP) 或 4μg DNA(TOPO-PPDKcDNA 和 TOPO-PPDKgDNA)、 1x 缓冲液 2、 10 单位 AvrII 和 10 单位 BamHI。使用结晶紫样品缓冲液 (250μM 结晶紫 (Hopkin and Williams) 和 30 ％ (w/v) 蔗糖 (Fisher Scientific))， 并将含有 25μM 结晶紫的 0.5x TBE 用作运行缓冲液， 使用 0.8％ (w/v) 琼脂糖、 0.5x TBE 和 25μM 结晶紫 (Hopkin and Williams) 在 50V 下进行电泳约 2 小时， 通过结晶紫琼脂糖凝胶 电泳对样品进行分离 (Rand， 1996， 在凝胶电泳期间， 结晶紫可用来观察 DNA 条带， 并改进克 隆效率。Elsevier Trends Journals Technical Tips Online)。将按照推荐的方案采用 QIAQuick 凝胶提取试剂盒 (Qiagen) 的凝胶条带提取法， 用来提取 14.4kb BNP、 2.6kb PPDK cDNA 和 4.4kb PPDK 基因组 DNA 片段。 利用使用溴化乙锭的 1％琼脂糖凝胶电泳， 检查片段， 并确定相对于 HyperLadder I(Bioline) 的量。
     由于基因组 DNA 片段 (4.4kb) 和 TOPO 骨架 (3.9kb) 的大小相似， 因此对凝胶提取 的基因组 DNA 片段进行磷酸酶处理以防止与任何污染的 TOPO 骨架连接。将虾碱性磷酸酶 (SAP， 1 单位， Roche) 加入含 1μg 凝胶提取的基因组 DNA 片段的 1x 去磷酸化缓冲液 (Roche) 中， 将反应物于 37℃温育 30 分钟， 然后于 65℃灭活 10 分钟。使用 10 ∶ 1 摩尔比的 cDNA 或基因组 DNA 片段与消化的 BNP、 1x 连接缓冲液 (NEB) 和 1 单位 T4DNA 连接酶 (NEB) 进行 连接反应。按照推荐的方案， 将连接反应物于 16℃温育过夜， 将 2μl 用来转化文库效率的 DH5_E.coli(library-efficiency DH5_E.coli)(Invitrogen)。
     将转化的大肠杆菌转移到含有 50μg ml-1 卡那霉素的 LB 琼脂中， 并于 37 ℃温 育 过 夜。 使 用 1x NH4 缓 冲 液、 2.5mM MgCl2、 0.5mMdNTPs、 0.3μM 的 表 1 所 示 的 各 引 物 (AtPPDKexon15FWD(SEQ ID No.7) 和 BNPnostREV(SEQ ID No.8) 和 0.5 单位 BioTaq DNA 聚合酶， 通过 PCR 筛选大肠杆菌菌落。以 95℃ 5 分钟的起始变性步骤， 接着 95℃ 30 秒钟、 55℃ 30 秒钟和 72℃ 3 分钟的 30 个循环以及 72℃ 5 分钟的最终延伸步骤， 进行了热循环。 如上应用 1％ (w/v) 琼脂糖凝胶电泳对 PCR 产物进行检查。在 37℃振荡培养箱中， 使含有 -1 所需插入片段的菌落在 5ml 含有 50μg ml 卡那霉素的 LB 培养液中生长过夜。按照推荐 的方案， 使用 QIAPrep Spin Miniprep 试剂盒提取质粒 DNA。将 DNA 用含 10 单位 BamHI 和 10 单位 StuI 的 1x BamHI 缓冲液于 37℃消化 1 小时后， 如上所述进行了 1％ (w/v) 琼脂糖 凝胶电泳。选出具有正确限制性内切酶消化谱的分别由 cDNA 和基因组 DNA 连接产生的一 个菌落， 并使用上述表 1 所示引物 BNP-SAG12FWD(SEQ ID No.9) 进行了测序。
     这些构建体称为 BNP-PPDKcDNA 和 BNP-PPDKgDNA， 如图 3a 和图 3b 所示。
     实施例 2- 鼠耳芥用 BNP-PPDKcDNA 和 BNP-PPDKgDNA 进行转化
     使 用 下 列 质 粒 通 过 电 穿 孔 转 化 根 癌 土 壤 杆 菌 菌 株 GV3101-R ： 图 3 所示 BNP-PPDKcDNA 和 BNP-PPDKgDNA， 实施例 1 中描述了所述质粒的制备。 -1
     从 含 有 25mg l 利 福 平 (Sigma-Aldrich) 的 LB 培 养 液 的 培 养 物 中 制 备 电 转 感受态 (Electrocompetent) 土壤杆菌属， 所述培养物生长在 30 ℃下， 且采用 Eppendorf Biophotometer 分 光 光 度 计 在 600nm 下 测 定 的 光 密 度 为 0.4-0.6。 将 500ml 的 培 养 物 以 4000g 离心 15 分钟， 弃去上清液后， 将细胞重新悬浮于 500ml 冷的 10 ％甘油 (Fisher Scientific) 中。 使用 250ml 甘油， 接着 10ml 甘油和最终 2ml 甘油重复离心和重新悬浮。 将 细胞等分成 50μl 等分样品， 在液氮中速冻， 并保存在 -80℃下。使用 BioRad Gene Pulser 进行电穿孔。将质粒 DNA(200ng) 加入预先冷却的电穿孔小槽 (Gene Pulser Cuvette， BioRad) 中的 50μl 上述土壤杆菌细胞中， 将细胞在冰浴上温育 5 分钟。 采用脉冲 2.5mV、 阻 抗 400ohm 和电容 25μF 以及 1ml SOC(Super Optimal Broth， Catabolite Repression 包 含 20g/l 细菌用胰蛋白胨、 5g/l 细菌用酵母提取物、 85mM 氯化钠和 250mM 氯化钾 )， 对该小槽进行电穿孔。用 10M 氢氧化钠调节至 pH 7.0 后高压灭菌。用前加入无菌氯化镁到 10mM 的终浓度， 并加入无菌葡萄糖 (Fisher Scientific) 至 20mM 的终浓度。将细胞在振荡培养 箱中于 30℃温育 2 小时后， 转移到含有 50μgml-1 卡那霉素和 50μg ml-1 利福平的 LB 琼脂 中。
     在 30℃下温育 2 天后， 通过 PCR， 然后通过限制性内切酶消化来筛选菌落。将 PCR 筛选呈阳性且具有预期的限制酶切消化谱的菌落接种到 5ml 含有 50μl ml-1 卡那霉素和 50μl ml-1 利福平的 LB 培养液中， 并在振荡培养箱中于 30℃温育过夜。次日， 将 600μl 该 培养物用来接种到 500ml 上述 LB 培养液， 在振荡培养箱中于 30℃温育 30 小时后用于花序 浸渍 (floral dipping)。
     将 4 周大的拟南芥植物用于花序浸渍。将所有构建体转化成野生型生态型 Columbia 0。将上述制备的土壤杆菌培养物在 4 ℃下以 5,000g 离心 15 分钟， 将细胞沉 淀重新悬浮于 250ml 无菌 5 ％蔗糖 (Fisher Scientific) 溶液 (w/v) 和 0.05 ％ Silwett L-77(OSi Specialties) 中。 轻轻搅动同时， 将植物浸入细胞悬液约 10 秒钟， 然后盖上薄膜 (clingfilm)， 避开直射光 24 小时。在此之后， 使植物恢复到正常生长方案， 收获种子。
     转基因鼠耳芥的选择
     按照 Harrison 等人 ((2006)， Plant Methods， 2， 19) 的方法， 在 50μgml-1 卡那霉 素 (Dufecha Biochemie) 中选出转化植物的种子。 使具有抗生素抗性的 T1 植物生长至结籽 并自花授粉。如上所述选出种子， 并选出具有 3 ∶ 1 抗性∶非抗性比的 T2 品系作为携带单 一拷贝的转基因。再次使这些植物自花授粉， 并如上选择。选出产生 100％抗性子代 (T3) 的 T2 品系作为纯合品系， 并用于所有实验。应用孟德尔遗传学原理选出对于转基因而言是 纯合的并包含单一转基因拷贝的 T2 代植物。对于用 SAG12-PPDKcDNA 和 SAG12-PPDKgDNA 转化的植物， 各选出 5 个独立的单一插入片段纯合品系。
     实施例 3- 用 BNP-PPDKcDNA 和 BNP-PPDKgDNA 转化烟草。
     使用质粒 BNP、 BNP-PPDKcDNA 和 BNPPPDKgDNA， 如实施例 2 所述通过电穿孔转化 电转感受态根癌土壤杆菌菌株 LBA4404。电穿孔后， 将 1ml LB 培养液加入经电穿孔的细 胞中， 然后将其在振荡培养箱中于 28℃温育 2 小时后， 转移到含有 50μg ml-1 卡那霉素和 100μgml-1 大观霉素 (Sigma-Aldrich) 的 LB 琼脂中。在 28℃下温育 2 天后， 将一个菌落用 -1 -1 来接种 50ml 含有 50μg ml 卡那霉素和 100μg ml 大观霉素的 LB 培养液。将该培养物 在振荡培养箱中于 28℃温育 3 天。通过限制性内切酶消化， 提取质粒 DNA 并进行分析， 将 -1 -1 50μl 培养物用于接种 50ml 含有 50μg ml 卡那霉素和 100μg ml 大观霉素的 LB 培养 液中。将该培养物在振荡培养箱中于 28℃温育过夜。
     将烟草栽培品种 Burley 21 和 K326 自种子生长， 从 8 周大的植物上切取最幼嫩 的叶， 在 8％ (v/v)Domestos 浓漂白液 (Domestos thick bleach)(Domestos) 中灭菌 10 分 钟后， 在无菌蒸馏水中漂洗。使用 6 号木塞钻孔器钻取叶盘， 然后将叶盘放入 25ml 土壤杆 菌培养物中 2 分钟。然后将叶盘面朝下放入含有 2.2μM 6- 苄氨基嘌呤 (BAP) 和 0.27μM a- 萘乙酸 (NAA) 的 MS 培养基上。将这些培养基放入 22℃生长室中 2 天。然后将叶盘转移 到含有 500μg ml-1 凯福隆 (clarofan)(Roussel Laboratories)( 非共培育对照 ) 或 500μg ml-1 凯福隆和 100μg ml-1 卡那霉素的上述选择性 MS 培养基中。每 14 天将叶盘转移到上 述新鲜的选择性 MS 培养基中， 持续 6 周。然后从叶盘上取出愈伤组织和芽块， 并放入含有0.5μM BAP、 500μg ml-1 凯福隆和 100μg ml-1 卡那霉素的 LS 培养基上。2 周后， 将芽转移 -1 到装有含 0.5μM BAP、 500μg ml 凯福隆和无卡那霉素的 LS 培养基的 150ml 广口瓶中。
     在随后的 3 周后， 将优势芽转移到含有 250μg ml-1 凯福隆和无 BAP 或卡那霉素的 LS 培养基上。再过 3 周后， 通过将芽尖转移到无抗生素或 BAP 的 LS 培养基， 来进一步清洗 芽。当长出充足的根时， 将植物转移到温室的土壤中。
     转基因烟草的选择
     采用定量 PCR(Q-PCR) 确定 T0 和 T1 植物的转基因拷贝数。可能的话， 选择单一插 入片段 T0 和纯合的 T1 植物用于分析。对转基因检测， 使用表 1 所示的引物 BNP-1271F(SEQ ID No.10) 和 BNP-1334R(SEQ ID No.11)， 并使用退火至 nptII 转基因上的 Vic/TAMARA 标记 的探针 BNP1291TV(SEQ ID No.12)。对于内部定量， 使用引物 NtCyc-184F(SEQ ID No.13) 和 NtCyc-316R(SEQ ID No.14)， 并使用退火至编码亲环蛋白的内源基因的 FAM/TAMARA 标记 的探针 NtCyc-267T(SEQ ID No.15)。通过比较 Ct 方法 (Comparitive Ct method， ΔΔCt 方法， Bubner 和 Baldwin(2004)， Plant Cell Reports， 23， 263-271) 进行定量。反应混 合物包含 1x Universal Master Mix(ABI)、 0.9μM 各引物、 0.2μM 各探针 ( 对于 BNP 和 NtCyc 引物和探针采用单独的反应 ) 以及约 500ng 基因组 DNA 模板， 其按照推荐的方案， 使 用 DNeasy 植物微型试剂盒 (Qiagen) 从叶组织提取。在 7900HT 快速实时 PCR 系统 (7900HT Fast Real-Time PCR System， Applied Biosystems) 中以 95℃ 10 分钟的起始变性步骤， 接 着 95℃ 15 秒钟和 60℃ 1 分钟的 40 个循环进行热循环。 运用所提供的 SDS2.2 软件 (Applied Biosystems) 对数据进行分析。
     在 转 化 的 T0 代 K326 和 Burley 21 烟 草 的 组 织 培 养 中 再 生 后， 应用定量 PCR(Q-PCR) 选择携带转基因单一拷贝的植物。 选择单一插入片段植物以降低转基因沉默的 可能性。使用与编码新霉素磷酸转移酶的 nptII 转基因互补的寡核苷酸进行 Q-PCR。该基 因存在于转移到构建体 pBNP、 BNP-PPDKcDNA 和 BNP-PPDKgDNA 的植物基因组中的 T-DNA 的 左缘和右缘之间。用 pBNP 转化的植物只用作空载体对照， 以确保通过组织培养的再生在用 空载体转化的植物和用含有 PPDK 编码序列的载体转化的植物之间是一致的。在再生和证 实发生了成功转化的 Q-PCR 检查之后， 弃去这些植物。
     对于每个构建体 (SAG12-PPDKcDNA 和 SAG12-PPDKgDNA) 和各栽培品种 (K326 和 Burley 21)， 选择了 6 种植物。不可能只选出单一插入片段植物， 因此如果无法获得 6 种单 一插入片段植物时， 则选出具有可能的最低拷贝数的植物。 使这些植物自花授粉， 并收获种 子。
     对于各种选出的 T0 植物， 使 14 个子代生长， 重复 Q-PCR 以选出纯合植物。纯合植 物的使用应确保转基因在后代中的稳定性。对于各 T0 亲本， 选出 4 个携带转基因的子代。 然而， 对于每个 T0 亲本不可能总是选出纯合子代。 如果亲本拷贝数高于 2， 则选择具有较低 拷贝数的植物以降低转基因沉默的可能性， 而且还简化了 T2 代纯合子的选择 ( 如有必要 )。 这样， 对于各构建体和各栽培品种， 选择具有低转基因拷贝数的得自 5 个独立品系的 4 个生 物重复 (biological replicate)( 同胞 ) 用于所有的其它实验。
     实施例 4- 转化拟南芥植物中 PPDK 蛋白的检测和定量测定蛋白质提取
     在液氮下， 使用微型研杵 (micropestle) 在 1.5ml 微量离心管中研磨拟南芥叶 组织 (100mg)， 加入 400μl 提取缓冲液 ( 磷酸钾缓冲液 ( 加蛋白酶抑制剂混合物 (PIC，Sigma))。按照推荐的方案， 使用 Bio-Rad 蛋白质测定试剂 (Bio-Rad)， 通过 Bradford 测定 法测定蛋白质浓度 (Jones 等， 1989， Journal of Chemical Ecology， 15， 979-992)。
     聚丙烯酰胺凝胶电泳
     在含有 10％ (v/v) 丙烯酰胺 (37.5 ∶ 1 丙烯酰基∶双丙烯酰基， Severn Biotech Ltd)、 50 ％ (v/v) 免疫印迹分离缓冲液 ( 参见 2.10 节 )、 0.05 ％ (w/v) 过二硫酸铵 (APS， AnalaR) 和 0.05％ (v/v)N， N， N’ N’ 四甲基乙二胺 (TEMED， Severn Biotech Ltd) 的分离 胶中， 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 分离蛋白质。成层胶包含 5％上述丙烯酰胺、 50％ (v/v) 免疫印迹成层缓冲液、 0.06％ (w/v)APS 和 0.1％ (v/v)TEMED。使用 1x 免疫印迹样品 缓冲液 (66mM Tris-HCl、 10％ (v/v) 甘油、 0.7mM SDS、 0.7Mβ- 巯基乙醇 (BDH Laboratory Supplies) 和 0.05％ (w/v) 溴酚蓝和免疫印迹运行缓冲液 (25mM Tris-HCl、 0.29mM 甘氨酸 (Fisher Scientific) 和 3.5mM SDS， 以 70mA 的电流对 20μg 提取的蛋白质进行电泳 1 小 时 30 分钟。
     同时运行一式两份胶。 第一份用于免疫印迹分析 ( 下文中予以描述 )， 第二份按照 推荐的方案， 用 GelCode Blue Safe 蛋白质染料 (Thermo Scientific) 染色。使用凝胶干 燥膜 (Gel Drying Film)(Promega) 将已染色的凝胶干燥。
     免疫印迹分析
     使用 Protean Extra-Thick 印迹纸 (Blot Paper)(Bio-Rad) 和免疫印迹转移缓冲 液 (48mM Tris-HCl、 39mM 甘氨酸、 1.3mM SDS 和 20％ (v/v) 甲醇 (Fisher Scientific))， 在 Semi-Dry Blotter(Bio-Ra d) 上以 15V 达 1 小时将用于免疫印迹分析的凝胶中的蛋白质转 印到 Protan BA83 硝酸纤维素膜 (Schleicher and Schuell) 上。 在印迹证实蛋白质转印后， 将丽春红染料 (0.5％ (w/v) 丽春红 S(Fluka) 和 1％ (w/v) 冰醋酸 (Fisher Scientific)) 涂在膜上， 然后将膜在蒸馏水中漂洗。
     使用含 1％ (w/v) 干脱脂奶粉 (Marvel) 和 0.1％ (v/v) 聚氧乙烯失水山梨醇单月 桂酸酯 ( 吐温 20(TWEEN 20)， Sigma-Aldrich) 的磷酸缓冲盐溶液 (PBS ： 1.5mM 正磷酸二氢 钾 (KH2PO4， AnalaR)、 8.1mM 正磷酸氢二钠、 2.7mM 氯化钾和 137mM 氯化钠 )， 每天新鲜配制 用于 PPDK 免疫印迹分析的封闭缓冲液。使用盐酸调节至 pH 7.4。在室温下， 将膜在振荡器 上在封闭缓冲液中温育 1 小时。使用 1 ∶ 10,000 稀释的兔抗 PPDK 抗体 (Chris Chastain， Minnesota State University) 进行初次杂交， 接着在封闭缓冲液中洗涤 3 次各 5 分钟。 使 用 1 ∶ 1000 稀释的驴抗兔生物素化完整抗体 (GE Healthcare) 进行第二次杂交， 接着如 上洗涤 3 次。使用 1 ∶ 1000 稀释的链霉抗生物素 - 生物素化辣根过氧化物酶复合物 (GE Healthcare)， 进行第三次杂交， 接着在含有 0.1％ (v/v) 吐温 20 的 PBS 中洗涤 3 次各 5 分 钟。
     然后将膜在蒸馏水中漂洗 3 次。按照推荐的方案， 使用 Western Lightning 化学 发光试剂 (Western Lightning Chemiluminescence Reagent)(Enhanced Luminol， Perkin Elmer) 进行检测。
     参照图 4， 图中显示通过蛋白质印迹选择转基因 SAG12-PPDK 拟南芥细胞系。从 8 周大的鼠耳芥野生型、 ΔPPDK SAG12-PPDKcDNA 和 SAG12-PPDKgDNA 植物的叶组织中提取蛋 白质， 并进行免疫印迹分析以选择表达较高水平 PPDK 的品系。重组玉米 PPDK(30μg) 用作 阳性对照。在野生型或 PPDK 突变型植物 (ΔPPDK) 中未检测出 PPDK。与 SAG12-PPDKcDNA相比， SAG12-PPDKgDNA 植物表达较高水平的 PPDK。对 5 个 SAG12-PPDKgDNA 品系进行了全 部的后续分析。
     在 野 生 型 和 ΔPPDK 植 物 中 无 法 检 出 PPDK， 在 一 些 SAG12-PPDKcDNA 植 物 中 可 检 出 低 水 平 的 PPDK， 而 在 所 有 SAG12-PPDKgDNA 品 系 中 均 可 检 出 PPDK。 与 野 生 型 或 SAG12-PPDKcDNA 品系相比， 在这 3 个品系中检测出高得多的 PPDK 量。因此， 内含子的存在 似乎对 PPDK 表达水平具有积极作用， 选择 SAG12-PPDKgDNA 品系用于所有的其它实验。
     对野生型、 ΔPPDK 和 SAG12-PPDKgDNA 植物进行了针对 PPDK 的免疫印迹， 以测定 SAG12-PPDKgDNA 植物中 PPDK 蓄积的开始和程度。
     参照图 5， 图中显示从第五周起野生型、 ΔPPDK 和 5 个独立的 SAG12-PPDKgDNA 品 系的 PPDK 丰度的定量测定。 对于从第 5 周到第 9 周的每个时间点， 将 PPDK 丰度计算为野生 型的百分比。数据显示为这 5 个时间点的平均值。误差棒表示 1SEM。将 SAG12-PPDKgDNA 品系按递增的 PPDK 丰度的顺序排列。应用 ANOVA 检验基因型间的差异 (F ＝ 4.775， df ＝ 6， p ＝ 0.001)。与野生型显著不同的品系是 G12.3(p ＝ 0.005) 和 G16.1(p ＝ 0.004)。
     从自播种后 3 周到 9 周以一周一次的间隔收获的叶组织中提取蛋白质。从第五周 起在野生型植物中检出少量的 PPDK， 这证实了转录物中所观察到的增加导致蛋白质丰度的 提高。在 SAG12-PPDKgDNA 植物中， 在第 5 周还发现开始 PPDK 蓄积， 但 PPDK 丰度高于野生 型的 PPDK 丰度。在 ΔPPDK 植物中， 在任何阶段都未检出 PPDK 蛋白。 还使允许定量测定叶蛋白质提取物中的 PPDK 的方法最优化。对不同量的重组玉 米 PPDK 蛋白进行了 SDS-PAGE 和免疫印迹分析。 应用 AlphaEase 成像软件计算出条带强度， 并绘制标准曲线。应用 SigmaPlot 软件计算出回归线， 该软件随后用于计算植物叶样品中 的 PPDK 的量。由于免疫印迹检测水平可改变， 因此对每个免疫印迹有必要包括至少 3 个标 准品以供不同免疫印迹间的真实比较。用于定量测定不同提取物中的 PPDK 丰度的该项技 术被用来选择和比较不同的转基因品系。
     参照重组玉米 PPDK 蛋白的已知标准品， 计算出每个时间点上各个品系至少 4 个生 物重复的 PPDK 蛋白丰度。 分析表明， 从第五周起， SAG12-PPDKgDNA 的 PPDK 丰度高于野生型 的 PPDK 丰度。对于各 SAG12-PPDKgDNA 品系， 从第五周起在每个时间点将 PPDK 丰度计算为 野生型的百分比， 从这些值得到的平均值对衰老期间各 SAG12-PPDKgDNA 品系中的 PPDK 蓄 积进行量化。这就允许按照递增的 PPDK 丰度对 SAG12-PPDKgDNA 品系排序， 如图 5 所示。
     由于在转基因植物中大量蓄积的蛋白质可经历灭活， 因此升高的蛋白质丰度并不 一定意味着增加酶活性。在暗中， PPDK 进行可逆的磷酸化， 导致其失活。针对磷酸化形式 的 PPDK( 磷酸 -PPDK) 产生的抗体， 可供特异性检测无活性形式的 PPDK， 而之前所使用的 抗体 ( 抗 PPDK) 不论磷酸化状态都测出 PPDK(Chastain 等， 2002， Plant Physiology， 128， 1368-1378)。对于最初用抗 PPDK 抗体探测然后剥离和再探测的免疫印迹， 在从播种后 3 周 到 9 周的时程中， 抗磷酸 PPDK 抗体被用来检测无活性的 PPDK。
     出人意料的是， 在野生型植物中在多个免疫印迹上只可检出非常低水平的无活性 PPDK( 磷酸化 PPDK)， 且只在衰老的晚期检出。在 SAG12-PPDKgDNA 植物中， 取决于使之失活 的时间点， 检出较高水平的 PPDK。然而， 尽管总 PPDK 的高丰度， 但在 PPDK 丰度开始提高后 不久的时间点上， 检出非常少的无活性 PPDK 或未检出无活性 PPDK。这些结果表明， 虽然在 SAG12-PPDKgDNA 植物中可发生一些 PPDK 失活， 但是至少在衰老早期， 丰度增加的酶促活性
     PPDK 存在于 SAG12-PPDK 植物中。
     实施例 5- 转化的烟草植物中 PPDK 蛋白的检测和定量测定
     在液氮下， 使用微型研杵将烟草叶组织 (100mg) 在 1.5ml 微量离心管中研磨， 加入 400μl 提取缓冲液 (Overcoat 缓冲液 (PIC))。按照推荐的方案， 使用 Bio-Rad 蛋白质测定 试剂 (Bio-Rad)， 通过 Bradford 测定法测定蛋白质浓度 (Jones 等， 1989)。如实施例 4 所 述， 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 对蛋白质进行分离。如实施例 4 所述， 通过免疫印迹 对蛋白质进行分析并定量测定 PPDK 蛋白。
     对自通过剥离和于 30℃避光温育而诱导衰老的 K326 和 Burley 21T1 代烟草叶提 取的叶蛋白质进行了针对 PPDK 的免疫印迹。以这种方式诱导衰老， 使得在植物达到成熟 前， 可鉴定出具有最高 PPDK 丰度的转基因品系， 并弃去其它品系。在 K326 植物中， 在3个 SAG12-PPDKgDNA 品系 (G4、 G8 和 G10) 以及在 1 个 SAG12-PPDKcDNA 品系 (C10) 中， 检出高 丰度的 PPDK。在 Burley 21 植物中， 在 4 个 SAG12-PPDKgDNA 品系 (G3、 G7、 G15 和 G23) 中 有丰富 PPDK， 但 PPDK 不以与 K326 品系一样的高丰度存在。具有最高 PPDK 丰度的 K326 和 Burley 21 的各 4 个品系均用于所有的进一步分析。 由于几乎唯一在 SAG12-PPDKgDNA 品系 中观察到最高 PPDK 丰度， 因此似乎内含子对 PPDK 表达具有积极作用。 参照图 6， 图中显示如下对 SAG12-PPDK K326 和 Burley 21 烟草品系进行选择 ：
     (b) 选择转基因 K326 品系的 PPDK 免疫印迹。在 6 周大植物的绿叶中通过剥离并 于 30℃避光温育 3 天诱导衰老。提取蛋白质， 并进行免疫印迹分析以选出表达较高水平的 PPDK 的品系。重组玉米 PPDK(50μg) 用作阳性对照。用各亲本 T0 植物的一个子代显示一 个代表性免疫印迹。将亲本品系 SAG12-PPDKgDNA G4、 G8 和 G10 和 SAG12-PPDKcDNA 品系 C10 的植物用于所有后续分析。
     (c) 与在 (b) 部分中对 K326 所进行的一样进行选择转基因 Burley21 品系的 PPDK 免疫印迹。将亲本品系 SAG12-PPDKgDNA G3、 G7、 G15 和 G23 的植物用于所有后续分析。
     对野生型、 零拷贝 ( 阴性分离子 )、 SAG12-PPDKgDNA K326、 SAG12-PPDKcDNA K326 和 SAG12-PPDKgDNA Burley 21 烟草进行了针对 PPDK 的免疫印迹以测定 PPDK 表达的开始， 并定量测定转化植物中 PPDK 过表达的程度。从 3 个月大植物的 K326 野生型和转化植物叶 1( 最老 ) 至 8( 嫩 ) 提取蛋白质， 并进行了针对 PPDK 的免疫印迹。
     参照图 7， 图中显示在 K326 烟草成熟叶中 PPDK 的过表达。根据免疫印迹计算出 PPDK 丰度。数据显示为零拷贝植物的 10 个生物重复的平均值和各 SAG12-PPDK 品系的 4 个 生物重复的平均值。误差棒表示 1SEM。将 SAG12-PPDK 品系以递增的 PPDK 丰度的顺序排 列。使用 ANOVA 检验基因型间的差异 (F ＝ 6.995， df ＝ 4， p ＝ 0.001)。与零拷贝植物显 著不同的品系是 G10(p ＝ 0.006)、 G8(p ＝ 0.003) 和 C10(p ＝ 0.000)。
     在野生型植物较老叶中， PPDK 丰度较高， 这就表明 PPDK 在烟草以及拟南芥衰老期 间天然被增量调节。在转化的 K326 植物中， 较老叶中的 PPDK 丰度也较高， 且比野生型植物 的高得多。在具有最高 PPDK 丰度的转化品系的较幼嫩叶中， PPDK 的丰度也较高。对零拷贝 植物 ( 阴性分离子 ) 和转化植物的 ‘成熟’ 叶中提取的蛋白质进行了免疫印迹。成熟叶是 收获期的叶， 并且是衰老晚期的叶。定量测定了 PPDK 丰度。与零拷贝植物相比， 所有 4 个
    独立的转化品系成熟叶中的 PPDK 丰度较高。对于 K326 烟草， 在衰老期间使用 SAG12 启动 子的 PPDK 过表达是成功的。实施例 6- 转化拟南芥植物的表型分析
     拟南芥植物生长的分析
     参 照 图 8， 图 中 清 楚 显 示， 鼠 耳 芥 中 PPDKgDNA 的 过 表 达 产 生 具 有 较 大 莲 座 叶 丛 的 植 物。 在 播 种 后 3、 5、 7 和 9 周， 给 野 生 型、 ΔPPDK 和 SAG12-PPDKgDNA 植 物 拍 照。 SAG12-PPDKgDNA 植物比野生型大。在 PPDK 植物和野生型植物之间不存在可辨别的差异。
     使用 Mettler Toledo AB104-S 天平测定莲座叶丛和繁殖组织的鲜质量， 精确到 0.1mg。从利用 Edwards Super Modulyo 冷冻干燥器冷冻干燥过夜的样品， 测定莲座叶丛组 织的干质量， 精确到 0.1mg。
     参照图 9， 图中显示第 9 周的繁殖组织质量。 观察到对 PPDK 的剂量反应， 其中 PPDK 丰度较高的品系具有较高的繁殖组织质量。 将总繁殖组织 ( 茎、 茎生叶、 花和长角果 ) 称重。 值为 3 个生物重复的平均值。误差棒表示 1SEM。将转基因 SAG12-PPDKgDNA 品系以 PPDK 丰度递增的顺序排列。应用 ANOVA 检验基因型间的差异 (F ＝ 8.062， df ＝ 6， p ＝ 0.001)。 所有 SAG12-PPDKgDNA 品系与野生型显著不同 (G9.4p ＝ 0.031， G5.4p ＝ 0.000， G19.2p ＝ 0.000， G12.3p ＝ 0.001， G16.1p ＝ 0.001)。具有较高 PPDK 丰度的品系趋于具有较高的繁 殖组织质量， 虽然这种趋势不是绝对的。 还计算出繁殖组织占植物总鲜质量的百分比， 但当 应用 ANOVA 检验时， 与野生型、 ΔPPDK 或 SAG12-PPDKgDNA 植物无显著差异 (F ＝ 0.544， df ＝ 6， p ＝ 0.767， 数据未显示 )。
     然而， 占植物总质量百分比的繁殖组织的比例不改变， 这就表明整体来看植物较 大， 营养组织和繁殖组织之间的资源分配未发生改变。还在 ΔPPDK 植物中测定了植物总的 鲜质量和繁殖组织质量， 并且与野生型无显著不同。 还测定了莲座叶丛干质量， 对于植物总 的鲜质量和繁殖组织质量， 发现与野生型相比， SAG12-PPDKgDNA 植物具有显著较高的质量。
     参 照 图 10， 图 中 显 示 播 种 后 自 第 3 周 到 第 9 周 野 生 型 和 SAG12-PPDgDNA 植 物 的植物总鲜质量 ( 莲座叶丛加繁殖组织 )。将数据表示为野生型的 3 个生物重复和 SAG12-PPDKgDNA 的 15 个生物重复 (5 个独立品系各 3 株植物 ) 的平均值。 误差棒表示 1SEM。 应用斯氏 t 检验 (student’ s t-test) 在各个时间点， 对野生型和 SAG12-PPDKgDNA 植物总质 量进行了比较。在第 9 周的 SAG12-PPDKgDNA 植物中， 莲座叶丛质量显著较高 (p ＝ 0.032)。
     由于 SAG12 启动子所致， 在第 5 周开始 PPDK 过表达前没有显著差异。所有 5 个独 立的 SAG12-PPDKgDNA 品系的莲座叶丛干质量都增加。至于繁殖组织质量， 观察到对 PPDK 丰度的剂量反应， 其中较高 PPDK 含量的品系具有较高的质量。还在 ΔPPDK 植物中测定了 莲座叶丛干质量， 与野生型植物没有显著不同。
     拟南芥叶表面积的测定
     通过采取单片成熟叶 ( 通过是第 10 叶 ) 样品， 如上所述测定叶质量和整个莲座叶 丛质量， 并对放在直尺旁的叶拍照， 来测定莲座叶丛的表面积。 应用 ImageJ 软件 (National Institutes of Health) 测量叶表面积， 并由此计算整个莲座叶丛的表面积。
     在 PPDK 过表达开始后， 在 SAG12-PPDKgDNA 植物中， 莲座叶丛表面积增加。尽管在 第六周和第七周， SAG12-PPDKgDNA 植物的表面积显著较大， 但在第 8 和 9 周时， 表面积与野 生型无显著不同。表面积的这种大的降低可能是由于与野生型相比 SAG12-PPDKgDNA 植物 中营养物再动员增加所致。ΔPPDK 植物的表面积与野生型植物无显著不同。
     叶绿素浓度的测定使用 CCM-200 手提式叶绿素仪 (Opti-Sciences)， 测定相对单位的叶绿素含量。
     拟南芥的荧光测定
     使用 Hansatech FMS2 荧光计测定了 FV/FM 比率。使用生产商提供的叶夹， 使叶在 测定前进行暗适应过夜。为了确定在 SAG12-PPDKgDNA 或 ΔPPDK 植物中衰老的开始相对于 野生型植物是否改变， 测定了 FV/FM 比率。FV/FM 是光系统 II 的量子效率估值， 当发生光 抑制时便下降。 其是衰老开始的有用的衡量值， 因为光合作用下降发生在衰老的早期， 在检 出叶绿素含量下降之前。在播种后 4 周 ( 当叶变大到足以测定 FV/FM 时 ) 到 9 周的时程 内测定了 FV/FM。在野生型、 SAG12-PPDKgDNA 和 ΔPPDK 植物中， 在第 7 周时 FV/FM 最大， 随后下降， 这就表明开始衰老的时机在所有 3 种基因型中是相同的。然而， 与野生型相比， SAG12-PPDKgDNA 植物中第 8 周的 FV/FM 显著较高， 这就表明在衰老晚期光合活性延长。
     氮含量
     使用 Edwards Super Modulyo 冷冻干燥器将用于氮分析的组织冷冻干燥。将拟南 芥叶组织 (25mg) 或烟草叶组织 (100mg) 包装在无氮称量纸 (Elementar Ahalysensysteme GmbH) 中。 利 用 快 速 N III 氮 分 析 仪 (Rapid N III Nitrogen Analyzer)(Elementar Analysensysteme GmbH)， 使 用 推 荐 的 设 置 测 定 氮 含 量 占 干 重 的 百 分 比。 将 天 冬 氨 酸 (Sigma-Aldrich) 用 作 标 准 品。 在 播 种 后 3-9 周 的 时 程 内， 测 定 了 拟 南 芥 野 生 型、 SAG12-PPDKgDNA 和 ΔPPDK 植物的叶氮含量。
     参照图 11， 图中显示第 7 周野生型、 ΔPPDK 和 SAG12-PPDKgDNA 植物叶的氮含 量。将数据表示为野生型和 ΔPPDK 的 8 个生物重复及 SAG12-PPDKgDNA 品系各 4 个生物 重复的平均值。误差棒为 1SEM。将 SAG12-PPDKgDNA 品系以 PPDK 丰度递增的顺序排列。 应用 ANOVA 检验基因型间的差异 (F ＝ 6.047， df ＝ 6， p ＝ 0.000)。ΔPPDK 植物和所有 的 SAG12-PPDKgDNA 品系与野生型显著不同 (ΔPPDK p ＝ 0.004， G9.4p ＝ 0.000， G5.4p ＝ 0.000， G19.2p ＝ 0.001， G12.3p ＝ 0.007， G16.1p ＝ 0.006)。
     与 野 生 型 相 比， 在 所 有 5 个 独 立 的 SAG12-PPDKgDNA 品 系 中， 自第 7 周后叶氮 素 显 著 较 低， 这 就 支 持 提 高 PPDK 丰 度 在 衰 老 期 间 可 提 高 氮 素 再 动 员 的 效 率 的 假 说。 SAG12-PPDKgDNA 植物中， PPDK 表达和活性在第 6 周达到峰值， 这就表明在 PPDK 丰度的升 高与叶氮素可测量的降低之间存在延时， 这可能归因于将蛋白质氨基酸转化成转运氨基酸 ( 天冬酰胺和谷氨酰胺 ) 并将其运输到叶外所耗费的时间。
     拟南芥种子的分析
     测定了野生型、 SAG12-PPDKgDNA 和 ΔPPDK 鼠耳芥植物种子中的单粒种子质量和 氮含量。
     参照图 12， 图中表示野生型、 ΔPPDK 和 SAG12-PPDK 植物的单粒种子的氮含量。 SAG12-PPDKgDNA 植物的种子氮含量有显著增加。 将数据表示为野生型和 ΔPPDK 的 8 个生物 重复及各 SAG12-PPDKgDNA 品系的 4 个生物重复的平均值。 误差棒为 1SEM。 SAG12-PPDKgDNA 品系以 PPDK 丰度递增的顺序排列。应用 ANOVA 检验基因型间的差异 (F ＝ 6.704， df ＝ 6， p ＝ 0.000)。与野生型显著不同的品系为 G19.2(p ＝ 0.000)、 G12.3(p ＝ 0.005) 和 G16.1(p ＝ 0.002)。具有较高 PPDK 丰度的品系趋于具有较高的种子氮质量。因此， 与野生型相比， 在所有 5 个独立的 SAG12-PPDKgDNA 品系中单粒种子质量增加， 并且观察到对 PPDK 丰度的 剂量反应， 其中 PPDK 丰度较高的植物具有较高的种子质量。还对从各植物收获的总的种子进行称重， 在野生型和 SAG12-PPDKgDNA 植物之间无显著差异， 因此增加 SAG12-PPDK 植物的 种子大小不会损害种子总收成。
     拟南芥叶组织的游离氨基酸含量
     在液氮下， 使用微型研杵 (Eppendorf)， 将叶组织 (100mg) 在 1.5ml 微量离心管中 研磨， 并加入 300μl 无菌去离子水。在 4℃下， 将样品以 13,000rpm 进行离心 5 分钟。按照 推荐的方案， 使用 Bio-Rad 蛋白质测定试剂 (Bio-Rad)， 通过 Bradford 测定法测定蛋白质浓 度 (Jones 等， 1989)。 按照推荐的方案， 使用 EZfaast 氨基酸样品测试试剂盒 (Phenomenex)， 制备用于氨基酸分析的样品。将样品重新悬浮于含 10mM 甲酸铵 (BDH 实验室供应 ) 的 50％ 无菌蒸馏水和 50％超级别甲醇 (Romil) 中。
     然后采用 Q Trap LC/MS/MS(Applied Biosystems/MDS SCIEX) 与 EZfaast 250x 3.0mm AAA-MS 柱 (Phenomenex) 以及将含 10mM 甲酸铵的 50 ％ (v/v) 无菌蒸馏水溶液和 50％ (v/v) 超级别甲醇用作流动相， 对样品进行液相色谱 - 质谱法 (LC-MS)。 按阳离子模式 与 EZfaast 试剂盒 (Phemonenex) 中推荐的条件使用质谱仪。运用所供应的 Analyst 软件 (Applied Biosystems/MDS SCIEX) 对结果进行分析。
     在自播种后第 3 周到第 9 周的时程内， 在野生型、 SAG12-PPDKgDNA 和 ΔPPDK 拟南 芥植物叶中测定了总游离氨基酸含量。
     参照图 13， 图中显示过表达 PPDK 的拟南芥叶中的总游离氨基酸含量增加。 将数据 表示为野生型和 ΔPPDK 的 6 个生物重复及各 SAG12-PPDKgDNA 品系的 4 个生物重复的平均 值。误差棒为 1SEM。将 SAG12-PPDKgDNA 品系以 PPDK 丰度递增的顺序排列。与野生型相 比， 所有 5 个 SAG12-PPDKgDNA 品系具有较高的总氨基酸含量， 但变化大， 当应用 ANOVA 检验 时差异不显著 (F ＝ 1.314， df ＝ 6， p ＝ 0.289)。
     在 第 7 周， 即叶氮含量变得显著低于野生型的氮含量的同一时间和 SAG12-PPDKgDNA 植物叶中 PPDK 丰度最高后的一周， 与野生型植物相比， SAG12-PPDKgDNA 植物中的总游离氨基酸含量显著较高。在所有 5 个独立的 SAG12-PPDKgDNA 品系中出现增 加， 尽管变化大， 且各品系和野生型之间的差异不显著。这种增加表明在该时间点上， 氨基 酸的产生以比可发生的氨基酸输出大的速率进行， 因此氨基酸在叶中蓄积。 与野生型相比， ΔPPDK 植物中的总游离氨基酸没有明显不同。
     还测定了转运氨基酸 ( 谷氨酰胺和天冬酰胺 )， 用占总游离氨基酸的百分比表示。 在第 7 周和第 8 周， SAG12-PPDKgDNA 植物中的转运氨基酸含量显著高于野生型植物的转运 氨基酸含量。 增加出现在所有 5 个独立的 SAG12-PPDKgDNA 品系中， 尽管变化大， 且各品系和 野生型之间的差异并不显著。因此， 除 SAG12-PPDKgDNA 植物中的总游离氨基酸含量增加以 外， 转运氨基酸的含量还与总量成比例地增加。这再次表明， 在这些时间点上， 谷氨酰胺和 天冬酰胺的产生超过叶的输出能力， 这就支持在衰老期间升高的 PPDK 丰度提高导致形成 转运氨基酸的氨基酸互变效率的假说。在 ΔPPDK 植物中， 未观察到与野生型有显著差异。
     实施例 7- 转化烟草植物的表型分析
     烟草叶氮含量的分析
     测定了阴性分离子和 SAG12-PPDK K326 烟草的成熟叶中的叶氮含量。成熟叶是已 准备收获用于烟草生产的叶。对于 4 个独立 SAG12-PPDK 品系中的一些， SAG12-PPDK 植物 的叶氮含量低于阴性分离子植物的叶氮含量。将成熟叶用来测定叶氮含量， 因为这些叶处于可以收获用于烟草生产的阶段。 然而， 成熟叶中叶氮含量的差异很小的事实并不一定意味着氮素再动员不会增加。在 SAG12-PPDKgDNA 拟南芥植物开始衰老的时程中， 叶氮含量显著低于野生型， 但到衰老后期， 差异小得多。 因此， 烟草中叶氮含量的差异有可能出现在衰老较早期， 并且有可能到测定叶 氮含量时该差异缩小。
     烟草叶氨基酸含量的分析
     测定了 K326 烟草成熟叶的氨基酸含量， 该成熟叶通过剥离和避光于 30℃温育 3 天 来诱导衰老。这就允许对在诱导衰老之前和之后的同一叶之间进行比较。通过叶剥离和避 光温育对衰老的诱导显示基因表达图式与年龄相关性衰老的最大重叠。
     在 K326 烟草中， 在诱导阴性分离子植物和 SAG12-PPDK 植物衰老后总氨基酸含量 增加。将增加计算为诱导衰老前总氨基酸含量的百分比。对于 SAG12-PPDK 品系 C10， 增加 显著小于阴性分离子植物的增加， 但其它 SAG12-PPDK 品系与阴性分离子植物都没有显著 性差异。因此在诱导暗诱导衰老后， 在衰老期间 PPDK 的过表达似乎对总氨基酸含量几乎无 影响。在诱导衰老后， K326 烟草中的转运氨基酸 ( 谷氨酰胺和天冬酰胺 ) 含量也增加， 但 这种增加发生在阴性分离子和 SAG12-PPDK 品系两者中， 而且在诱导衰老后， 基因型之间在 增加程度上没有显著差异。
     烟草种子的分析
     测定了 K326 烟草的单粒种子质量， 对于所有 4 个独立的转基因品系， 与阴性分离 子植物相比， 单粒种子质量在 SAG12-PPDKgDNA 和 SAG12-PPDKcDNA 植物中显著较高。还测 定每个种子荚的种子质量， 并且在 SAG12-PPDKgDNA 和 SAG12-PPDKcDNA 植物中显著较高。
     参照图 14， 图中显示在 SAG12-PPDK K326 烟草中种子大小增加。通过给约 1000 粒种子拍照、 计数和称重， 来计算 K326 零拷贝 ( 对于 SAG12-PPDK 插入片段为阴性分离子的 植物 ) 和 SAG12-PPDK 植物的每粒种子质量。将数据表示为零拷贝植物的 10 个生物重复的 平均值和各 SAG12-PPDK 品系的 4 个生物重复的平均值。误差棒为 1SEM。SAG12-PPDK 品系 以成熟叶中递增的 PPDK 丰度的顺序排列。SAG12-PPDK 植物的种子质量较大。应用 ANOVA 检验基因型间的差异 (F ＝ 4.870， df ＝ 4， p ＝ 0.006)。与零拷贝植物显著不同的品系是 G8(p ＝ 0.005) 和 C10(p ＝ 0.002)。
     对于所有 4 个独立的 SAG12-PPDKgDNA 和 SAG12-PPDKcDNA 品系， 种子的百分比氮 含量较高， 但是差异并不显著。然而， 在 SAG12-PPDKgDNA 和 SAG12-PPDKcDNA 植物中， 每粒 种子的氮质量显著较高。
     参照图 15， 图中清楚表明， SAG12-PPDK K326 烟草的种子氮含量增加。从种子质量 和种子氮含量数据计算 K326 零拷贝和 SAG12-PPDK 植物单粒种子的氮质量。将数据表示为 零拷贝植物的 10 个生物重复的平均值和各 SAG12-PPDK 品系的 4 个生物重复的平均值。误 差棒为 1SEM。SAG12-PPDK 品系以成熟叶中递增的 PPDK 丰度的顺序排列。SAG12-PPDK 植物 中单粒种子的氮质量较高。应用 ANOVA 检验基因型之间的差异 (F ＝ 7.807， df ＝ 4， p＝ 0.001)。与零拷贝植物显著不同的品系是 G8(p ＝ 0.000) 和 C10(p ＝ 0.000)。
     这就表明 SAG12-PPDKgDNA 和 SAG12-PPDKcDNA K326 烟草植物中供应给种子的氮 增加。在 K326 植物中， 观察到对 PPDK 的剂量反应。成熟叶中 PPDK 丰度较高的植物具有较 高的种子单粒种子质量、 较高的种子质量 / 种子荚和增加的单粒种子的氮质量。这强有力地支持 PPDK 的氮素再动员中的作用， 因为 PPDK 含量增加似乎与供应给种子的氮的增加有 关。
     总的来说， 在 SAG12-PPDK K326 烟草中单粒种子质量 ( 图 14) 和氮质量 / 种子 ( 图 15) 两者均增加， 这就表明氮素再动员通过 PPDK 的过表达而增加。因此， 对于拟南芥 SAG12-PPDKgDNA 植物， 可预期渐老叶中转运氨基酸含量增加。然而， 在拟南芥中测定了天 然衰老叶的氨基酸含量， 而在烟草中， 衰老是通过叶剥离和避光温育而诱导的。 由于暗诱导 和年龄相关性衰老发生的过程不同， 烟草叶中发生的过程未必与拟南芥叶中发生的过程类 似。
     实施例 8- 过表达 PCK 和 PPDK 的拟南芥植物的产生
     通过使 PCK 的编码区和基因组克隆与 BNP1380000001 二元载体 ( 如实施例 1 和 2 中所述将其转化到鼠耳芥中 ) 内的衰老相关基因 12(SAG12) 启动子融合， 来实现拟南芥 PCK(At4g37870.1) 在衰老期间的过表达。
     如实施例 1 有关 PPDK 中所述， 采用 PCR， 先从拟南芥 cDNA 中分离出 At PCK 编码序 列， 并从拟南芥基因组 DNA 中分离出基因组序列。另一方面， 设计出 PCR 引物以促进基因随 后与 BNP1380000001 载体连接 ( 参见图 3a)， 所述 PCR 引物包括鼠耳芥 (At)PCK 基因的起始 密码子和终止密码子， 且亦如表 1 所示， 在正向引物 AtPCK-Xba IFOR(SEQ ID No.25) 中包 括 XbaI 限制位点， 而在反应向引物 AtPCK-SacIREV(SEQ ID No.26) 中包括 SacI 限制位点。 按照实施例 1， 制备用于各 PCR 反应的 cDNA 和基因组 DNA 模板。PCR 反应混合物 包含 1x HF 缓冲液 (NEB)、 2mM 氯化镁 (NEB)、 0.5mM dNTPs(Bioline)、 100ng 模板 (cDNA 或 基因组 DNA)、 0.5μM 各引物和 1 单位 Phusion 高保真 DNA 聚合酶 (NEB)。采用 Techne 热 循环仪如下进行热循环 ： 98℃ 30 秒钟的起始变性步骤， 接着 35 个以下循环 ： 98℃ 10 秒钟、 60℃ 30 秒钟以及对于编码区 72℃ 2 分 30 秒而对于基因组克隆 4 分 30 秒的延伸时间。最 后步骤包括 72℃ 10 分钟的最后延伸。
     这些 PCR 产物产生编码序列 (cDNA) 的 2kb 条带和 PCK 基因组序列的 3.5kb 条带， 并进行了 PEG 沉淀。与实施例 1 对 PPDK 所述一样， 按照推荐的方案， 将扩增的 DNA 连接 ( 平端 ) 至 pCR4Blunt-TOPO 载体 (Invitrogen) 中。然后将质粒转化至文库效率 (Library Efficiency)DH5α 大肠杆菌细胞中。卡那霉素 (50μg ml-1) 用作选择性抗生素。对于编 码区和基因组克隆两者， 使用引物 AtPCK-Xba IFOR(SEQ ID No.25) 和 AtPCK-Sac IREV(SEQ ID No.26) 两者， 通过菌落 PCR 选出阳性菌落。使阳性菌落在 37℃振荡培养箱中在 5ml 含 -1 有 50μg ml 卡那霉素的 LB 培养液中生长过夜。
     使用 QIAprep Spin Miniprep 试剂盒 (Qiagen Ltd)， 分离质粒 DNA， 通过依次的限 制酶切消化对插入片段大小进行分析。这通过用 10 单位 XbaI 和 1x XbaI 缓冲液于 37℃ 消化 1μg DNA 2 小时， 然后加入 10 单位 SacI 和 1x SacI 缓冲液于 37℃过夜来进行。使 用 AtPCK-XbaIFOR/AtPCK-Sac IREV， 对含有正确插入片段的质粒 DNA 进行了测序。应用 BioEdit 分析序列， 并应用 BLASTX 验证扩增的 AtPCK 编码序列和基因组序列。
     为了使 AtPCK 编码区和基因组克隆与图 3a 所示的 pBNP 载体连接， 使用分别代表 -1 两种质粒的大肠杆菌菌落接种 25ml 含有 50μg ml 卡那霉素的 LB 培养液。将培养物于
    37℃振荡过夜后， 使用 QIAfilter 质粒 midi 试剂盒 (Qiagen Ltd) 纯化质粒 DNA。以相同方 式但从 100ml 含有 50μg ml-1 卡那霉素的培养物中纯化 pBNP 载体。 对所有纯化的质粒 DNA进行与上述相同的顺序酶消化。 对于含有编码区和基因组克隆的质粒， 消化 3μg DNA， 对于 pBNP 载体， 消化 1μg DNA。通过结晶紫凝胶电泳分离样品， 使用 Qiaquick 凝胶提取试剂盒 (Qiagen Ltd) 纯化产物。14.4kb pBNP 载体产物用碱性磷酸酶处理以防止自身连接， 利用 XbaI/SacI 消化， 使编码区和基因组克隆插入片段与 pBNP 载体连接。将文库效率 DH5α 大 肠杆菌细胞用 2μl 连接反应物转化， 使用 AtPCK-Xba IFOR 和 AtPCK-Sac IREV 通过 PCR 筛 选阳性菌落。
     使用 QIAprep Spin Miniprep 试剂盒 (Qiagen Ltd)， 从含有所需插入片段的菌落 中提取质粒 DNA， 将 DNA 随后用 10 单位 XbaI、 15 单位 SacI 和 1x XbaI 缓冲液于 37℃消化 2 小时。选出 pBNP 载体中的编码序列和基因组序列插入片段 ( 其具有正确的预期限制性内 切酶消化谱 ) 的各两个分离菌落， 然后使用 BNP-SAG12FWD 引物 (SEQ ID No.9) 测序。应用 BioEdit 程序对序列进行分析。所产生的构建体称为 pALBNP1( 编码序列 ) 和 pALBNP2( 基 因组序列 )， 如图 3b 所示。
     产生了 5 个纯合的单一插入片段品系， 并通过如实施例 3 所述的免疫印迹法， 使 用 PCK 特异性抗体证实了 PCK 过表达。使用针对 PCK 氨基酸序列设计的合成肽， 在兔中 产生多克隆抗血清。序列为化学合成的 (i)DEHCWTETGVSNIEG(SEQ ID No.27)， 和 (ii) CVDLSREKEPDIWNA(SEQ ID No.28)， 然后与匙孔血蓝蛋白偶联， 随后共同注射到兔中。使用 抗体得到的结果见图 16， 图中显示转化植物具有高水平的 PCK 蛋白。
     通过将单一 SAG12-PCK 转化子 (3)1 和 (19)4 与强 SAG12-PPDK 过表达品系杂交， 产生 SAG12-PCK-PPDK 细胞系。对具有高水平的 PCK 和 PPDK 两者的植物的分析显示莲座叶 丛质量提高， 如图 17 所示。
     最后， 虽然本发明人不希望受假设的束缚， 但图 18 表示推测的生化途径， 说明了 PCK 和 PPDK 可如何影响氮素再动员。
     PCK/PPDK 双重构建体
     本发明人观察到， 当转化到植物中时， 图 3 所示 PCK 和 PPDK 单一构建体引起衰老 叶的氮素再动员速度提高， 而且当这些酶在衰老叶中过表达时， 营养性植物生长的量也提 高 ( 这相当于作物产量提高 )。 本发明人因此决定制备两种双重构建体， 其中将编码 PCK 和 PPDK 的基因两者插入 SAG12 启动子控制下的 pBNP130000001 中。
     利用 XbaI/SacI 消化， 通过连接编码 BNP-PPDKgDNA 的 PPDK 编码 gDNA 片段下游 ( 即 3’ 端 ) 的 PCK 的 gDNA， 制备了第一种双重构建体。因此， 质粒中的 SAG12 启动子负责 PPDK 基因和 PCK 基因两者的表达。
     利用 AvrII/BamHI 消化， 通过连接编码 pALBNP2 的 PCK 编码 gDNA 片段直接下游的 PPDK 的 gDNA， 制备了第二种双重构建体。SAG12 同样负责 PPDK 基因和 PCK 基因两者的表 达。39102428186 A CN 102428193
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