一种以金钱松叶片为外植体的金钱松植株再生方法.pdf

本发明公开了一种以金钱松叶片为外植体的金钱松植株再生方法，该方法通过诱导金钱松叶片产生愈伤组织，再将愈伤组织进行芽分化培养、生根培养和炼苗与移栽等步骤，最终获得了生长速度快、不带任何病虫害和具有优良性状的金钱松组培苗，为金钱松植株的大规模快速繁殖提供了一条新途径，有效地解决当前金钱松药材资源短缺的问题。

权利要求书1.  一种以金钱松叶片为外植体的金钱松植株再生方法，其特征在于包 括如下步骤： (1)外植体的选取和消毒：选取生长健康、无病虫害的金钱松叶片， 先用浓度为75％的酒精消毒10～30s，用无菌水冲洗后，再用浓度为0.1％的 升汞消毒3～6min，最后用无菌水冲洗后用已灭菌的滤纸吸干表面的水分； (2)外植体的处理：将消毒后的叶片放在滤纸上，用刀切伤金钱松叶 片，伤口以不切断叶片为准； (3)愈伤组织的诱导培养：将处理后的金钱松叶片接入愈伤组织诱导 培养基GD+NAA0.5～1.5mg/L+GA3 0.5～1.5mg/L中进行愈伤组织的诱导培 养； (4)芽分化培养：选取质地较紧密、生长状况良好的愈伤组织，接入 芽分化培养基MS+TDZ0.1～0.3mg/L+Ad 10～30mg/L中进行不定芽的诱导培 养； (5)生根培养：当不定芽长至1.0～2.5cm时，将其切下转接到生根培 养基1/3MS+IAA0.5～1.5mg/L+活性炭20～40mg/L中进行生根培养； (6)炼苗和移栽：当组培苗不定根生长健壮时，打开瓶盖，在室内炼 苗2～4天后，将其从培养瓶中取出，洗去不定根上的培养基，将其移栽至 松软的土壤中生长； 上述所有培养基的pH值5.5～6.7、蔗糖15～50g·L-1、琼脂4.0～6.0 g·L-1；培养条件为：每天光照12～24小时、光照强度为2000～3000lx、培 养温度20～30℃。 2.  根据权利要求1所述的一种以金钱松叶片为外植体的金钱松植株再 生方法，其特征在于：步骤(1)中所述金钱松叶片为刚伸展1～7天的金 钱松幼嫩叶片。 3.  根据权利要求1或2所述的一种以金钱松叶片为外植体的金钱松植 株再生方法，其特征在于：步骤(1)中用浓度为0.1％的升汞消毒时，每 100ml的0.1％升汞溶液中还滴加了5～10ml吐温20。 4.  根据权利要求1所述的一种以金钱松叶片为外植体的金钱松植株再 生方法，其特征在于：步骤(6)中移栽后的培养条件为适当遮光，温度保 持在20～28℃，相对湿度保持在75～85％。

说明书一种以金钱松叶片为外植体的金钱松植株再生方法
技术领域
本发明涉及一种金钱松植株的再生方法，特别是涉及一种以金钱松叶 片为外植体的金钱松植株再生方法。
背景技术
金钱松是我国特有的古老孑遗松科树种。根据世界保护联盟(IUCN) 新制定的物种受威胁的分类系统标准和中国植物红皮书的标准，金钱松 被定为渐危种，并被列为国家二级保护植物。
金钱松既是重要的园林植物，同时更是一种重要的、应用前景广阔 的药用植物。研究发现，金钱松最主要的药用成分是从其树皮和根皮中 提取出来的二萜类化合物土槿酸，它具有抗肿瘤、抗真菌、抗早孕和使 胆囊自截等功效，尤其是抗肿瘤的功效使得金钱松的药用价值更加凸 显。现代药理研究发现，土槿酸及其衍生物能作用于多种癌细胞如胃癌 细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞等，并具有明 显的量效关系。
目前金钱松人工种植主要采用有性繁殖和无性繁殖两种方式。有性 繁殖即种子繁殖，由于金钱松存在结实率低、结实间隔期较长(一般3～ 5年结实)、采种条件苛刻(采种母树年龄以100年左右为最好)、种子成 活率低(仅为60％-70％)、以及种子需低温保存等因素的限制，因此目 前通过有性繁殖大量种植金钱松植物还存在一定的困难。无性繁殖即扦 插繁殖，金钱松为菌根性树种，宜在海拔500m左右的山地建立永久性 育苗基地或在土内有菌的林间育苗，植物生长周期长，并易受金钱松小 卷蛾的严重危害，这些因素限制了金钱松的大量无性繁殖。由于人工种 植金钱松植物存在上述问题，因此目前迫切需要利用组织培养技术来大 规模生产品质优良的金钱松植物及其培养物，以满足人们对金钱松植物 和相关产物的需要。
目前关于对金钱松植物的研究，主要集中在对金钱松有效成分的提 取及其内生真菌的筛选方面，而在植物生物技术的研究报道方面，有王跃 华等人发明的“一种以叶原基为外植体的金钱松愈伤组织培养方法”(专利 号：ZL 201210104866.8)和“一种金钱松细胞的悬浮培养方法”(专利号： ZL 201210472291.5)的研究报道；然而上述两个专利是采用金钱松植物的 芽和叶原基为外植体，通过固体和液体两种培养方式，完成了对其愈伤组 织的诱导和增殖培养，目前还没有涉及到以金钱松叶片为外植体，经诱导 获得愈伤组织后，再进一步完成不定芽的分化和无根苗的生根培养，最后 成功培育出金钱松植物的组培苗的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以金钱松叶片为外植体的金钱松植株再生 方法，该方法通过诱导金钱松叶片产生愈伤组织、以及芽分化培养、生根 培养和炼苗与移栽等步骤，可获得生长速度快、不带任何病虫害且具有优 良性状的金钱松组培苗。
本发明提供的以金钱松叶片为外植体的金钱松植株再生方法包括如下 步骤：
(1)外植体的选取和消毒：选取生长健康、无病虫害的金钱松叶片， 先用浓度为75％的酒精消毒10～30s，用无菌水冲洗后，再用浓度为0.1％的 升汞消毒3～6min，最后用无菌水冲洗后用已灭菌的滤纸吸干表面的水分；
(2)外植体的处理：将消毒后的叶片放在滤纸上，用刀切伤金钱松叶 片，伤口以不切断叶片为准；
(3)愈伤组织的诱导培养：将处理后的金钱松叶片接入愈伤组织诱导 培养基GD+NAA0.5～1.5mg/L+GA30.5～1.5mg/L中进行愈伤组织的诱导培 养；
(4)芽分化培养：选取质地较紧密、生长状况良好的愈伤组织，接入 芽分化培养基MS+TDZ0.1～0.3mg/L+Ad 10～30mg/L中进行不定芽的诱导培 养；
(5)生根培养：当不定芽长至1.0～2.5cm时，将其切下转接到生根培 养基1/3MS+IAA0.5～1.5mg/L+活性炭20～40mg/L中进行生根培养；
(6)炼苗和移栽：当组培苗不定根生长健壮时，打开瓶盖，在室内炼 苗2～4天后，将其从培养瓶中取出，洗去不定根上的培养基，将其移栽至 松软的土壤中生长；
上述所有培养基的pH值5.5～6.7、蔗糖15～50g·L-1、琼脂4.0～6.0g·L-1； 所有培养条件为：每天光照12～24小时、光照强度为2000～3000lx、培养 温度20～30℃。
进一步地，步骤(1)中所述金钱松叶片为刚伸展1～7天的金钱松幼 嫩叶片。
进一步地，步骤(1)中用浓度为0.1％的升汞消毒时，每100ml的0.1％ 升汞溶液中还滴加了5～10ml吐温20。
进一步地，步骤(6)中移栽后的培养条件为适当遮光，温度保持在20～ 28℃，相对湿度保持在75～85％。
本发明利用组织培养技术，以金钱松叶片为外植体，建立了金钱松再 生植株的快速繁殖技术，为金钱松植株的大规模快速繁殖提供了一条新途 径，有效地解决了当前金钱松植物资源和种苗资源短缺的问题。另外实施 本发明方法，只需有简单的植物组织培养设备即可进行，因此实用性强， 可行性高，且不受季节限制。
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
具体实施方式
实施例1
(1)外植体的选取和消毒：在晴天选取生长健康、无病虫害和幼叶刚 伸展了1天的金钱松叶片，将其放在超净工作台上，先用浓度为75％的酒 精消毒10s，用无菌水冲洗3次后，再用浓度为0.1％的升汞(每100mL的 0.1％升汞溶液中滴加了5mL吐温20)消毒3min，最后用无菌水冲洗2次 后用已灭菌的滤纸吸干表面的水分；
(2)外植体的处理：将消毒后的叶片放在滤纸上，用刀切伤金钱松叶 片，伤口以不切断叶片为准；
(3)愈伤组织的诱导培养：将处理后的金钱松叶片接入愈伤组织诱导 培养基GD+NAA0.5mg/L+GA30.5mg/L中进行愈伤组织的诱导培养，叶片 在接入培养基中第7天，在其伤口处开始有愈伤组织产生，在培养30天后 统计其愈伤组织诱导率为39％；
(4)芽分化培养：选取质地较紧密、生长状况良好的愈伤组织，接入 芽分化培养基MS+TDZ0.1mg/L+Ad 10mg/L中进行不定芽的诱导培养，在 培养35天后统计其不定芽诱导率为19.38％；
(5)生根培养：当不定芽长至1.0cm时，将其切下转接到生根培养基 1/3MS+IAA0.5mg/L+活性炭20mg/L中进行生根培养，在培养35天后统计 其生根率为38.60％；
(6)炼苗和移栽：当组培苗不定根生长健壮时，打开瓶盖，在室内炼 苗2天后，将其从培养瓶中取出，洗去不定根上的培养基，将其移栽至松 软的土壤中生长，适当遮光，温度保持在20℃，相对湿度在75％，组培苗 快速生长，成活率在93％以上；
上述所有培养基的pH值5.5、蔗糖15g·L-1、琼脂4.0g·L-1；上述培养 基中的培养条件为：每天光照12小时、光照强度为2000lx、培养温度20℃。
实施例2
(1)外植体的选取和消毒：在晴天选取生长健康、无病虫害和幼叶刚 伸展了2天的的金钱松叶片，将其放在超净工作台上，先用浓度为75％的 酒精消毒15s，用无菌水冲洗3次后，再用浓度为0.1％的升汞(每100mL 的0.1％升汞溶液中滴加了7mL吐温20)消毒4min，最后用无菌水冲洗4 次后用已灭菌的滤纸吸干表面的水分；
(2)外植体的处理：将消毒后的叶片放在滤纸上，用刀切伤金钱松叶 片，伤口以不切断叶片为准；
(3)愈伤组织的诱导培养：将处理后的金钱松叶片水平接在愈伤组织 诱导培养基GD+NAA1.0mg/L+GA31.0mg/L表面进行愈伤组织的诱导培养， 叶片在接入培养基中第7天，在其伤口处开始有愈伤组织产生，在培养30 天后统计其愈伤组织诱导率为65％；
(4)芽分化培养：选取质地较紧密、颜色为绿色和黄绿色的愈伤组织， 接入芽分化培养基MS+TDZ0.2mg/L+Ad 20mg/L中进行不定芽的诱导培养， 在培养35天后统计其不定芽诱导率为23.18％；
(5)生根培养：当不定芽长至2.0cm时，将其切下转接到生根培养基 1/3MS+IAA1.0mg/L+活性炭30mg/L中进行生根培养，在培养35天后统计 其生根率为54.0％；
(6)炼苗和移栽：当组培苗不定根生长健壮时，打开瓶盖，在室内炼 苗3天后，将其从培养瓶中取出，洗去不定根上的培养基，将其移栽至松 软的土壤中生长，适当遮光，温度保持在24℃，相对湿度在76％，组培苗 快速生长，成活率在95％以上；
上述所有培养基的pH值5.9、蔗糖30g·L-1、琼脂5.0g·L-1；上述培养 基中的培养条件为：每天光照18小时、光照强度为2500lx、培养温度25℃。
实施例3
(1)外植体的选取和消毒：选取生长健康、无病虫害的金钱松叶片， 将其放在超净工作台上，先用浓度为75％的酒精消毒30s，用无菌水冲洗3 次后，再用浓度为0.1％的升汞(每100ml的0.1％升汞溶液中滴加了10ml 吐温20)消毒6min，最后用无菌水冲洗4次后用已灭菌的滤纸吸干表面的 水分；
(2)外植体的处理：将消毒后的叶片放在滤纸上，用刀切伤金钱松叶 片，伤口以不切断叶片为准；
(3)愈伤组织的诱导培养：将处理后的金钱松叶片接入愈伤组织诱导 培养基GD+NAA1.5mg/L+GA31.5mg/L中进行愈伤组织的诱导培养，叶片在 接入培养基中第7天，在其伤口处开始有愈伤组织产生，在培养30天后统 计其愈伤组织诱导率为48％；
(4)芽分化培养：选取质地较紧密、生长状况良好的愈伤组织，接入 芽分化培养基MS+TDZ0.3mg/L+Ad 30mg/L中进行不定芽的诱导培养，在 培养35天后统计其不定芽诱导率为20.24％；
(5)生根培养：当不定芽长至2.5cm时，将其切下转接到生根培养基 1/3MS+IAA1.5mg/L+活性炭40mg/L中进行生根培养，在培养35天后统计 其生根率为47.60％；
(6)炼苗和移栽：当组培苗不定根生长健壮时，打开瓶盖，在室内炼 苗4天后，将其从培养瓶中取出，洗去不定根上的培养基，将其移栽至松 软的土壤中生长，适当遮光，温度保持在28℃，相对湿度保持在85％，组 培苗快速生长，成活率在90％以上；
上述所有培养基的pH值6.7、蔗糖50g·L-1、琼脂6.0g·L-1；上述培养 基中的培养条件为：每天光照12～24小时、光照强度为2000～3000lx、培 养温度20～30℃。
比较实施例1
将实施例2步骤(1)中的金钱松叶片改选为幼叶伸展20天的金钱松 叶片，其它步骤同实施例2，在培养30天后统计其愈伤组织诱导率仅为 20.43％。
比较实施例2
将实施例2的步骤(2)取消，其它步骤同实施例2，在培养30天后统 计其愈伤组织诱导率仅为18.42％。
比较实施例3
将实施例2步骤(3)中叶片接入培养基中的方式改为竖直插入到培养 基中，其它步骤同实施例2，在培养30天后统计其愈伤组织诱导率仅为 13.82％。
比较实施例4
将实施例2步骤(3)中所述愈伤组织诱导培养基中的基本培养基由 GD改为MS，其它步骤如实施例2，在培养30天后统计其愈伤组织诱导率 仅为27.85％。
比较实施例5
将实施例2步骤(3)中所述愈伤组织诱导培养基改为 GD+NAA1.0mg/L，其它步骤如实施例2，在培养30天后统计其愈伤组织诱 导率仅为18.55％。
比较实施例6
在实施例2步骤(4)中改选为质地较疏松、颜色为黄色的愈伤组织， 其它步骤如实施例2，在培养35天后统计其不定芽诱导率为0％。
比较实施例7
将实施例2步骤(4)中所述不定芽的诱导培养基改为MS+TDZ0.2mg/L， 其它步骤同实施例2，在培养35天后统计其不定芽诱导率仅为10.28％。
比较实施例8
将实施例2步骤(4)中所述不定芽的诱导培养基改为MS+Ad 20mg/L， 其它步骤同实施例1，在培养35天后统计其不定芽诱导率仅为7.51％。
比较实施例9
将实施例2步骤(5)中所述生根培养基改为MS+IAA1.0mg/L+活性炭 30mg/L，其它步骤同实施例2，在培养35天后统计其生根率仅为24.60％。