荧光光谱可调的量子点纳米复合粒子的制备方法.pdf

一种纳米技术与生物医学的交叉领域的荧光光谱可调的量子点纳米复合粒子的制备方法，在油包水型微乳体系中，将两种或两种以上荧光颜色可区分的量子点纳米粒子同时包埋到二氧化硅纳米粒子中，形成一种粒度在10~100nm之间的荧光光谱可调的量子点纳米复合粒子，通过改变不同荧光颜色的量子点的种类和比例，来调整量子点纳米复合粒子的荧光峰的位置和强度。本发明可以方便地对任何荧光颜色的量子点进行任意组合并能同时全部包埋到粒度均匀且小于100nm的二氧化硅球形粒子中，可以得到数量庞大的具有不同荧光特征的量子点纳米复合粒子。本发明所获得的量子点纳米复合粒子，可以作为一种生物荧光探针应用于生物医学的多方面领域。

1、  一种荧光光谱可调的量子点纳米复合粒子的制备方法，其特征在于，在油包水型微乳体系中，将两种或两种以上荧光颜色可区分的量子点纳米粒子同时包埋到二氧化硅纳米粒子中，形成荧光光谱可调的量子点纳米复合粒子，通过改变两种或两种以上荧光颜色的量子点的种类和比例，来调整量子点纳米复合粒子的荧光峰的位置和强度，其中：
所述的量子点纳米粒子包埋到二氧化硅纳米粒子中，是在乳液中进行的，包埋时温度为0.5-70℃，pH为3-14；
所述的量子点是指主要由II-VI簇或III-V簇元素组成的半导体纳米微晶以及由它们组成的核-壳结构的量子点和量子点量子阱，以及掺杂量子点。

2、  根据权利要求1所述的荧光光谱可调的量子点纳米复合粒子的制备方法，其特征是，所述的量子点是指主要由II-VI簇或III-V簇元素组成的半导体纳米微晶以及由它们组成的核-壳结构的量子点和量子点量子阱，如：CdS，ZnS，HgS，CdSe，ZnSe，HgSe，CdTe，ZnTe，ZnO，PbSe，HgTe，GaAs，InP，InAs，InGaAs，CdS/ZnS，CdS/Ag2S，CdS/PbS，CdS/Cd(OH)2，CdS/HgS，CdS/HgS/CdS，ZnS/CdS，ZnS/CdS/ZnS，ZnS/HgS/ZnS/CdS，CdSe/CdS，CdSe/ZnS，CdSe/ZnSe，CdSe/CuSe，CdSe/HgTe，CdSe/HgSe，CdSe/HgSe/CdSe，CdTe/HgS，InAs/InP，InAs/CdSe，InAs/ZnSe；还包括：MgS，MgSe，MgTe，CaS，CaSe，CaTe，SrS，SrSe，CuS，SeTe，BaS，BaSe，BaTe；以及掺杂量子点：CdS:Mn，ZnS:Mn，CdS:Cu，ZnS:Cu，CdS:Tb，ZnS:Tb中的任意一种或几种的组合。

3、  根据权利要求1所述的荧光光谱可调的量子点纳米复合粒子的制备方法，其特征是，所述的微乳体系是由水相液滴分散在油相液体中形成的由乳化剂为界面膜的胶体分散体系，粒径为10-100nm，所述的乳化剂是由表面活性剂与助表面活性剂或者单独由表面活性剂组成，微乳体系中，乳化剂质量百分比浓度：2-40％，水相浓度：0.1-45％，其余为油相。

4、  根据权利要求1或者3所述的荧光光谱可调的量子点纳米复合粒子的制备方法，其特征是，将两种荧光颜色可区分的量子点纳米粒子按所需要的比例进行混合，混合的量子点的溶剂为水相，然后将量子点混合水溶液与乳化剂和油进行混合，形成混合量子点的W/O型微乳液，在该微乳的乳滴中通过硅酸酯水解或通过硅酸盐的沉淀反应生成二氧化硅，反应时间为30min-10天，通过离心使反应产物沉淀，用水和有机溶剂洗涤反应的沉淀产物，得到两个荧光峰彼此可区分的量子点纳米复合粒子，通过改变两种荧光颜色的量子点的种类和比例，来调整量子点纳米复合粒子的两种荧光峰的位置和强度，
所述的硅酸酯是指正硅酸甲酯、正硅酸乙酯、正硅酸丙酯中的任意一种，其水解是在酸或碱的条件下进行的。

5、  根据权利要求1或者3所述的荧光光谱可调的量子点纳米复合粒子的制备方法，其特征是，将三种荧光颜色可区分的量子点纳米粒子按所需要的比例进行混合，然后制备量子点的微乳液并在微乳液中合成二氧化硅，通过改变量子点混合液中不同荧光特征的量子点的种类和比例，来调整所获得的量子点纳米复合粒子的荧光光谱的峰位置和强度。

6、  根据权利要求1所述的荧光光谱可调的量子点纳米复合粒子的制备方法，其特征是，所述的荧光光谱可调的量子点纳米复合粒子，表面可连接抗体、配体、多肽、细胞因子、核酸，它们与量子点纳米复合粒子之间的作用为吸附、化学键合。

7、  根据权利要求1所述的荧光光谱可调的量子点纳米复合粒子的制备方法，其特征是，所述的荧光光谱可调的量子点纳米复合粒子，表面含有修饰剂，这些修饰剂是指分子中含有羧基、氨基、羟基、磺酸基、腈基中的一种或几种极性基团的高分子或小分子，或者是指硅烷偶连剂，这些修饰剂分子是在量子点纳米复合粒子制备过程中加入的，或者是在量子点纳米复合粒子制备结束后加入的，所修饰的分子与量子点纳米复合粒子之间的作用方式为吸附、化学键合，表面的修饰度为0-99％摩尔比。

8、  根据权利要求1所述的荧光光谱可调的量子点纳米复合粒子的制备方法，其特征是，获得的荧光光谱可调的量子点纳米复合粒子是分散在去离子水或分散在蒸馏水或分散在0.9％的生理盐水或分散在缓冲溶液中的，量子点纳米复合粒子的分散液中含有起分散和稳定纳米复合粒子的分散剂分子，这些分散剂分子中含有羧基、氨基、羟基、磺酸基、腈基中的一种或几种极性基团，分散剂分子质量百分比浓度为0-5％。

9、  根据权利要求1所述的荧光光谱可调的量子点纳米复合粒子的制备方法，其特征是，获得的量子点纳米复合粒子进行冷冻干燥，使产物以粉末状态保存。

荧光光谱可调的量子点纳米复合粒子的制备方法
技术领域
本发明涉及的是一种纳米技术与生物医学交叉领域的纳米复合粒子的制备方法，尤其是一种荧光光谱可调的量子点纳米复合粒子的制备方法。
发明背景
量子点是指由II-VI簇或III-V簇元素组成的半导体纳米微晶，是纳米材料中的重要组成部分。量子点在光的激发下，可发射比传统荧光物质更优越的荧光，其光学性质使量子点具有极广泛的应用。量子点在生物医学中的应用是目前纳米技术与生物技术相结合的前沿性领域，受到研究者们极大的关注。将不同荧光颜色和荧光强度的量子点进行组合，可得到数量庞大的具有不同荧光光谱特征的量子点微球。这种微球具有极高的科学研究价值和实际应用价值，它可以应用于生物医学中的高通量分析，在基因或蛋白质编码中可望发挥重大作用。Nie的研究小组率先制备了具有多种荧光颜色和荧光强度的量子点聚苯乙烯微球，方法是先通过苯乙烯的乳液聚合获得0.1-5μm聚苯乙烯微球，然后将微球置于氯仿与丙醛或丁醇的混合溶剂中于室温下进行溶胀，并将不同数量和不同荧光特征的的量子点CdSe/ZnS加入其中，量子点通过扩散作用在30min内进入到溶胀的微球孔隙中。微球中的孔径分布对于量子点的组装至关重要，Nie的研究小组先将大粒径的量子点先引入到微球的孔隙中，然后再引入较小的量子点，结果得到了具有不同光谱特征和发光强度的量子点微球。理论上，应用10中荧光强度和6中荧光颜色的量子点就可对100万个DNA或蛋白质序列进行编码。
经对现有技术的文献检索发现，美国专利申请号6,548,171，发明名称：Fluorescent nanocrystal-embedded microspheres for fluorescence analyses(荧光分析用的包埋荧光纳米晶粒的微球)，该专利通过加热或加热并加压的方法使聚合物微球发生溶胀，使量子点纳米粒子进入聚合物微球因溶胀而产生的孔隙中，然后对体系进行降温、减压等方法使聚合物溶胀停止，从而将量子点物理包埋到微球中。或者将聚合物微球加入到一种或多种有机溶剂中使微球发生溶胀，使量子点进入微球的孔隙中，然后移去有机溶剂使微球溶胀停止，量子点便物理包埋在聚合物微球中。
以上方法共同特点是将量子点扩散到容胀的聚合物微球的孔隙中。由于微球是事先制备好的，因此获得的量子点聚合物微球的粒度分布可事先确定，通过改变加入的量子点的种类和数量，获得单颜色和多颜色的量子点聚合物微球。然而，这种方法制备量子点微球，主要受微球在容胀后产生的孔隙数量和孔隙大小的影响。将不同荧光颜色的量子点填装到微球中时，加入量子点要有先后顺序，否则，粒径大的量子点将难以进入微球中。此外，所制备的量子点聚合物微球的粒径在亚微米到微米级分布，作为生物医学中的标记示踪材料，微球的粒径偏大。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种荧光光谱可调的量子点纳米复合粒子的制备方法。通过采用在微乳液中以二氧化硅包埋量子点的方法，使其将所加入的量子点全部包埋到二氧化硅中，而且得到的是单分散的粒度小于100nm的量子点纳米复合粒子，制备过程温和，得到的量子点纳米复合粒子在生物医学领域具有重要的研究价值和广阔的应用前景。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明在油包水型微乳体系中，将两种或两种以上荧光颜色可区分的量子点纳米粒子同时包埋到二氧化硅纳米粒子中，形成一种粒度在10~100nm之间地荧光光谱可调的量子点纳米复合粒子，通过改变不同荧光颜色的量子点的种类和比例，来调整量子点纳米复合粒子的所有荧光峰的位置和强度。这种纳米复合粒子表面还可进一步连接抗体、配体、多肽、细胞因子、核酸等生物分子。
所述的量子点纳米粒子包埋到二氧化硅纳米粒子中，是在乳液中进行的，包埋时温度为0.5~70℃，pH为3~14。
所述的量子点是指主要由II-VI簇或III-V簇元素组成的半导体纳米微晶以及由它们组成的核-壳结构的量子点和量子点量子阱，如：CdS，ZnS，HgS，CdSe，ZnSe，HgSe，CdTe，ZnTe，ZnO，PbSe，HgTe，GaAs，InP，InAs，InGaAs，CdS/ZnS，CdS/Ag2S，CdS/PbS，CdS/Cd(OH)2，CdS/HgS，CdS/HgS/CdS，ZnS/CdS，ZnS/CdS/ZnS，ZnS/HgS/ZnS/CdS，CdSe/CdS，CdSe/ZnS，CdSe/ZnSe，CdSe/CuSe，CdSe/HgTe，CdSe/HgSe，CdSe/HgSe/CdSe，CdTe/HgS，InAs/InP，InAs/CdSe，InAs/ZnSe；还包括：MgS，MgSe，MgTe，CaS，CaSe，CaTe，SrS，SrSe，CuS，SeTe，BaS，BaSe，BaTe；以及掺杂量子点：CdS:Mn，ZnS:Mn，CdS:Cu，ZnS:Cu，CdS:Tb，ZnS:Tb中的任意一种或几种的组合。量子点纳米粒子表面可修饰能增强粒子稳定性的分子，如亲水性高分子、疏水性高分子、表面活性剂等。
所述的微乳体系是由水相液滴分散在油相液体中形成的由乳化剂为界面膜的胶体分散体系，粒径为10~100nm。所述的乳化剂是由表面活性剂与助表面活性剂或者单独由表面活性剂组成。微乳体系中，乳化剂质量百分比浓度：2~40％，水相浓度：0.1~45％，其余为油相。
如将两种荧光颜色可区分(如红色与绿色、红色与黄色、黄色与绿色、黄色与蓝色等)的量子点纳米粒子按所需要的比例进行混合，混合的量子点的溶剂为水相，如去离子水或蒸馏水或0.9％的生理盐水或缓冲溶液等，然后将量子点混合水溶液与乳化剂和油进行混合，形成混合量子点的W/O型微乳液。在该微乳的乳滴中通过硅酸酯水解或通过硅酸盐的沉淀反应生成二氧化硅，反应时间为30min~10天。通过离心使反应产物沉淀，用水和有机溶剂如甲醇、乙醇等洗涤反应的沉淀产物，得到两个荧光峰彼此可以区分的量子点纳米复合粒子。通过改变两种荧光颜色的量子点的种类和比例，来调整量子点纳米复合粒子的两种荧光峰的位置和强度。
所述的硅酸酯是指正硅酸甲酯、正硅酸乙酯、正硅酸丙酯等中的任意一种，其水解是在酸或碱的条件下进行的。
再如将三种荧光颜色可区分(如红色与黄色与绿色、红色与黄色与蓝色、黄色与绿色与蓝色，等)的量子点纳米粒子按所需要的比例进行混合，然后按照上述相同的方法制备量子点的微乳液并在微乳液中合成二氧化硅。通过改变量子点混合液中不同荧光特征的量子点的种类和比例，来调整所获得的量子点纳米复合粒子的荧光光谱的峰位置和强度。
所述的荧光光谱可调的量子点纳米复合粒子，表面可连接抗体、配体、多肽、细胞因子、核酸等生物分子，它们与量子点纳米复合粒子之间的作用为吸附、化学键合等。
所述的荧光光谱可调的量子点纳米复合粒子，表面含有修饰剂，这些修饰剂是指分子中含有羧基、氨基、羟基、磺酸基、腈基中的一种或几种极性基团的高分子或小分子，或者是指硅烷偶连剂。这些修饰剂分子是在量子点纳米复合粒子制备过程中加入的，或者是在量子点纳米复合粒子制备结束后加入的，所修饰的分子与量子点纳米复合粒子之间的作用方式为吸附、化学键合。表面的修饰度为0-99％摩尔比。
获得的荧光光谱可调的量子点纳米复合粒子是分散在去离子水或分散在蒸馏水或分散在0.9％的生理盐水或分散在缓冲溶液中的。量子点纳米复合粒子的分散液中含有起分散和稳定纳米复合粒子的分散剂分子，这些分散剂分子中含有羧基、氨基、羟基、磺酸基、腈基中的一种或几种极性基团，分散剂分子质量百分比浓度为0~5％。或者对获得的量子点纳米复合粒子进行冷冻干燥，使产物以粉末状态保存。
本发明具有实质性特点和显著进步，本发明可以方便地对任何荧光颜色的量子点进行任意组合并能同时全部包埋到粒度十分均匀且小于100nm的二氧化硅球形粒子中，理论上可得到上百万以上的不同荧光特征的量子点纳米复合粒子。由于本发明所获得的量子点纳米复合粒子，其表面可连接多种生物分子，因此，它可以作为一种生物荧光探针应用于生物医学的多方面领域。
具体实施方式
实施例1：
将表面修饰有巯基乙酸的水溶性的且最大发射波长在635nm荧光峰半高宽为40nm的CdSe/CdS量子点[以下简称CdSe/CdS(635)]与最大发射波长在565nm荧光峰半高宽为45nm的水溶性CdSe/CdS量子点[以下简称CdSe/CdS(565)]在去离子水中进行混合。调节这两种量子点的体积比例，得到在以450nm波长的激发光激发混合液时CdSe/CdS(635)的最大荧光发射值与CdSe/CdS(565)的比例分别为1∶1、1∶3和3∶1的3种量子点混合液。分别取这3种混合液，加入到由磷脂、乙醇、十四酸异丙酯组成的混合液中，振荡30sec左右即得到3种透明的量子点微乳，分别记为“微乳1∶1”、“微乳1∶3”、“微乳3∶1”。这些微乳体系中，混合表面活性剂磷脂和乙醇的浓度为40％，量子点浓度为14％，十四酸异丙酯为46％。然后分别向这3种微乳中滴加正硅酸乙酯溶液，搅拌。将“微乳1∶1”溶液等份3等份(即共有5个微乳反应体系)，反应条件分别为：0.5℃，水相pH为14；70℃，水相pH为3；其余反应条件为30℃，水相pH为9。磁力搅拌，于30min，24h，10天后取样。
通过离心分离反应产物，用乙醇洗涤分离出的沉淀3次，再用去离子水洗涤沉淀3次，将一部分产物分别分散到含有浓度为0.01％、0.5％和5％的聚乙二醇水溶液中，超声波分散2min，另一部分经过冷冻干燥24h后以粉末状态保存。
结果，在透射电子显微镜下，所有产物粒子为规则的球形，反应时间小于5天的样品，其粒度大部分为70±3nm，每个球形纳米粒子中含有5~50颗粒度在3~10nm的更小的球形纳米粒子。反应超过5天的样品，粒子聚集较多。
以450nm的激发光激发反应产物时，发现在560nm和631nm处有两个彼此分离的荧光峰，这两个荧光峰的强度有所增强，但它们的比值与1∶1、1∶3和3∶1相比有一定偏离。X-射线衍射分析表明，量子点表面生成的产物为二氧化硅。
实施例2：
将CdSe/CdS(635)和CdSe/CdS(565)]在去离子水中进行混合，得到在以450nm波长的激发光激发混合液时CdSe/CdS(635)的最大荧光发射值与CdSe/CdS(565)的比例为1∶1量子点混合液。将该混合液2等份，分别加入到由磷脂、乙醇、十四酸异丙酯组成的混合液中，振荡30sec左右即得到2个量子点乳液，其中一个乳液样品中，混合表面活性剂磷脂和乙醇的浓度为2％，量子点浓度为0.1％，其余为十四酸异丙酯。另一个乳液样品中，混合表面活性剂磷脂和乙醇的浓度为40％，量子点浓度为45％，其余为十四酸异丙酯。均在30℃和水相pH为9的条件下反应。48h后取样，采用实施例1相同的方法分离洗涤产物，并将产物分散到去离子水中。
结果，在透射电子显微镜下，所有产物粒子为球形，量子点浓度为0.1％的样品，粒子粒度大多小于20nm，大部分粒子中含有2~6nm左右的小粒子。量子点浓度为45％的样品，部分粒子已聚集成亚微米的粒子，对于聚集体中的单个原生粒子，粒度约在90~100nm。粒子中有更小的小粒子。以450nm的激发光激发反应产物时，发现在560nm和631nm处仍然有两个彼此分离的荧光峰，荧光强度比为1∶1.4。
实施例3：
将荧光最大发射波长在500nm，577nm和635nm且荧光峰的半高宽分别为65nm、50nm和45nm的水溶性CdSe/CdS进行混合，得到以450nm激发光激发时最大荧光发射值的比例为1∶2∶3的量子点混合液。将量子点混合液加入到由磷脂、乙醇、十四酸异丙酯组成的混合液中，即得量子点乳液。微乳中，混合表面活性剂磷脂和乙醇的浓度为34％，量子点浓度为10％，其余为十四酸异丙酯。然后向这微乳中滴加正硅酸乙酯溶液，在30℃和水相pH为9的条件下反应24h。采用实施例1相同的方法分离洗涤产物，并将产物分散到去离子水中，超声波分散2min。
结果在透射电子显微镜下，观察到50~70nm的分散较好的球形粒子，每个球形纳米粒子中含有5~50颗数目不等的小于10nm的更小的球形粒子。以450nm的激发光激发分离出的反应产物，结果在490nm，570nm和630nm处出现3个荧光峰。
实施例4：
按实施例3相同的方法制备量子点纳米复合粒子。
取该纳米复合粒子300μL，浓度为50mg·mL^-1，向其中加入适量硅烷偶连剂KH550和乙醇，于60℃反应5h，然后离心，用去离子水洗涤3次，将沉淀再分散到去离子水中，然后加入浓度为25％的戊二醛，室温反应4h后，用去离子水洗涤3次，将沉淀分散到去离子水中，加入20μL浓度为0.1μg·uL^-1的表皮生长因子(EGF)，室温反应过夜，再用去离子水洗涤3次，即得到表面连接EGF的近红外荧光纳米复合粒子。
将连接了EGF的量子点纳米复合粒子加入到表达EGFR的卵巢癌细胞Skov-3中于37℃培育30min，用PBS洗涤细胞3次，在荧光显微镜下观察，结果发现大部分细胞周围有明亮的橘红色荧光。对比实验表明，没有连接EGF的量子点纳米复合粒子在与Skov-3细胞培育后，细胞周围只有很少的橘红色荧光，很多细胞无橘红色荧光，单独的Skov-3细胞有极其微弱的绿色自发荧光。