玉米根虫和其他昆虫害虫的管理.pdf

本发明提供诱虫作物和/或庇护作物以及用于管理玉蜀黍的玉米根虫和其他昆虫害虫的方法。一些方法涉及使用诱虫作物来引诱和杀灭昆虫害虫，所述诱虫作物包括具有提高的对一种或更多种昆虫害虫的易感性的植物。其他方法涉及使用庇护作物，所述庇护作物包括具有提高的对一种或更多种昆虫害虫的易感性的植物，来监测某个区域中的昆虫害虫群体或者促进杀虫剂抗性昆虫与非杀虫剂抗性昆虫之间的交配。

权利要求书1.  一种减少昆虫害虫对主要作物的植食性的方法，所述方法包括：a.在某个区域中种植所述主要作物；以及b.在所述主要作物当中、紧邻所述主要作物或者在所述主要作物2公里以内种植诱虫作物，所述诱虫作物包括一种或多种由于Crw1和/或Crw2的内源表达降低而具有提高的对昆虫害虫植食性的易感性的植物。2.  根据权利要求1所述的方法，其中所述昆虫害虫是鞘翅目或者鳞翅目害虫。3.  根据权利要求1所述的方法，其中所述主要作物是玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、小米或者甘蔗。4.  根据权利要求1所述的方法，其中所述诱虫作物是玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、小米或者甘蔗。5.  根据权利要求1所述的方法，还包括消灭存在于所述诱虫作物上的所述昆虫害虫。6.  根据权利要求1所述的方法，其中所述诱虫作物包括一种或多种包含干扰所述昆虫害虫的生活周期的转基因的植物。7.  根据权利要求6所述的方法，其中所述转基因产生在所述昆虫害虫取食所述诱虫作物中的植物时被引入到所述昆虫害虫的dsRNA。8.  根据权利要求1所述的方法，还包括在下一生长季节中对所述诱虫作物的所述区域进行轮作以控制下一代的所述昆虫害虫。9.  根据权利要求1所述的方法，还包括在下一生长季节种植之前进行耕土以控制下一代的所述昆虫害虫。10.  根据权利要求1所述的方法，其中所述诱虫作物占包括所述诱虫作物和主要作物的总区域的约10％。11.  根据权利要求1所述的方法，其中所述诱虫作物与所述主要作物一起收获。12.  一种减少昆虫害虫的幼虫取食主要作物的根的方法，所述方法包括：a.在一年中种植诱虫作物，所述诱虫作物包括一种或多种由于Crw1和/或Crw2的内源表达降低而具有提高的对昆虫害虫植食性的易感性的植物；以及b.消灭存在于所述诱虫作物上的所述昆虫害虫，使得所述昆虫害虫不能为下一代产卵。13.  根据权利要求12所述的方法，其中所述昆虫害虫处于成虫期，并且其中所述昆虫害虫在交配和/或产卵前被消灭。14.  根据权利要求12所述的方法，其中所述昆虫害虫处于卵期或者蛹期。15.  一种减少或者延迟针对作物中存在的一种或更多种抗虫性状的抗性昆虫发展的方法，所述方法包括在大田中种植包括一种或更多种具有降低的Crw1和/或Crw2活性的植物的庇护作物，所述大田中还包括具有一种或更多种抗虫性状的作物。16.  根据权利要求15所述的方法，其中所述庇护作物占所述大田中种植的作物植物的约1％至约20％。17.  根据权利要求15所述的庇护作物，其中所述一种或更多种植物是玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、小米或者甘蔗。18.  一种诱虫作物或者庇护作物，其包括一种或更多种由于Crw1和/或Crw2的内源表达降低而具有提高的对昆虫害虫植食性的易感性的植物。19.  根据权利要求1所述的诱虫作物，其中所述昆虫害虫是鞘翅目或者鳞翅目害虫。20.  根据权利要求1所述的诱虫作物，其中所述一种或更多种植物是玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、小米或者甘蔗。

说明书玉米根虫和其他昆虫害虫的管理
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年9月20日提交的美国临时申请第61/703,396号；2013年3月14日提交的美国临时申请第61/781,057号；2012年9月20日提交的美国临时申请第61/703,414号；2013年3月14日提交的美国临时申请第61/781,124号；以及2013年3月14日提交的美国临时申请第61/782,116号的权益，所述临时申请的全部内容以引用方式并入本文。
序列表的引用
序列表作为于2013年9月20日创建的名为“BB2191PCT_Sequence_Listing”的文本文件于2013年9月20日提交，大小为167,238字节，根据37C.F.R.§1.52(e)(5)以引用方式将其并入本文。
技术领域
技术领域涉及包括具有提高的对一种或更多种昆虫害虫植食性(herbivory)的易感性的植物的诱虫作物和/或庇护作物，以及它们作为昆虫害虫管理计划的一部分的用途。
背景技术
昆虫、线虫和相关的节肢动物每年在美国估计破坏15％的农作物，在发展中国家破坏的比例更高。这种损害有些是在植物病原体、昆虫和其他此类土生(soil borne)害虫在种子种植后攻击种子时在土壤中发生的。例如在玉米的生产中，这种损害的其余部分中有很多是由根虫(以取食或者以别的方式损害植物根的昆虫害虫)、由切根虫、欧洲玉米螟(ECB)以及由取食或者损害植物的地上部分的其他害虫引起的。有关害虫对农作物的攻击的类型和机制的一般描述由例如以下文献提供：Metcalf，1962年，《破坏性昆虫和有益昆虫：它们的习性和防控(第四版)》(Destructive and Useful Insects：Their Habits and Control)Fourth Edition)，(更早的版本由C.L. Metcalf和W.P.Flint编著)，麦格劳-希尔图书公司(McGraw-Hill Book Company)，纽约，三藩市、多伦多、伦敦；以及Agrios，1988年，《植物病理学(第三版)》(Plant Pathology，3rd Ed.)，学术出版社(Academic Press)。
在北美，传统上，轮作和使用杀虫剂是针对以下害虫的主要管理策略：玉米根虫[西部玉米根虫(Diabrotica virgifera virgifera LeConte)、北部玉米根虫(Diabrotica barberi Smith和Diabrotica barberi Lawrence)以及南部玉米根虫(Diabrotica undecimpunctata howardi Barber)]。但是，西部玉米根虫(WCR)的生物变型(biotype)适应而优先在大豆植物上产卵、北部玉米根虫(NCR)的生物变型适应而导致卵的滞育延长、玉米根虫对土壤杀虫剂和叶面杀虫剂的逆抗性以及人们对连作玉米的不断增加的需求，已导致了近年来这种昆虫害虫的分布区显著扩大。能防护根虫的转基因杀虫性杂交玉米(Bt)的市场供应提供了一种有效的替代方案，结果导致用于防控WCR的转基因玉米的种植面积快速增加。针对Bt杀虫蛋白的广泛使用，需要考虑昆虫抗性管理方法。对于其他昆虫害虫如欧洲玉米螟的防控计划，存在类似的问题和关注。
对于另外的防控方法存在着需求，所述另外的防控方法可与其他方法或者过程联合使用，以便得到成本效益性好且具有可持续性的昆虫害虫管理方案。对于降低昆虫害虫发展对Bt毒素的抗性的可能性的方法也存在着需求。
发明内容
本文提供了由于Crw1和/或Crw2的内源表达的降低而对昆虫害虫植食性的易感性提高的植物。还提供了制备这种植物的方法。所述植物可为玉蜀黍(maize)、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜(kanola)、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、小米或者甘蔗。玉蜀黍尤其值得关注。昆虫害虫可为鞘翅目或者鳞翅目害虫。玉米(corn)根虫、欧洲玉米螟、日本金龟子、秋幕毛虫和香蒲毛虫特别值得关注。
还提供了包括这种植物的诱虫作物。诱虫作物可由选自以下的植物构成：玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、小米和甘蔗。玉蜀黍特别值得关注。
提供了使用诱虫作物来防控一种或更多种昆虫害虫的方法。
还提供了包含这种植物的庇护作物。庇护作物可由选自以下的植物构成：玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、小米和甘蔗。玉蜀黍特别值得关注。
本文提供了使用庇护作物来减少昆虫害虫发展对杀虫剂或者对抗虫转基因植物所提供的毒素的抗性的方法。
附图和序列表的说明
由以下的“具体实施方式”及构成本申请的一部分的附图和序列表可以更完全地理解本公开。
图1显示从叶取食选择测定法获得的结果，在该测定法中，将西部玉米根虫(WCR)甲虫放在具有来自玉蜀黍crw1-Ac突变株的叶子和来自其野生型亲缘株的叶子的盒子中。结果代表9个生物样品的平均值。
图2显示玉蜀黍Crw1基因、crw1-Ac突变株系中的突变的位置以及公共的多样性株系CO109和NC316中的插入的位置的示意图。
图3绘出了Crw1突变植株(MT)和野生型(WT)植株响应机械创伤(“机械创伤”)和秋粘虫毛虫(Fall Armyworm caterpillar)反刍(“反刍(Regurgitant)”)的茉莉酸(JA)的定量。Crw1突变植株积累较高水平的JA，但仅响应所施加的应激。
图4绘出了来自Crw1突变植株(MT)和野生型植株(WT)的幼叶和成叶的对香豆酸和阿魏酸水平的差异。
图5绘出了Crw1突变植株(MT)和野生型植株(WT)的叶木质素含量的差异。
图6A-6C显示来自野生型亲缘株的Crw1的cDNA序列与crw1-Ac突变等位基因的比对，该突变等位基因是切除原始等位基因中存在的自主Ac转座子而得到的。外显子1中的8bp插入(加框显示)导致预测的肽链在插入位点处过早终止。
图7A-7C显示来自野生型亲缘株的Crw1的cDNA序列与crw1-CO109等位基因的比对。该crw1-CO109等位基因与其野生型亲缘株相比，在外显子2中添加了1bp的插入和两个其他的bp变化(参见图7A中的箭头，其 指示插入和bp变化的位置。)在外显子2中插入1bp导致CRw1肽的过早终止。
图8A-8C显示来自野生型亲缘株的Crw1的cDNA序列与crw1-NC316等位基因的比对。该crw1-NC316等位基因具有1bp插入(参见图8A中的箭头)并在第二外显子中具有45bp插入。该1bp插入的存在导致在45bp插入的位点处出现过早终止密码子。
图9A-9L显示SEQ ID NO：3、10、11、12、13、14、15，16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26和27的多肽的氨基酸序列的多序列比对。当某个位置处的所有残基匹配共有序列的残基时，则显示该残基；否则显示“.”。另外，精确匹配共有序列的残基加框显示。
图10显示图9A-9L中所示的多肽的每对氨基酸序列的序列同一性百分数和趋异值(divergence value)。
图11A-11G显示ZmCrw2与crw2-Mutag突变等位基因之间的比对。
图12A-12F显示ZmCrw2与crw2-EMS突变等位基因之间的比对。
图13显示玉蜀黍同型半乳糖醛酸聚糖1(Homogalacturonanl，HGA1)基因(也称糖基转移酶AER61或者Crw2)的结构。显示了两个增变基因(mutator)插入和EMS等位基因的位置。
图14A-14J显示ZmCrw2蛋白(SEQ ID NO：29)与其同系物(SEQ ID NO：34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、47、49和50)的比对。
图15显示图14A至14J中所示的多肽的每对氨基酸序列的序列同一性百分数和趋异值。
图16(A)显示10天龄的籽苗中crw2-Mutag突变等位基因的基因表达。总RNA样品是从叶子、茎秆和根组织收集，RT-PCR分析是使用基因特异性引物进行。crw2-Mutag突变株在三个组织中显示出差异表达，并且具有比野生型亲缘株中的转录物长145bp的转录物。图16(B)显示crw2-TUSC突变株与其野生型亲缘株比较的RT-PCR分析。
图17显示汇编自Lynx数据库的ZmCrw2基因在不同植物组织中的表达。
图18显示与crw1-Ac突变株及其野生型亲缘株相比较，来自crw2-EMS突变株的叶圆片的TBO染色模式。叶子位置数字在每张小图的下方表 示，并且每个数字后的“A”或“B”分别代表叶子的顶端部分或者基部部分。crw2-EMS突变株的叶圆片在整个发育过程中呈现出均匀的深色染色，相比之下，正常的野生型叶圆片显示深色染色直到过渡(transition)(叶子数字7)，然后是较浅的染色。crw2-EMS突变株TBO染色模式类似crw1-Ac突变株的TBO染色模式。
图19显示在WCR甲虫取食后的不同时间点，与其野生型比较的Crw1突变株的Crw2转录物水平。在WCR取食45分钟内，野生型植株中Crw2转录物的水平快速上调(A，上小图)。这种上调在Crw1突变株中在WCR取食时没有观察到(A，下小图)。具有相同的上样方案的18S rRNA对照在B中表示。
图20(A)显示在成体阶段，Crw2突变株(“MT”)与野生型(“WT”)相比，具有较低水平的细胞壁结合的对香豆酸(pCA)和阿魏酸(FA)以及(B)较低水平的木质素(p＜0.05；非配对t检验)。
本申请随附的序列说明和序列表符合美国联邦法规37C.F.R.§1.8211.825中设定的关于专利申请中的核苷酸和/或氨基酸序列公开的指导规则。
该序列表含有遵照Nucleic Acids Res.(《核酸研究》)13：3021 3030(1985)和Biochemical J.(《生物化学杂志》)219(No.2)：345 373(1984)中描述的IUPAC IUBMB标准进行定义的核苷酸序列字符的单字母代码和氨基酸的三字母代码，所述文献以引用方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式符合37C.F.R.§1.822中设定的规则。
SEQ ID NO：1是野生型玉米(Zea mays)基因组Crw1的核苷酸序列。
SEQ ID NO：2是野生型玉米Crw1(Zm Crw1)cDNA的编码区的核苷酸序列。
SEQ ID NO：3是野生型玉米CRW1(ZmCRW1)蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4是突变crw1-Ac等位基因的cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：5是突变crw1-Ac等位基因编码的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：6是来自玉蜀黍近交系CO109的Crw1cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：7是SEQ ID NO：6编码的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：8是来自玉蜀黍近交系NC316的Crw1cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：9是SEQ ID NO：8编码的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：10是来自水稻(Oryza sativa)的次生壁NAC转录因子2的氨基酸序列(UniProt条目G3M8D2)。
SEQ ID NO：11是来自水稻的推定NAM蛋白(OsNAC7)的氨基酸序列(标识符0s06g04090.1；UniProt条目Q9SNM6)。
SEQ ID NO：12是来自高粱(Sorghum bicolor)的推定的未表征的蛋白的氨基酸序列(标识符Sb07g001550.1；UniProt条目C5YM23)。
SEQ ID NO：13是来自高粱的推定NAM蛋白的氨基酸序列(标识符Sb10g002120.1；UniProt条目Q5NKS7)。
SEQ ID NO：14是来自中国栽培大豆(Glycine max)的未表征的蛋白的氨基酸序列(标识符Glyma16g02200.1；UniProt条目I1MKD6)。
SEQ ID NO：15是来自中国栽培大豆的未表征的蛋白的氨基酸序列(标识符Glyma07g05660.1；UniProt条目I1KHQ4)。
SEQ ID NO：16是来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的含NAC结构域的蛋白43的氨基酸序列(标识符At2g46770.1；UniProt条目Q84WP6)。
SEQ ID NO：17是来自拟南芥的含NAC结构域的蛋白12的氨基酸序列(Atl g32770.1；UniProt条目Q9LPI7)。
SEQ ID NO：18是来自拟南芥的含NAC结构域的蛋白66的氨基酸序列(标识符At3g61910.1；UniProt条目Q9M274)。
SEQ ID NO：19是来自玉米的次生壁NAC转录因子2的氨基酸序列(UniProt条目B4FPS5)。SEQ ID NO：20是来自玉米的推定NAM蛋白的氨基酸序列(UniProt条目Q5NKQ3)。
SEQ ID NO：21是来自二穗短柄草(Brachypodium distachyon)的含NAC结构域的蛋白43样的氨基酸序列(NCBI GI No.357139497，本文中称为BdCRW1)。
SEQ ID NO：22是来自葡萄(Vitis vinifera)的推定的未表征的蛋白的氨基酸序列(UniProt条目F6HU82)。
SEQ ID NO：23是来自中国栽培大豆的含NAC结构域的蛋白43样的氨基酸序列(NCBI GI No.356522480，本文中称为GmCRW1)。
SEQ ID NO：24是来自陆地棉(Gossypium hirsutum)的含NAC结构域的蛋白的氨基酸序列(UniProt条目G4V2G0)。
SEQ ID NO：25是来自苹果(Pyrus malus)的NAC结构域类转录因子(NAC12)的氨基酸序列(UniProt条目D9ZJ90)。
SEQ ID NO：26是来自大麦(Hordeum vulgare)的预测的蛋白的氨基酸序列(UniProt条目F2DV83)。
SEQ ID NO：27是来自拟南芥的NAM样蛋白的氨基酸序列(NCBI GI No.3510262；UniProt条目Q84WP6)。
SEQ ID NO：28是野生型玉米Crw2(ZmCrw2)cDNA的编码区的核苷酸序列。
SEQ ID NO：29是野生型玉米CRW2(ZmCRW2)蛋白(也称糖基转移酶)的氨基酸序列(UniProt条目B6TY42；455个氨基酸)。
SEQ ID NO：30是突变的crw2-Mutag等位基因的cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：31是突变的crw2-Mutag等位基因编码的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：32是突变的crw2-EMS等位基因的cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：33是突变的crw2-EMS等位基因编码的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：34是玉米推定的未表征的蛋白的氨基酸序列(UniProt条目COPDR7；488个氨基酸)。
SEQ ID NO：35是玉米推定的未表征的蛋白的氨基酸序列(UniProt条目C4J6GO；491个氨基酸)。
SEQ ID NO：36是水稻推定的HGA1的氨基酸序列(标识符0s06g49320；UniProt条目Q5Z8T7；460个氨基酸)。
SEQ ID NO：37是水稻推定的HGAI的氨基酸序列(标识符0s02g0135500；UniProt条目Q6Z0Z4；485个氨基酸)。
SEQ ID NO：38是高粱推定的未表征的蛋白Sb10g029380的氨基酸序列(UniProt条目C5Z9B2；462个氨基酸)。
SEQ ID NO：39是高粱推定的未表征的蛋白Sb04g002850的氨基酸序列(UniProt条目C5XTX5；499个氨基酸)。
SEQ ID NO：40是中国栽培大豆未表征的蛋白的氨基酸序列(标识符Glyma05g34170；UniProt条目I1K5F9；452个氨基酸)。
SEQ ID NO：41是中国栽培大豆未表征的蛋白的氨基酸序列(标识符Glyma08g05490；UniProt条目11KQG2；462个氨基酸)。
SEQ ID NO：42是拟南芥At3g18170的氨基酸序列(UniProt条目Q9LV23；535个氨基酸)。
SEQ ID NO：43是拟南芥At3g18180基因座(也称糖基转移酶家族61蛋白)的氨基酸序列(UniProt条目Q9LV22；470个氨基酸)。
SEQ ID NO：44是大麦预测的蛋白的氨基酸序列(UniProt条目F2DBB4；462个氨基酸)。
SEQ ID NO：45是二穗短柄草未表征的蛋白(也称BRADI1G34670)的氨基酸序列(UniProt条目IIGVVVI；455个氨基酸)。
SEQ ID NO：46是来自百喜草(Paspalum notatum)的ZmCrw2的同系物的核苷酸序列(在内部专有数据库中鉴定，在本文中称为PnCrw2)。
SEQ ID NO：47是SEQ ID NO：46编码的多肽的氨基酸序列。该多肽在本文中称为PnCRW2。
SEQ ID NO：48是来自画眉草(Eragrostis nindensis)的ZmCrw2的同系物的核苷酸序列(在内部专有的数据库中鉴定，在本文中称为EnCrw2)。
SEQ ID NO：49是SEQ ID NO：48编码的多肽的氨基酸序列。该多肽在本文中称为EnCRW2。
SEQ ID NO：50是来自中国栽培大豆的未表征的糖基转移酶AG061样的氨基酸序列(NCBI GI No.356511269)。
具体实施方式
本文中所列出的每篇参考文献的公开内容均全文以引用方式并入本文。
本文中和随附的权利要求书中所用名词形式上为单数，但包括复数指代，除非上下文清楚表明并非如此。因此，例如，提及“植物(植株)”则包括多株此类植物(植株)，提及“细胞”则包括一个或更多个细胞以及本领域技术人员已知的其等同物，等等。
如本文所用：
术语“单子叶植物”和“单子叶的植物”在本文可互换使用。单子叶植物包括禾本科(Gramineae)。
术语“双子叶植物”和“双子叶的植物”在本文可互换使用。双子叶植物包括以下科：十字花科(Brassicaceae)、豆科(Leguminosae)和茄科(Solanaceae)。
术语“全长互补序列”和“全长的互补序列”在本文可互换使用，是指给定核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和所述核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且是100％互补的。
“转基因”指其基因组因异源核酸(诸如重组DNA构建体)的存在而发生变更的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植株部分或植株，包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性繁殖而产生的那些。本文所用的术语“转基因(的)”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)的变更。
“基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核内的染色体DNA，而且还涵盖存在于细胞的亚细胞组分(例如线粒体、质体)内的细胞器DNA。
“植物(植株)”包括整株植物、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及它们的子代。植物细胞包括但不限于来自种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子的细胞。
“子代”包含植物的任何后续各代。
“转基因植物”包括在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。例如，异源多核苷酸被稳定地整合在基因组内，使得该多核苷酸传递至连续的世代。异源多核苷酸可单独地或者作为重组DNA构建体的一部分整合到基因组中。
“性状”指植物或者特定的植物材料或细胞的生理特性、形态特性、生化特性或者物理特性。
针对序列而言的“异源”意指来源于外来物种的序列，或者如果来源于相同物种的话，则为通过蓄意的人为干预从其天然形式在组成和/或基因组基因座方面进行实质性修饰得到的序列。
“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用，指作为单链或双链的RNA或DNA聚合物，任选含有合成的、非天然的或经变更的核苷酸碱基。核苷酸(通常以其5′-单磷酸盐形式存在)用如下的其单字母代码指代：“A”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任意核苷酸。
“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白(质)”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白(质)”还可包括修饰，所述修饰包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。
“信使RNA(mRNA)”指无内含子并且可由细胞翻译成蛋白质的RNA。
“cDNA”指与mRNA模板互补并且利用反转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是单链的或者可以用DNA聚合成酶I的Klenow片段转化成双链形式。
“编码区”指当被转录、加工和/或翻译时导致多肽序列的产生的多核苷酸序列。
“表达序列标签”(“EST”)是源自cDNA文库的DNA序列，并且因此是已经被转录的序列。EST通常通过cDNA插入片段的单程测序(single sequencing pass)获得。将完整的cDNA插入片段的序列称为“全长插入片段序列”(“FIS”)。“重叠群”序列是由可选自但不限于EST、FIS和PCR序列的两种或更多种序列装配成的序列。编码完整或功能性蛋白的序列称为“完全基因序列”(“CGS”)并且可源自FIS或重叠群。
“成熟”蛋白质指经翻译后加工的多肽；即已经去除了存在于初级翻译产物中的任何前肽或原肽的多肽。
“前体”蛋白指mRNA的翻译初级产物；即仍然存在前肽和原肽。前肽和原肽可以是并且不限于细胞内定位信号。
“分离的”指这样的物质(如核酸分子和/或蛋白质)，该物质基本上不含在天然环境中通常伴随该物质或与该物质相互作用的组分，或者说是该物质被从所述组分移出。分离的多核苷酸可从它们天然存在于其中的宿主细胞纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。
“重组的”指例如通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸区段来实现的两个原本分离的序列区段的人工组合。“重组的”也指已经通过引入异源核酸而进行了修饰的细胞或载体，或源自经这样修饰的细胞的细胞，但不涵盖天然发生的事件(例如自发突变、自然转化/转导/转座)对细胞或载体的变更，所述天然发生的事件例如不经蓄意人为干预而发生的那些事件。
“重组DNA构建体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于自然界中通常存在的方式排列的调控序列和编码序列。
术语“入门克隆”和“入门载体”在本文可互换使用。
“调控序列”或“调控元件”可互换使用，指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、内部或下游(3′非编码序列)，并且影响相关的编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和聚腺苷酸化识别序列。术语“调控序列”和“调控元件”在本文中可互换使用。
“启动子”指能够控制另一核酸片段的转录的核酸片段。
在大多数情况下引起基因在大多数细胞型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。
“在植物中有功能的启动子”指能够控制植物细胞中的转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。
“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，指主要但未必专门在一种组织或器官中表达，但是也可以在一种特定细胞中表达的启动子。
“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。
“有效连接”指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调控核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段有效连接。
“表达”指功能产物的产生。例如，核酸片段的表达可指核酸片段的转录(例如生成mRNA或功能RNA的转录)和/或mRNA翻译成前体或成熟蛋白质。
“过表达”指基因产物在转基因生物体中的产量超过来自相同实验的无效分离(null segregating)(或非转基因)生物体中的产量水平。
“表型”意指细胞或生物体的可检测的特征。
在将核酸片段(例如重组DNA构建体)插入到细胞中的语境中的“引入”，意指“转染”或者“转化”或者“转导”，并包括指将核酸片段掺入到真核或原核细胞中，在该细胞中，核酸片段可掺入到细胞的基因组中(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)、转变成自主的复制子或者瞬时表达(例如转染的mRNA)。
“转化的细胞”是任何其中已引入了核酸片段(例如重组DNA构建体)的细胞。
本文所用的“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。
“稳定转化”指核酸片段引入到宿主生物的基因组中而得到遗传学上稳定的遗传。一旦稳定转化，该核酸片段稳定整合在该宿主生物及任何后续各代的基因组中。
“瞬时转化”指核酸片段引入到宿主生物的细胞核或者含DNA的细胞器中而得到没有遗传学上稳定的遗传的基因表达。
术语“杂交的”或“杂交(cross)”意指配子经由授粉发生融合以产生子代(例如细胞、种子或植物)。该术语涵盖有性杂交(一株植物被另一株植物授粉)和自交(自花授粉，例如当花粉和胚珠来自相同植株时)两者。术语“杂交(crossing)”指经由授粉融合配子以产生子代的行为。
“抑制DNA构建体”是在转化或稳定整合到植物的基因组中时，导致该植物中的靶基因“沉默”的重组DNA构建体。该靶基因对于该植物而言可为内源的或转基因的。本文针对靶基因所使用的“沉默”通常指该靶基因所表达的mRNA或蛋白质/酶的水平的抑制，和/或酶活性或蛋白质功能性的水平的抑制。本文中可互换使用的术语“抑制”及“沉默”包括 降低、减少、减退、减小、抑制、消除或防止。“沉默”或“基因沉默”不指定机理，并且包括且不限于反义、共抑制、病毒抑制、发夹抑制、茎-环抑制、基于RNAi的方法以及基于小RNA的方法。沉默可靶向编码区或者非编码区，例如内含子、5′-UTR和3′-UTR、或者两者。
抑制DNA构建体可包含源自所关注的靶基因的区域，并且可包含所关注的靶基因的有义链(或反义链)的全部或部分核酸序列。取决于所要采用的方法，该区域与该所关注的基因的全部或者部分有义链(或者反义链)可以有100％同一性或者小于100％同一性(例如至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者99％同一性)。
抑制DNA构建体是本领域熟知的，易于在选择所关注的靶基因后进行构建，并且包括但不限于共抑制构建体、反义构建体、病毒抑制构建体、发夹抑制构建体、茎-环抑制构建体、产生双链RNA的构建体，以及更一般地，RNAi(RNA干扰)构建体和小RNA构建体诸如siRNA(短干扰RNA)构建体和miRNA(微RNA)构建体。
“反义抑制”指产生能够抑制靶基因或基因产物的表达的反义RNA转录物。“反义RNA”指与靶初级转录物或者mRNA的全部或者部分互补，并且能阻断靶分离核酸片段的表达的RNA转录物(美国专利第5,107,065号)。反义RNA的互补性可存在于特定基因转录物的任何部分，即在5′非编码序列、3′非编码序列、内含子或者编码序列。
“共抑制”指产生能够抑制靶基因或基因产物的表达的有义RNA转录物。“有义”RNA指包括该mRNA并且可在细胞内或者在体外被翻译成蛋白质的RNA转录物。植物中的共抑制构建体之前是通过聚焦于与天然mRNA具有同源性的核酸序列在有义方向上的过表达而设计的，这导致所有与过表达的序列具有同源性的RNA的减少(参见Vaucheret等人，《植物杂志》(Plant J.)，16：651-659，(1998)；以及Gura，《自然》(Nature)，404：804-808(2000))。共抑制构建体可含有来自编码区或者非编码区的序列，例如内含子、5′-UTR和3′-UTR，或者两者。
另一种变型方案描述使用植物病毒序列来指导邻近的mRNA编码序列的抑制(1998年8月20日公布的PCT公布第WO 98/36083号)。
RNA干扰(RNAi)指由短干扰RNA(siRNA)介导的动物中序列特异性的转录后基因沉默的过程(Fire等人，《自然》(Nature)，391：806(1998))。植物中的相应过程通常称作转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，而在真菌中也称作压抑(quelling)。转录后基因沉默的过程被认为是用于阻止外来基因的表达的进化上保守的细胞防御机制，并且通常由不同的植物区系和门共有(Fire等人，《遗传学趋势》(Trends genet.)，15：358(1999))。
小RNA在控制基因表达中起到重要作用。许多发育过程(包括开花在内)的调节是由小RNA控制的。现在有可能通过使用在植物中产生小RNA的转基因构建体来工程构建出植物基因的基因表达的变化。
小RNA似乎通过与互补的RNA或DNA靶序列的碱基配对而发挥功能。当与RNA结合时，小RNA引起靶序列的RNA切割或者翻译抑制。当与DNA靶序列结合时，据信小RNA可介导靶序列的DNA甲基化。这些事件的后果是基因表达被抑制，无论具体的机制如何。
微RNA(miRNA)是在动物和植物中都鉴定到的长度为约19至约24个核苷酸(nt)的非编码RNA(Lagos-Quintana等人，《科学》(Science)，294：853-858(2001)；Lagos-Quintana等人，《当代生物学》(Curr.Biol.)，12：735-739(2002)；Lau等人，《科学》(Science)，294：858-862(2001)；Lee和Ambros，《科学》(Science)，294：862-864(2001)；Llave等人，《植物细胞》(Plant Cell)，14：1605-1619(2002)；Mourelatos等人，《基因与发育》(Genes.Dev.)，16：720728(2002)；Park等人，《当代生物学》(Curr.Biol.)，12：1484-1495(2002)；Reinhart等人，《基因与发育》(Genes.Dev.)，16：1616-1626(2002))。它们是从大小在大约70至200nt范围内的较长的前体转录物加工而成的，这些前体转录物具有形成稳定的发夹结构的能力。
微RNA(miRNA)似乎是通过结合位于由这些基因产生的转录物中的互补序列来调节靶基因的。看来很可能miRNA可进入至少两个靶基因调节途径：(1)翻译抑制；以及(2)RNA切割。进入RNA切割途径的微RNA类似于动物中在RNA干扰(RNAi)过程中以及植物中在转录后基因沉默(PTGS)过程中产生的21至25nt的短干扰RNA(siRNA)，并且很可能掺入到与见于 RNAi的RNA诱导沉默复合体(RISC)相似或相同的RNA诱导沉默复合体中。
术语“基因座”一般指染色体的遗传上确定的区域，该区域携带某个基因，或者可能携带两个或更多个基因，所述两个或更多个基因是如此紧密地连锁，以至于它们在遗传上表现为负责某种表型的单一基因座。
“基因”应指基因座内的特定遗传编码区，包括其相关的调节序列在内。本领域普通技术人员会理解，相关的调节序列与编码序列的距离将在约4kb以内，启动子位于上游。
“等位基因”是占据染色体上的给定基因座的基因的几种可选形式中的一种。当二倍体植物中一对同源染色体上的给定基因座处存在的等位基因相同时，则该植物在该基因座是纯合的。如果二倍体植物中一对同源染色体上的给定基因座处存在的等位基因不相同时，则该植物在该基因座是杂合的。如果在二倍体植物中一对同源染色体中的一条染色体上存在转基因，则该植物在该基因座是半合的。
“种质”指属于或者来自个体(例如某个植株)、一组个体(例如某个植物株系、品种或者家族)的遗传材料，或者源自某个株系、品种、物种或者培养物的克隆。种质可以是生物体或者细胞的一部分，或者可以是与该生物体或者细胞分开的。一般地讲，种质提供具有特定的分子构成(molecular makeup)的遗传材料，该分子构成为生物体或者细胞培养物的一些或者全部遗传品质提供物理基础。本文所用的种质包括可从中长出新植物的细胞、种子或者组织，或者可培养成整株植物的植物部分如叶、茎、花粉或者细胞。
术语“基因改组”和“定向进化”在本文中可互换使用。“基因改组”的方法由如下步骤组成：反复进行DNA改组，然后进行适当的筛选和/或选择以产生具有经修饰的生物活性的Crw1和/或Crw2核酸变体或其部分(Castle等人，(2004)，《科学》(Science)，304(5674)：1151-4；美国专利第5,811,238号和第6,395,547号)。
“TILLING”或“定向诱导基因组局部损害(Targeting Induced Local Lesions IN Genomics)”指一种诱变技术，可用于产生和/或鉴定并最终分离特定核酸的具有经调节的表达和/或活性的诱变变体(McCallum等人，(2000)，《植物生理学》(Plant Physiology)，123：439-442；McCallum等 人，(2000)，《自然生物技术》(Nature Biotechnology)，18：455-457；以及Colbert等人，(2001)，《植物生理学》(Plant Physiology)，126：480-484)。
TILLING将高密度点突变与突变的快速灵敏度检测结合。通常，乙基甲磺酸(EMS)用于诱变植物种子。EMS使鸟嘌呤烷基化，其通常导致错配。例如，种子浸泡在EMS的约10-20mM溶液中约10至20小时；清洗种子然后播种。这一代植物被称为M1。然后M1植物自花受精。存在于形成繁殖组织的细胞中的突变由下一代(M2)继承。通常，针对所需基因中的突变和/或针对特定表型筛选M2植物。
TILLING还使得可以选择携带突变型变体的植物。这些突变型变体可表现出在强度上或在位置上或在时间上经修饰的表达(例如，如果突变影响启动子的话)。TILLING将高密度诱变与高通量筛选方法结合。通常在TILLING中所遵循的步骤如下：(a)EMS诱变(Redei G P和Koncz C，(1992)，《拟南芥研究方法》(Methods in Arabidopsis Research)，Koncz C、Chua N H、Schell J编辑，新加坡，世界科学出版公司(World Scientific Publishing Co)，第16-82页；Feldmann等人，(1994)，《拟南芥》(Arabidopsis)，Meyerowitz E M、Somerville C R编辑，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)，第137-172页；Lightner J和Caspar T，(1998)，《分子生物学方法(第82卷)》(Methods on Molecular Biology，Vol.82)，J Martinez-Zapater，J Salinas编辑，Humana出版社，美国新泽西州托托瓦(Humana Press，Totowa，N.J.)，第91-104页)；(b)个体的DNA制备和汇集(pooling)；(c)所关注的区域的PCR扩增；(d)变性和退火以允许形成异源双链体；(e)DHPLC，其中异源双链体在汇集池(pool)中的存在作为色谱图中的额外峰被检测；(f)鉴别突变型个体；以及(g)突变型PCR产物的测序。TILLING的方法是本领域公知的(美国专利第US8,071,840号)。
也可采用其他诱变方法来在Crw1和/或Crw2基因中引入突变。用于将基因突变引入植物基因并且选择具有所需性状的植物的方法是熟知的。例如，可根据标准技术用诱变化学物质处理种子或其他植物材料。此类化学物质包括但不限于以下物质：硫酸二乙酯、乙烯亚胺和N-亚硝基-N-乙基脲。或者，可使用来自源诸如X射线或γ射线的电离辐射。
可以采用其他用于检测Crw1和/或Crw2基因中的突变的检测方法，例如毛细管电泳(例如恒定变性剂毛细管电泳和单链构象多态性)。在另一个例子中，可通过使用错配修复酶学法(例如来自芹菜的CELI内切核酸酶)来检测异源双链体。CELT能识别错配并在该错配的3′侧精确地切割。可通过用该错配修复酶进行切割然后例如进行变性凝胶电泳，来确定该错配的确切碱基位置。参见例如Oleykowski等人，(1998)，(“使用新型的植物内切核酸酶进行突变检测”)(“Mutation detection using a novel plant endonuclease”)，《核酸研究》(Nucleic Acid Res.)，26：4597-4602；以及Colbert等人，(2001)，(“诱导的点突变的高通量筛选”)(“High-Throughput Screening for Induced Point Mutations”)，《植物生理学》(Plant Physiology)，126：480-484。
可将含有突变的Crw1和/或Crw2基因的植物与其他植物杂交以将该突变引入到另一植物中。这可使用标准的育种技术来进行。
同源重组容许将选定的核酸引入在基因组中确定的选定位置处。同源重组已在植物中得到证明。参见例如Puchta等人，(1994)，《经验》(Experientia)，50：277-284；Swoboda等人，(1994)，《欧洲分子生物学组织杂志》(EMBO J.)，13：484-489；Offringa等人，(1993)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Nat1.Acad.Sci.USA)，90：7346-7350；Kempin等人，(1997)，《自然》(Nature)，389：802-803；以及Terada等人，(2002)，《自然生物技术》(Nature Biotechnology)，20(10)：1030-1034)。
已不但针对模型植物(Offringa等人，(1990)，《欧洲分子生物学组织杂志》(EMBO J.)，十月；9(10)：3077-84)而且针对作物植物例如水稻(Terada R、Urawa H、Inagaki Y、Tsugane K、lida S，《自然生物技术》(Nat Biotechnol.)，2002；lida和Terada，《生物技术新见》(Curr Opin Biotechnol.)，2004年4月，15(2)：1328)描述了在植物中进行同源重组的方法。要靶向的核酸(其可为Crw1和/或Crw2或其变体，如前文所定义)不必被分别靶向到Crw1和/或Crw2基因的基因座，而是可引入在例如高表达的区域中。
转座元件基于它们的转座模式可分成两大类。这两类命名为I类和II类；这两类都作为诱变剂和作为递送载体具有应用。I类转座元件通过RNA中间体进行转座并使用反转录酶，即它们是反转录元件。有至少三种 类型的I类转座元件，例如反转录转座子(retrotransposon)、反转录子(retroposon)、SINE样元件。反转录转座子通常含有LTR、以及编码病毒外被蛋白(gag)和反转录酶的基因、RNA酶H、整合酶和聚合酶(pol)基因。在植物物种中已描述了许多反转录转座子。这类反转录转座子在转座子编码的反转录酶和RNA酶H所催化的反应中通过RNA中间体进行活动化和易位。例子归属Tyl-copia组和Ty3-gypsy组以及归属SINE样分类和LINE样分类(Kumar和Bennetzen，(1999)，《遗传学年评》(Annual Review of genetics)，33：479)。另外，DNA转座元件如Ac、Taml和En/Spm也存在于多种植物物种中，并且可被利用。转座子(以及IS元件)是用于在植物细胞中引入突变的通用工具。
“昆虫”和“昆虫害虫”在本文中可互换使用。
“易感性”指某植物品种不能够限制指定的害虫的生长和发育。
“抗性”指某植物品种当与易感植物品种在相似的环境条件和害虫压力下比较时，能够限制指定的害虫的生长和发育和/或它们所造成的损害。
序列比对和同一性百分数计算可用多种被设计用于检测同源序列的比较方法来确定，所述方法包括但不限于生物信息学计算软件包(Inc.公司，威斯康星州麦迪逊市(Inc.，Madison，WI))的程序。除非另有说明，否则本文提供的序列的多序列比对是使用Clustal W比对方法进行的。
Clustal w比对方法(描述于：Higgins和Sharp，《计算机在生物科学中的应用》(CABIOS)，5：151-153，(1989)；Higgins，D.G.等人，《计算机在生物科学中的应用》(Comput.Appl.Biosci.)，8：189-191(1992))可见于生物信息学计算软件包(Inc.公司，威斯康星州麦迪逊市)的MegAlignTM v6.1程序中。多序列比对的默认参数对应于空位罚分＝10、空位长度罚分＝0.2、延迟趋异序列(Delay Divergent Sequences)＝30％，DNA转换权重(DNA Transition Weight)＝0.5、蛋白质权重矩阵＝Gonnet系列，DNA权重矩阵＝IUB。对于双序列比对，默认参数为：比对＝慢-准确、空位罚分＝10.0、空位长度＝0.10、蛋白质权重矩阵＝Gonnet250、DNA权重矩阵＝IUB。
在使用Clustal W程序进行序列的比对之后，通过查看该同一程序上的“序列距离”表格，可以得到“同一性百分数”和“趋异值”；除非另有说明，否则本文所提供和声称的同一性百分数和趋异值按此方式计算。
Crw1和Crw2这两个玉米基因中的突变产生出具有提高的对一种或更多种昆虫害虫的易感性的玉蜀黍植物。具有减低的Crw1和/或Crw2的内源表达的这些植物及类似植物，可用作昆虫害虫管理方案的一部分以防控这类害虫。
CRW1
使用正向遗传学方法鉴定了其叶子被西部玉米根虫(WCR)甲虫吞食的玉蜀黍突变株(玉米根虫1)(Dhillon B、Moose SP和Johal GS，(2007)，“crw1-一种对西部玉米根虫尤其易感的新型玉蜀黍突变株”(crw1-A novel maize mutant exceptionally susceptible to Western Corn Rootworm)，玉蜀黍遗传学会议(Maize Genetics Conference)，3月22-25日，美国伊利诺伊州圣查尔斯市(St.Charles，Illinois)，摘要和演示稿可从网上获取)。该突变株的表型是不寻常的，因为WCR甲虫通常取食玉蜀黍的花粉和穗丝而不取食叶子。因此，看来某种通常造成玉蜀黍叶子对WCR甲虫不好吃的机制在该突变株中被削弱了。Crw1基因(SEQ ID NO：2)编码NAC转录因子。该基因位于6号染色体上并且以隐性方式遗传。
随后鉴定了Crw1的至少三个赋予提高的对玉米根虫甲虫植食性的易感性的等位基因，其中一个是突变的，另两个是天然存在的。一个是Crw1的稳定地突变但回复的等位基因，其在插入位点含有8bp的同向重复(Ac切除的“足迹(footprint)”)，从而造成CRW1的过早终止。其他两个在公共的玉蜀黍近交系中。CO109中的Crw1基因在外显子2中含有1bp插入，而NC316中的Crw1基因在外显子2中的不同位置含有1bp插入和45bp插入。在两种情形中都产生过早终止密码子。图2显示crw1-Ac中人工诱导的突变的位置以及CO109和NC316株系中天然发生的突变的位置。
术语“野生型crw1基因”、“crw1wt基因”、“Crw1基因”和“CRW1基因”在本文中可互换使用。
本公开包括下述的分离的多核苷酸、cDNA和多肽：
一种分离的多核苷酸或cDNA，其包含：(i)编码具有如下的氨基酸序列的多肽的核酸序列，该氨基酸序列基于Clustal W比对方法，当与SEQ  ID NO：3、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或者27比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％序列同一性；或者(ii)(i)的核酸序列的完全互补序列，其中该完全互补序列和(i)的核酸序列由相同数目的核苷酸组成并且100％互补。任何前述的分离的多核苷酸或cDNA可在本公开的任何重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体在内)中应用。该多肽优选是CRW1多肽。
一种具有如下的氨基酸序列的分离的多肽，该氨基酸序列基于Clustal W比对方法，当与SEQ ID NO：3、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。该多肽优选为CRW1多肽。
一种分离的多核苷酸或cDNA，其包含：(i)基于Clustal W比对方法，当与SEQ ID NO：2比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列；或者(ii)(i)的核酸序列的完全互补序列。任何前述的分离的多核苷酸或cDNA可在本公开的任何重组DNA构建体(包括抑制构建体在内)中应用。
一种分离的多核苷酸或cDNA，其包含核苷酸序列，其中该核苷酸序列可在严格条件下与包含SEQ ID NO：2的完全互补序列的DNA分子杂交。
一种分离的多核苷酸或cDNA，其包含核苷酸序列，其中该核苷酸序列通过至少一种选自缺失、置换、添加和插入的方法变更SEQ ID NO：2的一个或更多个核苷酸而源自SEQ ID NO：2。
一种分离的多核苷酸或cDNA，其包含核苷酸序列，其中该核苷酸序列对应于SEQ ID NO：2的等位基因。
CRW2
从EMS群体分离了一株显示出提高的对WCR成虫的易感性的玉蜀黍突变株，并命名为crw2-EMS。独立地，在源自Mu活性株系的F2群体中鉴定了另一株WCR易感突变株，命名为crw2-Mutag。该Crw2突变株当在大田试验中评估时显示出提高的对WCR成虫以及对日本金龟子和欧洲玉米螟(ECB)的易感性。crw2-EMS和crw2-Mutag都作为单基因隐性性状分离，定位于5号染色体的相同区域，并且在正反交中互为等位基因。克隆了Crw2基因(SEQ ID NO：28)并确定其编码推定的同型半乳糖醛酸聚糖(HGA1)(也称为“糖基转移酶AER61”)或者“推定的未表征的蛋白”(SEQ ID NO：29)。糖基转移酶是植物中一个可将单个或多个活化的糖转移到多种小分子接纳体的大的超家族的成员。最近的研究已显示，植物中的糖基转移酶可在植物生长、发育和对环境的响应的许多过程中具有作用(Wang，J.和Hou，B.，(2009)，《中国生物学前沿》(Front.Biol.China)，4：39-46)。
Crw2的至少两个突变等位基因已显示赋予提高的对玉米根虫甲虫植食性的易感性：称为crw2-Mutag的等位基因，其在外显子2中具有Mu元件插入，crw2-EMS等位基因，其在HGA1的保守区域中具有单个氨基酸改变R292C，以及独立的TUSC等位基因，其也在外显子2中具有插入。图13显示玉蜀黍Crw2基因结构和每个鉴定的Crw2突变的位置的示图。
术语“野生型Crw2基因”、“crw2wt基因”、“Crw2基因”和“CRW2基因”在本文中可互换使用。
本公开包括下述的分离的多核苷酸、cDNA和多肽：
一种分离的多核苷酸或cDNA，其包含：(i)编码具有如下的氨基酸序列的多肽的核酸序列，该氨基酸序列基于Clustal W比对方法，当与SEQ ID NO：29、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、 66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；或者(ii)(i)的核酸序列的完全互补序列，其中该完全互补序列和(i)的核酸序列由相同数目的核苷酸组成并且100％互补。任何前述的分离的多核苷酸或cDNA可在本公开的任何重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体在内)中应用。该多肽优选为CRW2多肽。
一种具有如下的氨基酸序列的分离的多肽，该氨基酸序列基于Clustal W比对方法，当与SEQ ID NO：29、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。该多肽优选为CRW2多肽。
一种分离的多核苷酸或cDNA，其包含：(i)基于Clustal W比对方法，当与SEQ ID NO：28比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列；或者(ii)(i)的核酸序列的完全互补序列。任何前述的分离的多核苷酸或cDNA可在本公开的任何重组DNA构建体(包括抑制构建体在内)中应用。该多肽优选为CRW2多肽。
一种分离的多核苷酸或cDNA，其包含核苷酸序列，其中该核苷酸序列可在严格条件下与包含SEQ ID NO：28的完全互补序列的DNA分子杂交。该多肽优选为CRW2多肽。
一种分离的多核苷酸或cDNA，其包含核苷酸序列，其中该核苷酸序列通过至少一种选自缺失、置换、添加和插入的方法变更SEQ ID NO：28的一个或更多个核苷酸而源自SEQ ID NO：28。
一种分离的多核苷酸或cDNA，其包含核苷酸序列，其中该核苷酸序列对应于SEQ ID NO：28的等位基因。
具有提高的对昆虫害虫植食性的易感性的植物及其制备方法。
由于Crw1的内源表达降低而具有提高的对昆虫害虫植食性的易感性的植物可包括Crw1基因的任何变体，如：(i)Crw1核酸序列(SEQ ID NO：2)的一部分；(ii)能够与Crw1核酸序列(SEQ ID NO：2)杂交的核酸序列；(iii)Crw1核酸序列(SEQ ID NO：2)的剪接变体；(iv)Crw1核酸序列(SEQ ID NO：2)的天然存在的等位基因变体；(v)通过基因改组获得的Crw1核酸序列；(vi)通过定点诱变获得的Crw1核酸序列；(vii)通过TILLING方法获得和鉴定的Crw1变体。
类似地，由于Crw2的内源表达降低而具有提高的对昆虫害虫植食性的易感性的植物可包括Crw2基因的任何变体，如：(i)Crw2核酸序列(SEQ ID NO：28)的一部分；(ii)能够与Crw2核酸序列(SEQ ID NO：28)杂交的核酸序列；(iii)Crw2核酸序列(SEQ ID NO：28)的剪接变体；(iv)Crw2核酸序列(SEQ ID NO：28)的天然存在的等位基因变体；(v)通过基因改组获得的Crw2核酸序列；(vi)通过定点诱变获得的Crw2核酸序列；(vii)通过TILLING方法获得和鉴定的Crw2变体。
可通过如下方式在植物细胞中降低内源Crw1和/或Crw2表达的水平：反义构建体、有义构建体、RNA沉默构建体、RNA干扰、人工微RNA以及基因组破坏如但不限于通过转座子、TILLING和同源重组引起的破坏。
在一个方面，可使用经修饰的植物miRNA前体，其中该前体已被修饰成用被设计来产生导向靶基因(Crw1或者Crw2)的miRNA的序列替换miRNA编码区。该前体还在星号链序列中被修饰以对应于该miRNA编码区中的变化。
在另一个方面，通过基因改组获得可用于本公开的方法的Crw1和/或Crw2的核酸变体。
在另一个方面，还可使用TILLING(定向诱导基因组局部损害)技术，在玉蜀黍Crw1或者Crw2基因的基因座中引入遗传修饰。
在另一个方面，可使用定点诱变来产生Crw1和/或Crw2核酸的变体。有几种方法可用来实现定点诱变；最常用的方法是基于PCR的方法(美国专利第7956240号)。
在另一个方面，还可使用同源重组来使植物中的内源Crw1和/或Crw2的表达失活或者降低。
同源重组可用来通过特异性地靶向体内Crw1和/或Crw2基因来诱导定向基因修饰。使用标准的技术，在体外作出基因的选定部分(包括5′上游区域、3′下游区域和基因内区域)的突变(如本文中提供的那些)并引入到所需的植物中。引入的突变基因和靶内源基因之间的同源重组将导致转基因植物中的野生型基因的定向替换，从而导致基因表达的抑制。
在另一个方面，还可使用催化性RNA分子或核糖酶来抑制所关注的基因的表达(Crw1或者Crw2)。可以设计实际上与任何靶RNA特异性配对并且在特定位置切割磷酸二酯骨架，从而使靶RNA功能性失活的核糖酶。在进行这个切割时，核糖酶本身不发生变更，因而能够循环使用并切割其他分子。在反义RNA内插入核糖酶序列赋予其RNA切割活性，从而增加构建体的活性。已鉴定了许多类别的核糖酶。例如，有一类核糖酶源自多种能够在植物中自我切割并复制的小环形RNA。所述RNA可单独复制(类病毒RNA)或者与辅助病毒一起复制(卫星RNA)。RNA的例子包括来自鳄梨日斑类病毒的RNA以及来自烟草环斑病毒、紫花苜蓿短暂条纹病毒、绒样烟草斑点病毒、茄属植物斑点病毒和地中海三叶草斑点病毒的卫星RNA。靶RNA特异性核糖酶的设计和用途已被描述。参见例如Haseloff等人，(1988)，《自然》(Nature)，334：585-591。
在另一个方面，可通过有义抑制来抑制表达，使所关注的基因(Crw1或者Crw2)灭活。其中核酸被构造成相对于启动子处于有义方向的表达盒的引入，已被显示是阻断期望的靶基因的转录的有效手段。(Napoli等人，(1990)，《植物细胞》(The Plant Cell)，2：279-289；以及美国专利第5,034,323号、第5,231,020号和第5,283,184号)。
在另一个方面，Crw1和/或Crw2基因也可通过例如基于转座子的基因失活来进行失活。
在另一个方面，该失活步骤包括在所关注的基因(Crw1或者Crw2)中产生一个或更多个突变，其中该基因序列中的该一个或更多个突变包含 一个或更多个转座子插入，从而与相应的对照植物相比灭活该基因。例如，该突变可包含该基因中的纯合破坏，或者该一个或更多个突变包含该基因中的杂合破坏。
这些可移动的遗传元件例如通过有性杂交传递到细胞，选择转座，并且对所得的插入突变株进行例如所关注表型的筛选。可将包含破坏的Crw1和/或Crw2基因的植物与野生型植物杂交。取决于要杂交的物种，可使用多种标准的育种技术中的任何一种。TN(转座子)在分离的或者重组的植物的基因组内的位置可通过已知的方法确定，例如侧翼区的测序，如本文所描述。例如，可使用来自植物的PCR反应来扩增该序列，然后可进行诊断性测序以确认其来源。可选地，对插入突变株筛选所需的表型，如Crw1和/或Crw2的表达的抑制或者提高的对昆虫害虫植食性的易感性。
任何在本文中被鉴定为具有降低的Crw1和/或Crw2表达从而具有提高的对昆虫害虫植食性的易感性的植物，都可在以下描述的方法中使用。
Crw1的表达的降低可赋予提高的对昆虫害虫植食性的易感性，其中该昆虫害虫可为鞘翅目害虫。鞘翅目害虫的例子包括但不限于西部玉米根虫(WCR，Diabrotica virgifera virgifera LeConte)、北部玉米根虫(NCR，Diabrotica barberi Smith和Lawrence)、墨西哥玉米根虫(MCR，Diabrotica virgtfera zeae Krysan和Smith)、南部玉米根虫(SCR，Diabrotica undecimpunctata howardi)、科罗拉多马铃薯甲虫(CPB，Leptinotarsa decemlineata)和日本金龟子(Popiffia japonica)。玉米根虫特别值得关注。
Crw2的表达的降低可赋予提高的对昆虫害虫植食性的易感性，其中该昆虫害虫可为鞘翅目或者鳞翅目害虫。
鞘翅目害虫的例子包括但不限于西部玉米根虫(WCR，Diabrotica virgifera virgifera LeConte)、北部玉米根虫(NCR，Diabrotica barberi Smith和Lawrence)、墨西哥玉米根虫(MCR，Diabrotica virgifera zeae Krysan和Smith)、南部玉米根虫(SCR，Diabrotica undecimpunctata howardi)、科罗拉多马铃薯甲虫(CPB，Leptinotarsa decemlineata)和日本金龟子(Popiffia japonica)。玉米根虫和日本金龟子特别值得关注。
鳞翅目害虫的例子包括但不限于欧洲玉米螟(ECB)(鳞翅目：草螟科)、西南部玉米螟(SWCB)(鳞翅目：草螟科)、玉米穗虫(CEW)(鳞翅目：夜蛾科)、秋粘虫(FAW)(鳞翅目：夜蛾科)、藜豆毛虫(VBC)(鳞翅 目：夜蛾科)、大豆尺蠖(SBL)(鳞翅目：夜蛾科)、西部豆切根虫(WBCW)(鳞翅目：夜蛾科)、黑地蚕(BCW)(鳞翅目：夜蛾科)、甘蔗螟虫(SCB)(鳞翅目：草螟科)、秋结网毛虫(Hyphantria cunea)和香蒲毛虫(Simyra insularis)。欧洲玉米螟特别值得关注。
诱虫作物及其用途
Crw1和Crw2突变株对植食性的不寻常的易感性使得这种植物能够被用作“诱虫”作物。诱虫作物可被定义为“吸引、转移、拦截和/或保留目标昆虫或者它们所携带的病原体以便减少对主要作物的损害”的一片植物(plant stand)(Shelton和Badenes-Perez，2006，《昆虫学年评》(Annu.Rev.Entomol.)，51：285-308)。
诱虫作物包括一种或更多种由于Crw1和/或Crw2的内源表达降低而具有提高的对昆虫害虫植食性的易感性的植物。昆虫害虫可为鞘翅目或者鳞翅目害虫。昆虫害虫可为玉米根虫、欧洲玉米螟或者日本金龟子。诱虫作物和/或主要作物可包括选自以下的植物：玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、小米或者甘蔗。玉蜀黍特别值得关注。
诱虫作物可种植在主要作物当中、紧邻主要作物种植，或者在主要作物2公里以内种植。如果散布种植在主要作物当中，则诱虫作物的种子和主要作物的种子可在同一个种子袋中存在。针对种子的术语“混合”意指例如将至少两种类型的种子在袋子中混合(如在包装、生产或者出售过程中混合)、将至少两种类型的种子在地块中混合、或者任何其他导致至少两种类型的种子被引入到地块中的方法。该混合物可导致在地块中随机排列，或者可以是结构化的(如，例如在块状地(block)或者带状地(strip)中)。诱虫作物的种子可占袋中的种子总量的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或者最多20％。诱虫作物面积的大小和布置通常不是基于面积的大小，而是基于预期的昆虫害虫数目。
在一个方面，诱虫作物可用来将昆虫害虫引诱到诱虫作物以试图监测昆虫害虫数目。监测是昆虫害虫管理方案的一个关键组成部分，并且可通过直接观察或者使用仪器对作物采样来进行。对于监测生长季节早期群集的害虫甲虫的群体，以便估计剩余的生长季节的昆虫害虫压力和推荐使用 最具成本效益性的防控方法而言，诱虫作物的使用将是特别有用的。对于限制外来害虫(如在欧洲的西部玉米根虫(Diabrotica virgifera))的地理分布的扩大而言，监测也是重要的。
在另一个方面，诱虫作物可用来吸引昆虫害虫离开主要作物，从而防止昆虫害虫到达主要作物或者减低到达的可能性。这个方法因而减少主要作物上的昆虫害虫数目。
在另一个方面，诱虫作物可用来将昆虫害虫引诱到诱虫作物，在诱虫作物上可采取行动以杀灭昆虫害虫或者减少害虫的数目。这个策略被称为“吸引-杀灭”策略。在这个情形中，“杀灭”可通过本领域普通技术人员知道的任何方法来进行。通常，首选的方法是施加杀虫剂，但也可使用靶向昆虫成虫的转基因杀虫剂，或者使用食昆虫剂(entomophagous agent)如昆虫致病真菌。“吸引-杀灭”策略也可以是一个重要且有效的全地区(region-wide)管理工具，以减少外来害虫物种(如在欧洲的西部玉米根虫(Diabrotica virgifera))的地理分布的扩大。
昆虫害虫的可确定昆虫是否可受诱虫作物管理的最重要特征之一是诱虫作物所靶向的昆虫阶段。例如，鳞翅目雌性成虫选择植物进行产卵，但幼虫(其通常具有有限的活动性)才是造成损害的阶段。
另一个重要的特性是昆虫指导其活动、其迁移行为及其找宿主行为的能力。鞘翅目和鳞翅目中的较大的昆虫通常具有增强的定向飞行能力，这使得更容易用诱虫作物对付它们。
在玉米根虫的情况中，防控方法可包括防控一个生长季节中的昆虫害虫成虫和下一代的幼虫。例如，诱虫作物可用来将成虫甲虫吸引到诱虫作物的区域，成虫甲虫会保留在该区域并产卵。杀虫剂可用来杀灭昆虫害虫成虫，从而管理成虫甲虫的群体并减少对玉米穗丝的损害。此外，如果昆虫在产卵之前被杀灭，则在下一代中昆虫害虫幼虫的数目将减少。因而，由于玉米根虫幼虫的数目有限，下一个季节中玉米根部的损害将减少。还可在诱虫作物的区域中放置粘性捕虫器，以图减少昆虫害虫成虫的数目。作为另一种选择，可将诱虫作物连同昆虫害虫卵一起消灭。
结合生物防控方法、杀虫剂防控方法和/或栽培防控方法来补充诱虫作物的作用，可提高诱虫作物的有效性并且还提供其他有益效果。
仅在诱虫作物上而不在主要作物上施加杀虫剂，其好处是减少杀虫剂的使用总量，对环境的负面影响较少。
诱虫作物可包含转基因，当昆虫害虫取食该诱虫作物的植株时，该转基因干扰该昆虫害虫的生活周期。这可通过涉及RNAi的机制发生。生活周期的破坏可采取杀虫剂或者绝育剂的形式，其中杀虫剂杀灭或者伤害当前一代害虫，而绝育剂减少下一代的卵的成活力或者干扰下一代的发育和成活力。
栽培措施如轮作和/或收获后耕土可与诱虫作物种植一起使用，以吸引一代的昆虫害虫成虫并杀灭下一代的昆虫。在本文的方法中，可在一个生长季节中在主要作物内或者附近的小面积中种植诱虫作物。诱虫作物在该生长季节中吸引成虫甲虫，减少对主要作物的昆虫害虫压力并增加在诱虫作物上的产卵。在下一个季节，诱虫作物所处的区域可播上非宿主植物的种子(即轮作)，或者在种植之前可耕土，从而减少下一代昆虫群体。
一般地，诱虫作物可占总区域的约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或者最多20％。
留出土地进行诱虫作物种植的成本可能是非常大的。但是，包括一种或更多种由于Crw1和/或Crw2的内源表达降低而具有提高的对昆虫害虫植食性的易感性的植物的诱虫作物仍可进行收获，尤其是如果诱虫作物与主要作物散布种植在一起的话。尽管产量可能不是最佳的，但收获易感植株能使与使用土地资源进行诱虫作物种植相关的损失减至最低。
庇护作物及其用途
用于防控昆虫害虫(例如玉米根虫和欧洲玉米螟)的转基因Bt玉米的种植面积的快速增加，已激发了人们对于管理昆虫体内的抗性发展的兴趣，例如在具有抗虫作物植株的大田中强制种植庇护作物。在一个实施例中，昆虫庇护区由不含防控玉米螟和/或玉米根虫的植物体内抗虫性状(例如Bt性状)的植株组成。庇护区的存在能让从具有抗虫性状的田地里出现的潜在抗性昆虫与来自庇护区的易感昆虫交配，稀释昆虫群体中的抗性基因型并延长抗虫性状的持久性。
在一个实施例中，庇护作物包括一种或更多种由于Crw1和/或Crw2的内源表达降低而具有提高的对昆虫害虫植食性的易感性的植物。该昆虫害 虫可为鞘翅目或者鳞翅目害虫。该昆虫害虫可为玉米根虫、欧洲玉米螟或者日本金龟子。庇护作物和/或主要作物(包含一种或更多种抗虫性状)可包括选自以下的植物：玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、小米或者甘蔗。玉蜀黍特别值得关注。
庇护作物可用来减少昆虫害虫中发展对抗虫转基因植株的抗性。本文提供一种产生内源Crw1的表达降低的转基因植株的方法，其中该方法包括：(a)向可再生的植物细胞中引入包含与启动子有效连接的多核苷酸或cDNA的重组构建体，其中该多核苷酸或cDNA序列的表达减少内源Crw1表达；(b)在步骤(a)之后从该可再生的植物细胞再生出转基因植株，其中该转基因植株在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(c)选择(b)的转基因植株，其中该转基因植株包含该重组构建体并且与不包含该重组DNA构建体的对照植株比较时表现出Crw1的表达降低。
本文提供一种产生内源Crw1的表达降低的转基因植株的方法，其中该方法包括：(a)向可再生的植物细胞中引入重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与在植物中有功能的启动子在有义或反义方向上有效连接的分离多核苷酸或cDNA，其中该多核苷酸或cDNA可包含(i)SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列；(ii)基于Clustal W比对方法，当与SEQ ID NO：1或2比较时具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；(iii)SEQ ID NO：1或2的至少100个毗连核苷酸的核苷酸序列；(iv)可在严格条件下与(i)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或者(v)经修饰的植物miRNA前体，其中该前体已被修饰成用被设计来产生导向SEQ ID NO：1或2的miRNA的序列替换miRNA编码区；(b)在步骤(a)之后再生出转基因植株细胞，其中该转基因植株在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(c)选择(b)的转基因植株，其中该转基因植株包含该重组DNA构建体并且当与不包含该重组DNA构建体的对照植株比较时表现出Crw1的表达降低。
本文提供一种鉴定Crw1的赋予提高的对昆虫害虫植食性的易感性的等位基因的方法，其中该方法包括：(a)对突变玉蜀黍植株的群体进行遗传筛选；(b)鉴定一株或更多株表现出提高的对昆虫害虫植食性的易感性的突变株；以及(c)从该赋予提高的对昆虫害虫植食性的易感性的突变玉蜀黍植株鉴定Crw1等位基因。
本文提供一种鉴定Crw1的赋予提高的对昆虫害虫植食性的易感性的等位基因的方法，其中该方法包括以下步骤：(a)使用一个或更多个编码SEQ ID NO：3或者与SEQ ID NO：3具有至少70％同一性的蛋白质、或其片段的核苷酸序列进行基因改组；(b)将来自步骤(a)的经改组的序列转化到可再生的植物细胞的群体中；(c)从步骤(b)的经转化的可再生植物细胞的群体再生出经转化的植株的群体；(d)对来自步骤(c)的经转化的植株的群体筛选提高的对昆虫害虫植食性的易感性；以及(e)从该表现出提高的对昆虫害虫植食性的易感性的经转化的植株鉴定该Crw1等位基因。
本文提供一种鉴定玉蜀黍植株中Crw1的与提高的对昆虫害虫植食性的易感性相关的等位基因的方法，其中该方法包括以下步骤：(a)将两株对所述昆虫害虫具有不同水平的抗性的玉蜀黍植株进行杂交；(b)针对编码包含SEQ ID NO：3的蛋白质的多核苷酸或cDNA序列，或者在调节编码该蛋白质的多核苷酸或cDNA的表达的基因组区域中，评估子代植株中的等位基因变异；(c)对所述子代植株进行表型分析，确定对所述昆虫害虫植食性的易感性；(d)将等位基因变异与所述易感性建立关联；以及(e)鉴定出与提高的对昆虫害虫植食性的易感性相关的等位基因。该方法还包括通过植物育种将鉴定出的等位基因引入到其他玉蜀黍植株中。
本文提供一种鉴定玉蜀黍植株中Crw1的与提高的对昆虫害虫植食性的易感性相关的等位基因的方法，其中该方法包括以下步骤：(a)获得玉蜀黍植株的群体，其中所述玉蜀黍植株表现出不同水平的对所述昆虫害虫植食性的易感性；(b)针对编码包含SEQ ID NO：3的蛋白质的多核苷酸或cDNA序列，或者在调节编码该蛋白质的多核苷酸或cDNA的表达的基因组区域中，评估等位基因变异；(c)将等位基因变异与所述易感性建立关联；以及(d)鉴定出与提高的对昆虫害虫植食性的易感性相关的等位基因变体。该方法还包括通过植物育种将鉴定出的等位基因引入到其他玉蜀黍植株中。
本文提供一种用于制备表现出提高的对昆虫害虫植食性的易感性的植株的方法，其中该方法包括：(a)向内源Crw1基因中引入突变；以及(b)检测该突变。(a)和(b)的步骤可用定向诱导基因组局部损害(TILLING)方法进行，并且该突变可有效地降低内源Crw1基因的表达。该突变可为位点特异性突变。
本文提供一种制备表现出提高的对昆虫害虫植食性的易感性的植株的方法，其中该方法包括：(a)向含有内源Crw1基因的种质中引入转座子；(b)获得步骤(a)的种质的子代；以及(c)鉴定得自步骤(b)的子代植株，其中该转座子插入在该内源Crw1基因中导致Crw1的表达降低。步骤(a)还包括通过转化将该转座子引入到该种质的可再生植物细胞中，并且从该可再生植物细胞再生出转基因植株，其中该转基因植株在其基因组中包含该转座子。该方法还包括以下步骤：(a)向可再生的植物细胞中引入包含该鉴定出的Crw1等位基因的重组构建体；(b)在步骤(i)之后从该可再生的植物细胞再生出转基因植株，其中该转基因植株在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(c)选择(b)的转基因植株，其中该转基因植株包含该重组DNA构建体并且当与不包含该重组DNA构建体的对照植株比较时表现出提高的对昆虫害虫植食性的易感性。
本文提供一种用于产生具有提高的对昆虫害虫植食性的易感性的转基因植物的方法，其中该方法包括以下步骤：(a)向可再生的植物细胞中引入重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与在植物中有功能的启动子在有义或反义方向上有效连接的分离多核苷酸或cDNA，其中该多核苷酸或cDNA包含：(i)SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列；(ii)基于Clustal W比对方法，当与SEQ ID NO：1或2比较时具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；(iii)SEQ ID NO：1或2的至少100个毗连核苷酸的核苷酸序列；(iv)可在严格条件下与(i)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或者(v)经修饰的植物miRNA前体，其中该前体已被修饰成用被设计来产生导向SEQ ID NO：1或2的miRNA的序列替换该miRNA编码区；(b)在步骤(a)之后从该可再生的植物细胞再生出转基因植株，其中该转基因植株在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(c)选择(b)的转基因植株，其中该转基因植株包含该重组DNA构建体并且当与不包含该重组DNA构建体的对照植株比较时表现出提高的对昆虫害虫植食性的易感性。
本文提供一种在其基因组中包含编码具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸或cDNA的植株，其中所述植株具有提高的对昆虫害虫植食性的易感性。
本文提供一种植株，其中所述植株在其基因组中包含这样的重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含与在植物中有功能的启动子在有义或反义 方向上或同时在这两个方向上有效连接的分离多核苷酸或cDNA，其中该多核苷酸或cDNA包含：(a)SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列；(b)基于Clustal W比对方法，当与SEQ ID NO：1或2比较时具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；(c)可在严格条件下与(a)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或者(d)经修饰的植物miRNA前体，其中该前体已被修饰成用被设计来产生导向SEQ ID NO：1或2的miRNA的序列替换miRNA编码区。该植株当与不包含该重组DNA构建体的对照植株比较时表现出提高的对昆虫害虫植食性的易感性。
按本公开的任何前述方法，可产生出植株。该植株可为玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、小米或者甘蔗。该昆虫害虫可为鞘翅目害虫。该昆虫害虫可为玉米根虫。
本文提供一种用于产生内源Crw2的表达降低的转基因植株的方法，其中该方法包括以下步骤：(a)向可再生的植物细胞中引入包含与启动子有效连接的多核苷酸或cDNA的重组构建体，其中该多核苷酸或cDNA序列的表达降低内源Crw2表达；(b)在步骤(a)之后从该可再生的植物细胞再生出转基因植株，其中该转基因植株在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(c)选择(b)的转基因植株，其中该转基因植株包含该重组构建体并且当与不包含该重组DNA构建体的对照植株比较时表现出Crw2的表达降低。
本文提供了一种用于产生内源Crw2的表达降低的转基因植株的方法，其中该方法包括：(a)向可再生的植物细胞中引入重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与在植物中有功能的启动子在有义或反义方向上有效连接的分离多核苷酸或cDNA，其中该多核苷酸或cDNA包含：(i)SEQ ID NO：28的核苷酸序列；(ii)基于Clustal W比对方法，当与SEQ ID NO：28比较时具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；(iii)SEQ ID NO：28的至少100个毗连核苷酸的核苷酸序列；(iv)可在严格条件下与(i)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或者(v)经修饰的植物miRNA前体，其中该前体已被修饰成用被设计来产生导向SEQ ID NO：28的miRNA的序列替换miRNA编码区；(b)在步骤(a)之后再生转基因植株细胞，其中该转基因植株在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(c)选择(b)的转基因植株，其中该转基因植株包含该重组DNA构建体并且当与不包含该重组DNA构建体的对照植株比较时表现出Crw2的表达降低。
一种用于鉴定Crw2的赋予提高的对昆虫害虫植食性的易感性的等位基因的方法，其中该方法包括：(a)对突变玉蜀黍植株的群体进行遗传筛选；(b)鉴定一株或更多株表现出提高的对昆虫害虫植食性的易感性的突变株；以及(c)从该赋予提高的对昆虫害虫植食性的易感性的突变玉蜀黍植株鉴定该Crw2等位基因。
本文提供一种用于鉴定Crw2的赋予提高的对昆虫害虫植食性的易感性的等位基因的方法，其中该方法包括以下步骤：(a)使用一个或更多个编码SEQ ID NO：29或者与SEQ ID NO：29具有至少70％同一性的蛋白质、或其片段的核苷酸序列进行基因改组；(b)将来自步骤(a)的经改组的序列转化到可再生的植物细胞的群体中；(c)从步骤(b)的经转化的可再生植物细胞的群体再生出经转化的植株的群体；(d)对来自步骤(c)的经转化的植株的群体筛选提高的对昆虫害虫植食性的易感性；以及(e)从该表现出提高的对昆虫害虫植食性的易感性的经转化的植株鉴定该Crw2等位基因。
本文提供一种鉴定玉蜀黍植株中Crw2的与提高的对昆虫害虫植食性的易感性相关的等位基因的方法，其中该方法包括以下步骤：(a)将两株对所述昆虫害虫具有不同水平的抗性的玉蜀黍植株进行杂交；(b)针对编码包含SEQ ID NO：29的蛋白质的多核苷酸或cDNA序列，或者在调节编码该蛋白质的多核苷酸或cDNA的表达的基因组区域中，评估子代植株中的等位基因变异；(c)对所述子代植株进行表型分析，确定对所述昆虫害虫植食性的易感性；(d)将等位基因变异与所述易感性建立关联；以及(e)鉴定出与提高的对昆虫害虫植食性的易感性相关的等位基因。该方法还包括通过植物育种将鉴定出的等位基因引入到其他玉蜀黍植株中。
本文提供一种鉴定玉蜀黍植株中Crw2的与提高的对昆虫害虫植食性的易感性相关的等位基因的方法，其中该方法包括以下步骤：(a)获得玉蜀黍植株的群体，其中所述玉蜀黍植株表现出不同水平的对所述昆虫害虫植食性的易感性；(b)针对编码包含SEQ ID NO：29的蛋白质的多核苷酸或cDNA序列，或者在调节编码该蛋白质的多核苷酸或cDNA的表达的基因组区域中，评估等位基因变异；(c)将等位基因变异与所述易感性建立关联；以及(d)鉴定出与提高的对昆虫害虫植食性的易感性相关的等位基因变体。该方法还包括通过植物育种将鉴定出的等位基因引入到其他玉蜀黍植株中。
本文提供一种用于制备表现出提高的对昆虫害虫植食性的易感性的植株的方法，其中所述方法包括：(a)向内源Crw2基因中引入突变；以及(2)检测该突变。步骤(a)和(b)可使用定向诱导基因组局部损害(TILLING)方法进行，并且其中该突变可有效地降低内源Crw2基因的表达。该突变可为位点特异性突变。
本文提供一种用于制备表现出提高的对昆虫害虫植食性的易感性的植株的方法，其中所述方法包括：(a)向含有内源Crw2基因的种质中引入转座子；(b)获得步骤(a)的种质的子代；以及(c)鉴定得自步骤(b)的子代植株，其中该转座子插入到该内源Crw2基因中导致Crw2的表达降低。步骤(a)还包括通过转化将该转座子引入到该种质的可再生植物细胞中，并且从该可再生植物细胞再生出转基因植株，其中该转基因植株在其基因组中包含该转座子。该方法还包括以下步骤：(a)向可再生的植物细胞中引入包含通过权利要求34或者35的方法鉴定的Crw2等位基因的重组构建体；(b)在步骤(a)之后从该可再生的植物细胞再生出转基因植株，其中该转基因植株在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(c)选择(b)的转基因植株，其中该转基因植株包含该重组DNA构建体并且当与不包含该重组DNA构建体的对照植株比较时表现出提高的对昆虫害虫植食性的易感性。
本文提供一种产生具有提高的对昆虫害虫植食性的易感性的转基因植株，其中该方法包括以下步骤：(a)向可再生的植物细胞中引入重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与在植物中有功能的启动子在有义或反义方向上有效连接的分离多核苷酸或cDNA，其中该多核苷酸或cDNA包含：(i)SEQ ID NO：28的核苷酸序列；(ii)基于Clustal W比对方法，当与SEQ ID NO：28比较时具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；(iii)SEQ ID NO：28的至少100个毗连核苷酸的核苷酸序列；(iv)在严格条件下与(i)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或者(v)经修饰的植物miRNA前体，其中该前体已被修饰成用被设计来产生导向SEQ ID NO：28的miRNA的序列替换miRNA编码区；(b)在步骤(a)之后从该可再生的植物细胞再生出转基因植株，其中该转基因植株在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(c)选择(b)的转基因植株，其中该转基因植株包含该重组DNA构建体并且当与不包含该重组DNA构建体的对照植株比较时表现出提高的对昆虫害虫植食性的易感性。
本文提供一种在其基因组中包含编码具有SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：33所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸或cDNA的植株，其中所述植株具有提高的对昆虫害虫植食性的易感性。
本文还提供一种在其基因组中包含这样的重组DNA构建体的植株，该重组DNA构建体包含与在植物中有功能的启动子在有义或反义方向上或同时在这两个方向上有效连接的分离多核苷酸或cDNA，其中该多核苷酸或cDNA包含：(a)SEQ ID NO：28的核苷酸序列；(b)基于Clustal W比对方法，当与SEQ ID NO：28比较时具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；(c)在严格条件下与(a)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或者(d)经修饰的植物miRNA前体，其中该前体已被修饰以用被设计来产生导向SEQ ID NO：28的miRNA的序列替换miRNA编码区；以及其中该植株当与不包含该重组DNA构建体的对照植株比较时表现出提高的对昆虫害虫植食性的易感性。
按本公开的任何前述方法，可以生产出植株。该植株可为玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、小米或者甘蔗。该昆虫害虫可为鞘翅目或者鳞翅目害虫。该昆虫害虫可为玉米根虫、欧洲玉米螟或者日本金龟子。
本文中还提供一种在其基因组中包含(a)编码具有SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸或cDNA；和(b)编码具有SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：33所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸或cDNA的植株，其中所述植株具有提高的对昆虫害虫植食性的易感性。该植株可为玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、小米或者甘蔗。该昆虫害虫可为鞘翅目或者鳞翅目害虫。该昆虫害虫可为玉米根虫、欧洲玉米螟或者日本金龟子。
本文提供一种减少昆虫害虫发展对Bt转基因植物的抗性的方法，其中该方法包括：(a)在某个区域中种植Bt转基因植物的主要作物；以及(b)在该主要作物当中、紧邻该主要作物或者在该主要作物2公里以内种植包含具有提高的对昆虫害虫的易感性的植株的庇护作物。
在任何上文给出的方法中，对昆虫害虫植食性的抗性或者易感性的评估可包括本领域普通技术人员知道的任何规程。还可使用本文给出的取食选择测定法。
实例
以下实例进一步说明本公开，其中份和百分数是以重量计，度是指摄氏度，除非另有规定。应理解，这些实例虽然说明本发明的各实施例，但仅以举例说明的方式给出。由以上讨论和这些实例，本领域技术人员可以确定本公开的必要特征，并在不背离本公开的精神和范围的情况下，可对本公开作出各种变化和修改以使其适应各种用途和条件。因此，除了本文显示和描述的那些修改之外，本领域技术人员由前文的描述将显而易见地知道其他各种修改。这类修改也旨在落入所附权利要求的范围内。
实例1
叶取食选择测定
进行了取食选择测定法，以评估植物对玉米根虫甲虫的抗性水平。使用具有可拆卸的盖的PVC盒，并将相等重量的来自突变植株和野生型植株的新鲜收获成熟叶子以随机方式附于潮湿的滤纸。将已饿了一夜的西部玉米根虫甲虫和南部玉米根虫甲虫放入盒中。之前的观察表明，根虫通常在前45分钟随机觅食，然后才建立取食偏好，并且偏好的取食通常持续到所选择的叶子被完全吞食为止。按0至5的尺度对叶取食进行评分，其中0表示无损害，5表示完全毁坏。
实例2
玉蜀黍Crw1基因的克隆和验证
在Ac活性材料中鉴定了对西部玉米根虫(WCR)成虫甲虫高度易感的Crw1玉蜀黍突变株(在本文中也称crw1-Ac突变株)。用取食选择测定法进行评估得知，WCR甲虫对crw1l-Ac突变株叶子的偏好压倒性地超过对野生型亲缘株叶子的偏好。将该基因通过共分离分析与Ac一起进行克隆，确定了Crw1基因位于6号染色体上，并且它编码与植物特异性NAC家族转录因子具有高度同源性的多肽。从原始的Ac等位基因鉴定了Crw1的稳定地突变但回复的等位基因，其在插入位点含有8bp的同向重复(`Ac切除的足迹)。这个8bp的插入造成CRW1的过早终止。图2显示crw1-Ac突变株中Crw1基因及该突变的位置的示意图。图6A-6C显示野生型Crw1和crw1-Ac等位基因之间的比对。SEQ ID NO：4和5分别指crw1-Ac核苷酸编码序列和CRW1-Ac氨基酸序列。
为鉴定Crw1的另外的突变等位基因，首先在大田中在天然的虫扰条件下对一批公共的玉蜀黍多样性株系进行WCR甲虫易感性的筛选，然后通 过实例1描述的叶取食选择测定法进行验证。发现两个公共的多样性株系CO109和NC316在对WCR甲虫的易感性上发生分离。通过将每个株系与crw1-Ac株系杂交，显示了CO109和NC316在Crw1基因处含有赋予提高的WCR甲虫易感性的天然存在的突变等位基因。对每个株系中的Crw1cDNA进行测序表明，CO109在外显子2中含有1bp插入(在核苷酸368处)，而NC316在外显子2的不同位置处含有1bp插入(在核苷酸366处)和45bp插入。在两种情形中都产生过早终止密码子。图2显示CO109和NC316株系中的突变的位置。图7A-7C显示野生型Crw1和来自CO109的Crw1之间的比对。SEQ ID NO：6和7分别指crw1-CO109核苷酸编码序列和CRW1-00109氨基酸序列。图8A-8C显示野生型Crw1和来自NC316的Crw1之间的比对。SEQ ID NO：8和9分别指crw1-NC316核苷酸编码序列和CRW1-NC316氨基酸序列。
实例3
玉蜀黍Crw1基因的转录特征和生化特
征迄今为止，玉蜀黍Crw1基因的转录谱(transcriptional profile)一直难以完全地建立。一个可能的原因是，玉蜀黍Crw1转录物可能缺乏聚腺苷酸尾。该预测是基于如下事实：在任何公共的EST数据库中都未曾找到玉蜀黍Crw1cDNA。另外，在RNA seq实验(转录组学)中没有检测到玉蜀黍Crw1基因的读段(read)，该RNA seq实验是对从在发生甲虫损害后的不同时间间隔分离的成叶RNA样品产生的cDNA上进行的。尽管如此，该转录组学实验和随后对显著命中结果(significant hit)的RT-PCR验证揭示了玉蜀黍Crw1突变株的三个重要特征：
首先，玉蜀黍中控制茉莉酸(JA)和绿叶挥发物(GLV，如二萜烯)的生成的脂氧合酶途径基因的表达发生显著变化。这些化合物都在植物与昆虫害虫的相互作用中起到显著的作用，尽管作用是相反的。例如，已知JA能介导宿主抗性，而GLV有助于吸引害虫及其捕食者。与其野生型对照相比，玉蜀黍Crw1突变株中JA途径基因的表达被上调(表1)，而GLV基因的表达却减少。这些结果与突变体Crw1植株较其野生型对应物出现较高的JA诱导水平是一致的(图3)。
表1是与野生型亲缘株相比，Crw1突变株中因响应昆虫取食而被差异化调节的脂氧合酶途径基因的列表。正值和负值表示突变株中的特定转录 物与野生型相比的变化倍数。看来，因响应WCR的取食，Crw1中出现JA生物合成和信号转导基因的上调，并伴随着出现GLV基因的下降。

其次，在玉蜀黍Crw1突变株中，苯丙素(phenylpropanoid)和木质素生物合成基因的表达下降(表2)。与这些结果一致的是如下的发现：Crw1突变株积累较低水平的对香豆酸和阿魏酸(图4)并且表现出成体组织的木质化减少(图5)。鉴于这些酚类化合物执行细胞壁交联，我们的结果与Crw1突变株叶子的拉伸强度减弱和所述叶子的甲苯胺蓝O(TBO，其与细胞壁中的游离羟基反应)染色的改变是相一致的。
表2是被差异调节的参与木质素生物合成的转录物的列表。正值和负值表示与野生型相比Crw1突变株中特定转录物的变化倍数。看来，因响应WCR甲虫取食，木质素生物合成的负调节因子被上调，而Crw1中的木质素生物合成途径的几个关键基因被下调。


第三，Crw1突变株中的许多氨基酸生物合成基因和修饰基因的表达被上调(表3)，而这进而造成更高水平的相关氨基酸(表4)。这些游离氨基酸中突出的是丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸和丝氨酸，它们都显示出起到WCR甲虫的强效诱食剂的作用。
表3是与Crw1的野生型亲缘株相比，突变株中因响应WCR取食而被差异化诱导的氨基酸生物合成或修饰基因的列表。正值和负值表示与野生型相比Crw1突变株中特定转录物的变化倍数。丙氨酸氨基转移酶参与丙氨酸的形成，而丝氨酸家族氨基酸生物合成蛋白样和甘氨酸羟甲基转移酶参与丙氨酸和甘氨酸的形成。

表4显示Crw1突变株中生长阶段特异性的叶代谢物分布。差异的代谢物水平以突变株相比于野生型的变化倍数表示。负值和正值分别表示突变株与野生型相比在特定的生长阶段特定代谢物的较低水平和较高水平。表中的零值表示在该特定生长阶段没有检测到变化倍数。


实例4
玉蜀黍CRW1多肽的同系物的鉴定
可使用美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的BLASTP算法以及DUPONTTM专有内部数据库，分析玉蜀黍CRW1多肽与无冗除(“nr”)数据库中含有的所有可公开获得的氨基酸序列的相似性。
使用玉蜀黍CRW1多肽的序列进行的BLAST搜索揭示了玉蜀黍CRW1多肽与来自各种生物体的NAC转录因子的相似性。表5(非专利文献)和表6(专利文献)中显示的是玉蜀黍CRW1的氨基酸序列的BLASTP结果。图5和6中还显示了使用Clustal W比对方法和默认参数得到的每对氨基酸序列的序列同一性百分数的值：
表5.玉蜀黍CRW1多肽的BLASTP结果(非专利)

表6.玉蜀黍CRW1多肽的BLASTP结果(专利)

*E值仅代表被比对的部分。
图9A-9L示出SEQ ID NO：3、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26和27所示多肽的氨基酸序列的比对。图10示出图9A-9L中示出的每个序列对的序列同一性百分数和趋异值。
序列比对和同一性百分数计算是用生物信息学计算软件包(Inc.公司，威斯康星州麦迪逊市)的程序进行的。所述序列的多序列比对是用Clustal W比对方法(Thompson等人，(1994)，《核酸研究》(Nucleic Acids Research)，22：4673-80)和默认参数(空位罚分＝10、空位长度罚分＝0.20)进行的。使用Clustal方法进行的双序列比对的默认参数为空位罚分＝10.00和空位长度＝0.10。所用的蛋白质权重矩阵为Gonnet系列。
实例5
Crw2基因的克隆和验证
从EMS群体分离了一株显示出提高的对WCR成虫的易感性的玉蜀黍突变株，并命名为crw2-EMS。独立地，在源自Mu活性株系的F2群体中鉴定了另一株WCR易感突变株，命名为crw2-Mutag。该Crw2突变株当在大田试验中评估时显示出对WCR成虫以及对日本金龟子和欧洲玉米螟(ECB)的易感性提高。crw2-EMS和crw2-Mutag都作为单基因隐性性状分离，定位于5号染色体的相同区域，并且在正反交中互为等位基因。使用共分离分析从crw2-Mutag突变株分离了候选基因，该基因(SEQ ID NO：28)被发现编码推定的同型半乳糖醛酸聚糖(HGA1)(也称为“糖基转移酶AER61”)或者“推定的未表征的蛋白”。该候选基因包含两个外显子和一个内含子，并编码长度为445个氨基酸(aa)的产物(SEQ ID NO：29)，其具有一个20aa的跨膜螺旋(TMH)(来自该肽的氨基酸13-32)。预期该跨膜螺旋将该蛋白质定位于ER/Golgi，其中该肽的前12个氨基酸朝向该细胞器的内部，而其余部分(从氨基酸33至455)在外部垂到细胞质中。crw2-Mutag的克隆和测序(SEQ ID NO：30为cDNA的核苷酸序列，而SEQ ID NO：31为编码的多肽的氨基酸序列)揭示该Mu元件添加了145bp(参见图11A至11G的比对)。
为验证该候选基因，使用一组嵌套引物从crw2-EMS突变等位基因(SEQ ID NO：32为cDNA的核苷酸序列，而SEQ ID NO：33为编码的多肽 的氨基酸序列)及其始祖MO20W(一个公共的玉蜀黍近交系)扩增全长基因。经与MO20W HGA1基因比较，在crw2-EMS等位基因中检测到单个氨基酸变化R292C(图12A-12F)。这个氨基酸变化在HGA1的保守区中，并且很可能是导致crw2-EMS突变的等位基因。分离了具有位于EMS等位基因和Mu-tag等位基因的位置之间的增变基因(Mutator)插入的独立TUSC等位基因，并进行表型分析和分子分析。发现该TUSC等位基因与crw2-Mutag等位基因互为等位基因，并且显示出类似的提高的对WCR成虫和对日本金龟子的易感性。图13显示玉蜀黍Crw2基因结构和每个Crw2突变的位置的示图。
实例6
玉蜀黍CRW2多肽的同系物的鉴定
可使用美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的BLASTP算法以及DUPONTTM专有内部数据库，分析玉蜀黍CRW2多肽与“nr”数据库中含有的所有可公开获得的氨基酸序列的相似性。
使用玉蜀黍CRW2(SEQ ID NO：29)多肽的序列进行的BLAST搜索揭示了玉蜀黍CRW2多肽与来自各种生物体的同型半乳糖醛酸聚糖的相似性。表1(非专利文献)和表2(专利文献)中显示的是玉蜀黍CRW2的氨基酸序列的BLASTP结果。图7和8中还显示了使用Clustal W比对方法和默认参数得到的每对氨基酸序列的序列同一性百分数的值：
表7.玉蜀黍CRW2多肽的BLASTP结果(非专利)


*表示该序列是在内部专有数据库中发现的
表8.玉蜀黍CRW2多肽的BLASTP结果(专利)

图14A-14J显示ZmCRW2蛋白(SEQ ID NO：29)与其同系物(SEQ ID NO：34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、47、49和50)的比对。图15示出图14A-14J中示出的每个序列对的序列同一性百分数和趋异值。
序列比对和同一性百分数计算是用生物信息学计算软件包(Inc.公司，威斯康星州麦迪逊市)的程序进行的。所述序列的多序列比对是用Clustal W比对方法(Thompson等人，(1994)，《核酸研究》(Nucleic Acids Research)，22：4673-80)和默认参数(空位罚分＝10、空位长度罚分＝0.20)进行的。使用Clustal方法进行的双 序列比对的默认参数为空位罚分＝10.00和空位长度＝0.10。所用的蛋白质权重矩阵为Gonnet系列。
实例7
突变株和野生型亲缘株中的ZmCrw2基因的RT-PCR分析
从crw2-Mutag突变株及其野生型亲缘株的10天龄籽苗的叶、茎秆和根组织收集总RNA样品，并使用基因特异性引物完成RT-PCR分析(图16A)。crw2-Mutag突变株显示出在三个组织中存在差异表达(在茎秆样品中的表达比叶和根样品要多)，并且具有比野生型亲缘株长145bp的转录物。crw2-Mutag转录物的克隆和测序揭示Mu-TIR末端在成熟转录物的差异剪接中的干扰。该Mu元件添加了141bp的该MuTIR(末端反向重复序列)末端，并添加了来自9bp同向重复的4bp。这导致了移码，从而改变最后73个氨基酸(与野生型相比)并且通过添加149个额外的氨基酸而使翻译产物更长。crw2-TUSC突变株的RT-PCR显示出与其野生型亲缘株相比，在叶中完全缺乏Crw2转录物(图16B)。
实例8
使用Lynx数据库得到的ZmCrw2基因在不同组织中的表达
Lynx数据库显示，ZmCrw2在例如以下的不同组织中的表达相对较低：伸长中的节间(370PPM)、根(367PPM)、抽丝期的内稃(324PPM)、穗(310PPM)和维管束(220PPM)(图17)。ZmCrw2基因在叶组织中的表达在V5叶中是最高的(300PPM)；但是，在V5叶组织中的表达因响应欧洲玉米螟(ECB)侵扰而显著下降。当V5叶轮被ECB幼虫侵扰时，在侵扰后0小时、3小时、6小时和24小时，ZmCrw2的表达分别为300、200、150和137RPM。
实例9
Crw1和Crw2途径分析
crw2-EMS的TBO染色导致与crw1-Ac的TBO染色相同的模式(图18)，这提示这两种突变株都在单个遗传途径或者网络中具有缺陷。
为进一步研究这个关联，在Crw1突变植株和野生型植株之间比较昆虫取食后的不同时间点的Crw2转录物水平的差异。将七周龄的crw1-Ac突变株及其野生型亲缘株在大田中装入帐篷中，然后让已被禁食16小时的成虫甲虫进行侵扰。在侵扰后0分钟、45分钟、1小时、6小时、12小时、24 小时、36小时和48小时收集RNA。然后对突变株和野生型亲缘株汇集不同时间点的RNA样品，突变株标为“汇集1”，野生型亲缘株标为“汇集2”。在这两个汇集中的每一个，在不同时间点评估Crw2转录物水平。相比于crw1-Ac突变植株，在野生型亲缘株中立即(45分钟)观察到Crw2转录物水平的显著上调(图19)。这些结果在RNA Seq实验中也得到确认，在该实验中，Crw1野生型亲缘株中的Crw2转录物高出2.8倍(1og2尺度)(表1)。这些结果表明，Crw2是昆虫诱导的，并且对昆虫取食的响应取决于具有功能性Crw1产物。
这些结果还提示，Crw1和Crw2属于相同的遗传或者生化网络，并且Crw2可在Crw1基因的下游起作用。
实例10
Crw2表型的进一步评估
将Crw2突变株和相应的野生型(WT)亲缘株以两星期的间隔种植在大田中。在七月中旬WCR压力处于最高峰时，对植株评估西部玉米根虫(WCR)甲虫所造成的昆虫损害。不论是否可得到幼态突变籽苗，都是在Crw2突变植株达到5周龄或者更大以后才观察到叶易感性表型。之后，叶损害继续稳定地发生，并且导致突变植株在严重的WCR侵扰下完全落叶。另外，Crw2突变株成为包括日本金龟子、欧洲玉米螟、秋粘虫和香蒲毛虫在内的多种草食昆虫的食物。
实例11
玉蜀黍Crw2基因的生化表征
用甲苯胺蓝O(TBO，其与细胞壁中的游离羟基反应)对Crw2突变株的叶子进行染色显示出脉间细胞的染色减少，这大概会导致拉伸强度减弱。为检验这是否是由于细胞壁结合的对香豆酸(pCA)和阿魏酸(FA)的水平降低造成的，用Crw2叶子和野生型叶子两者的幼态(V3期)和成体(V8期)表皮细胞壁对这些羟基肉桂酸酯进行定量。相比于野生型亲缘株，在Crw2突变株中观察到pCA和FA水平的显著下降，但仅在成叶中观察到(图20A)。
为研究羟基肉桂酸酯水平的降低是否也导致木质素水平的降低，从成体的(V8期)Crw2突变株和野生型亲缘株叶子的分离的细胞壁提取木质素(作为乙酰溴可溶性(ABS)级分)并通过紫外分光光度法进行分析。相比 于野生型叶子，Crw2的成叶中ABS木质素的水平显著较低(p＜0.05；非配对t检验)(图20B)。