擎天树发芽种子的组培繁殖方法.pdf

本发明涉及一种擎天树发芽种子的组培繁殖方法，本发明的技术方案包括擎天树种子的预处理、灭菌过程、初代培养等步骤，将擎天树种子培育成有两对真叶的无菌苗，所述预处理为将擎天树已发芽种子放入30-35℃无菌水内浸洗2-5min，所述灭菌过程为将种子放入0.8-0.9‰升汞溶液中浸洗2-5min，用30-35℃无菌水清洗，所述初代培养为将种子接种到MS+100mg/L肌醇+2.5mg/L6-BA+1.0mg/LNAA+10mg/LVc+30g/L蔗糖，pH6.6的培养基中培养，培养控制光照强度1500-3000lux，光照时间12h/d，温度25±3℃。本发明将外植体灭菌为无菌材料，使得无菌材料可以进一步开展扩繁，生根，培育无菌苗，相对于传统育苗方法，具有增殖率高、全年无间断生产苗木的优点。

权利要求书1.  擎天树发芽种子的组培繁殖方法，其特征在于：包括预处理、灭菌、初代培养工序，主要操作步骤为：预处理：将擎天树发芽种子的种翅去掉，用清水冲洗种子后，再剥除种壳，置于30-35 ℃无菌水内浸洗2-5 min，得到种胚备用；（2）灭菌：将备用种胚置于质量浓度0.8-0.9 ‰升汞溶液中浸泡，用30-35 ℃无菌水清洗5-8次，得到灭菌种胚待培养；（3）初代培养：将灭菌种胚接种到初代培养基中作一次初代培养，接种3d后种胚开始分株，胚轴伸长，接种20-30 h有褐化物质产生时，将种胚转接到新的初代培养基中作二次初代培养，转接2-3次，得到长有两对真叶，顶芽并带有一对托叶的组培苗。2.  根据权利要求1所述的擎天树发芽种子的组培繁殖方法，其特征在于：所述的浸泡的时间为2-5 min。3.  根据权利要求1所述的擎天树发芽种子的组培繁殖方法，其特征在于：所述的初代培养基配方的体积浓度为：MS + 80-120 mg/L肌醇 + 8-10 g/L卡拉胶 + 2-3 mg/L 6-BA + 0.5-1.5 mg/L NAA + 5-15 mg/L VC + 15-45 g/L蔗糖，pH6.0-7.0。4.  根据权利要求1所述的擎天树发芽种子的组培繁殖方法，其特征在于：所述的初代培养控制光照强度为1500-3000 lux，光照时间为10-15 h/d，温度为25±3 ℃。5.  根据权利要求3所述的擎天树发芽种子的组培繁殖方法，其特征在于：所述的初代培养基配方的体积浓度为：MS + 100 mg/L肌醇 + 9 g/L卡拉胶 + 2.5 mg/L 6-BA + 1.0 mg/L NAA + 15 mg/L VC + 30 g/L蔗糖，PH6.6。6.  根据权利要求4所述的擎天树发芽种子的组培繁殖方法，其特征在于：所述的初代培养的条件为：光照强度2000 lux，光照时间12 h/d，温度25℃。7.  一种擎天树发芽种子的组培繁殖方法，其特征在于：将擎天树发芽种子的种翅去掉，用清水冲洗后，再剥除种壳得到完整种胚；将种胚置于35 ℃无菌水内浸洗3 min，再将种胚置于质量浓度0.9 ‰升汞溶液中浸泡3 min，用35 ℃无菌水清洗7次，然后接种到含有体积浓度MS + 100 mg/L肌醇 + 9 g/L卡拉胶 + 2.5 mg/L 6-BA + 1.0 mg/L NAA + 10 mg/L VC + 30 g/L蔗糖，pH=6.6的初代培养基中培养，初代培养控制光照强度2000 lux，光照时间12 h/d，温度25℃，接种20-25 h有褐化物质产生时，将种胚转接到新的初代培养基中培养，转接3次，得到长有两对真叶，顶芽并带有一对托叶的组培苗。

说明书擎天树发芽种子的组培繁殖方法
技术领域
    本发明涉及植物无性快繁技术领域，具体地说是一种擎天树发芽种子的组培繁殖方法。
背景技术
擎天树（Parashorea chinensis Wang Hsie.），龙脑香科柳桉属，常绿高大乔木，为亚洲热带雨林中最繁茂、 最具代表性的树种。 树干可高达五六十米， 雄居林冠之上，木材坚硬、耐腐性强，木材纹理直，结构均匀，加工容易，刨切面光滑，花纹美观，为制造各种家具的高级用材，具有重要经济价值和科学研究价值，是国之瑰宝。擎天树分布狭窄，只分布在西双版纳的补蚌和广纳里新寨至景飘一带的20平方公里范围内；生长环境大部分为原始沟谷雨林及山地雨林，多成片生长，组成独立的群落，形成奇特的自然景观，是中国的一级保护植物。
擎天树开花结实较晚，一般在胸径达40厘米以上才开花结实，结实稀少，且每隔2-5年才开花结实1次，落果严重，不易采种。擎天树的种子发芽很快，在林地上l-4 d便发芽，在高温多雨环境，有些成熟果尚在母树上，种子就已发芽，严重影响着苗木培育的成功率。擎天树若采用嫩枝扦插或硬枝扦插无性繁殖技术，季节性强，扦插成活率70 %以上的时间是在每年的3月至7月。由于擎天树枝条内含酚类物质，嫩枝扦插褐化严重，硬枝扦插不定根发生时间长，如遇上干旱或高温梅雨恶劣气候条件，擎天树枝条容易干枯或腐烂致死。因擎天树生物特性特异，严重限制着该资源的开发利用。采用组培无性繁殖技术是促进擎天树发展的有效途径。由于擎天树幼嫩茎段密布绒毛，灭菌难度大。为了获取擎天树组培快繁繁殖体，探索擎天树发芽种子灭菌的方法尤为重要。
发明内容
本发明目的是为了保持种子生命力，提高增殖率，全年无间断生产苗木，提供一种擎天树发芽种子的组培繁殖方法。
本发明的方案是通过这样实现的：
一种擎天树发芽种子的组培繁殖方法，其特征在于：包括预处理、灭菌、初代培养工序，主要操作步骤为：
（1）预处理：将擎天树发芽种子的种翅去掉，用清水冲洗种子后，再剥除种壳，置于30-35 ℃无菌水内浸洗2-5 min，得到种胚备用；
（2）灭菌：将备用种胚置于质量浓度0.8-0.9 ‰升汞溶液中浸泡，用30-35 ℃无菌水清洗5-8次，得到灭菌种胚待培养；
（3）初代培养：将灭菌种胚接种到初代培养基中作一次初代培养，接种3d后种胚开始分株，胚轴伸长，接种20-30 h有褐化物质产生时，将种胚转接到新的初代培养基中作二次初代培养，转接2-3次，得到长有两对真叶，顶芽并带有一对托叶的组培苗。
以上所述的浸泡的时间为2-5 min。
以上所述的初代培养基配方的体积浓度为：MS + 80-120 mg/L肌醇 + 8-10 g/L卡拉胶 + 2-3 mg/L 6-BA + 0.5-1.5 mg/L NAA + 5-15 mg/L VC + 15-45 g/L蔗糖，pH6.0-7.0。
以上所述的初代培养控制光照强度为1500-3000 lux，光照时间为10-15 h/d，温度为25±3 ℃。
以上所述的初代培养基配方的体积浓度为：MS + 100 mg/L肌醇 + 9 g/L卡拉胶 + 2.5 mg/L 6-BA + 1.0 mg/L NAA + 15 mg/L VC + 30 g/L蔗糖，PH6.6。
以上所述的初代培养的条件为：光照强度2000 lux，光照时间12 h/d，温度25℃。
本发明具备以下的优点和积极效果：
（1）本发明采用0.8-0.9‰升汞溶液对擎天树种胚进行灭菌，既可以有效地杀死附着在外植体表面的细菌及真菌芽孢，又能防止种胚中毒，保持外植体的生命力，获取优质的无菌外植体。
（2）本发明在初代培养阶段，在接种20-30 h有褐化物质产生时，将种胚转接到新的培养基中培养，转接2-3次的培养，能有效预防种胚褐化，提高培养繁殖成功率，枯死率3-10%，无菌率70-94 %。
（3）本发明通过对初代培养基和培养条件的优化，肌醇促进胚状体和芽的形成，缩短培养时间，提高培养效率，同时在培养基中添加VC可以有效防止培养过程中的褐化现象。
（4）本发明方法操作过程简便，条件温和，培养周期短，增殖率高，可满足全年无间断生产苗木的要求，具有较好的经济效益和社会效益。
附图说明
图1为擎天树种胚用0.9 ‰升汞灭菌后接种在初代培养基上的状况图。
图2为种胚胚芽伸长状况图。
图3为种胚长出一对真叶的状况图。
图4为种胚长出两对真叶的状况图。
具体实施方式
以下结合实施例描述本发明一种擎天树发芽种子的组培繁殖方法，这些描述并不是对本发明内容的限定。
实施例1
将擎天树发芽种子的种翅去掉，用清水冲洗后，再剥除种壳得到完整种胚；将种胚置于35℃无菌水内浸洗3 min，再将种胚置于质量浓度0.9 ‰升汞溶液中浸泡3 min，用35℃无菌水清洗7次，然后接种到含有体积浓度MS + 100 mg/L肌醇 + 9 g/L卡拉胶 + 2.5 mg/L 6-BA + 1.0 mg/L NAA + 10 mg/L VC + 30 g/L蔗糖，pH=6.6的初代培养基中培养，初代培养控制光照强度2000 lux，光照时间12 h/d，温度25℃，接种20-25 h有褐化物质产生时，将种胚转接到新的初代培养基中培养，转接3次，得到长有两对真叶，顶芽并带有一对托叶的组培苗。
本例培养繁殖成功率较高，枯死率3%，无菌率94%。
实施例2
将擎天树发芽种子的种翅去掉，用清水冲洗后，再剥除种壳得到完整种胚；将种胚置于30℃无菌水内浸洗2 min，再将种胚置于质量浓度0.8 ‰升汞溶液中浸泡2 min，用30℃无菌水清洗5次，然后接种到含有体积浓度MS + 80 mg/L肌醇 + 8 g/L卡拉胶 +2 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L NAA + 5 mg/L VC +15 g/L蔗糖，pH=6.0的初代培养基中培养，初代培养控制光照强度1500 lux，光照时间10h/d，温度22℃，接种25-30 h有褐化物质产生时，将种胚转接到新的初代培养基中培养，转接3次，得到长有两对真叶，顶芽并带有一对托叶的组培苗。
本例培养繁殖成功率较高，枯死率1%，无菌率88%。
实施例3
本实施例中擎天树发芽种子的组培繁殖方法如下：
将擎天树发芽种子的种翅去掉，用清水冲洗后，再剥除种壳得到完整种胚；将种胚置于32℃无菌水内浸洗4 min，再将种胚置于质量浓度0.8 ‰升汞溶液中浸泡4 min，用32℃无菌水清洗6次，然后接种到含有体积浓度MS + 90mg/L肌醇 + 10 g/L卡拉胶 + 3 mg/L 6-BA + 1.5 mg/L NAA + 7 mg/L VC +24g/L蔗糖，pH=6.3的初代培养基中培养，初代培养控制光照强度1800lux，光照时间13 h/d，温度23℃，接种20-23 h有褐化物质产生时，将种胚转接到新的初代培养基中培养，转接2次，得到长有两对真叶，顶芽并带有一对托叶的组培苗。
本例培养繁殖成功率较高，枯死率4%，无菌率80%。
实施例4
将擎天树发芽种子的种翅去掉，用清水冲洗后，再剥除种壳得到完整种胚；将种胚置于33℃无菌水内浸洗5 min，再将种胚置于质量浓度0.8 ‰升汞溶液中浸泡5 min，用33℃无菌水清洗8次，然后接种到含有体积浓度MS + 110 mg/L肌醇 + 8.5 g/L卡拉胶 + 2.8 mg/L 6-BA +1.2 mg/L NAA + 12 mg/L VC + 38g/L蔗糖，pH=6.8的初代培养基中培养，初代培养控制光照强度2500lux，光照时间14 h/d，温度27℃，接种24-28 h有褐化物质产生时，将种胚转接到新的初代培养基中培养，转接3次，得到长有两对真叶，顶芽并带有一对托叶的组培苗。
本例培养繁殖成功率较高，枯死率7%，无菌率75%。
实施例5
将擎天树发芽种子的种翅去掉，用清水冲洗后，再剥除种壳得到完整种胚；将种胚置于34℃无菌水内浸洗3 min，再将种胚置于质量浓度0.9 ‰升汞溶液中浸泡5 min，用34℃无菌水清洗7次，然后接种到含有体积浓度MS + 120mg/L肌醇 + 9.5 g/L卡拉胶 + 2.3 mg/L 6-BA + 0.8 mg/L NAA + 15 mg/L VC + 45 g/L蔗糖，pH=7.0的初代培养基中培养，初代培养控制光照强度3000 lux，光照时间15 h/d，温度28℃，接种26-30 h有褐化物质产生时，将种胚转接到新的初代培养基中培养，转接2次，得到长有两对真叶，顶芽并带有一对托叶的组培苗。
本例培养繁殖成功率较高，枯死率10%，无菌率70%。
对比例1
将擎天树发芽种子的种翅去掉，用清水冲洗后，再剥除种壳得到完整种胚；将种胚置于无菌水内浸洗5 min，再将种胚置于质量浓度1 ‰升汞溶液中浸泡8 min，用无菌水清洗6次，然后接种到含有体积浓度1/2 MS + IBA 0.3 mL/L + 6-BA 0.4 mL/L + 糖30 g + 琼脂5 g的初代培养基中培养，初代培养控制光照强度3000 lux，光照时间12 h/d，温度26℃，当有褐化物质产生时，将种胚转接到1/2 MS + 6-BA 0.4 mg/L + IBA0.3 mg/L + VC 0.2 mg/L + AC 0.5 g/L、1/2 MS + 6-BA0.4 mg/L + IBA 0.3 mg/L + VC 0.2 mg/L、1/2 MS + VC0.2 mg/L + PVP 2 g/L + AC 0.5 g/L的初代培养基中培养，得到长有一对真叶，顶芽并带有一对托叶的组培苗。
本对比例培养繁殖成功率较高，枯死率18%，无菌率65%。