说明书快速诱导繁殖盐生草幼根愈伤组织的方法
技术领域
本发明涉及一种植物愈伤组织诱导及培养的方法，尤其是一种盐生草幼根愈伤组织快速诱导及增殖的方法。
背景技术
愈伤组织的培养是植物组织培养过程中的一个重要阶段，愈伤组织是幼嫩的薄壁细胞，具有潜在的分化能力，可以进一步分化形成完整植株，通过愈伤的培养也可获得不同性质的愈伤组织，可为原生质体的分离，融合或遗传转化提供优质材料。盐生草(halogeton glomeratus)为藜科盐生草属一年生草本稀盐盐生植物，分布于甘肃西部、青海、新疆及西藏；蒙古、苏联、西伯利亚和中亚地区亦有，生长于山脚，戈壁滩，适合在沙漠中生长生存。盐生草是通过根系从周围环境吸收水分、高盐碱以及营养物质等供其生长利用，目前对盐生草根系的相关报道还比较少。当前急需一种以盐生草的幼根为外植体诱导愈伤并使其增殖的方法，通过人工控制环境条件来产生大量的愈伤组织，并进一步培养使其增殖，为盐生草根系耐盐性的研究提供技术支撑。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种快速诱导繁殖盐生草幼根愈伤组织的方法，该方法简单易行，能够高效快速的获得大量盐生草幼根愈伤组织。
以无菌培养获得的盐生草幼根为外植体，诱导愈伤组织发生，然后继代培养，使其增殖。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种快速诱导繁殖盐生草幼根愈伤组织的方法，其主要特点在于步骤如下：
(1)无菌外植体的获得：将盐生草种子置于超净工作台，首先用无菌水清洗种子，然后用75％的酒精处理0.5-1min，紧接着用无菌水将种子表面的酒精清洗干净，再用 20％的次氯酸钠处理1.5-2min,最后用无菌水将种子表面的次氯酸钠清洗干净，获得盐生草无菌种子，将灭菌后的种子放置于培养无菌实生苗的培养基中培养10-15d，获得无菌实生苗的根系作为诱导愈伤的外植体；
(2)愈伤组织诱导：将步骤(1)获得的无菌实生苗幼根组织横切为约0.3-0.5cm长的小段作为诱导愈伤的材料，接种于诱导愈伤组织培养基上培养10-15d，诱导愈伤发生；
(3)愈伤组织增殖培养：将步骤(2)获得的颜色浅白，质地疏松的愈伤组织切割成直径约0.1-0.3cm的小块，然后转接到诱导愈伤组织增殖培养基中，培养10-15d后继续转接到新的诱导愈伤组织增殖培养基中进行继代增殖，最终获得颜色嫩白，结构致密的优良愈伤组织材料。
所述的一种快速诱导繁殖盐生草幼根愈伤组织的方法，步骤(1)中所述的培养无菌实生苗的培养基由1/2Hoagland-Hoagland完全营养液，6-8g/L的琼脂粉组成，PH＝5.7-5.8。
所述的一种快速诱导繁殖盐生草幼根愈伤组织的方法，步骤(2)中所述的诱导愈伤组织培养基由1/2MS-MS营养液，1.0-2.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，5-7g/L琼脂，20-30g/L蔗糖，0.05-0.1g肌醇组成，PH＝5.7-5.8。
所述的一种快速诱导繁殖盐生草幼根愈伤组织的方法，步骤(3)中所述的诱导愈伤组织增殖培养基由1/2MS-MS营养液，1.0-2.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，5-7g/L琼脂，20-30g/L蔗糖，0.05-0.1g肌醇组成，PH＝5.7-5.8。
所述的一种快速诱导繁殖盐生草幼根愈伤组织的方法，所述的步骤(1)、(2)、(3)实生苗培养、幼根愈伤诱导和愈伤增殖均在连续光照培养，光照强度在1500-2000lx之间，湿度60-70％的环境下进行。
所述的一种快速诱导繁殖盐生草幼根愈伤组织的方法，步骤(1)中培养10-15d的幼苗根部幼嫩，且具备主根，侧根与根毛。
所述的一种快速诱导繁殖盐生草幼根愈伤组织的方法，所述产生的愈伤组织质嫩，并且可通过称量法测定愈伤组织的生长量。
本发明的有益效果如下：
1.以盐生草培养10-15d的无菌实生苗根部为取材对象，保证了材料的无菌，杜绝了由材料带菌或灭菌不彻底造成的组培污染。
2.盐生草培养10-15d的无菌实生苗根部幼嫩，且具备主根侧根与根毛，为根系的系统性研究奠定基础。
3.以无菌实生苗幼根组织为诱导愈伤的材料，能够高效地诱导愈伤组织的生成。
4.愈伤的诱导与继代培养所产生的愈伤组织质嫩，并且也可以通过称量法测定愈伤组织的生长量，同时能有效解决根部木质化的问题。
5.愈伤的诱导与继代培养所用培养基均以2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)为外源激素，实生苗培养、幼根愈伤诱导和愈伤增殖均在同一环境下进行，效果良好。实现了简单、易行、高效获得盐生草幼根愈伤组织的目标。
附图说明：
图1.本发明所用的无菌实生苗；
图2.本发明所剪切的盐生草实生苗根部组织；
图3.本发明根部组织培养15d后所得盐生草幼根愈伤组织；
图4.本发明盐生草幼根愈伤组织继代繁殖后的愈伤组织。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下面对本发明的内容进行详细的说明。
实施例1：一种快速诱导及繁殖盐生草幼根愈伤组织的方法，将盐生草种子置于超净工作台，首先用无菌水清洗种子，然后用75％的酒精处理0.5-1min，紧接着用无菌水将种子表面的酒精清洗干净，再用20％的次氯酸钠处理1.5-2min,最后用无菌水将种子表面的次氯酸钠清洗干净，获得盐生草无菌种子，将灭菌后的种子放置于培养无菌实生苗的培养基中培养10-15d，获得无菌实生苗的根系作为诱导愈伤的外植体，培养基主要由1/2Hoagland营养液+8g/L的琼脂粉组成，PH＝5.8；将无菌实生苗幼根横切为约0.5cm的小段作为诱导愈伤的材料，接种于诱导愈伤组织培养基上培养15d，诱导愈伤的发生，将获得的颜色嫩白，质地疏松的愈伤组织切割成小块，然后转接到增殖培养基，培养15d后继续转接到新的培养基继代增殖。诱导愈伤组织及继代繁殖所用培养基主要由1/2MS营养液+2.0mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)+7g/L琼脂+30g/L蔗糖+0.1g/L肌醇组成，PH＝5.8，愈伤诱导和愈伤繁殖均为连续光照培养，光照强度在1500-2000lx之间， 湿度70％的环境下进行。
结果：诱导愈伤率100％，诱导愈伤嫩白色，无褐变；在继代增殖过程中，愈伤组织生长迅速，最终愈伤组织呈现白色。
实施例2：一种快速诱导及繁殖盐生草幼根愈伤组织的方法，将盐生草种子置于超净工作台，首先用无菌水清洗种子，然后用75％的酒精处理0.5-1min，紧接着用无菌水将种子表面的酒精清洗干净，再用20％的次氯酸钠处理1.5-2min,最后用无菌水将种子表面的次氯酸钠清洗干净，获得盐生草无菌种子，将灭菌后的种子放置于培养无菌实生苗的培养基中培养10-15d，获得无菌实生苗的根系作为诱导愈伤的外植体，培养基主要由Hoagland营养液，6g/L的琼脂粉组成，PH＝5.7；将无菌实生苗幼根横切为约0.5cm的小段作为诱导愈伤的材料，接种于诱导愈伤组织培养基上培养10d，诱导愈伤的发生；将获得的颜色嫩白，质地疏松的愈伤组织切割成小块，然后转接到增殖培养基，培养10d后继续转接到新的培养基继代增殖。诱导愈伤组织及继代繁殖所用培养基主要由MS营养液+1.0mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)+7g/L琼脂+20g/L蔗糖+0.1g/L肌醇组成，PH＝5.8，愈伤诱导和愈伤繁殖均为连续光照培养，光照强度在1500-2000lx之间，湿度60％的环境下进行。
结果：诱导愈伤率100％，诱导愈伤嫩白色，无褐变；在继代增殖过程中，愈伤组织生长迅速，最终愈伤组织呈现白色。
实施例3：
一种快速诱导及繁殖盐生草幼根愈伤组织的方法，将盐生草种子置于超净工作台，首先用无菌水清洗种子，然后用75％的酒精处理0.5-1min，紧接着用无菌水将种子表面的酒精清洗干净，再用20％的次氯酸钠处理1.5-2min,最后用无菌水将种子表面的次氯酸钠清洗干净，获得盐生草无菌种子，将灭菌后的种子放置于培养无菌实生苗的培养基中培养10-15d，获得无菌实生苗的根系作为诱导愈伤的外植体，培养基主要由1/2Hoagland营养液+6g/L的琼脂粉组成，PH＝5.8；将无菌实生苗幼根横切为约0.5cm的小段作为诱导愈伤的材料，接种于诱导愈伤组织培养基上培养10d，诱导愈伤的发生，将获得的颜色嫩白，质地疏松的愈伤组织切割成小块，然后转接到增殖培养基，培养10d后继续转接到新的培养基继代增殖。诱导愈伤组织及继代繁殖所用培养基主要由MS营养液+1.5mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)+7g/L琼脂+25g/L蔗糖+0.1g/L肌醇组成，PH＝5.8，愈伤诱导和愈伤繁殖均为连续光照培养，光照强度1500-2000lx之间，湿度70％的环境下进行。
结果：诱导愈伤率100％，诱导愈伤嫩白色，无褐变；在继代增殖过程中，愈伤组织生长迅速，最终愈伤组织呈现白色。
试验例：
在盐生草幼根愈伤组织诱导及增殖过程中，外源诱导激素的选择与配比对愈伤组织的诱导及增殖起到了关键作用，本试验通过对激素的选择与配比进行优化，最终确定了最佳的盐生草幼根愈伤组织诱导及其增殖的方法。
1.外源激素种类的选择
选择常用诱导愈伤组织的3种外源激素，设置六个处理，分别为处理A(0.1mg/L6-BA+1.0mg/L NAA)，处理B(0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA)，处理C(1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA)，处理D(1.0mg/L 2,4-D)，处理E(1.0mg/L NAA),处理F(1.0mg/L 6-BA)，其中6-BA是6-苄氨基嘌呤，NAA是萘乙酸，2,4-D是2,4-二氯苯氧乙酸。所用的基础培养基是MS培养基，30g/L蔗糖，6g/L琼脂，0.1g/L肌醇，PH＝5.8。将培养15d实生苗的幼根组织接种于以上六种不同诱导培养基中，3次重复，每瓶接种8块，连续光照培养10-15d，观察诱导愈伤组织情况。结果发现：处理A，B，C，E，F均无愈伤组织产生，且产生白色絮状物，处理D诱导愈伤率高达100％，且全为嫩白色的愈伤组织。因此，确定2,4-D是最佳的诱导幼根愈伤组织的外源激素。
然后选择使愈伤增殖的3种外源激素，设置六个处理，分别为处理A(0.1mg/L6-BA+1.0mg/L NAA)，处理B(0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA)，处理C(1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA)，处理D(1.0mg/L 2,4-D)，处理E(1.0mg/L NAA),处理F(1.0mg/L 6-BA)，其中6-BA是6-苄氨基嘌呤，NAA是萘乙酸，2,4-D是2,4二氯苯氧乙酸。所用的基础培养基是MS培养基，30g/L蔗糖，6g/L琼脂，0.1g/L肌醇，PH＝5.8。在诱导愈伤培养基上生长10-15d的愈伤组织转接至以上六种不同激素处理的增殖培养基中，3次重复，每瓶转接8块，连续光照培养10-15d，观察愈伤组织的增殖情况，结果发现：处理A，B，C，E，F愈伤增值不明显，并随着培养时间的延长，愈伤组织颜色逐渐变黑；处理D愈伤组织明显增大，且全为嫩白色的愈伤组织。因此，确定2,4-D是最佳的幼根愈伤组织增殖的外源激素。
2.外源激素用量的选择
通过试验1优选出适合诱导盐生草幼根愈伤组织的外源激素，在此基础上，继续对2,4-D用量进行优化，设处理A(1mg/L)、处理B(2mg/L)和处理C(4mg/L)3个梯度，所用基础培养基是MS培养基，30g/L蔗糖，6g/L琼脂，0.1g/L肌醇，PH＝5.8。 将培养15d实生苗的幼根组织接种于以上三种不同诱导培养基中，3次重复，每瓶接种8块，连续光照培养10-15d，观察诱导愈伤组织情况。结果发现：处理A，B，C愈伤诱导率均为100％，处理A、B愈伤组织嫩白，结构质密，处理C部分愈伤组织松散且呈现红色。
然后，在优选出最佳盐生草幼根诱导愈伤组织2,4-D用量的基础上，继续对幼根愈伤组织增殖培养基中2,4-D用量进行优化，设处理A(1mg/L)、处理B(2mg/L)和处理C(4mg/L)3个梯度，所用基础培养基是MS培养基，30g/L蔗糖，6g/L琼脂，0.1g/L肌醇，PH＝5.8。在诱导愈伤组织培养基上生长10-15d的愈伤组织转接至以上三种不同的2,4-D用量的增殖培养基中，3次重复，每瓶转接8块，连续光照培养10-15d，观察愈伤组织的增殖情况，结果发现：处理A，B明显增殖，并且愈伤组织嫩白，结构质密。处理C愈伤组织松散，并且组织变红，随着培养时间的延长，红色加深。
综上所述，故确定外源激素2,4-D是盐生草幼根愈伤组织诱导及增殖的最适激素配比，同时1-2mg/L 2,4-D是诱导盐生草幼根愈伤组织最适的激素用量，1-2mg/L 2,4-D是盐生草幼根愈伤组织增殖的最适激素用量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。