说明书一种波叶红果树离体培养再生体系的建立方法
技术领域
本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种波叶红果树离体培养再生体系的建立方法。
背景技术
波叶红果树（S. Davidiana var. undulata.）为蔷薇科红果属常绿矮小灌木。其花瓣为白色，果实桔红色，秋季叶色朱红，红叶期持续达一个月之久,果实冬季经久不落,成为我国目前观赏类观花、观叶、观果花灌木中无可比拟的珍贵树种之一。在我国广西、四川、江西、浙江、陕西、湖南、湖北等省区均有分布，主要生于海拔1300～1900m 的山坡、山顶、河谷及灌丛中。
目前，波叶红果树种苗繁育主要通过种子繁殖、扦插繁殖等方式进行，存在周期长，效率低，成本高等问题，不能适应规模化和标准化生产的需要，因此有必要构建波叶红果树离体培养再生体系。在短时间内快速扩大繁殖材料,保护植物资源,并为今后实现波叶红果树的工厂化和商业化生产奠定理论和技术基础。波叶红果树离体培养再生体系的建立,可以增加园林绿化材料,解决材料来源匮乏的问题,并为深度开发提供技术支撑。因此，本发明以波叶红果树种子为外植体，通过播种、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等过程获得了波叶红果树离体再植株，建立波叶红果树离体培养再生体系，提高繁殖效率，有利加快其繁育及推广。
发明内容
本发明的目的在于提供出一种波叶红果树离体培养再生体系的建立方法，本本发明以波叶红果树种子为外植体，通过播种、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等过程获得了波叶红果树离体再植株，建立波叶红果树离体培养再生体系，从而实现了本发明的目的。
本发明的一种波叶红果树离体培养再生体系的建立方法，包括以下的步骤：
（1）种子无菌播种：将种子从果实中剥离出来置于烧杯中,用自来水清洗干净,置于自来水下冲洗1～3h,再用蒸馏水冲洗3～5次。将冲洗干净的种子置于超净工作台上,用75%乙醇浸泡5～15s,0.1%HgCl2浸泡消毒5～15min,最后用无菌水冲洗 4～5次。经消毒后的种子在无菌培养皿中剥去种皮,则得到成熟种胚,将种胚接种种子萌发培养基中。接种后先黑暗条件下培养，待种子萌发后再移至置于每天光照12～14小时，光照强度为1000～2000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计发芽率。
（2）增殖培养：待步骤（1）无菌材料在种子萌发培养基中生长30天后，切取2～3cm的茎段并转接至增殖培养基进行扩繁。接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计丛生芽增殖系数。
（3）生根培养：将增殖培养得到的无菌材料，切取2～3cm的茎段并转入生根培养基中。接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计生根情况。
（4）炼苗移栽：试管苗生根20天后，具备发达健壮的根时将组培苗不揭瓶盖在自然光下炼苗7天。移栽时用镊子从瓶中取出组培苗,小心洗净基部残留的培养基,选择健壮苗移栽到消过毒的轻基质中，浇足水,遮荫处理。移栽后经常喷水,保持空气湿度。植株成活后转入正常土壤中定植。
上述步骤（1）所述的种子萌发培养基为：MS+0.5～2.0mg/L 6-BA+ NAA+25～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
上述步骤（2）所述的增殖培养基为：MS+0.05～0.2mg/LTDZ+1.0～3.0mg/LNAA+25～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
上述步骤（3）所述的生根培养基为：1/2MS+0.1～0.3mg/LNAA+0.01～0.1mg/LIAA+20～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
本发明的优点是：以波叶红果树种子为外植体，通过播种、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等过程获得了波叶红果树离体再植株，建立波叶红果树离体培养再生体系，提高繁殖效率，有利加快其繁育及推广。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1
（1）种子无菌播种：将种子从果实中剥离出来置于烧杯中,用自来水清洗干净,置于自来水下冲洗1h,再用蒸馏水冲洗3次。将冲洗干净的种子置于超净工作台上,用75%乙醇浸泡5s,0.1%HgCl2浸泡消毒5min,最后用无菌水冲洗 4次。经消毒后的种子在无菌培养皿中剥去种皮,则得到成熟种胚,将种胚接种种子萌发培养基中。接种后先黑暗条件下培养，待种子萌发后再移至置于每天光照12小时，光照强度为1000lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后发芽率达到100%。所述的种子萌发培养基为：MS+1.5mg/L 6-BA+ NAA+25g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.5。
（2）增殖培养：待步骤（1）无菌材料在种子萌发培养基中生长30天后，切取2～3cm的茎段并转接至增殖培养基进行扩繁。接种后置于每天光照12小时，光照强度为2000lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后丛生芽增殖系数达到6.8。所述的增殖培养基为：MS+0.08mg/LTDZ+1.5mg/LNAA+25g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.5。
（3）生根培养：将增殖培养得到的无菌材料，切取2～3cm的茎段并转入生根培养基中。接种后置于每天光照12小时，光照强度为2000lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天生根达到93.6%。所述的生根培养基为：1/2MS+0.1mg/LNAA+0.01mg/LIAA+20g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.5。
（4）炼苗移栽：试管苗生根20天后，具备发达健壮的根时将组培苗不揭瓶盖在自然光下炼苗7天。移栽时用镊子从瓶中取出组培苗,小心洗净基部残留的培养基,选择健壮苗移栽到消过毒的轻基质中，浇足水,遮荫处理。移栽后经常喷水,保持空气湿度。植株成活后转入正常土壤中定植，定植成活率达到90%以上。
实施例2
（1）种子无菌播种：将种子从果实中剥离出来置于烧杯中,用自来水清洗干净,置于自来水下冲洗2h,再用蒸馏水冲洗4次。将冲洗干净的种子置于超净工作台上,用75%乙醇浸泡10s,0.1%HgCl2浸泡消毒8min,最后用无菌水冲洗 5次。经消毒后的种子在无菌培养皿中剥去种皮,则得到成熟种胚,将种胚接种种子萌发培养基中。接种后先黑暗条件下培养，待种子萌发后再移至置于每天光照13小时，光照强度为1500lx，置于培养温度为28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后发芽率达到98.5%。所述的种子萌发培养基为：MS+2.0mg/L 6-BA+ NAA+30g/L蔗糖+4.5g/L琼脂，pH为5.6。
（2）增殖培养：待步骤（1）无菌材料在种子萌发培养基中生长30天后，切取2～3cm的茎段并转接至增殖培养基进行扩繁。接种后置于每天光照13小时，光照强度为2500lx，置于培养温度为26℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后丛生芽增殖系数达到7.3。所述的增殖培养基为：MS+0.1mg/LTDZ+1.8mg/LNAA+28g/L蔗糖+4.5g/L琼脂，pH为5.6。
（3）生根培养：将增殖培养得到的无菌材料，切取2～3cm的茎段并转入生根培养基中。接种后置于每天光照13小时，光照强度为2500lx，置于培养温度为26℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天生根达到94.8%。所述的生根培养基为：1/2MS+0.2mg/LNAA+0.03mg/LIAA+25g/L蔗糖+4.5g/L琼脂，pH为5.6。
（4）炼苗移栽：试管苗生根20天后，具备发达健壮的根时将组培苗不揭瓶盖在自然光下炼苗7天。移栽时用镊子从瓶中取出组培苗,小心洗净基部残留的培养基,选择健壮苗移栽到消过毒的轻基质中，浇足水,遮荫处理。移栽后经常喷水,保持空气湿度。植株成活后转入正常土壤中定植，定植成活率达到95%以上。