水稻低温强诱导启动子POSCOLD6的克隆及应用.pdf

本发明公开一种水稻低温强诱导启动子POscold6的克隆及应用。本发明还提供了含有该启动子的表达盒、植物表达载体、宿主菌和转化子并将其应用于植物基因工程中。本申请的发明人通过对水稻品种日本晴的特定基因组进行扩增、分离、分析、利用以及实验验证，从而获得并验证了具有特殊功能的一段DNA序列——水稻低温强诱导启动子POscold6。本发明提供的启动子能够特异地驱动外源基因在低温/冷胁迫条件下在植物中表达，因此在基因工程中用该启动子替代组成型启动子驱动抗寒基因，既可以有效的提高低温下转基因植物的耐寒性，又将避免常温下抗寒基因的无效表达，从而达到对抗寒基因的最佳利用。

权利要求书1.  一种水稻低温强诱导启动子POscold6，其特征在于，所述水稻低温强诱导启动子POscold6包含：1)序列表中SEQ ID No：1所示的DNA序列；或者2)在严格条件下与1)中的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA序列；或者3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上的同源性，且具有启动子功能的DNA序列；或者4)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中添加、缺失或取代一个或多个核苷酸后所获得的具有启动子功能的核苷酸序列。2.  根据权利要求1所述的水稻低温强诱导启动子POscold6，其特征在于，所述水稻低温强诱导启动子POscold6提取自日本晴水稻。3.  一组扩增权利要求1所述DNA片段或其部分片段的引物对。4.  一种含有权利要求1所述DNA片段的重组载体或表达盒。5.  一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为在植物表达载体pCAMBIA1391的多克隆位点插入权利要求1所述的DNA片段得到的重组质粒，在所述重组表达载体中，所述植物冷诱导强表达启动子POscold6连接于载体中待表达的基因序列的上游。6.  根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述待表达基因为耐寒基因。7.  一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1中任意一项所述的水稻低温强诱导启动子POscold6。8.  一种宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含权利要求1中任意一项所述的水稻低温强诱导启动子POscold6、权利要求4所述的重组表达载体、或权利要求5所述的表达盒，其中，所述宿主菌为根癌农杆菌。9.  一种转化子，其特征在于，所述转化子包含权利要求1中任意一项所述的水稻低温强诱导启动子POscold6、权利要求5或6所述的重组表达载体、或权利要求7所述的表达盒、或者权利要求8所述的宿主菌。10.  一种根据权利要求1中任意一项所述的水稻低温强诱导启动子POscold6在培育转基因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将根据权利要求1中任意一项所述的水稻低温强诱导启动子POscold6连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到水稻细胞、组织或器官中进行培育，优选地，所述待表达基因为耐寒基因。

说明书水稻低温强诱导启动子POscold6的克隆及应用
技术领域
本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种水稻低温强诱导启动子POscold6的克隆及应用，该启动子能够特异地驱动外源基因在低温/冷胁迫条件下在植物中表达。
背景技术
水稻是重要的粮食作物，冷害是影响水稻生产的重要限制因子之一。芽期、苗期和孕穗开花期遭遇冷害，将导致水稻幼苗生长迟缓、分蘖减少，最终造成水稻产量的大幅度降低。另外，温度也是影响水稻籽粒品质的一个重要的环境因素。因此，解决水稻冷害问题对于世界食物安全、促进水稻产区的经济发展具有十分重要的现实意义。
随着分子生物学和基因组学的发展，现代生物技术开始广泛用于水稻等粮食作物的遗传改良。仲康等(2007)将锌指蛋白类似蛋白OsCOIN基因在水稻中过量表达使转基因水稻中脯氨酸含量升高，提高植物的耐冷性。张红生等(2009)将水稻锌指蛋白ZFP245基因在水稻中过量表达，发现超量表达ZFP245基因水稻在冷胁迫下使脯氨酸积累相关基因OsP5CS和脯氨酸转运基因OsProT基因的表达量提高，促使脯氨酸的量增加，增强植物的耐冷性。余淑美等(2010)发现MYBS3超量表达水稻能在4℃下处理以后可以存活，且不影响其主要农艺性状。另外，对一些包括DREB/CBF、NAC等转录因子的过量表达可以提高水稻的耐冷性。
目前已有部分冷诱导启动子的报道，如拟南芥PCBF3等。但这些启动子虽然可以较为特异的响应环境低温胁迫诱导，但或多或少的存在本底表 达泄露、诱导后强度不足支撑功能基因充分发挥抗冷作用等缺陷。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种分离鉴定本底信号低、诱导倍数高、诱导后高表达的新型冷诱导启动子，这种启动子对作物基因工程将有着重要的意义。
为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种水稻低温强诱导启动子POscold6，水稻低温强诱导启动子POscold6包含1)序列表中SEQ No：1所示的DNA分子；或者2)在严格条件下与1)中的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；或者3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上的同源性，且具有启动子功能的DNA分子。2)和3)中植物冷诱导强表达启动子序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列具有相同的功能，即驱动目标基因在植物中表达。
序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)的水稻冷诱导强表达启动子，本文中称为POscold6或启动子POscold6。具体而言，本申请的发明人发现日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)基因上游包括转录起始位点在内的2047bp的DNA序列，具有驱动目标基因在寒冷条件下特异性表达的功能，并且分离克隆、并鉴定了该DNA序列的功能。
优选地，本发明提供的水稻低温强诱导启动子POscold6的DNA序列为SEQ ID No:1所示的序列，即POscold6或启动子POscold6。
另一方面，本发明还提供一种包含上述水稻低温强诱导启动子POscold6的表达盒。
又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的水稻低温强诱导启动子POscold6，在所述重组表达载体中，所述水稻低温强诱导启动子POscold6连接于待表达的基因序列的上游；优选的， 所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-POscold6，该重组表达载体为将SEQ ID No:1所示的序列即POscold6或启动子POscold6构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-POscold6。
在一种优选实现方式中，所述待表达基因为对作物的耐寒性具有改善功能的基因。通过本发明的启动子驱动该耐寒基因在寒冷条件下表达，从而实现改善作物耐寒性状的功能。
另一方面，本发明还提供一种宿主菌，所述宿主菌包含本发明提供的上述水稻低温强诱导启动子POscold6、上述表达盒、或上述重组表达载体；优选地，所述宿主菌为根癌农杆菌。
另一方面，本发明提供一种转化子，所述转化子包含本发明提供的上述植物冷诱导强表达启动子、上述表达盒、上述重组表达载体、或上述宿主菌。其中，所述转化子优选为转基因细胞系、愈伤组织或植株。
再一方面，本发明提供上述植物冷诱导强表达启动子在培育转基因植物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述植物冷诱导强表达启动子连接于载体的待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列插入目标基因之前)，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。
并且优选地，所述应用可以用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优选为水稻。
本发明中所提供的启动子的DNA序列为(与序列表中SEQ ID No:1中相同)：
TGTTTAGATACAAAGATGGACTGGTAGCTACCACACTACAGGACGGAACAGAATGCATAATTCACAAAGGGTAGCCCCCCATGCATGTACGTAATTGTCCTTTGCCTGCGAGAAAATATCCTGTCAAATCGCACTATAACATTTTAATATTGTGCATTGCATATTCGTTT CACAGAATGCTACTACTACTGATCAAAGGCCAAGTTTCATTTGTTCTCTTACGTGAAGCATGAGTTTGTACACACATACATGTAGCCTGTTGGTAGCTTGGGCCGGTACACTGATAATGCCGTCATAATTGAACGAGAACAAGCGATCAATATCCTCCCCTGCCGGCAGCATGGCGCGTTGCAAACGTCTAGAAGGCAATGGCCTCATCTGCGATGACCGATGAAGAAATAGGTTGAGTATACGTTTATAACGCAGCTCATTCGAAAGTTGTGTGAGATTCAGATTCAGCATCACAACTGTTAGACTATATTACGAAATGCCTGCCACTCCTTTTACATTATATTGTATACTAATATAGAGCCTCTTTTACATTTGCTCATAGCGATGAGGATACGTTGGATTAAGAATGAACGCAAATGATGGTTCCGTGCCACTTGTCCTTTTGCTTGCATGGAGTCAGGAAGAGATTAGGAACAACCGAACAAGAGGGTATTTTCAATGGTCCACGTGTCCAGAAACCATGGCAGATATTTTGTTACTAATAGTTTCCACAGTAGACTACTACTACACCTCCTCAGCGTCCTTCCCTAATACACATATACTAGTAGTATTCAGTTTCGAGTTGAAAGATTTTTTGACGGGATGAGTTGAACGACTGAATTTGGATTTGATGAATAAGAGATGAATTGAAGCACACCCTCACAGCTGTCCCATCACATGCAAAGGTCAACCTGTAGATCTGAATGCACATGCCTTTGAATTTCTGATTAAGATGTTAACCTACTACTAGAACTGCTACCATCCGATCTTTTTTTGCCCGAATCAAAAAAGAGAGAAAAGAGAAAAAAATATGCTTTTATTTTTCTCAGAAGAAAAAAAGAGGGGTAGAGCTGCATGCGCACGACCATTTCGCGACGGACTAACGGTTTGTTCAACACCTGTCATTCCCATCATGAGCAGGTTAAGCATTTCGGCACGCATTCCTACTTTGCAACCTGCTTTAGCTAGCCGCGGTCAGTGATACCGGCAAAAATTCCCAAGTGATGTTTACTTCGAAAAAATAGATTATTCACGCATCAATAAATCATAAAATGAGTATCTTACGATGGACTCAGGAACAATCGGTAGATGTGTTTACCGACAAAAAGAAAAAAAAAACACCGCCGCACCGGACACCAAGTAATTAAGCAGAACAGTGTTCAGGCCAGTATGATGGCTGGTTGGGGATGATCAGAGGAAGCGGCCAAAGGAGAGCAGCATTATAGGAGCAGGAGCAGGAGCAGGAGCAGCAGCAGCTGCTGCCGGGGCAGTACGTAGTACGTACGAGAGCGCGTACAGTAGCTGATGGTGTGGAAACAGGGCGGAAAGGGAGAGGTGAGCTGGAGAAA GGGATGATTCTCTCGCGCGCTGGCCAGAAGAGAAGAGAGGCCCATTTAGCTATCACTGTATTGGTTAACCGGTTTAACCGATCAGTTGATTAATCCGGCTCTCTCGCCCGCACGCCTTTTTCCCTTTATTTCCGTATTGATTGCGCAATTATTCGGCAGCGTCTATCTGTCTCTCTCGCGCGCGGAGGCACCCAGCTCGGCTATTCTAGCGCGTAGTGGTGGTGCTAGCTACTAGTAGTAGTAGATTTTTGGGCAGCAAGCGGCCGCAGAAAAGGAGAGCGAAACGGAGGAGAAACCGGGAAACTCAGCTCGCGGCCAATCTATAAATAGCTGCCACCCCTCTCGCCTTTCCCTCCACACCCCCCCCAACAACACCACCGCCCATTTCCCTTTCTCTTCCTCTTCTTCTTCCTTCTCCTCCTACTCCTCTGCGATTGACAAAGA
需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表示的序列“TCATATTCCTCATAGATAAACT”为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp；序列末尾以斜体并加粗表示的序列“TAAGTGAAGTGAGCAGGCGCCA”为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)，共计22bp；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要说明的是，即便本领域技术人员在本发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发明的保护范围之内。
综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)基因上游包括转录起始位点在内的2047bp的DNA序列，并将其命名为POscold6。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行Gus表达定量检测 发现，转基因植株在低温诱导处理后，整体上的Gus基因表达水平提高，从而证明该2047bp的序列具有驱动基因表达的活性，而且该启动子驱动的Gus基因在水稻低温诱导处理后表达。
本发明所述的低温强诱导启动子POscold6可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组植物表达载体，经转化后，在低温诱导处理后可驱动靶标基因在植株中特异性表达，从而提高外源靶标基因在植物中的表达量，增加转基因的效果。
技术效果
本发明所克隆的水稻启动子POscold6能够调控基因在植株中在预定条件下集中表达，在实际应用中具有重要意义。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动子驱动目标基因在植株中表达，可以提高和改善水稻的生长特性，尤其是耐寒特性，从而培育出实用有效的耐寒植物品种。
本发明将加深对植物耐冷分子机理的认识，并且对解决水稻冷害问题、促进水稻产区经济发展作用重大。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为将POscold6启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A为pCAMBIA1391示意图，图1中B为pCAMBIA1391-Poscold6示意图，其中示出了利用POscold6启动子驱动位于其下游的Gus基因表达；
图2为对本发明启动子进行酶切验证的结果示意图；
图3为6周苗龄的POscold6::GUS转基因植株组织染色图。在30℃条件下正常生长的水稻植株，经24小时染色后，根、茎、叶均无Gus活性，而在4℃冷处理24小时后，再经过30min染色后，在根、茎、叶中均有Gus 强烈表达。(标尺＝10mm)
图4为冷处理0h、8h、24h后POscold6与作为对照的POsDREB1a的相对表达量的变化。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
含有酶切位点的POscold6启动子的获得
步骤1、引物的设计
根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻POscold6基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。
本实验例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391(来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物(SEQ ID No:2)5’端带HindIII，酶切位点(AAGCTT)，反向引物(SEQ ID No:3)5’端带EcoRI，酶切位点(GAATTC)，引物序列如下：
正向引物：AAGCTTTCATATTCCTCATAGATAAACT HindIII
反向引物：GAATTCTGGCGCCTGCTCACTTCACTTA EcoRI
由深圳华大基因公司合成。
步骤2、启动子POscold6的获得
以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：
95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s， 循环35次；最后72℃延伸10min。
回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度2047bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照冷激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆菌液提质粒，用HindIII和EcoRI进行双酶切验证，如图3所示。将经过鉴定的阳性克隆送并Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。
植物表达载体的构建和农杆菌的转化
从上面“启动子的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用HindIII和EcoRI酶切，回收启动子POscold6片段。同时利用HindIII和EcoRI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的POscold6片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子POscold6与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391-POscold6，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)。
利用启动子POscold6驱动Gus报告基因在水稻中表达
步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化
成熟种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌的转化。
采用上述“植物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，获得POscold6::gus转基因水稻植株，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan,Chenguang Zhai,et al.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based on phOsphomannOse isomerase pOsitive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report,2012.DOI10.1007/s00299-01201275-3.)等提出的方法。
步骤2、POscold6-pCAMBIA1391植株的冷胁迫处理和POscold6的冷响应活性
从转基因植株POscold6-pCAMBIA1391植株和作为对照的PActin-pCAMBIA1391植株(来自于美国康奈尔大学，由目前基因工程中常用的组成型启动子水稻PActin驱动GUS基因，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)中，挑选4个的T2种子用于启动子活性鉴定。将萌发后6周龄苗分别置于4℃下24h进行冷胁迫处理，用于对照的材料则置于30℃正常生长环境下作为对照。
Gus染色：取4℃下24h进行冷胁迫处理的材料，将其根、茎、叶分别染色并拍照。结果显示在4℃的冷诱导24小时的条件下，根、茎、叶均能被染成明显可见的蓝色(图3)，说明该启动子在4℃处理24小时时可驱动GUS基因强烈表达。
Gus定量：取处理0h、8h、24h的全株材料作为样本，使用天根生化科技有限公司的植物总RNA提取试剂盒提取样品总RNA，再使用天根生长科技有限公司的Fastquant RT试剂盒反转录为cDNA，以cDNA为模板，以ACTIN基因为内参，以天根生化科技有限公司的SuperReal PreMix Plus实时荧光定量PCR预混液为反应试剂，在ABI公司的PRISM7500荧光PCR 仪上，通过qRT-PCR反应检测POscold6和PActin启动子驱动的Gus表达强度。其中，用于标定ACTIN基因的定量qRT-PCR引物为：
ACTIN上游引物：5’-CCTTCAACACCCCTGCTATG-3’,
ACTIN下游引物：5’-CAATGCCAGGGAACATAGTG-3’
用于检测GUS基因表达的qRT-PCR引物为：
Gus上游引物：5’-TACGGCAAAGTGTGGGTCAATAATCA-3’
Gus下游引物：5’-CAGGTGTTCGGCGTGGTGTAGAG-3’
结果显示，在没有冷诱导时，POscold6-pCAMBIA1391植株中Gus基因的表达量仅为对照材料POsDREB1a(一种冷诱导启动子)驱动Gus活性的四分之一，而随着冷处理，POscold6表达活性显著提高，在冷处理24小时后，POscold6的表达活性达到未处理时的两百多倍，同时也远远高于POsDREB1a的表达量，结果见图4。该结果表达POscold6是一种低本底、冷响应灵敏且诱导强度高的冷诱导启动子。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。