淀粉衍生物、淀粉活性物质结合物、其制备方法 及其作为药物的应用 本发明涉及淀粉衍生物、这种淀粉衍生物与活性物质的结合物及其制备方法。本发明进一步涉及淀粉/活性物质结合物作为药物的应用。
药物活性物质如治疗性蛋白、抗生素、核酸、细胞因子和激素与聚乙二醇衍生物共轭(“聚乙二醇化”)是广泛应用的方法(Francis G.E.等人，Polyethylene glycol modification in tumour targeting and cytokinetherapy，J.Drug Targeting(1995)，3：321-340)。从而使例如本身为水不溶性的活性物质转变为水溶性衍生物，其可施用到血流中。
另外，有可能通过与聚乙二醇衍生物偶联增加所述活性物质的分子量，以使其不再可能经由肾脏滤过，即，克服了所谓的肾脏屏障，从而使得这种衍生物与未共轭的活性物质相比，他们的血浆半衰期显著地延长。此外，与聚乙二醇衍生物偶联还有可能降低例如非人源的蛋白质的抗原性，否则当给予所述物质时会产生免疫副作用。
然而，聚乙二醇(PEG)具有缺点，其为不可代谢分子，用其衍生的蛋白质可导致肾脏的空泡化。因此使用可代谢的聚合物将活性物质衍生化特别有意义，所述可代谢的聚合物在体内的分解可以优先控制。用于此目的地适合的分子是羟乙基淀粉(HES)，其长时间以来已经广泛地以多种分子规格用作血浆扩容剂(DE 19628705A1)。
即使当以高剂量给药时，与其它血浆扩容剂如明胶衍生物或右旋糖苷、以及人白蛋白相比，HES只表现出罕见的和很小程度的副作用。
然而，活性物质衍生化的其它未解决的问题是活性物质与载体的选择性结合。在蛋白质的情况中，例如希望在距离反应中心或受体充分远处与载体偶联。否则，活性被降低或破坏。
DE19628705A1描述了使血红蛋白结合于羟乙基淀粉的方法。然而，该结合通过血红蛋白的多个游离氨基相对非选择性地发生。
考虑到现有技术，本发明要解决的问题是得到与活性物质尽可能选择性结合的淀粉衍生物。
另外，这种淀粉衍生物的组成应尽可能使活性物质通过共价结合定量地结合到这种淀粉衍生物上。
本发明要解决的问题是还要得到淀粉衍生物，其在有机体内的分解行为是可以控制的。具体地说，淀粉衍生物的组成应使其不能通过肾脏屏障并防止其被迅速排泄。因此，淀粉衍生物在血清中应表现出延长的半衰期。然而，淀粉衍生物在生理学合理的时间段内应是可分解的并且没有残留。
活性物质在水相和有机溶剂中的溶解行为也应通过其与已知的淀粉衍生物的结合能够在宽的范围内控制。
最后，本发明要解决的问题是得到一种方法，其应该尽可能简单和经济地制备这种淀粉衍生物及其与活性物质的偶联产品。
这些问题，以及虽然没有确切地提及，但可不言而喻地从本文中讨论的或从中必然显现的关系推断出的其它问题可用权利要求1中描述的淀粉衍生物解决。对本发明的这些淀粉衍生物的经验性修饰在从属于权利要求1的从属权利要求2-9中保护。这些淀粉衍生物与活性物质的结合物在权利要求10-25中保护。对于用得到的所述淀粉衍生物作为中间产物来制备淀粉/活性物质结合物的方法，权利要求26-28提供了对要解决的问题的解决方案。
权利要求29-31描述了包含本发明的淀粉/活性物质结合物的药物以及这些药物的优选医药应用。
通过制备式(I)的化合物，有可能得到极具选择性地与活性物质的SH官能团结合的淀粉衍生物，
其中X表示溴或碘原子，R”表示直链或支链烷基、芳基或芳烷基，R-CO-表示取代或未取代的氧化淀粉残基，其在还原性端基处被氧化形成羧酸。
本发明的化合物具有以下优点。
淀粉衍生物的特有结构式防止淀粉衍生物能够通过肾脏屏障，其结果是血浆中活性物质的半衰期得到延长。半衰期表示在所用活性物质的一半被分解或排泄时的时间。
式(I)的化合物在生理学合理的时间段内是可分解的并且没有残留，但另一方面还表现出可控制的消除行为。
权利要求1的衍生物通常可从任何具有可氧化为羧酸的基团的淀粉制备。优选地，所述基团为淀粉的还原性端基。已经发现，当氧化的淀粉R-CO-残基为羟乙基淀粉残基时，式(I)的前述性质可特别容易地达到。
得到羟乙基淀粉的起始产品为具有高含量支链淀粉的淀粉，其是淀粉的高度支化组分，具体为马铃薯淀粉、蜡状玉米淀粉、高梁淀粉或蜡状米淀粉。
对这些淀粉进行水解分解反应以大致预调到预期的分子量。分子量从大约20,000,000道尔顿降低到几百万道尔顿。
在随后的用已知的羟乙基化试剂进行碱羟乙基化中，有可能在失水葡萄糖单元的2，3和6位引入羟乙基。在合成中不易形成双取代单元，如2，3-二羟亚乙基水解葡萄糖、2，6-二羟亚乙基水解葡萄糖。
羟乙基取代存在两种不同定义的取代度。
取代度MS(摩尔取代)定义为是每失水葡萄糖单元的平均羟乙基数。其根据样品中羟乙基的总数来确定，例如根据Morgan，通过醚分离和随后定量测定由此形成的碘乙烷和亚乙基。
另一方面，取代度DS(取代的程度)定义为是所有失水葡萄糖单元中取代的失水葡萄糖单元的比例。其可在样品水解后定量测量未取代的葡萄糖测定。从这些定义可知MS＞DS。在单取代的情况中，即，每个取代的失水葡萄糖单元只带有一个羟乙基时，MS＝DS。
本发明的式(I)的羟乙基淀粉中的羟乙基淀粉残基优选具有0.1到0.8的取代度MS。特别优选地，羟乙基淀粉残基具有0.4到0.7的取代度MS。
未取代的失水葡萄糖单元中的每个羟乙基在羟乙基化方面的反应性不同，取决于反应条件。在一定范围内，取代的样品，即，为统计学上分布在单个聚合物分子中的单个的不同取代的失水葡萄糖，可受此影响。有利的是，C2-和C5-位主要发生羟乙基化，由此C6-位由于其容易接近更常被取代。
在本发明范围内，优选使用主要在C2-位取代的羟乙基淀粉(HES)，其被尽可能均匀地取代。这种HES的制备在EP 0402724 B2中有所描述。他们在生理学合理的时间段内分解且没有残留，但另一方面还表现出可控制的消除行为。主要在C2-位取代使羟乙基淀粉相对难以被α-淀粉酶分解。如果可能，聚合物分子内不发生失水葡萄糖单元被连续取代是有利的，以保证分解性而没有残留。另外，尽管是低取代的，这种羟乙基淀粉在含水介质中具有充分高的溶解性，使得溶液即使较长时间后仍保持稳定，且没有聚集体或凝胶形成。
对于失水葡萄糖单元的羟乙基，优选本发明的式(I)中的羟乙基淀粉残基的C2∶C6的取代比为2到12。特别优选地，C2∶C6的取代比为3到11。
对于活性物质的偶联，优选将羟乙基淀粉(HES)的还原性端基氧化为羧酸或内酯。DE 19628705 A1描述了一种方法，其中用碘/氢氧化钾使还原性端基氧化。随后可通过得到的酸官能团与活性物质发生偶联。
本发明式(I)的化合物中的R-CO-残基在优选分子式中表示氧化的羟乙基淀粉残基，其以所描述的用于形成羧酸的方式在还原性端基被氧化。
由于使用天然原材料支链淀粉和由于其中在某种程度上需要分离聚合物链的制备方法，羟乙基淀粉不是以具有规定分子量的均匀分子的物质存在，而是不同大小的分子的混合物，其也被羟乙基不同地取代。这种混合物的描述需要使用统计学平均量级(参见K.Sommermeyer等人，“Klinisch Verwendete Hydoxyethylstrke：Physikalisch-chemische Charakterisierung”，Krankenhauspharmazie，271(1987))。因此，为表示平均分子量，使用平均分子量(Mw)。这种平均值的通用定义为：
Mw=ΣiNi·MiwΣiNi·Miw-1]]>
优选本发明式(I)中的羟乙基淀粉R-CO-残基具有2000到1,000,000 D的平均分子量(使用凝胶渗透色谱法测定)。更优选地，平均分子量Mw为5,000到500,000 D和最更优选为8,000到250,000D。
化合物(I)中的基团R”可包含饱和或不饱和键。如作为R”的烷基、芳基和芳烷基还可包含取代基，诸如例如，烷基、芳基、芳烷基、卤素、羰基、酰基、羧基、羧酸酯基、羟基、硫羟基、烷氧基和/或烷基硫代取代基。在优选的实施方案中，R”为式(CH2)n的基团，其中n表示1到10的整数。特别优选地，R”为亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基或亚辛基。
本发明还涉及通式(II)的淀粉/活性物质结合物：
其中R”表示直链或支链的烷基、芳基或芳烷基，R-CO-表示取代或未取代的氧化淀粉残基，其在还原性端基处被氧化形成羧酸，和R’为活性物质残基。
式(II)的淀粉/活性物质结合物为前述式(I)的化合物与其中含有至少一个SH基团的活性物质形成的偶联产物。R-CO-残基和R”具有与前面说明式(I)中相同的含义。
优选的活性物质R’-SH，其作为残基R’-S-包含在式(II)的化合物中，选自肽、蛋白质、抗生素、核酸、或激素。必要的条件是这些化合物包含至少一个SH基团。
其也可为通过定向诱变引入半胱氨酸残基的蛋白质或肽。因为在蛋白质或肽中没有SH基团，有可能在本发明的范围内使用治疗性蛋白的所谓半胱氨酸-muteine，其通过使用基因工程的定向诱变选择性地进行交换或引入半胱氨酸残基。这种交换是本领域技术人员已知的，在A.Bendele等人的Short Communication：Renal TubularVacuolation in Animals Treated with Polyethylene-Glycol conjugatedProteins，Toxicological Science 42，152-157(1998)中有所描述，在其它文献中也有描述。
SH官能团也可在活性物质与式(I)的化合物反应之前通过用2-亚胺基四氢噻吩(Trauts试剂)转化引入到带有伯胺基团的活性物质中。通过这种方法把SH基团引入到活性物质诸如例如蛋白质中通常是本领域技术人员已知的。
治疗性抗体、抗体fab片段和抗体F(ab’)2片段为优选的活性物质蛋白质。由于他们相对低的分子量，这种抗体片段容易通过肾脏，其可通过用淀粉衍生化延长其血浆半衰期。在本发明的范围内也已经确定抗体或抗体片段被蛋白酶的水解分解可借助于用羟乙基淀粉衍生化而减少。
在另外的优选实施方案中，活性物质为细胞因子，具体为干扰素α2a或干扰素α2b，或促红细胞生成素。
在本发明的范围内，已经确定，当活性物质与式(I)的化合物偶联并转化为式(II)的淀粉/活性物质结合物时，活性物质在含水介质中的溶解性受到影响。
在本发明的范围内，已经确定，当蛋白质或酶与式(I)的化合物偶联并转化为式(II)的淀粉/活性物质结合物时，蛋白质或酶在有机溶剂中的溶解性受到影响。优选的非质子性溶剂为二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或二甲基乙酰胺。
本发明还在另外的方面涉及前述的式(II)的淀粉/活性物质结合物的制备方法。得到最初描述的式(I)的淀粉衍生物作为该方法的中间产物。该方法的特征在于以下步骤：
a)取代或未取代淀粉的还原性端基首先被选择性地氧化，形成羧基或内酯基团。优选使用羟乙基淀粉。氧化可例如根据DE 19628705A1使用碘/氢氧化钾进行。
b)步骤a)中得到的氧化的淀粉或羟乙基淀粉的羧基或内酯基团与二胺反应，
H2N-R”-NH2
其中R”表示烷基、芳基或芳烷基，其可为支链或非支链的。所述残基也可包含饱和及不饱和键。烷基、芳基或芳烷基也可包含其它取代基，诸如例如烷基、芳基、芳烷基、卤素、羰基、酰基、羧酸酯基、羟基、硫羟基、烷氧基和/或烷基硫代取代基。
优选地，R”为非支链的饱和烷基(CH2)n，其中n表示2到10的整数。特别优选的化合物为乙二胺、1，3-丙二胺、1，4-丁二胺、1，5-戊二胺、1，6-己二胺和1，8-辛二胺。
通过使取代或未取代的氧化淀粉与上述二胺反应，得到式(III)的化合物：
其中R-CO-表示取代或未取代的氧化淀粉残基，如同已经在开始的式
(I)中的描述，所述淀粉残基在还原性端基处被氧化形成羧酸。
c)式(III)的化合物与卤代乙酸和作为活化剂的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺反应，以形成式(I)的化合物：
其中X表示溴或碘原子。
d)最后，式(I)的化合物与具有至少一个硫羟基的活性物质R’-SH反应，形成式(II)的淀粉/活性物质结合物：
其中R’表示活性物质残基。
已经发现，在中性到微碱性条件下，活性物质的硫羟基比其它活性基团更容易与式(I)的化合物反应。优选地，pH为6.5-8.5。在这些条件下，硫羟基脱质子化发生硫羟化，其具有特别的反应性，并选择性地与式(I)的化合物反应。
已经确定，使用上述方法可极具选择性地使活性物质通过与淀粉偶联进行衍生化。在这种情况中，有选择性的是指活性物质基本上只通过它的硫羟基与式(I)的化合物反应，和其基本上只通过硫醚键偶联为淀粉/活性物质结合物。
特别优选地，该偶联方法用于含有SH基团的肽或蛋白质。式(I)的化合物有可能与蛋白质或肽的SS基团反应，在SS基团转化为SH基团后进行。
式(I)的化合物与含SH基团的肽或蛋白质的反应的收率为20％到90％，取决于蛋白质或肽的分子量和SH或SS基团的数量。因此，在优选的情况中，可实现活性物质与淀粉载体的大量偶联。
有可能使上述方法步骤c)中的式(III)的中间产品与其它通常使用的交联剂反应，代替与卤代乙酸的反应。在这种情况中，交联剂的官能团与化合物(III)的伯胺反应。在随后的步骤中，交联剂的残余官能团之一与活性物质的官能团反应，优选与SH基团反应，其结果形成了淀粉/活性物质结合物。通常使用的交联剂为如具有α-ω-末端相同或不同官能团的双官能交联剂。这种交联剂的综述可在firmPerbio的目录(2001/2002)中发现。
另外，对于本领域技术人员不言而喻的是，有可能使开始描述的在还原性端基基团被氧化形成羧酸的淀粉残基或羟乙基淀粉残基直接与上述通常使用的交联剂之一反应。在这种情况中，交联剂的官能团与氧化的淀粉或羟乙基淀粉的羧基反应，在随后的步骤中，交联剂的残余官能团之一与活性物质的官能团反应，优选与SH基团反应，其结果是形成淀粉/活性物质结合物。
根据本发明的一个方面，上述的活性物质的淀粉衍生物可用于制备药物。优选地，所述药物用于治疗传染性疾病或激素紊乱。在这个方面，这种药物可包含标准的药学助剂。
以下用一个实施例描述本发明，但本发明不受其限制。
实施例1
10g氧化羟乙基淀粉的结合物与乙二胺一起溶解于50ml蒸馏水中，所述氧化羟乙基淀粉结合物的平均分子量Mw为40,000和取代度MS为0.2，其制备类似于DE 19628705 A1。把0.2g的溴乙酸溶解于5ml蒸馏水中，并用0.01标准氢氧化钠浓溶液调节pH值为4.5，把该溶液加入到上述氨基官能团化的羟乙基淀粉中。搅拌下，向反应混合物中加入0.1g的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺，通过加入0.01标准盐酸和然后加入0.01标准氢氧化钠浓溶液保持pH为4.5长达一小时。另外反应2小时后，反应产物经过超滤，然后用乙醇沉淀和用乙醇洗，真空避光干燥。