一种土壤微生物CDNA文库的构建方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201110277886.0	申请日：	2011.09.19
公开号：	CN102418151A	公开日：	2012.04.18
当前法律状态：	终止	有效性：	无权
法律详情：	未缴年费专利权终止IPC(主分类):C40B 50/06申请日:20110919授权公告日:20130417终止日期:20150919\|\|\|授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C40B 50/06申请日:20110919\|\|\|公开
IPC分类号：	C40B50/06; C40B40/08; C12N1/21; C12N15/70; C12N15/10; C12R1/19(2006.01)N	主分类号：	C40B50/06
申请人：	福建农林大学
发明人：	方长旬; 林文雄; 黄力坤; 许铁城; 林瑞余
地址：	350002 福建省福州市仓山区建新镇金山学区
优先权：
专利代理机构：	福州元创专利商标代理有限公司 35100	代理人：	蔡学俊
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内容摘要

本发明提供了一种土壤微生物cDNA文库的构建方法，本发明的构建方法先将总RNA逆转录成单链的cDNA，单链cDNA的5’端经去磷酸化后与5’端磷酸化修饰的接头1连接，再将5’端连有接头的cDNA进行磷酸化反应，反应后的cDNA的3’端与接头2连接，获得5’、3’端分别连接有接头的cDNA，采用与接头部分序列互补的寡核苷酸作为引物对cDNA进行扩增，从而获得土壤微生物的双链cDNA，将此双链cDNA与克隆载体pMD-18T连接后转化大肠杆菌感受态细胞，最终获得土壤微生物的cDNA文库。本发明构建的土壤微生物cDNA文库库容量较大，可以用来筛选感兴趣的目的基因，以及后续的基因、蛋白互作分析。

权利要求书

1：一种土壤微生物 cDNA 文库的构建方法，包括土壤微生物总 RNA 的提取、逆转录， 5’ 端接头连接， 3’ 端接头连接， PCR 扩增，以及 cDNA 文库的构建，其特征在于：具体步骤包括如下：（1）土壤微生物总 RNA 获得：提取获得土壤微生物基因组 DNA 和总 RNA，再利用 DNA 酶去除基因组 DNA 后获得总 RNA，总 RNA 纯化后备用；（2）总 RNA 的逆转录：总 RNA 采用 PrimeScript RT reagent Kit 进行逆转录，逆转录获得的 cDNA 用
2： 5 倍体积的无水乙醇和 0.1 倍体积的 3M 、 pH=5.2 的醋酸钠溶液，于 -20℃ 下沉淀 12 h ；（3） cDNA 5’ 端接头连接：纯化后的 cDNA 用碱性磷酸酶进行 5’ 的去磷酸化反应，去磷酸化的 cDNA 与 5’ 接头 1 进行连接，连接产物用 2.5 倍体积的无水乙醇和 0.1 倍体积的的 3M、 pH=5.2 的醋酸钠溶液，于 -20℃下沉淀 12h ；其中接头 1 ： 5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCA GCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3'， 5’ 端经磷酸化修饰；（4） cDNA 3’ 端接头连接：连有 5’ 接头 cDNA 的 3’ 端用 T4 多核苷激酶进行磷酸化反应，磷酸化反应后的 cDNA 与 3’ 接头 2 进行连接；其中接头 2 ： 5'-CTAATACGACTCACTATAGG GCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3' ；（5） PCR 扩增：分别连接有 3’端和 5’端接头的 cDNA 用接头的互补引物 P1 ： 5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3' ， P2 ： 5'-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3' 进行扩增，具体的反应参数为： 95℃ 1 min， 94℃ 1 min、 65℃ 30sec、 72℃ 2 min 30sec 共 30 cycles, 72℃ 10min，扩增后的产物再以相同的引物进行二次扩增；（6） cDNA 文库构建：二次扩增的 PCR 产物经纯化后，与 pMD-18 T 载体进行连接、转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，获得 cDNA 文库。 2. 根据权利要求 1 所述的土壤微生物 cDNA 文库的构建方法，其特征在于：步骤（1）中利用 DNA 酶 I 去除基因组 DNA 后获得总 RNA，总 RNA 用 RNAPure 高纯总 RNA 快速提取试剂盒和 MicroSpin S-400 HR spin column 进行纯化。

说明书

一种土壤微生物 cDNA 文库的构建方法
    【技术领域】
     本发明涉及一种土壤微生物 cDNA 文库的构建方法，属于生物技术领域。背景技术随着生物及信息技术的迅速发展，挖掘、克隆新基因、研究新基因的功能已成为功能基因组研究中的一项重要工作。构建 cDNA 文库是功能基因组学研究的基本手段之一，其在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。
     土壤微生物作为土壤生态系统的重要组成部分，在土壤有机物质分解和养分释放、能量转移等生物地化循环中扮演着重要角色，土壤微生物的功能多样性也成为土壤生态学研究的热点问题。构建土壤微生物的 cDNA 文库则能够为深入分析土壤微生物功能多样性，包括不同环境条件下，土壤微生物中相关基因的表达、调控，以及此过程中的基因与基因、蛋白质与蛋白质的互作提供重要的基础。然而，由于土壤中的微生物包括细菌、放线菌和真菌等，它们所转录的 mRNA 各不相同，常规的方法需要我们利用特定的试剂盒提取土壤总 mRNA，包括带 poly(A) 的 ( 真菌和放线菌 mRNA、少数细菌的一些 mRNA) 和不带 poly(A) 的 ( 细菌 mRNA)。在此基础上，分别针对这两种类型的 mRNA，应用不同试剂盒分离各种 mRNA，最后合并成用于 cDNA 文库构建的土壤总 mRNA。此法不仅费时费力，而且由于操作过程繁琐容易出现 RNA 降解而导致实验失败。
     因此，开发一种快速、简单、高效的土壤微生物 cDNA 文库的构建方法，解决常规操作步骤复杂， RNA 容易降解的问题，此法对于开展土壤微生物的功能多样性研究十分必要。鉴于此，发明人前期发明了一种土壤微生物 DNA 和总 RNA 的提取方法 ( 申请号： 201010548527.X)，通过此法并分离获得土壤微生物总 RNA，本发明在此基础上，开发一种简单、高效的土壤 cDNA 文库的构建方法。
     发明内容本发明提供一种简单有效的土壤微生物 cDNA 文库的构建方法，利用该法获得的文库的容量大。
     本发明的土壤微生物 cDNA 文库的构建方法，包括土壤微生物总 RNA 的提取、逆转录， 5’ 端接头连接， 3’ 端接头连接， PCR 扩增，以及 cDNA 文库的构建，其特征在于：具体步骤包括如下：（1）土壤微生物总 RNA 获得：提取获得土壤微生物基因组 DNA 和总 RNA，再利用 DNA 酶去除基因组 DNA 后获得总 RNA，总 RNA 纯化后备用；（2）总 RNA 的逆转录：总 RNA 采用 PrimeScript RT reagent Kit 进行逆转录，逆转录获得的 cDNA 用 2.5 倍体积的无水乙醇和 0.1 倍体积的 3M 、 pH=5.2 的醋酸钠溶液，于 -20℃ 下沉淀 12 h ；
     （3） cDNA 5’ 端接头连接：纯化后的 cDNA 用碱性磷酸酶进行 5’ 的去磷酸化反应，去磷酸化的 cDNA 与 5’ 接头 1 进行连接，连接产物用 2.5 倍体积的无水乙醇和 0.1 倍体积的的 3M、 pH=5.2 的醋酸钠溶液，于 -20℃下沉淀 12h ；其中接头 1 ： 5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCA GCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3'， 5’ 端经磷酸化修饰；（4） cDNA 3’ 端接头连接：连有 5’ 接头 cDNA 的 3’ 端用 T4 多核苷激酶进行磷酸化反应，磷酸化反应后的 cDNA 与 3’ 接头 2 进行连接；其中接头 2 ： 5'-CTAATACGACTCACTATAGG GCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3' ；（5） PCR 扩增：分别连接有 3’端和 5’端接头的 cDNA 用接头的互补引物 P1 ： 5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3' ， P2 ： 5'-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3' 进行扩增，具体的反应参数为： 95℃ 1 min， 94℃ 1 min、 65℃ 30sec、 72℃ 2 min 30sec 共 30 cycles, 72℃ 10min，扩增后的产物再以相同的引物进行二次扩增；（6） cDNA 文库构建：二次扩增的 PCR 产物经纯化后，与 pMD-18 T 载体进行连接、转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，获得 cDNA 文库。
     步骤（1）中利用 DNA 酶 I 去除基因组 DNA 后获得总 RNA，总 RNA 用 RNAPure 高纯总 RNA 快速提取试剂盒和 MicroSpin S-400 HR spin column 进行纯化。本发明的构建方法先将总 RNA 逆转录成单链的 cDNA，单链 cDNA 的 5’ 端经去磷酸化后与 5’ 端磷酸化修饰的接头 1 连接，再将 5’ 端连有接头的 cDNA 进行磷酸化反应，反应后的 cDNA 的 3’ 端与接头 2 连接，获得 5’、 3’ 端分别连接有接头的 cDNA，采用与接头部分序列互补的寡核苷酸作为引物对 cDNA 进行扩增，从而获得土壤微生物的双链 cDNA，将此双链 cDNA 与克隆载体 pMD-18T 连接后转化大肠杆菌感受态细胞，最终获得土壤微生物的 cDNA 文库。所得的文库含有 1000 个以上的单基因克隆，部分结果见图 3。反复试验证明，此法构建的土壤微生物 cDNA 文库库容量较大，可以用来筛选感兴趣的目的基因，以及后续的基因、蛋白互作分析。
     目前构建的 cDNA 文库主要是对单一的植物、动物或微生物进行，本发明针对土壤中的所有微生物构建 cDNA 文库，文库中基因信息来源更加丰富，具有下列显著优点： 1. 利用 oliga dT 和 Random 引物能够一次性将包括细菌、真菌、原生动物在内的土壤微生物总 RNA 全部逆转录为单链 cDNA，避免了对细菌、真菌、原生动物总 RNA 分别进行逆转录的繁琐步骤。
     2. 分别对土壤微生物的单链 cDNA 的 5’ 和 3’ 端连接接头， PCR 扩增形成双链 cDNA，从而获得微生物双链 cDNA，一次性构建细菌、真菌、原生动物的双链 cDNA 文库。
     3. 适合于不同来源的土壤微生物，具有广普适用性。
     4. 文库中基因来源于细菌、真菌、原生动物，因而信息来源更加丰富。
     5. 构建文库的方法便捷、无需复杂的操作步骤。
     附图说明
     图 1 为不同作物土壤微生物总 RNA 的逆转录结果，其中 A ：水稻， B：甘蔗，虚线框中的为土壤微生物总 RNA 逆转录后形成的单链 cDNA ；图 2 为不同作物土壤微生物双链 cDNA 的 PCR 扩增结果，其中 A ：水稻， B：甘蔗，虚线框中的为土壤微生物总 RNA 逆转录后形成的单链 cDNA ；图 3 为不同作物土壤微生物的部分 cDNA 文库，其中 A ：水稻， B：甘蔗。具体实施方式
     本发明的土壤微生物 cDNA 文库的构建方法，包括土壤微生物总 RNA 的提取、逆转录， 5’ 端接头连接， 3’ 端接头连接， PCR 扩增，以及 cDNA 文库的构建。具体步骤如下：（1）土壤微生物总 RNA 获得：土壤微生物总 RNA 的提取参照方长旬等 ( 一种土壤微生物基因组 DNA 和总 RNA 的提取方法，申请号： 201010548527.X) 的专利说明书的方法进行。按照该方法提取获得的土壤微生物基因组 DNA 和总 RNA，再利用 DNA 酶 (DNAase I, TaKaRa Biotechnology, Dalian) 去除基因组 DNA 后获得总 RNA，总 RNA 用 RNAPure 高纯总 RNA 快速提取试剂盒 ( 北京百泰克公司 ) 和 MicroSpin S-400 HR spin column (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) 进行纯化。
     （2）总 RNA 的逆转录：总 RNA 采用 PrimeScript RT reagent Kit (TaKaRa Biotechnology, Dalian) 进行逆转录。逆转录获得的 cDNA 用 2.5 倍体积的无水乙醇和 0.1 倍体积的 3M 醋酸钠溶液 (pH=5.2)，于 -20℃下沉淀 12 h。
     （3） cDNA 5’ 端接头连接： cDNA 用碱性磷酸酶 (Alkaline Phosphatase)(TaKaRa Biotechnology, Dalian) 进行 5’ 的去磷酸化反应，去磷酸化的 cDNA 与 5’ 接头 (5'-CTAAT ACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3'， 5’ 端经磷酸化修饰 ) 进行连接。连接产物用 2.5 倍体积的无水乙醇和 0.1 倍体积的的 3M 醋酸钠溶液 (pH=5.2)，于 -20℃下沉淀 12h。
     （4） cDNA 3’ 端接头连接：连有 5’ 接头的 cDNA 用 T4 多核苷激酶 (T4 Polynucleotide Kinase) (TaKaRa Biotechnology, Dalian) 进行磷酸化反应，磷酸化反应后的 cDNA 与 3’ 接头 (5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3') 进行连接。
     （5） PCR 扩增：分别连接有 3’端和 5’端接头的 cDNA 用接头的互补引物 (P1 ： 5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3' , P2 ： 5'-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3' ) 进行扩增，具体的反应参数为： 95℃ 1 min， (94℃ 1 min, 65℃ 30sec， 72℃ 2 min 30sec) 30 cycles, 72℃ 10min，扩增后的产物再以相同的引物进行二次扩增。
     （6） cDNA 文库构建：二次扩增的 PCR 产物经纯化后，与 pMD-18 T 载体进行连接后转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，获得 cDNA 文库。
     实施例 1 本发明的土壤微生物 cDNA 文库的构建方法，具体步骤如下：（1）原料：新鲜水稻根际土壤，来自福建福州（福建农林大学教学农场）；（2）土壤微生物总 RNA 的提取：土壤微生物总 RNA 的提取参照方长旬等 ( 一种土壤微生物基因组 DNA 和总 RNA 的提取方法，申请号： 201010548527.X) 的专利说明书的方法进行。按照该方法提取获得的土壤微生物基因组 DNA 和总 RNA，利用 DNA 酶 (DNAase I, TaKaRa Biotechnology, Dalian) 在 37℃温育 10min 去除基因组 DNA 后获得总 RNA，总 RNA 用 RNAPure 高纯总 RNA 快速提取试剂盒 ( 北京百泰克公司 ) 和 MicroSpin S-400 HR spin column (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) 进行过柱纯化。
     （3）总 RNA 的逆转录：上述（2）中获得的总 RNA 采用 PrimeScript RT reagent Kit (TaKaRa Biotechnology, Dalian) 进行逆转录。具体步骤为：在反应体系中加入 2 μl5×PrimeScript Buffer， 0.5 μl PrimeScript RT Enzyme Mix I， 0.5 μl Oligo dT Primer (50 μM)， 2 μl Random 6 mers (100 μM) 和 500ng 总 RNA，并用 RNAase-free H2O 补足至终体积 10 μl。反转录反应条件如下 : 37℃ 15 min， 85℃ 5 sec。逆转录获得的单链 cDNA 用 2.5 倍体积的无水乙醇和 0.1 倍体积 3M 的醋酸钠溶液 (pH=5.2)，于 -20℃ 下沉淀 12 h，后于 4℃ 14000rpm 离心 10min，离心获得的沉淀用 1ml 75% 的乙醇，于 4℃ 14000rpm 离心洗涤 10min，重复两次，后去除上清并吹干沉淀，沉淀用 50ul 无菌水溶解。取 3μl 此 cDNA 的溶液，于 1% 琼脂糖凝胶中电泳检测，检测结果见图 1A，从图 1A 可见水稻土壤微生物总 RNA 经逆转录后形成单链 cDNA，单链 cDNA 为弥散的条带，片段大小主要集中在 0.5~3 kb 之间。
     （4） cDNA 5’ 端接头连接：上述（3）的 cDNA 先用 Alkaline Phosphatase (TaKaRa Biotechnology, Dalian) 进行 5’ 的去磷酸化反应，具体步骤为：在反应体系中加入 43ul cDNA, 5ul 10×Alkaline Phosphatase Buffer， 2ul Alkaline Phosphatase， 37 ℃反应 30min，反应液用等体积的苯酚 / 氯仿 / 异戊醇（25 ： 24 ： 1）抽提 1 次， 4℃ 14000rpm 离心 10min，上清用 2.5 倍体积的无水乙醇和 0.1 倍体积 3M 的醋酸钠溶液 (pH=5.2)，于 -20℃下沉淀 60min，后于 4℃ 14000rpm 离心 10min，沉淀用 1ml 75% 的乙醇于 4℃ 14000rpm 离心洗涤 10min，后去除上清并吹干沉淀，沉淀用 10ul 无菌水溶解。去磷酸化后的 cDNA 利用 DNA 连接酶与 5’ 接头 (5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3'， 5’ 端经磷酸化修饰 ) 于 16℃下连接 12 h, 连接产物用 2.5 倍体积的无水乙醇和 0.1 倍体积 3M 的醋酸钠溶液 (pH=5.2)，于 -20℃下沉淀 12h 后离心洗涤，用 43ul 的无菌水溶解沉淀。 (5) cDNA 3’ 端接头连接：将（4）中连有 5’ 接头的 cDNA 加入 2ul T4 Polynucleotide Kinase(TaKaRa Biotechnology, Dalian), 5ul 10×T4 DNA Polynucleotide Kinase Buffer, 37℃反应 30min, 反应体系用等体积的苯酚 / 氯仿 / 异戊醇（25 ： 24 ： 1）抽提 1 次， 4℃ 14000rpm 离心 10min，上清用用 2.5 倍体积的无水乙醇和 0.1 倍体积 3M 的醋酸钠溶液 (pH=5.2)，于 -20℃下沉淀 60min，沉淀用 1ml 75% 的乙醇，于 4℃ 14000rpm 离心洗涤 10min，后去除上清并吹干沉淀，沉淀用 10ul 无菌水溶解。磷酸化反应后的 cDNA 利用 DNA 连接酶与 3’ 接头 (5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCG GGCAGGT-3') 于 16℃下连接 12 h。
     （6） PCR 扩增：取 1ul 上述 (5) 分别连接有 3’ 端和 5’ 端接头的 cDNA，用接头的互补引物 (P1 ： 5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3' , P2 ： 5'-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3' ) 进行扩增，反应体系为 10×Buffer 5μl， dNTP(10mM) 2μl，上述引物 P1， P2(10μM) 各 2μl， Taq DNA 聚合酶 (5U/μl) 0.3μl， cDNA 1μl，无菌水 37.7μl，共 50μl。具体的反应参数为： 95℃ 1 min， (94℃ 1 min, 65℃ 30sec， 72℃ 2 min 30sec) 30 cycles, 72℃ 10min。扩增后取 1ul 作为模板按上述反应参数继续二次扩增，循环数为 20，二次扩增结束后取 3μl 于 1% 琼脂糖凝胶中电泳检测，检测结果见图 2A，从图 2A 可见单链 cDNA 经扩增得到的双链 cDNA 也为弥散的条带，片段大小也主要在 0.5~3 kb 之间，浓度较单链 cDNA 大，通过电泳结果可以发现，运用此方法获得的土壤微生物的双链 cDNA 浓度高，片段丰富。
     (7) cDNA 文库的构建：将 (6) 中 PCR 产物经纯化后，与 pMD-18 T 载体进行连接后 42℃热击转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，获得水稻土壤微生物 cDNA 文库，部分结果见图 3A，图 3A 中 LB 琼脂平板上的每一个白斑含有水稻土壤微生物的一个 cDNA，即为水稻土壤微
     生物的一个 cDNA 克隆。
     实施例 2 （1）取新鲜的甘蔗根际土壤来自福建福州（福建农林大学甘蔗园）；，土壤微生物总 RNA 的提取参照方长旬等 ( 一种土壤微生物基因组 DNA 和总 RNA 的提取方法，申请号： 201010548527.X) 的专利说明书的方法进行。按照该方法提取获得的土壤微生物基因组 DNA 和总 RNA，利用 DNA 酶 (DNAase I, TaKaRa Biotechnology, Dalian) 在 37℃温育 10min 去除基因组 DNA 后获得总 RNA，总 RNA 用 RNAPure 高纯总 RNA 快速提取试剂盒 ( 北京百泰克公司 )MicroSpin S-400 HR spin column (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) 进行过柱纯化。
     （3）总 RNA 的逆转录：上述（2）中获得的总 RNA 采用 PrimeScript RT reagent Kit (TaKaRa Biotechnology, Dalian) 进行逆转录。具体步骤为：在反应体系中加入 2 μl 5×PrimeScript Buffer， 0.5 μl PrimeScript RT Enzyme Mix I， 0.5 μl Oligo dT Primer (50 μM)， 2 μl Random 6 mers (100 μM) 和 500ng 总 RNA，并用 RNAase-free H2O 补足至终体积 10 μl。反转录反应条件如下 : 37℃ 15 min， 85℃ 5 sec。逆转录获得的单链 cDNA 用 2.5 倍体积的无水乙醇和 0.1 倍体积 3M 的醋酸钠溶液 (pH=5.2)，于 -20℃ 下沉淀 12 h，后于 4℃ 14000rpm 离心 10min，离心获得的沉淀用 1ml 75% 的乙醇，于 4℃ 14000rpm 离心洗涤 10min，重复两次，后去除上清并吹干沉淀，沉淀用 50ul 无菌水溶解。取 3μl 此 cDNA 的溶液，于 1% 琼脂糖凝胶中电泳检测，检测结果见图 1B，从图 1B 可见甘蔗土壤微生物总 RNA 经逆转录后形成单链 cDNA，单链 cDNA 为弥散的条带，片段大小主要集中在 0.5~3 kb 之间。
     （4） cDNA 5’ 端接头连接：上述（3）的 cDNA 先用 Alkaline Phosphatase (TaKaRa Biotechnology, Dalian) 进行 5’ 的去磷酸化反应，具体步骤为：在反应体系中加入 43ul cDNA, 5ul 10×Alkaline Phosphatase Buffer， 2ul Alkaline Phosphatase， 37 ℃反应 30min，反应液用等体积的苯酚 / 氯仿 / 异戊醇（25 ： 24 ： 1）抽提 1 次， 4℃ 14000rpm 离心 10min，上清用 2.5 倍体积的无水乙醇和 0.1 倍体积 3M 的醋酸钠溶液 (pH=5.2)，于 -20℃下沉淀 60min，后于 4℃ 14000rpm 离心 10min，沉淀用 1ml 75% 的乙醇于 4℃ 14000rpm 离心洗涤 10min，后去除上清并吹干沉淀，沉淀用 10ul 无菌水溶解。去磷酸化后的 cDNA 利用 DNA 连接酶与 5’ 接头 (5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3'， 5’ 端经磷酸化修饰 ) 于 16℃下连接 12 h, 连接产物用 2.5 倍体积的无水乙醇和 0.1 倍体积 3M 的醋酸钠溶液 (pH=5.2)，于 -20℃下沉淀 12h 后离心洗涤，用 43ul 的无菌水溶解沉淀。
     (5) cDNA 3’ 端接头连接：将（4）中连有 5’ 接头的 cDNA 加入 2ul T4 Polynucleotide Kinase(TaKaRa Biotechnology, Dalian), 5ul 10×T4 DNA Polynucleotide Kinase Buffer, 37℃反应 30min, 反应体系用等体积的苯酚 / 氯仿 / 异戊醇（25 ： 24 ： 1）抽提 1 次， 4℃ 14000rpm 离心 10min，上清用用 2.5 倍体积的无水乙醇和 0.1 倍体积 3M 的醋酸钠溶液 (pH=5.2)，于 -20℃下沉淀 60min，沉淀用 1ml 75% 的乙醇，于 4℃ 14000rpm 离心洗涤 10min，后去除上清并吹干沉淀，沉淀用 10ul 无菌水溶解。磷酸化反应后的 cDNA 利用 DNA 连接酶与 3’ 接头 (5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCG GGCAGGT-3') 于 16℃下连接 12 h。
     (6) PCR 扩增：取 1ul 上述 (5) 分别连接有 3’ 端和 5’ 端接头的 cDNA，用接头的互补引物 (P1 ： 5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3' , P2 ： 5'-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3' ) 进行扩增，反应体系为 10×Buffer 5μl， dNTP(10mM) 2μl，上述引物 P1， P2(10μM) 各 2μl， Taq DNA 聚合酶 (5U/μl) 0.3μl， cDNA 1μl，无菌水 37.7μl，共 50μl。具体的反应参数为： 95℃ 1 min， (94℃ 1 min, 65℃ 30sec， 72℃ 2 min 30sec) 30 cycles, 72℃ 10min。扩增后取 1ul 作为模板按上述反应参数继续二次扩增，循环数为 20，二次扩增结束后取 3μl 于 1% 琼脂糖凝胶中电泳检测，检测结果见图 2B，从图 2B 可见单链 cDNA 经扩增得到的双链 cDNA 也为弥散的条带，片段大小也主要在 0.5~3 kb 之间，浓度也较单链 cDNA 大，通过电泳结果可以发现，运用此方法获得的土壤微生物的双链 cDNA 浓度高，片段丰富。
     (7) cDNA 文库的构建：将 (6) 中 PCR 产物经纯化后，与 pMD-18 T 载体进行连接后 42℃热击转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，获得甘蔗土壤微生物 cDNA 文库图 3B，图 3B 中 LB 琼脂平板上的每一个白斑含有甘蔗土壤微生物的一个 cDNA，即为甘蔗土壤微生物的一个 cDNA 克隆。

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1、(10)申请公布号 CN 102418151 A(43)申请公布日 2012.04.18CN102418151A*CN102418151A*(21)申请号 201110277886.0(22)申请日 2011.09.19C40B 50/06(2006.01)C40B 40/08(2006.01)C12N 1/21(2006.01)C12N 15/70(2006.01)C12N 15/10(2006.01)C12R 1/19(2006.01)(71)申请人福建农林大学地址 350002 福建省福州市仓山区建新镇金山学区(72)发明人方长旬林文雄黄力坤许铁城林瑞余(74)专利代理机构福州元创。

2、专利商标代理有限公司 35100代理人蔡学俊(54) 发明名称一种土壤微生物cDNA文库的构建方法(57) 摘要本发明提供了一种土壤微生物cDNA文库的构建方法，本发明的构建方法先将总RNA逆转录成单链的cDNA，单链cDNA的5端经去磷酸化后与5端磷酸化修饰的接头1连接，再将5端连有接头的cDNA进行磷酸化反应，反应后的cDNA的3端与接头2连接，获得5、3端分别连接有接头的cDNA，采用与接头部分序列互补的寡核苷酸作为引物对cDNA进行扩增，从而获得土壤微生物的双链cDNA，将此双链cDNA与克隆载体pMD-18T连接后转化大肠杆菌感受态细胞，最终获得土壤微生物的cDNA文库。本发明构建的。

3、土壤微生物cDNA文库库容量较大，可以用来筛选感兴趣的目的基因，以及后续的基因、蛋白互作分析。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 6 页附图 2 页CN 102418161 A 1/1页21.一种土壤微生物cDNA文库的构建方法，包括土壤微生物总RNA的提取、逆转录，5端接头连接，3端接头连接，PCR扩增，以及cDNA文库的构建，其特征在于：具体步骤包括如下：（1）土壤微生物总RNA获得：提取获得土壤微生物基因组DNA和总RNA，再利用DNA酶去除基因组DNA后获得总RNA，总RNA纯化后备用；（2）总RNA的逆转录：总R。

4、NA采用PrimeScript RT reagent Kit进行逆转录，逆转录获得的cDNA用2.5倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的3M 、pH=5.2的醋酸钠溶液，于-20下沉淀12 h；（3）cDNA 5端接头连接：纯化后的cDNA 用碱性磷酸酶进行5的去磷酸化反应，去磷酸化的cDNA与5接头1进行连接，连接产物用2.5倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的的3M、pH=5.2的醋酸钠溶液，于-20下沉淀12h；其中接头1：5-CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，5端经磷酸化修饰；（4）cDNA 3端接头连接：连有5接头cDNA的3端用T4多。

5、核苷激酶进行磷酸化反应，磷酸化反应后的cDNA与3接头2进行连接；其中接头2： 5-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3；（5）PCR扩增：分别连接有3端和5端接头的cDNA用接头的互补引物P1：5-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3 ，P2：5-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3 进行扩增，具体的反应参数为：95 1 min，94 1 min、65 30sec、72 2 min 30sec共30 cycles, 72 10min，扩增后的产物再以相同的引物进行二次扩增；（6）cDNA 文库构建：二次扩增的PCR产。

6、物经纯化后，与pMD-18 T载体进行连接、转化大肠杆菌DH5感受态细胞，获得cDNA文库。2.根据权利要求1所述的土壤微生物cDNA文库的构建方法，其特征在于：步骤（1）中利用DNA酶I去除基因组DNA后获得总RNA，总RNA用RNAPure高纯总RNA快速提取试剂盒和MicroSpin S-400 HR spin column进行纯化。权利要求书CN 102418151 ACN 102418161 A 1/6页3一种土壤微生物 cDNA 文库的构建方法技术领域0001 本发明涉及一种土壤微生物cDNA文库的构建方法，属于生物技术领域。背景技术0002 随着生物及信息技术的迅速发展，。

7、挖掘、克隆新基因、研究新基因的功能已成为功能基因组研究中的一项重要工作。构建 cDNA 文库是功能基因组学研究的基本手段之一，其在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。0003 土壤微生物作为土壤生态系统的重要组成部分，在土壤有机物质分解和养分释放、能量转移等生物地化循环中扮演着重要角色，土壤微生物的功能多样性也成为土壤生态学研究的热点问题。构建土壤微生物的cDNA文库则能够为深入分析土壤微生物功能多样性，包括不同环境。

8、条件下，土壤微生物中相关基因的表达、调控，以及此过程中的基因与基因、蛋白质与蛋白质的互作提供重要的基础。然而，由于土壤中的微生物包括细菌、放线菌和真菌等，它们所转录的mRNA各不相同，常规的方法需要我们利用特定的试剂盒提取土壤总mRNA，包括带poly(A)的(真菌和放线菌mRNA、少数细菌的一些mRNA)和不带poly(A)的(细菌mRNA)。在此基础上，分别针对这两种类型的mRNA，应用不同试剂盒分离各种mRNA，最后合并成用于cDNA文库构建的土壤总mRNA。此法不仅费时费力，而且由于操作过程繁琐容易出现RNA降解而导致实验失败。0004 因此，开发一种快速、简单、高效的土壤微生物cDN。

9、A文库的构建方法，解决常规操作步骤复杂，RNA容易降解的问题，此法对于开展土壤微生物的功能多样性研究十分必要。鉴于此，发明人前期发明了一种土壤微生物DNA和总RNA的提取方法(申请号：201010548527.X)，通过此法并分离获得土壤微生物总RNA，本发明在此基础上，开发一种简单、高效的土壤cDNA文库的构建方法。发明内容0005 本发明提供一种简单有效的土壤微生物cDNA文库的构建方法，利用该法获得的文库的容量大。0006 本发明的土壤微生物cDNA文库的构建方法，包括土壤微生物总RNA的提取、逆转录，5端接头连接，3端接头连接，PCR扩增，以及cDNA文库的构建，其特征在于：具体步骤包。

10、括如下：（1）土壤微生物总RNA获得：提取获得土壤微生物基因组DNA和总RNA，再利用DNA酶去除基因组DNA后获得总RNA，总RNA纯化后备用；（2）总RNA的逆转录：总RNA采用PrimeScript RT reagent Kit进行逆转录，逆转录获得的cDNA用2.5倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的3M 、pH=5.2的醋酸钠溶液，于-20下沉淀12 h；说明书CN 102418151 ACN 102418161 A 2/6页4（3）cDNA 5端接头连接：纯化后的cDNA 用碱性磷酸酶进行5的去磷酸化反应，去磷酸化的cDNA与5接头1进行连接，连接产物用2.5倍体积的无水乙醇和0.。

11、1倍体积的的3M、pH=5.2的醋酸钠溶液，于-20下沉淀12h；其中接头1：5-CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，5端经磷酸化修饰；（4）cDNA 3端接头连接：连有5接头cDNA的3端用T4多核苷激酶进行磷酸化反应，磷酸化反应后的cDNA与3接头2进行连接；其中接头2： 5-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3；（5）PCR扩增：分别连接有3端和5端接头的cDNA用接头的互补引物P1：5-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3 ，P2：5-AGCGTGGTCGCGGCC。

12、GAGGT-3 进行扩增，具体的反应参数为：95 1 min，94 1 min、65 30sec、72 2 min 30sec共30 cycles, 72 10min，扩增后的产物再以相同的引物进行二次扩增；（6）cDNA 文库构建：二次扩增的PCR产物经纯化后，与pMD-18 T载体进行连接、转化大肠杆菌DH5感受态细胞，获得cDNA文库。0007 步骤（1）中利用DNA酶I去除基因组DNA后获得总RNA，总RNA用RNAPure高纯总RNA快速提取试剂盒和MicroSpin S-400 HR spin column进行纯化。0008 本发明的构建方法先将总RNA逆转录成单链的cDNA，单链。

13、cDNA的5端经去磷酸化后与5端磷酸化修饰的接头1连接，再将5端连有接头的cDNA进行磷酸化反应，反应后的cDNA的3端与接头2连接，获得5 、3端分别连接有接头的cDNA，采用与接头部分序列互补的寡核苷酸作为引物对cDNA进行扩增，从而获得土壤微生物的双链cDNA，将此双链cDNA与克隆载体pMD-18T连接后转化大肠杆菌感受态细胞，最终获得土壤微生物的cDNA文库。所得的文库含有1000个以上的单基因克隆，部分结果见图3。反复试验证明，此法构建的土壤微生物cDNA文库库容量较大，可以用来筛选感兴趣的目的基因，以及后续的基因、蛋白互作分析。0009 目前构建的cDNA文库主要是对单一的植物、。

14、动物或微生物进行，本发明针对土壤中的所有微生物构建cDNA文库，文库中基因信息来源更加丰富，具有下列显著优点：1.利用oliga dT和Random引物能够一次性将包括细菌、真菌、原生动物在内的土壤微生物总RNA全部逆转录为单链cDNA，避免了对细菌、真菌、原生动物总RNA分别进行逆转录的繁琐步骤。0010 2.分别对土壤微生物的单链cDNA的5和3端连接接头，PCR扩增形成双链cDNA，从而获得微生物双链cDNA，一次性构建细菌、真菌、原生动物的双链cDNA文库。0011 3.适合于不同来源的土壤微生物，具有广普适用性。0012 4.文库中基因来源于细菌、真菌、原生动物，因而信息来源更加丰富。

15、。0013 5.构建文库的方法便捷、无需复杂的操作步骤。附图说明0014 图 1为不同作物土壤微生物总RNA的逆转录结果，其中A：水稻，B：甘蔗，虚线框中的为土壤微生物总RNA逆转录后形成的单链cDNA；图2 为不同作物土壤微生物双链cDNA的PCR扩增结果，其中A：水稻，B：甘蔗，虚线框中的为土壤微生物总RNA逆转录后形成的单链cDNA；说明书CN 102418151 ACN 102418161 A 3/6页5图 3 为不同作物土壤微生物的部分cDNA 文库，其中A：水稻，B：甘蔗。具体实施方式0015 本发明的土壤微生物cDNA文库的构建方法，包括土壤微生物总RNA的提取、逆转录，5端。

16、接头连接，3端接头连接，PCR扩增，以及cDNA文库的构建。具体步骤如下：（1）土壤微生物总RNA获得：土壤微生物总RNA的提取参照方长旬等(一种土壤微生物基因组DNA和总RNA的提取方法，申请号：201010548527.X)的专利说明书的方法进行。按照该方法提取获得的土壤微生物基因组DNA和总RNA，再利用DNA酶(DNAase I, TaKaRa Biotechnology, Dalian)去除基因组DNA后获得总RNA，总RNA用RNAPure高纯总RNA快速提取试剂盒(北京百泰克公司)和MicroSpin S-400 HR spin column (GE Healthcare, Li。

17、ttle Chalfont, UK)进行纯化。0016 （2）总RNA的逆转录：总RNA采用PrimeScript RT reagent Kit (TaKaRa Biotechnology, Dalian)进行逆转录。逆转录获得的cDNA用2.5倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的3M 醋酸钠溶液(pH=5.2)，于-20下沉淀12 h。0017 （3）cDNA 5端接头连接：cDNA 用碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase)(TaKaRa Biotechnology, Dalian)进行5的去磷酸化反应，去磷酸化的cDNA与5接头(5-CTAATACGACTCACTATAGGGC。

18、AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，5端经磷酸化修饰)进行连接。连接产物用2.5倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的的3M醋酸钠溶液(pH=5.2)，于-20下沉淀12h。0018 （4）cDNA 3端接头连接：连有5接头的cDNA用T4多核苷激酶(T4 Polynucleotide Kinase) (TaKaRa Biotechnology, Dalian)进行磷酸化反应，磷酸化反应后的cDNA与3接头(5-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3)进行连接。0019 （5）PCR扩增：分别连接有3端和5端接头的cDNA用接头的互补引。

19、物(P1：5-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3 , P2：5-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3 )进行扩增，具体的反应参数为：95 1 min，(94 1 min, 65 30sec，72 2 min 30sec) 30 cycles, 72 10min，扩增后的产物再以相同的引物进行二次扩增。0020 （6）cDNA 文库构建：二次扩增的PCR产物经纯化后，与pMD-18 T载体进行连接后转化大肠杆菌DH5感受态细胞，获得cDNA文库。0021 实施例1本发明的土壤微生物cDNA文库的构建方法，具体步骤如下：（1）原料：新鲜水稻根际土壤，来自福建福州（福建农林大学。

20、教学农场）；（2）土壤微生物总RNA的提取：土壤微生物总RNA的提取参照方长旬等(一种土壤微生物基因组DNA和总RNA的提取方法，申请号：201010548527.X)的专利说明书的方法进行。按照该方法提取获得的土壤微生物基因组DNA和总RNA，利用DNA酶(DNAase I, TaKaRa Biotechnology, Dalian)在37温育10min去除基因组DNA后获得总RNA，总RNA用RNAPure高纯总RNA快速提取试剂盒(北京百泰克公司)和MicroSpin S-400 HR spin column (GE Healthcare, Little Chalfont, UK)进行过。

21、柱纯化。0022 （3）总RNA的逆转录：上述（2）中获得的总RNA采用PrimeScript RT reagent Kit (TaKaRa Biotechnology, Dalian)进行逆转录。具体步骤为：在反应体系中加入2 l 说明书CN 102418151 ACN 102418161 A 4/6页65PrimeScript Buffer，0.5 l PrimeScript RT Enzyme Mix I，0.5 l Oligo dT Primer (50 M)，2 l Random 6 mers (100 M) 和500ng 总RNA，并用RNAase-free H2O 补足至终体。

22、积10 l。反转录反应条件如下: 37 15 min，85 5 sec。逆转录获得的单链cDNA用2.5倍体积的无水乙醇和0.1倍体积3M的醋酸钠溶液(pH=5.2)，于-20下沉淀12 h，后于4 14000rpm离心10min，离心获得的沉淀用 1ml 75%的乙醇，于4 14000rpm离心洗涤10min，重复两次，后去除上清并吹干沉淀，沉淀用50ul无菌水溶解。取3l此cDNA的溶液，于1%琼脂糖凝胶中电泳检测，检测结果见图1A，从图1A可见水稻土壤微生物总RNA经逆转录后形成单链cDNA，单链cDNA为弥散的条带，片段大小主要集中在0.53 kb之间。0023 （4）cDNA 5端接。

23、头连接：上述（3）的cDNA 先用Alkaline Phosphatase (TaKaRa Biotechnology, Dalian)进行5的去磷酸化反应，具体步骤为：在反应体系中加入43ul cDNA, 5ul 10Alkaline Phosphatase Buffer，2ul Alkaline Phosphatase，37反应30min，反应液用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25 ：24 ：1）抽提1次，4 14000rpm离心10min，上清用2.5倍体积的无水乙醇和0.1倍体积3M的醋酸钠溶液(pH=5.2)，于-20下沉淀60min，后于4 14000rpm离心10min，沉淀用1。

24、ml 75%的乙醇于4 14000rpm离心洗涤10min，后去除上清并吹干沉淀，沉淀用10ul无菌水溶解。去磷酸化后的cDNA利用DNA连接酶与5接头(5-CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，5端经磷酸化修饰)于16下连接12 h, 连接产物用2.5倍体积的无水乙醇和0.1倍体积3M的醋酸钠溶液(pH=5.2)，于-20下沉淀12h后离心洗涤，用43ul的无菌水溶解沉淀。0024 (5) cDNA 3端接头连接：将（4）中连有5接头的cDNA加入 2ul T4 Polynucleotide Kinase(TaKaRa Biotechno。

25、logy, Dalian), 5ul 10T4 DNA Polynucleotide Kinase Buffer, 37反应30min,反应体系用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25 ：24 ：1）抽提1次，4 14000rpm离心10min，上清用用2.5倍体积的无水乙醇和0.1倍体积3M的醋酸钠溶液(pH=5.2)，于-20下沉淀60min，沉淀用1ml 75%的乙醇，于4 14000rpm离心洗涤10min，后去除上清并吹干沉淀，沉淀用10ul无菌水溶解。磷酸化反应后的cDNA利用DNA连接酶与3接头(5-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGG。

26、T-3) 于16下连接12 h。0025 （6）PCR扩增：取1ul上述(5)分别连接有3端和5端接头的cDNA，用接头的互补引物(P1：5-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3 , P2：5-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3 )进行扩增，反应体系为10Buffer 5l，dNTP(10mM) 2l，上述引物P1，P2(10M)各2l，Taq DNA聚合酶(5U/l) 0.3l，cDNA 1l，无菌水37.7l，共50l。具体的反应参数为：95 1 min，(94 1 min, 65 30sec，72 2 min 30sec) 30 cycles, 72 10min。扩。

27、增后取1ul作为模板按上述反应参数继续二次扩增，循环数为20，二次扩增结束后取3l于1%琼脂糖凝胶中电泳检测，检测结果见图2A，从图2A可见单链cDNA经扩增得到的双链cDNA也为弥散的条带，片段大小也主要在0.53 kb之间，浓度较单链cDNA大，通过电泳结果可以发现，运用此方法获得的土壤微生物的双链cDNA浓度高，片段丰富。0026 (7) cDNA文库的构建：将(6)中PCR产物经纯化后，与pMD-18 T载体进行连接后42热击转化大肠杆菌DH5感受态细胞，获得水稻土壤微生物cDNA文库，部分结果见图3A，图3A中LB琼脂平板上的每一个白斑含有水稻土壤微生物的一个cDNA，即为水稻土壤微。

28、说明书CN 102418151 ACN 102418161 A 5/6页7生物的一个cDNA克隆。0027 实施例2（1）取新鲜的甘蔗根际土壤来自福建福州（福建农林大学甘蔗园）；，土壤微生物总RNA的提取参照方长旬等(一种土壤微生物基因组DNA和总RNA的提取方法，申请号：201010548527.X)的专利说明书的方法进行。按照该方法提取获得的土壤微生物基因组DNA和总RNA，利用DNA酶(DNAase I, TaKaRa Biotechnology, Dalian)在37温育10min去除基因组DNA后获得总RNA，总RNA用RNAPure高纯总RNA快速提取试剂盒(北京百泰克公司)M。

29、icroSpin S-400 HR spin column (GE Healthcare, Little Chalfont, UK)进行过柱纯化。0028 （3）总RNA的逆转录：上述（2）中获得的总RNA采用PrimeScript RT reagent Kit (TaKaRa Biotechnology, Dalian)进行逆转录。具体步骤为：在反应体系中加入2 l 5PrimeScript Buffer，0.5 l PrimeScript RT Enzyme Mix I，0.5 l Oligo dT Primer (50 M)，2 l Random 6 mers (100 M) 和500n。

30、g 总RNA，并用RNAase-free H2O 补足至终体积10 l。反转录反应条件如下: 37 15 min，85 5 sec。逆转录获得的单链cDNA用2.5倍体积的无水乙醇和0.1倍体积3M的醋酸钠溶液(pH=5.2)，于-20下沉淀12 h，后于4 14000rpm离心10min，离心获得的沉淀用 1ml 75%的乙醇，于4 14000rpm离心洗涤10min，重复两次，后去除上清并吹干沉淀，沉淀用50ul无菌水溶解。取3l此cDNA的溶液，于1%琼脂糖凝胶中电泳检测，检测结果见图1B，从图1B可见甘蔗土壤微生物总RNA经逆转录后形成单链cDNA，单链cDNA为弥散的条带，片段大小主。

31、要集中在0.53 kb之间。0029 （4）cDNA 5端接头连接：上述（3）的cDNA 先用Alkaline Phosphatase (TaKaRa Biotechnology, Dalian)进行5的去磷酸化反应，具体步骤为：在反应体系中加入43ul cDNA, 5ul 10Alkaline Phosphatase Buffer，2ul Alkaline Phosphatase，37反应30min，反应液用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25 ：24 ：1）抽提1次，4 14000rpm离心10min，上清用2.5倍体积的无水乙醇和0.1倍体积3M的醋酸钠溶液(pH=5.2)，于-20下沉淀6。

32、0min，后于4 14000rpm离心10min，沉淀用1ml 75%的乙醇于4 14000rpm离心洗涤10min，后去除上清并吹干沉淀，沉淀用10ul无菌水溶解。去磷酸化后的cDNA利用DNA连接酶与5接头(5-CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，5端经磷酸化修饰)于16下连接12 h, 连接产物用2.5倍体积的无水乙醇和0.1倍体积3M的醋酸钠溶液(pH=5.2)，于-20下沉淀12h后离心洗涤，用43ul的无菌水溶解沉淀。0030 (5) cDNA 3端接头连接：将（4）中连有5接头的cDNA加入 2ul T4 Polynucl。

33、eotide Kinase(TaKaRa Biotechnology, Dalian), 5ul 10T4 DNA Polynucleotide Kinase Buffer, 37反应30min,反应体系用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25 ：24 ：1）抽提1次，4 14000rpm离心10min，上清用用2.5倍体积的无水乙醇和0.1倍体积3M的醋酸钠溶液(pH=5.2)，于-20下沉淀60min，沉淀用1ml 75%的乙醇，于4 14000rpm离心洗涤10min，后去除上清并吹干沉淀，沉淀用10ul无菌水溶解。磷酸化反应后的cDNA利用DNA连接酶与3接头(5-CTAATACGACTCA。

34、CTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3) 于16下连接12 h。0031 (6) PCR扩增：取1ul上述(5)分别连接有3端和5端接头的cDNA，用接头的互补说明书CN 102418151 ACN 102418161 A 6/6页8引物(P1：5-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3 , P2：5-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3 )进行扩增，反应体系为10Buffer 5l，dNTP(10mM) 2l，上述引物P1，P2(10M)各2l，Taq DNA聚合酶(5U/l) 0.3l，cDNA 1l，无菌水37.7l，共50l。具体的反应。

35、参数为：95 1 min，(94 1 min, 65 30sec，72 2 min 30sec) 30 cycles, 72 10min。扩增后取1ul作为模板按上述反应参数继续二次扩增，循环数为20，二次扩增结束后取3l于1%琼脂糖凝胶中电泳检测，检测结果见图2B，从图2B可见单链cDNA经扩增得到的双链cDNA也为弥散的条带，片段大小也主要在0.53 kb之间，浓度也较单链cDNA大，通过电泳结果可以发现，运用此方法获得的土壤微生物的双链cDNA浓度高，片段丰富。0032 (7) cDNA文库的构建：将(6)中PCR产物经纯化后，与pMD-18 T载体进行连接后42热击转化大肠杆菌DH5感受态细胞，获得甘蔗土壤微生物cDNA文库图3B，图3B中LB琼脂平板上的每一个白斑含有甘蔗土壤微生物的一个cDNA，即为甘蔗土壤微生物的一个cDNA克隆。说明书CN 102418151 ACN 102418161 A 1/2页9图1图2说明书附图CN 102418151 ACN 102418161 A 2/2页10图3说明书附图CN 102418151 A。

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