一种用于靶向人鼻咽癌细胞的核酸适配体序列及应用.pdf

本发明属细胞生物技术领域，具体涉及一种用于靶向人鼻咽癌细胞的核酸适配体的序列及应用。本发明筛选与人鼻咽癌细胞株5-8F特异性结合的核酸适配体，获得具有特异结合5-8F的序列S3。所述鼻咽癌细胞5-8F的核酸适配体在0℃、0.157mol/L Na+、0.005mol/L Mg2+条件下具有独特的茎环结构。所述鼻咽癌细胞5-8F的核酸适配体序列在制备鼻咽癌诊断试剂、治疗鼻咽癌药物、鼻咽癌的肿瘤标志物等方面，以及在研究鼻咽癌与正常组织的差异性、鼻咽癌组织切片成像、鼻咽癌相关的活体成像、鼻咽癌的靶向治疗等方面具有应用前景。

权利要求书
1.  一种可用于靶向人鼻咽癌细胞株5-8F的核酸适配体序列S3，其特征在于序列如下所示：
5’-ATCCAGAGTGACGCAGCATCTGAGAATAGTGGTTTGCTGTATGGTGGGCGTTGAAAGAGGGGTGGACACGGTGGCTTAGT-3’。

2.  如权利要求1所述鼻咽癌细胞5-8F的核酸适配体序列S3在制备鼻咽癌诊断试剂中的应用。

3.  如权利要求1所述鼻咽癌细胞5-8F的核酸适配体序列S3在制备治疗鼻咽癌药物中的应用。

4.  如权利要求1所述鼻咽癌细胞5-8F的核酸适配体序列S3在研究鼻咽癌与正常组织的差异性中的应用。

5.  如权利要求1所述鼻咽癌细胞5-8F的核酸适配体序列S3在制备鼻咽癌的肿瘤标志物中的应用。

6.  如权利要求1所述鼻咽癌细胞5-8F的核酸适配体序列S3在鼻咽癌组织切片成像中的应用。

7.  如权利要求1所述鼻咽癌细胞5-8F的核酸适配体序列S3在鼻咽癌相关的活体成像中的应用。

8.  如权利要求1所述鼻咽癌细胞5-8F的核酸适配体序列S3在鼻咽癌的靶向治疗中的应用。

说明书一种用于靶向人鼻咽癌细胞的核酸适配体序列及应用
技术领域
本发明属细胞生物技术领域。具体涉及一种鼻咽癌细胞的核酸适配体的序列及应用。
背景技术
鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我国南方及东南亚国家或地区高发的一种上皮源性恶性肿瘤，具有明显的种族聚集性和地域性。鼻咽癌对放疗和化疗高度敏感，但其疗效与疾病的进展程度相关。不幸的是，大部分鼻咽癌患者就诊时已是III或IV期。此时，单独放疗的5年生存率仅为35-52％。联合化疗可以有效提高治疗效果，但毒副作用明显增强。因此，发展早期诊断的方法对提高整体疗效十分关键。常规的临床检测方法如鼻内镜检查、病理切片等，由于有一定的技术要求且费用较高，不适合用于大规模的筛选普查。EB病毒与鼻咽癌发病相关，被国际癌症研究署分类为I组致癌原。血清学检测针对EB病毒的抗体如病毒壳蛋白抗原免疫球蛋白A(VCA/IgA)，早期抗原免疫球蛋白A(EA/IgA)和EB病毒核抗原免疫球蛋白A(EBNA1/IgA)等已被用作高危人群的血清学筛查，但其敏感度和特异性均较低。因此，筛选鼻咽癌特异的分子探针，鉴定鼻咽癌特异的分子标志物对于该疾病的早期诊断和治疗具有重要意义。
核酸适配体(aptamer)，也被称为“化学抗体”，是指从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的、能够高亲和性和高特异性地与蛋白质等生物靶标结合的单链寡核苷酸。其靶标可以是有机小分子、金属离子、蛋白质、细胞甚至组织。核酸适配体通过氢键、范德华力、疏水作用等分子间作用力形成特殊的三维结构，如假结、发卡、G-四聚体等，从而特异地识别靶物质并影响其生物活性。与抗体相比，核酸适配体具有许多独特的性质，如：快速、可重复合成；便于修饰以满足诊断和治疗的需要；稳定性好，易于保存；毒性和免疫原性小；快速的组织穿透性等等。这些优点使得核酸适配体可作为一种新的分子探针应用于临床早期诊断、分子医学研究，阐明疾病(特别是肿瘤)的分子基础，并研究疾病发生发展的分子机理，以实现疾病的早期诊断和治疗。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种具有高特异性和高亲和力的鼻咽癌核酸适配体。
本发明的第二个目的是提供鼻咽癌特异性核酸适配体在与鼻咽癌相关方面的应用。
所述鼻咽癌特异性核酸适配体的序列(命名为S3序列)如下：
5’-atccagagtg acgcagcatc tgagaatagt ggtttgctgt atggtgggcg ttgaaagagg ggtggacacg gtggcttagt-3’；
所述鼻咽癌特异性核酸适配体S3的应用如下：
(1)、所述鼻咽癌核酸适配体S3在制备鼻咽癌诊断试剂中的应用。
(2)、所述鼻咽癌核酸适配体S3在制备治疗鼻咽癌药物中的应用。
(3)、所述鼻咽癌核酸适配体S3在研究鼻咽癌与正常组织的差异性中的应用。
(4)、所述鼻咽癌核酸适配体S3在制备鼻咽癌的肿瘤标志物中的应用。
(5)、所述鼻咽癌核酸适配体S3在鼻咽癌组织切片成像中的应用。
(6)、所述鼻咽癌核酸适配体S3在鼻咽癌肿瘤相关的活体成像中的应用。
(7)、所述鼻咽癌核酸适配体S3在鼻咽癌靶向治疗中的应用。
本发明的优点在于：
基于细胞的核酸适配体筛选方法保证了细胞表面所表达的生物大分子更加接近于生物体内的分子构象。而且，所得的核酸适配体无毒性、分子量小、渗透性好、易于合成与标记。上述优点使得所述核酸适配体在生物医学检测、肿瘤生物标志物发现以及靶向治疗方面将有重要的应用价值。
附图说明
图1为本发明实例中利用Mfold软件模拟序列S3核酸适配体的二级结构示意图
图2为实施例1中流式细胞仪测定所得核酸适配体序列S3对鼻咽癌细胞5-8F的偏移。在图2中，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞个数，实线为起始DNA随机文库，虚线为序列S3.
图3为实施例2中流式细胞仪测定所得核酸适配体序列S3对鼻咽癌细胞5-8F的解离常数，解离常数为Kd＝11.9329±1.3997。在图3中，横坐标为DNA浓度(nmol/L)，纵坐标为平均荧光强度。
图4为实施例3中应用荧光纳米颗粒量子点及生物素标记的序列S3识别鼻咽癌组织切片的结果。
具体实施方式
实施例1流式分析法检测序列S3与鼻咽癌细胞5-8F的结合能力
将对数生长期的5-8F细胞用非酶消化液消化后打散，离心去上清，收集细胞用洗涤缓冲液洗涤两次。细胞与含有250nM DNA序列(FAM标记的序列S3及对照用FAM标记的起始文库)、10％胎牛血清的结合缓冲液冰上避光孵育0.5h。随后离心并去除上清，收集的细胞用 洗涤缓冲液洗涤两次，最后收集的细胞加入200μl的结合缓冲液，用于流式细胞仪检测。结果如图2所示，与起始文库相比，序列S3产生较大的峰移，说明序列S3能够很好地检测鼻咽癌细胞5-8F。
实施例2流式分析法检测序列S3对鼻咽癌细胞5-8F的解离系数
解离常数测定的操作与实施例1的操作基本一致，平行配置不同浓度的序列S3，以流式细胞仪的荧光值为纵坐标，以序列S3的浓度为横坐标，由Y＝Bmax×X/(Kd+X)方程模拟曲线，得到序列S3的解离常数。结果如图3所示，序列S3与靶细胞5-8F的结合能力很强，解离常数为11.9329±1.3997nM。
实施例3检测序列S3与鼻咽癌组织切片的结合
将石蜡包埋的鼻咽癌组织切片放置于60℃烤箱2h，切片浸于二甲苯中脱蜡两次，每次15min；随后浸入无水乙醇两次，每次5min；切片依次经过梯度乙醇(95％、90％、80％、70％乙醇各一次，每次2min)，最后浸入PBS；微波修复法对切片进行抗原修复，待冷却至室温，使用PBS洗两次；随后使用含有20％胎牛血清和鲑鱼精DNA的结合缓冲液室温封闭1h；去除封闭液，加入生物素标记的序列S3(200nM)于4℃孵育1h；洗涤缓冲液洗3次，每次5min；随后加入链霉亲和素修饰的量子点，室温孵育0.5h；经洗涤后，封片，荧光显微镜下观察。结果如图4所示，序列S3能够特异性识别切片中的鼻咽癌细胞，但与正常的鼻咽组织呈现较弱或无结合，从而在临床上可用于鼻咽癌的检测和诊断。