用于治疗豚草变态反应的包含AMBA1肽的疫苗.pdf

本发明涉及用于通过免疫耐受作用预防或治疗对豚草的变态反应的组合物。所述组合物是基于来源于豚草花粉中主要变应原Amb a 1的肽片段的组合。本发明还涉及可用于联合提供本发明多肽的产物、载体和制剂。本发明还涉及确定T细胞是否识别本发明多肽的体外方法，和确定个体是否患有疾患或处于疾患风险中的体外方法，其中所述疾患以应答于豚草变应原的变应性症状为特征。

权利要求书
1.  一种分离的多肽，所述分离的多肽能够诱导T细胞中IL-10释放，且所述分离的多肽的氨基酸序列由以下组成：
(i)KGEAAIKLTSSAGVLSKK(SEQ ID NO:10；RGW07D)的序列；
(ii)包含1个、2个或3个氨基酸取代的序列(i)的变体；
(iii)包含序列(i)的多于15个连续氨基酸的序列(i)的片段；
(iv)GESALSLTSSAGVLS(SEQ ID NO:8；RGW07B)的序列；或
(v)包含如(i)至(iv)中任一项定义的序列的长度直至20个氨基酸的较长序列。

2.  根据权利要求1所述的分离的多肽，所述分离的多肽具有选自以下的一种或多种修饰：
(i)N末端乙酰化；
(ii)C末端酰胺化；
(iii)精氨酸和/或赖氨酸侧链胺上的一个或多个氢被亚甲基代替；
(iv)糖基化；和
(v)磷酸化。

3.  根据权利要求1所述的分离的多肽，所述分离的多肽的氨基酸序列由以下组成：KGEAAIKLTSSAGVLSKK(SEQ ID NO:10；RGW07D)、KGEAAIKLTSSAGVLSK(SEQ ID NO:9；RGW07C)、或GESALSLTSSAGVLS(SEQ ID NO:8；RGW07B)。

4.  一种包含如权利要求1定义的多肽的组合物。

5.  根据权利要求4所述的组合物，还包含多肽(a)和多肽(b)、多肽(a)和多肽(c)、或多肽(b)和多肽(c)；其中所述多肽(a)至(c)为：
(a)选自RDLLENGAIFLPSG、DVFENGAIFVPSG和 KDLLENGAIFVTSG(SEQ ID NO.9、8和7)的多肽；
(b)选自GMIKSNDGPPI、GLIKSHDGPPV和GLIKSNDGPAA(SEQ ID NO.1、2和3)的多肽；且
(c)选自KAGMIPAEPGEA和SAGMIPAEPGEA(SEQ ID No:10和11)的多肽。

6.  根据权利要求4所述的组合物，所述组合物包含药学上可接受的运载体或稀释剂。

7.  根据权利要求4所述的组合物，所述组合物被提供作为注射溶液、悬液或乳液。

8.  根据权利要求4所述的组合物，所述组合物被配制用于肠胃外、皮下、皮内或经皮施用。

9.  如权利要求1定义的多肽在制备用于治疗或预防豚草变态反应的药物中的用途。

10.  如权利要求4定义的组合物在制备用于治疗或预防豚草变态反应的药物中的用途。

11.  一种制备药物组合物的方法，所述方法包括将如权利要求1定义的多肽与药学上可接受的运载体或稀释剂组合。

12.  根据权利要求11所述的方法，包括将如权利要求1定义的多肽和另外的如权利要求5定义的多肽与药学上可接受的运载体或稀释剂组合。

13.  根据权利要求12所述的方法，包括将以下多肽与药学上可接受的运载体或稀释剂组合：
-GMIKSNDGPPI(SEQ ID NO:1)、
-RDLLENGAIFLPSG(SEQ ID NO:9)、
-SAGMIPAEPGEA(SEQ ID NO:11)、
-GSSQIWIDHSSLSKS(SEQ ID NO:4)、
-KEGTLRFAAAQNRP(SEQ ID NO:12)、
-AINNDKTIDGRGAKVE(SEQ ID NO:15)、和
-KGEAAIKLTSSAGVLSKK(SEQ ID NO:20)。

说明书用于治疗豚草变态反应的包含Amb a 1肽的疫苗
本申请是申请日为2009年8月14日，申请号为200980139316.6，发明名称为“用于治疗豚草变态反应的包含Amb a 1肽的疫苗”的申请的分案申请。
通过引用并入
以下优先权申请的内容通过引用并入本文：2008年8月15日提交的英国专利申请第0814986.6号；均在2008年8月15日提交的国际专利申请第PCT/GB08/002781和PCT/GB08/002779号；2008年8月20日提交的英国专利申请第0815218.3号和2009年5月1日提交的欧洲专利申请第09251252.4号。
发明领域
本发明涉及用于预防或治疗对豚草的变态反应的组合物。
发明背景
T细胞抗原识别需要抗原呈递细胞(APC)在其细胞表面上呈递与主要组织相容性复合物(MHC)的分子缔合的抗原片段(肽)。T细胞使用其抗原特异性T细胞受体(TCR)来识别由APC呈递的抗原片段。这样的识别作为免疫系统的触发器起作用来产生一系列应答以根除已被识别的抗原。
生物体如人类的免疫系统对外部抗原的识别可在某些情况下造成疾病，其被称作特应性疾患。后者的实例是变应性疾病，包括哮喘、特应性皮炎和变应性鼻炎。在这一组疾病中，B淋巴细胞产生对外源产生的抗原 结合的IgE类抗体(在人类中)，所述抗原在本文称为变应原，因为这些分子引发变应性应答。变应原特异性IgE的产生依赖于也被变应原活化(并对其有特异性)的T淋巴细胞。借助于诸如嗜碱性细胞和肥大细胞的细胞对IgE表面受体的表达，变应原特异性的IgE抗体结合到这些细胞表面。
变应原对结合在表面的IgE分子的交联造成这些效应细胞脱粒，导致炎症介质诸如组胺、5-羟色胺和脂质介质如硫桥白三烯(sulphidoleukotriene)的释放。除了IgE依赖性事件，某些变应性疾病诸如哮喘的特征为IgE独立性事件。
目前用提供症状缓解或预防的剂来治疗IgE介导的变应性疾病。这种剂的实例是抗组胺剂、β2激动剂和糖皮质类固醇。此外，通过包括变应原成分或提取物的定期注射的去敏化程序来治疗一些IgE介导的疾病。去敏化治疗可诱导与IgE竞争变应原的IgG应答，或可诱导阻断针对变应原的IgE的合成的特定抑制性T细胞。这种形式的治疗不是总有效，并且具有激起严重副作用特别是一般变应性休克的风险。这可以是致命的，除非立即意识到并用肾上腺素治疗。将减少或消除针对特定变应原的不想要的变应性-免疫应答的、而不改变对其它外来抗原的免疫反应性的、或不触发本身变应性应答的治疗性处理将对变应性个体大有益处。
普遍认为，豚草变应原是包括哮喘、变应性鼻炎和变应性皮炎在内的人类和动物变应性疾病的主要原因。豚草花粉中存在的蛋白尤其重要。例如，美国大约75％的枯草热患者对豚草花粉是变应性的。枯草热是一种形式的季节性变态反应的统称，其特征是喷嚏、流鼻涕和目痒。术语“枯草热”出现是因为这种形式的变应性疾病在“采干草季节”期间最流行，这对应许多植物的开花季节，此时其释放最大量的花粉。这从夏末到早秋尤其流行，尤其是从六月末到九月末(在北半球)。
已计算获得，对于美国成年人，枯草热是第5种主要的慢性病，是缺勤的主要原因，导致每年失去或减少近400万个工作日，造成总生产力损失方面共超过7亿美元的损失。变态反应还是最频繁报告的儿童慢性疾患，限制了多于40％儿童的活动。每年在美国，变态反应占多于1700万门诊办公室拜访；季节性变态反应诸如枯草热占这些变态反应拜访的多于一 半。
因此，治疗性或预防性治疗对于患有豚草变态反应或处于患豚草变态反应风险中的人们将大有益处。
发明概述
豚草变态反应通常是由豚草(Ambrosia artemisiifolia)造成的。豚草花粉中的主要变应原是Amb a 1。这种蛋白以大量不同同种型存在，Amb a 1.1、1.2、1.3和1.4。本发明的发明人已发现，来源于Amb a 1蛋白的肽片段的某些组合对于使个体对这些变应原去敏化特别有用。选择本发明的多肽组合是由于它们的如下能力：结合许多MHC II类分子、高度可溶、不触发来自从一组豚草变应性个体提取的嗜碱性细胞的组胺释放、和在一组豚草变应性个体的高比例受治疗者中诱导细胞因子应答。因此，可向个体提供本发明的组合物、产物、载体和制剂以通过免疫耐受作用预防或治疗对豚草的变态反应。
通过计算机模拟方法选择本发明的肽为可能的T细胞表位。当鉴定包含表位的区域时，进一步分析它们来确定其中哪些在四种不同Amb a 1同种型之间是高度保守的。然后进一步筛选这些候选多肽在免疫耐受中的潜在用途。更具体地，分析其溶解度特征、和诱导细胞因子从来源于豚草变应性个体的PBMC的释放能力。在一些情形，改造肽序列以改进溶解度和/或减少二聚体形成。
与基于肽免疫的去敏化方法相关的困难在于如何选择变应原的合适的大小和区域作为用于免疫的肽的基础。所选择的肽的大小是关键的。如果肽太小，疫苗将不能有效引起免疫应答。如果肽太大，或如果将完整抗原引入个体，则存在引起副作用诸如过敏反应的风险，这可能是致命的。如果肽可溶性差，这种风险可能更大。
已经选择本发明的多肽以保持T细胞特异性，同时所述多肽的尺寸足够小以不具备将使其保留完整分子的IgE结合表位的构象的显著三级结构。因此，本发明的多肽不引起细胞诸如肥大细胞和嗜碱性细胞上相邻的 特异性IgE分子的显著交联，并已显示不导致来自人类嗜碱性细胞的显著组胺释放。
本发明的优势是肽广泛地靶向主要组织相容性复合物(MHC)分子的能力。T细胞受体(TCR)在其特异性方面是高度可变的。如同抗体分子一样，经由细胞中的基因重组事件产生变异性。TCR识别结合到由主要组织相容性复合物(MHC)的基因所编码的分子的短肽形式的抗原。这些基因产物是产生用于移植中的“组织型”的相同分子，并且还被称为人类白细胞抗原分子(HLA)，该术语可被互换地使用。单独的MHC分子具备肽结合沟，由于它们的形状和电荷，其只能够结合有限的一组肽。被一个MHC分子结合的肽可能不一定被其它MHC分子结合。
当蛋白分子诸如抗原或变应原被抗原呈递细胞诸如B淋巴细胞、树突细胞、单核细胞和巨噬细胞吸收时，该分子在细胞中被酶促降解。降解过程产生所述分子的肽片段，如果它们具有合适的大小、电荷和形状，则可能结合到某些MHC分子的肽结合沟之内，并随后展示在抗原呈递细胞表面上。如果肽/MHC复合物以足够数量呈递在抗原呈递细胞表面上，则它们可能活化带有合适的肽/MHC特异性T细胞受体的T细胞。
由于MHC的多态性质，远系繁殖群体诸如人类中的个体将在其细胞表面上表达不同组合的MHC分子。由于不同MHC分子可基于肽的大小、电荷和形状而结合来自同一分子的不同肽，不同个体将展示与其MHC分子结合的不同库的肽。鉴定远系繁殖群体诸如人类中的通用MHC-结合肽表位比在近亲繁殖的动物(诸如实验小鼠的某些品系)中更困难。基于个体之间MHC的差异表达以及其带来的肽结合与呈递的固有差异，不太可能鉴定可用于人类去敏化治疗的单种肽。
本发明的另一益处是基于在豚草变应性个体新鲜分离的PBMC中观察的应答来选择肽和肽组合。不同于其中为了检验T细胞应答而从变应性患者建立克隆细胞系的人造情况，评价新鲜分离的PBMC的先体外后体内应答允许代表性地观察不同肽的相对群体重要性而没有培养过程引起的可能的变形。
然而，本发明的肽组合通过靶向多种不同MHC分子而提供对人类群 体覆盖面广泛的效力。这种广泛的覆盖面由本发明的肽组合在群体的许多个体中导致阳性细胞因子应答的能力来阐释。因此，以本发明的肽配制的疫苗将具有广泛的应用。
本发明人的工作产生了具有以下特征的肽组合：
-该组合在来自一组豚草变应性个体的高比例受治疗者中诱导细胞因子应答；
-组合中的肽是可溶的；
-组合中的肽在一组豚草变应性个体中不引起显著的组胺释放。
因此，本发明提供用于通过免疫耐受作用预防或治疗对豚草的变态反应的组合物，所述组合物包括选自SEQ ID NO 1至31的至少一种多肽。通常，该组合物包括至少四种多肽，其中所述多肽独立地选自以下任一种：
(i)SEQ ID NO 1至31的多肽；或
(ii)根据(i)的多肽的变体，其中所述变体是长度为9至30个氨基酸的多肽，所述多肽包含由以下组成的区域：
-(i)的任何序列；或
-与(i)的任何序列具有至少65％同源性的序列，该序列能够使得
个体免疫耐受(i)的任何序列；或
(iii)根据(i)的多肽的变体，其中所述变体是长度为9至30个氨基酸的多肽，所述多肽包含由表示以下任一个的序列组成的区域：
-(i)的任何序列的片段；或
-(i)的任何序列的片段的同系物，
该序列能够使得个体免疫耐受(i)的任何序列并具有至少9个氨基酸的长度，而且其中所述同系物与(i)的任何序列中任何9个连续氨基酸具有至少65％的同源性。
此外，本发明还提供了以下方面的公开内容：
A1.一种用于通过免疫耐受作用预防或治疗对豚草的变态反应的组 合物，该组合物包括：
(i)选自RGW03B、RGW03A或RGW03(SEQ ID NO.9、8或7)的至少一种原始多肽或其变体；
(ii)选自RGW01、RGW01A或RGW01B(SEQ ID NO.1、2或3)的至少一种原始多肽或其变体；
iii)选自RGW04或RGW04A(SEQ ID No:10或11)的至少一种原始多肽或其变体；和
(iv)任选地，独立地选自SEQ ID NO.4-6和12-31的任一种的一种或多种原始多肽或其变体；
其中所述变体是：
(a)长度为9至20个氨基酸的多肽，所述多肽包含由以下所组成的区域：
-等效的原始肽序列；或
-与等效的原始肽序列具有至少65％同源性的同源序列，所述序列能够使得个体免疫耐受所述等效的原始肽序列，或
(b)长度为9至20个氨基酸的多肽，所述多肽包含由表示以下任一个的序列所组成的区域：
-等效的原始肽序列的片段；或
-等效的原始肽序列的片段的同系物，
所述序列能够使得个体免疫耐受所述等效的原始肽序列并具有至少9个氨基酸的长度，而且其中所述同系物与所述等效的原始肽序列中任何9个连续氨基酸具有至少65％的同源性。
A2.根据A1所述的组合物，其中所述组合物：
a)能够使得一组豚草变应性个体的群体中至少50％或至少60％免疫耐受；和/或
b)包括至少一种另外的多肽，最多总共十三种独特的/不同的多肽， 其中所述另外的多肽：
-包含与以上SEQ ID NO：1至31中任一个的至少9个或更多个连续氨基酸具有至少65％的序列同一性、在(i)至(iv)中未被选择的序列；且
-长度是9至30个氨基酸；和/或
c)包括最多达十三种多肽。
A3.根据A1或A2所述的组合物，所述组合物包括至少一种根据A2(b)的多肽，所述多肽长度是9至20或13至17个氨基酸，和/或其中所述多肽与SEQ ID NO：1至31中任一个的至少9个或更多个连续氨基酸具有至少70％的序列同一性。
A4.根据前述A1-A3任一项所述的组合物，所述组合物包括多肽RGW01或A1(a)或(b)定义的其变体；多肽RGW03B或A1(a)或(b)定义的其变体；和多肽RGW04A或A1(a)或(b)定义的其变体。
A5.根据前述A1-A4任一项所述的组合物，所述组合物包括选自RGW02、RGW09、RGW06、RGW06A、RGW10或RGW10A、RGW05或RGW05A的多肽(SEQ ID NO.4、26、14、15、27、12或13)、或A1(a)或(b)定义的其变体的至少一种多肽；任选地还包括RGW07、RGW07C或RGW07D的多肽(SEQ ID NO.16、19或20)、或A1(a)或(b)定义的其变体。
A6.根据前述A1-A5任一项所述的组合物，所述组合物包括RGW01或A1(a)或(b)定义的其变体；RGW03B或A1(a)或(b)定义的其变体；RGW04A或A1(a)或(b)定义的其变体；RGW02或A1(a)或(b)定义的其变体；RGW05或A1(a)或(b)定义的其变体；RGW06A或A1(a)或(b)定义的其变体；和RGW07D或A1(a)或(b)定义的其变体。
A7.根据前述A1-A6任一项所述的组合物，其中：
(i)所述多肽中的一种或多种具有选自以下的一种或多种修饰：
(a)N末端乙酰化；
(b)C末端酰胺化；
(c)精氨酸和/或赖氨酸侧链胺上的一个或多个氢被亚甲基代替；
(d)糖基化；和
(e)磷酸化；和/或
(ii)所述肽的至少一种已被改造为可溶以使其包含：
(a)在T细胞表位侧翼的所述肽的残基的N末端：一个至六个连续氨基酸，它们与衍生所述肽的蛋白序列中所述残基的N末端紧接的两个至六个连续氨基酸相对应；和/或
(b)在T细胞表位侧翼的所述肽的残基的C末端：一个至六个连续氨基酸，它们与衍生所述肽的蛋白序列中所述残基的C末端紧接的一个至六个连续氨基酸相对应；或
(c)在T细胞表位侧翼的所述肽的残基的N末端和/或C末端，选自精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的至少一个氨基酸，
其中所述多肽具有至少3.5mg/ml的溶解度，而且所述T细胞表位具有少于3.5mg/ml的溶解度；和/或
(iii)所述肽的至少一种已被改造为可溶以使另外地：
(a)所述肽的天然序列中的任何半胱氨酸残基被丝氨酸或2-氨基丁酸代替；和/或
(b)缺失了在所述肽的天然序列的N末端和/或C末端的最多三个氨基酸中、不包含在T细胞表位中的任何疏水残基；和/或
(c)缺失了在所述肽的天然序列的N末端和/或C末端的最多四个氨基酸中包含序列Asp-Gly的、不包含在T细胞表位中的任何两个连续氨基酸；和/或
(iv)每种多肽具有在0.03nmol/ml至200nmol/ml、0.3nmol/ml至200nmol/ml或30nmol/ml至120nmol/ml的范围内的浓度。
A8.一种用于通过免疫耐受作用预防或治疗对豚草的变态反应的组合物，所述组合物包括至少三种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列在被表 达时导致A1至A7任一项定义的组合物的产生，其中任选地，能够表达不同多肽的每种多核苷酸序列存在于相同或不同的多核苷酸载体中。
A9.一种用于通过免疫耐受作用预防或治疗对豚草的变态反应的载体，所述载体包括各自编码A1或A2定义的不同多肽的三种到十三种不同的多核苷酸序列，其中至少一种多核苷酸编码选自以下多肽组的每一组的多肽：
a)RGW01、RGW01A或RGW01B(SEQ ID NO:1、2或3)或A1(a)或(b)定义的其变体；
b)RGW03B、RGW03A或RGW03(SEQ ID NO:9、8或7)或A1(a)或(b)定义的其变体；和
c)RGW04或RGW04A(SEQ ID NO:10或11)或A1(a)或(b)定义的其变体。
A10.一种包括三种到十三种多肽的产物，其中至少一种多肽选自以下多肽组的每一组：
a)RGW01、RGW01A或RGW01B(SEQ ID NO:1、2或3)或A1(a)或(b)定义的其变体；
b)RGW03B、RGW03A或RGW03(SEQ ID NO:9、8或7)或A1(a)或(b)定义的其变体；和
c)RGW04或RGW04A(SEQ ID NO:10或11)或A1(a)或(b)定义的其变体；
其中每种不同多肽是为了同时、分别或顺序地用于通过免疫耐受作用预防或治疗对豚草的变态反应。
A11.一种包括各自编码A1或A2定义的不同多肽的三种到十三种多核苷酸序列的产物，其中至少一种多核苷酸编码选自以下多肽组的每一组的多肽：
a)RGW01、RGW01A或RGW01B(SEQ ID NO:1、2或3)或A1(a)或(b)定义的其变体；
b)RGW03B、RGW03A或RGW03(SEQ ID NO:9、8或7)或A1(a)或(b)定义的其变体；和
c)RGW04或RGW04A(SEQ ID NO:10或11)或A1(a)或(b)定义的其变体；
而且其中每种不同多肽是为了同时、分别或顺序地用于预防或治疗人类对豚草的变态反应。
A12.一种用于通过免疫耐受作用预防或治疗对豚草的变态反应的药物制剂，所述药物制剂包括根据A1至A8任一项的组合物；根据A9的载体；或根据A10或A11的产物；和药学上可接受的运载体或稀释剂；
其中任选地，所述组合物、载体或产物被配制为用于口服施用、鼻内施用、表皮施用、皮下施用、舌下施用、皮内施用、口腔施用或用于通过吸入或通过注射施用。
A13.如A1至A8任一项定义的组合物或如A10或A11定义的产物，所述组合物或产物另外地包括另外的多肽变应原，用于使得个体免疫耐受所述另外的多肽变应原。
A14.一种确定T细胞是否识别A1定义的组合物的体外方法，所述方法包括将所述T细胞与所述组合物接触并检测所述T细胞是否被所述组合物刺激。
A15.一种确定个体是否患有疾患或处于疾患风险中的体外方法，其中所述疾患以应答于豚草变应原的变应性症状为特征，所述方法包括测试个体是否具有对A1至A8任一项定义的组合物应答的T细胞，从而确定所述个体是否患有疾患或处于疾患风险中；
其中任选地，针对所述组合物的T细胞免疫应答通过如下来测量：在允许所述组合物与所述T细胞相互作用的条件下将所述组合物与从受治疗者获取的样品中的T细胞接触；并确定是否有任何T细胞被刺激了，从而确定是否存在T细胞免疫应答。
附图简述
图1显示由IL-13或IFN-γ的产生测量的对本发明的不同肽组合应答的个体百分比。
图2显示以本发明的不同肽刺激来自豚草变应性个体的PBMC时IL-10的平均产生量(pg/ml)。
图3显示以不同肽组合刺激来自豚草变应性个体的PBMC时产生IL-10的水平(pg/ml)。
本文提及的序列的描述
SEQ ID NO：1至31提供本发明的多肽序列。SEQ ID NO：32及其后提供另外的序列。
发明详述
本发明涉及可用于免疫耐受作用的肽和肽组合。这样的肽可包括以下显示的序列、由以下显示的序列组成或基本上由以下显示的序列组成：SEQ ID NO 1至31的任一个。还可使用这些特定肽的变体。所述变体可包括以下序列、由以下序列组成或基本上由以下序列组成：所述序列是SEQ ID NO 1至31任一个的片段或SEQ ID NO 1至31任一个的同系物的片段。
在一个实施方案中，本发明涉及用于预防或治疗对豚草的变态反应的组合物。组合物通常包括至少四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种或十二种、最多达十三种多肽，或由其组成。换言之，组合物包括四种至十三种多肽。多肽独立地选自以下任一种：
(i)SEQ ID NO 1至31的多肽；或
(ii)根据(i)的多肽的变体，其中所述变体是长度为9至30个氨基酸的多肽，所述多肽包含由以下组成的区域：
-(i)的任何序列；或
-与(i)的任何序列具有至少65％同源性的序列，该序列能够使得
个体免疫耐受(i)的任何序列，或
(iii)根据(i)的多肽的变体，其中所述变体是长度为9至30个氨基酸的多肽，所述多肽包含由表示以下任一个的序列组成的区域：
-(i)的任何序列的片段；或
-(i)的任何序列的片段的同系物，
该序列能够使得个体免疫耐受(i)的任何序列并具有至少9个氨基酸的长度，而且其中所述同系物与(i)的任何序列中任何9个连续氨基酸具有至少65％的同源性。
本发明还提供包括本发明的多肽的产物和制剂，以及组合物、产物和载体，所述组合物、产物和载体包括能够表达用于通过免疫耐受作用预防或治疗豚草变态反应的本发明的多肽的多核苷酸。这种免疫耐受作用通常将是针对存在于SEQ ID NO 1至31任一个中的表位(例如II类MHC表位)。
豚草物种
豚草物种豚草(Ambrosia artemisiifolia)(common ragweed)和在较低程度上的三裂叶豚草(Ambrosia trifida)(giant ragweed)在全世界造成高比例的豚草变态反应，尤其是豚草花粉相伴的变态反应，诸如枯草热。豚草是北美土生的，但已扩散到全世界的大多数大陆。在北半球，豚草从七月初至八月中开花，或直到更冷的天气到来。豚草是一种先锋植物，充分适应于开拓新的受影响的土地。尽管在自然生境中它通常被与其它植物的竞争限制，但在人类清除了现有植被的地方，豚草很快变得广泛和侵略性地建立。因此，豚草沿着乡村路边、栅栏线、荒地地带、新挖掘地、耕地、花园、和疏于修剪的草坪极为丰富。如此，其充分适应于宽范围的气候，能够耐受宽的土壤pH范围(从约4.5至约8.5)，还耐受高盐度。
豚草花粉变应原的肽片段
豚草花粉中的主要变应原是Amb a 1。这种蛋白以大量不同同种型Amb a 1.1、1.2、1.3和1.4存在。这些同种型在实施例1中全部列出。本发明的发明人已经鉴定出Amb a 1中的区域，其包含结合MHC II类的T 细胞表位，并在各同种型之间高度保守(参见实施例1的分析)。基于这一信息，来源于Amb a 1相关区域的肽适于通过免疫耐受作用预防或治疗对Amb a 1所有同种型的豚草变态反应。
术语“肽”和“多肽”在本文互换地使用。以上蛋白在本文还称为“变应原”。
表3、4和6列出本发明的肽的序列，其中适当地指出了每种肽所衍生自的亲本蛋白。
肽组合
组合物通常包括本发明的至少三种、最多达十三种不同多肽的组合。因此，本发明的组合物可由三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种或十三种肽组成。
选择本发明的组合物中的多肽组合以提供对人类群体尽可能广泛的覆盖面，即，本发明的组合物将在高比例的豚草变应性个体中，优选地一组或一群这样的个体中多于30％、40％、45％、50％、60％或70％的豚草变应性个体中产生免疫应答。豚草变应性个体的群体中的个体数目可以是任何适当的数目，通常为至少20、30、40、50、60、70、80或至少100个个体。优选地该群体具有在白种人群体中有代表性的频率范围内的MHC等位基因频率。11个常见DRB1等位基因家族的参考群体等位基因频率显示在表1中(数据来自HLA Facts Book(HLA事件簿)，Parham和Barber))。
本发明的组合物通常包括：
-选自RGW01、RGW01A或RGW01B的多肽的至少一种多肽，或其变体；和
-选自RGW03、RGW03A或RGW03B的多肽的至少一种多肽，或其变体；和
-选自RGW04或RGW04A的多肽的至少一种多肽，或其变体。
任选地，组合物可另外包括选自RGW02、RGW09、RGW06或RGW06A、RGW10、RGW10A、RGW05或RGW05A的任何多肽的至少 一种另外的多肽，或其变体。
任选地，组合物可另外包括选自RGW07、RGW07C、RGW07D的任何多肽的至少一种另外的多肽，或其变体。所述至少一种另外的多肽优选地是RGW07D的多肽，或其变体。
更具体地，在一个实施方案中，本发明因此提供包括三种至十三种多肽的组合物，该多肽由以下组成：
a)RGW01、RGW01A或RGW01B的多肽的至少一种，或其变体，优选地RGW01；和
b)RGW03、RGW03A或RGW03B的多肽的至少一种，或其变体，优选地RGW03B；和
c)RGW04或RGW04A的任何多肽的至少一种，或其变体，优选地RGW04A；和任选地
d)RGW02、RGW09、RGW06、RGW06A、RGW10、RGW10A、RGW05或RGW05A的任何多肽的至少一种，优选两种，最优选三种，或其变体，优选地RGW02和/或RGW06A和/或RGW05；和任选地
e)RGW07、RGW07C、RGW07D的任何多肽的至少一种，或其变体，优选地RGW07D。
换言之，本发明的一个具体的实施方案提供用于通过免疫耐受作用来预防或治疗豚草变态反应的包括三种至十三种肽序列的组合物，其中该组合物由以下组成：
a)至少一种具有以下序列的多肽：
RGW01 GMIKSNDGPPI；
RGW01A GLIKSHDGPPV；
RGW01B GLIKSNDGPAA；
或其变体，和；
b)至少一种具有以下序列的多肽：
RGW03 KDLLENGAIFVTSG；
RGW03A DVFENGAIFVPSG；
RGW03B RDLLENGAIFLPSG；
或其变体，和；
c)至少一种具有以下序列的多肽：
RGW04 KAGMIPAEPGEA；
RGW4A SAGMIPAEPGEA；
或其变体，和任选地；
d)至少一种具有以下序列的多肽：
RGW02 GSSQIWIDHSSLSKS；
RGW04 KAGMIPAEPGEA；
RGW4A SAGMIPAEPGEA；
RGW06 VVNSDKTIDGRGVKVE；
RGW06A AINNDKTIDGRGAKVE；
RGW09 ETRRSLKTSGAYN；
RGW10 FGFFQVVNNNYD；
RGW10A HGFFQVVNNNYD；
RGW05 KEGTLRFAAAQNRP；
RGW05A KEGTLRFGAAQNRP；
或其变体，和任选地；
e)至少一种具有以下序列的多肽：
RGW07 GEAAIKLTSSAGVLS；
RGW07C KGEAAIKLTSSAGVLSK；
RGW07D KGEAAIKLTSSAGVLSKK；
或其变体。
将理解的是，以上的(a)到(e)代表用于鉴定本发明的合适组合的严格性和高度选择性标准。例如，如果想要从本发明序列随机地选择六种肽，将有将近100万个可能组合可以选择。相比之下，考虑在其中应用上述标准的六种多肽的组合的一种实例是有用的。例如，考虑一种组合，其中选择以下多肽：
i)RGW01、RGW01A或RGW01B的多肽的任何一种，和RGW03、RGW03A或RGW03B的多肽的任何一种，和RGW04与RGW04A的多肽的任何一种；和
ii)选自RGW02、RGW09、RGW06、RGW06A、RGW10、RGW10A、RGW05或RGW05A的任何多肽的三种另外多肽；以及最后
基于这样的选择，可能的组合的数目占不应用本发明人确定的标准的情况下总的可得组合的极小部分。
基于上述，本发明特别优选的组合包括RGW01、RGW03B、RGW04A、RGW02、RGW05和RGW06A的多肽或其变体，或者由其组成。
进一步的优选组合包括RGW01、RGW03B、RGW04A、RGW02、RGW05、RGW06A和RGW07D的多肽，或者由其组成。
取决于上述，组合物可任选地包括另外的多肽，最多总共十三种独特多肽。这些另外的多肽与其它序列相关(即，通常是所述其他序列的同系物和/或片段)，其中所述其他序列即不在已经选择的多肽中的SEQ ID NO：1至31。另外的肽通常是SEQ ID NO 1至31的肽之一的功能变体。另外的多肽可以与SEQ ID NO：1至31任一个相同。因此，组合物可包括多达十三种不同的、SEQ ID NO：1至31中任一个提供的多肽。然而，任选的另外的多肽不必与SEQ ID NO：1至31任一个100％相同。它们优选地与未在此前选择的多肽中选择的SEQ ID NO：1至31任一个中至少9个(例如至少10、11、12或13)或更多个连续氨基酸至少65％相同。这些连续的氨基酸可包括例如结合于本文提及的任何MHC分子的II类MHC表位。换言之，该组合物可任选地包括另外的多肽，最多总共十三种独特多肽， 其中所述另外的多肽：
(i)包括与在以上(a)至(e)中未被选择的以上SEQ ID NO：1至31任一个中至少9个或更多个连续氨基酸具有至少65％的序列同一性的序列；并且
(ii)长度是9至30个氨基酸。
其中每种不同多肽是为了同时、分别或顺序地用于通过免疫耐受作用预防或治疗豚草变态反应。
因此更具体地，为了同时、分别或顺序地用于通过免疫耐受作用预防或治疗豚草变态反应，本发明提供含有如以上(a)至(e)定义的三种至十三种多肽的产物；和任选地：
(f)一种多肽：
(i)所述多肽包含与在以上a)至d)中未被选择的SEQ ID NO：1至31任一个中至少9个或更多个连续氨基酸具有至少65％序列同一性的序列；并且
(ii)长度是9至30个氨基酸；和任选地
(g)如f)中定义，但另外地在以上f)中未被选择的多肽；和任选地
(h)如f)中定义，但另外地在以上f)至g)中未被选择的多肽；和任选地
(i)如f)中定义，但另外地在以上f)至h)中未被选择的多肽；和任选地
(j)如f)中定义，但另外地在以上f)至i)中未被选择的多肽；和任选地
(k)如f)中定义，但另外地在以上f)至j)中未被选择的多肽；和任选地
(l)如f)中定义，但另外地在以上f)至k)中未被选择的多肽；和任选地
(m)如f)中定义，但另外地在以上f)至l)中未被选择的多肽；和任选 地
(n)如f)中定义，但另外地在以上f)至m)中未被选择的多肽；和任选地
(o)如f)中定义，但另外地在以上f)至n)中未被选择的多肽；和任选地
(p)如f)中定义，但另外地在以上f)至o)中未被选择的多肽。
本发明的另一实施方案是用于通过免疫耐受作用预防或治疗对豚草的变态反应的、包括一种或多种多肽的组合物，其中所述多肽选自以下任一种：
(i)SEQ ID NO 1至31的任何多肽；或
(ii)根据(i)的多肽的变体，其中所述变体是长度为9至30个氨基酸的多肽，所述多肽包含由以下组成的区域：
-(i)的任何序列；或
-与(i)的任何序列具有至少65％同源性的序列，该序列能够使得个体免疫耐受(i)的任何序列，或
(iii)根据(i)的多肽的变体，其中所述变体是长度为9至30个氨基酸的多肽，所述多肽包含由表示以下任一个的序列组成的区域：
-(i)的任何序列的片段；或
-(i)的任何序列的片段的同系物，
该序列能够使得个体免疫耐受(i)的任何序列并具有至少9个氨基酸的长度，而且其中所述同系物与(i)的任何序列中任何9个连续氨基酸具有至少65％的同源性。
本发明的组合物或产物可包括以上定义的任何序列的变体。所述变体通常包括SEQ ID NO：1至31的相应肽中存在的1、2、3或更多个II类MHC表位。
本文提及了功能变体。这样的变体可能能够使个体免疫耐受SEQ ID NO：1至31的相应肽中存在的II类MHC表位，并因此通常将包括如下 序列：其结合到相同II类MHC分子和/或被识别SEQ ID NO：1至31的多肽中相应的表位的T细胞所识别。
SEQ ID NO 1至31的变体可以是由截短所衍生的片段。截短是指从SEQ ID NO.1至31的多肽的N和/或C-末端除去一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸。
还可通过一个或多个内部缺失来产生片段，条件是构成T细胞表位的核心9个氨基酸基本未被破坏。
例如，SEQ ID NO：1的变体可包括SEQ ID NO：1的片段，即较短的序列。这可包括从SEQ ID NO：1的N-末端或从SEQ ID NO：1的C-末端缺失一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸。这样的缺失可从SEQ ID NO：1的两端进行。SEQ ID NO：1的变体可包括延伸超出SEQ ID NO：1的末端的另外的氨基酸(例如来自衍生肽的亲本蛋白的序列)。变体可包括以上讨论的缺失和添加的组合。例如，可从SEQ ID NO：1的一端缺失氨基酸，但可在SEQ ID NO：1的另一端添加来自全长亲本蛋白序列的另外的氨基酸。以上变体的相同讨论还适用于SEQ ID NO：2至31。SEQ ID NO:20的优选变体是肽KKGEAAIKLTSSAGVLSK。
变体肽可包括SEQ ID NO：1至31任一个或其片段的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代。变体肽可包括与SEQ ID NO：1至31任一个中至少9个或更多个连续氨基酸具有至少65％序列同一性的序列。更优选地，合适的变体可包括与SEQ ID NO：1至31任一个的至少9个连续氨基酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的氨基酸同一性。这一水平的氨基酸同一性可见于肽的任何区段，尽管它优选地是核心区域。氨基酸同一性的水平是至少9个连续氨基酸的范围内，但它可以是至少10、11、12、13、14、15或至少16或17个氨基酸，这取决于比较的肽的大小。因此，任何以上指明的同一性水平可跨越序列的完整长度。
关于氨基酸序列，“序列同一性”是指当使用ClustalW(Thompson等人,Nucleic Acids Res.1994Nov 11；22(22):4673-80)用以下参数评价时具 有指定值的序列：成对的比对参数-方法：准确，矩阵：PAM，缺口开放罚分：10.00，缺口延伸罚分：0.10；多比对参数-矩阵：PAM，缺口开放罚分：10.00，延迟百分比同一性：30，处罚末端缺口：开，缺口间距：0，负矩阵：不，缺口延伸罚分：0.20，残基特异性缺口罚分：开，亲水缺口罚分：开，亲水残基：GPSNDQEKR。在特定残基的序列同一性意在包括仅仅被衍生化的相同残基。
变体肽可包括SEQ ID NO：1至31任一个中的1、2、3、4、5或更多个或者多达10个氨基酸取代。取代变体优选地包括用相同数目的氨基酸代替一个或多个氨基酸并进行保守的氨基酸取代。例如，氨基酸可被具有相似特征的替代性氨基酸取代，例如，另一碱性氨基酸、另一酸性氨基酸、另一中性氨基酸、另一带电荷氨基酸、另一亲水氨基酸、另一疏水氨基酸、另一极性氨基酸、另一芳香族氨基酸或另一脂肪族氨基酸。可用于选择合适的取代基的20种主要氨基酸的一些特征如下：
Ala脂肪族、疏水、中性Met疏水、中性Cys极性、疏水、中性Asn极性、亲水、中性Asp极性、亲水、带电荷(-)Pro疏水、中性Glu极性、亲水、带电荷(-)Gln极性、亲水、中性Phe芳香族、疏水、中性Arg极性、亲水、带电荷(+)Gly脂肪族、中性Ser极性、亲水、中性His芳香族、极性、亲水、带电荷(+)Thr极性、亲水、中性Ile脂肪族、疏水、中性Val脂肪族、疏水、中性Lys极性、亲水、带电荷(+)Trp芳香族、疏水、中性Leu脂肪族、疏水、中性Tyr芳香族、极性、疏水
另外的变体包括在其中出现在序列中的代替天然存在的氨基酸的氨基酸是其结构类似物的那些。用于序列中的氨基酸还可被修饰例如被标记，条件是肽的功能未显著地受到不利影响。
当肽具有与SEQ ID NO：1至31任一个或其片段的序列不同的序列 时，取代可沿着序列的全长发生，其在SEQ ID NO：1至31的任何序列之内或SEQ ID NO：1至31的任何序列之外。例如，本文所述的变化诸如添加、缺失、取代和修饰可发生在SEQ ID NO：1至31的任何序列之内。变体肽可包括在其中已经进行了一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸取代的SEQ ID NO：1至31的任何氨基酸序列，或者基本上由其组成。变体肽可包括比SEQ ID NO：1至31任一个大的亲本蛋白片段。在该实施方案中，本文所述的变化诸如取代和修饰可发生在SEQ ID NO：1至31的任何序列之内和/或之外。
本发明的变体肽长度是9至30个氨基酸，9个和30个也包括在内。优选地，它们的长度可以是9至20个氨基酸或更优选地13至17个氨基酸。所述肽可与SEQ ID NO：1至31的任何一种中的肽序列具有相同的长度。
所述肽可例如通过蛋白水解裂解化学地衍生自多肽变应原，或者可以有意方式从多肽变应原衍生，例如通过利用多肽变应原的氨基酸序列并基于该序列合成肽。可使用本领域公知方法合成肽。
当多肽包括通常难以在制造过程中保留的残基时，这些残基可被代替。例如，谷氨酸在溶液中自发地形成焦谷氨酸，特别是当存在于肽的N末端时。因此，当这样的残基存在于肽的N末端时，对应于天然变应原蛋白序列的序列中的谷氨酸或谷氨酰胺残基的本发明的肽的残基可被本发明的肽中的焦谷氨酸代替。
术语“肽”不仅包括在其中氨基酸残基被肽(-CO-NH-)键连接的分子，还包括在其中肽键被倒转的分子。这样的逆反(retro-inverso)模拟肽可使用本领域已知的方法制备，例如诸如Meziere等人(1997)J.Immunol.159,3230-3237中描述的那些。该方法包括制备包含骨架变化而非侧链定向的拟肽。Meziere等人(1997)显示，至少对于II类MHC和T辅助细胞应答，这些拟肽是有用的。包含NH-CO键而非CO-NH肽键的逆反肽对蛋白水解的抵抗要多得多。
类似地，可完全不需要肽键，条件是使用保持氨基酸残基的碳原子之间间距的合适的连接体部分；如果所述连接体部分具有与肽键大致上相同 的电荷分布和大致上相同的平面性，它是特别优选的。还应理解的是，可方便地在其N-或C-末端封闭所述肽，以帮助减少对外蛋白水解消化的敏感性。例如，可通过与羧酸反应而保护肽的N-末端氨基，而且可通过与胺反应而保护肽的C-末端羧基。修饰的其它实例包括糖基化和磷酸化。另外的潜在修饰是R或K侧链胺上的氢可被亚甲基代替(-NH2→-NH(Me)或-N(Me)2)。
根据本发明的肽的类似物还可包括增加或减少肽的体内半衰期的肽变体。能够增长按照本发明使用的肽的半衰期的类似物的实例包括肽的类肽类似物、肽的D-氨基酸衍生物和肽-类肽杂合体。按照本发明使用的变体多肽的另外的实施方案包括多肽的D-氨基酸形式。使用D-氨基酸而非L-氨基酸制备多肽大大减少正常代谢过程对这种药剂的任何不想要的破坏，减少待施用的药剂的量以及施用频率。
本发明提供的肽可衍生自由编码亲本蛋白链的原始转录子的可变剪接产生的mRNA所编码的亲本蛋白的剪接变体。肽还可衍生自亲本蛋白的保持变应原的至少MHC结合性质的氨基酸突变体、糖基化变体和其它共价衍生物。示例性衍生物包括这样的分子，其中本发明的肽通过取代、化学、酶促或其它合适手段被除了天然存在的氨基酸以外的部分共价修饰。还包括不同螨中发现的亲本蛋白的天然存在的变体。这样的变体可被等位基因变体编码或代表选择性的剪接变体。
可在肽的合成期间或通过生产后修饰，或当肽是重组形式时，使用定点诱变、随机诱变或酶促裂解和/或核酸连接的已知技术来制备如上所述的变体。
根据本发明，组合物可包括的另外的肽优选地是SEQ ID NO：1至31任一个的功能变体。也就是说，肽优选地能够引起免疫应答。特别地，肽优选地能够在豚草变应性个体中诱发细胞因子的产生。因此，通常本发明的组合物将包括在豚草变应性个体群体中超过45％、50％、55％，优选60％或65％的个体中产生细胞因子应答的至少一种多肽或其变体。一组豚草变应性个体中的个体数目可以是超过1的任何数目，例如至少20、30、40、50、80或至少100个个体。优选地，组合物包括至少两种、三种或 最优选四种这样的肽。优选地，细胞因子应答是IL-13或IFN-γ的产生。可通过任何合适的方法测量细胞因子的产生。如果在肽存在时产生的细胞因子水平比刺激物不存在时产生的所述细胞因子背景水平(即，不存在肽或任何其它刺激物时相同个体产生的水平)高至少2、3、4或5倍，通常认为发生了应答于肽的细胞因子的产生。可选地，通常在250μl中大约1.25×106个细胞的样品中，如果产生细胞因子的量超过通常是90pg/ml、95pg/ml或优选100pg/ml的公认限值，则可以认为发生了细胞因子的产生。
用于测量细胞因子产生的合适的方法通常包括测量从受治疗者获取的样品中外周血单核细胞(PBMC)的细胞因子释放。样品通常是血液或血清。在给定肽存在时孵育细胞之后，测量PBMC的细胞因子释放。随后使用任何合适的测定例如ELISA、ELISPOT测定或流式细胞测定来检验来自孵育混合物的上清液中细胞因子的存在。特别优选的方法包括在例如de Jager等人；Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology(临床和诊断性实验免疫学)，2003,第10(1)卷第133-139页中描述的多重微珠阵列测定。通常，组合物可包括不在已经选择的多肽中的、在豚草变应性个体群体中超过30％、35％、40％、优选45％或50％的个体中产生细胞因子应答的至少一种另外的肽或其变体，最多总共十三种不同的肽。
组合物还可包括不在已经选择的多肽中的、在豚草变应性个体群体中多于10％、15％、20％、25％、优选30％或35％的个体中产生细胞因子应答的一种或多种另外的肽或其变体，最多总共十三种不同的肽。
组合物还可包括诱导IL-10释放的一种或多种另外的肽。已知IL-10为一种免疫调节物，能够转变T细胞应答远离变应性类型应答。显著的IL-10释放可能导致诱导调节性T细胞，这导致对组合物的其它肽的存在的免疫耐受或改进所述免疫耐受。
优选地，所述肽可以在群体的至少35％、40％、45％、50％或55％诱导IL-10释放。因此，在这一实施方案中，该肽能够结合代表样品群体等比例的MHC等位基因亚组。优选地，该肽在55％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、或90％或更多的群 体中诱导IL-10释放。
“诱导IL-10释放”在本文定义为可由本领域常用方法测量的释放。通常，利用从变应性个体获得的T细胞体外测量该应答。以高于在其中T细胞未暴露于肽的对照样品中观察到的IL-10水平来评价“诱导”。在一些实施方案中，诱导适于免疫耐受的IL-10释放可定义为应答于完整蛋白变应原而释放的IL-10平均量的至少35％、40％、45％、50％或55％的IL-10释放，其中第一多肽为所述完整变应原的片段。应理解的是，用作比较的蛋白变应原可以是整个的完整多肽，或可以是包含介导对蛋白变应原免疫应答的T细胞表位的截短形式。通常，来源于蛋白变应原的单独肽将显示平均IL-10释放，所述释放显著低于如上定义的应答于完整或截短的蛋白变应原获得的平均IL-10释放。然而，对完整或截短的蛋白变应原显示IL-10释放的至少35％、40％、45％、50％或55％的IL-10释放的单独肽可能是特别适合的免疫耐受剂。肽还可以展示与应答于完整或截短的蛋白变应原观察到的应答相比，相同或更大的平均应答。
可选地，释放的IL-10的平均水平可以绝对项来测量，这种情况下高于大约400、450、500或550pg/ml的平均水平将认为是诱导，特别是来自250μl中大约1.25×106细胞的样品。
应理解的是，平均值可以是群体中观察到的单独IL-10释放的平均值、中值或最频值。应理解的是，当群体中的个体与群体中其它成员相比展示异常低或异常高的IL-10释放时，可将其从平均值中排除。这可以允许测量更代表群体中显示的应答的平均值。术语‘异常低’或‘异常高’可以指与排除显示异常IL-10释放特征的个体的更代表性的IL-10释放平均值相比，差异10倍或20倍。
能够结合TCR的合适的变体可根据经验衍生或根据已知标准选择。在单个肽中，存在有助于MHC抗原结合沟中的结合的某些残基，以及与T细胞受体的高变区相互作用的其它残基(Allen等人(1987)Nature 327:713-5)。
在有助于T细胞受体相互作用的残基中，已经证明了与取代指定肽残基时与T细胞活化的依赖性相关的级系。使用已经含有用不同氨基酸 取代的一个或多个T细胞受体接触残基的肽，多个组已经证明了对T细胞活化过程的深远作用。Evavold&Allen(1991)Nature 252:1308-10证明了T细胞增殖和细胞因子产生之间不相关。在该体外模型中，用其中已经进行了用天冬氨酸保守取代谷氨酸的肽类似物来攻击对血红蛋白的残基64-76(在I-Ek环境中)有特异性的T细胞克隆。该取代不显著影响类似物结合I-Ek的能力。
用该类似物体外攻击T细胞克隆后，未检测到增殖，尽管保持了IL-4分泌，也保持了该克隆辅助B细胞应答的能力。在随后的研究中，同一组证明了T细胞介导的细胞溶解与细胞因子产生之间的分离。该情况中，前者保持不变而后者受损。McDevitt和同事最初在EAE(实验性变应性脑脊髓炎)的鼠模型中证明了改变的肽配体在体内的效力(Smilek等人(1991)Proc Natl Acad Sci USA 88:9633-9637)。在这一模型中通过用MBP(髓磷脂碱性蛋白)的致脑炎的肽Ac1-11免疫来诱发EAE。在位置四(赖氨酸)用丙氨酸残基的取代产生了与其限制性元件(AαuAβu)结合良好的肽，但其在易感的PL/JxSJLF1品系中是非免疫原性的，而且其在用致脑炎的肽免疫之前或之后施用时还阻止EAE发作。因此，可鉴定肽中影响该肽诱发T细胞各种功能的能力的残基。
有利地，可设计肽以利于T细胞增殖和诱发去敏化。Metzler和Wraith已经证明了在其中已经进行了增加肽-MHC亲和力的取代的肽的致耐受能力提高(Metzler & Wraith(1993)Int Immunol～:1159-65)。Sloan-Lancaster等人(1993)Nature 363:156-9证明，改变的肽配体可在克隆的T细胞导致长期和深远的无反应性。
本发明的组合物能够在对变应原敏感的个体中诱发晚期应答。术语“晚期应答”包括列在Allergy and Allergic Disease(变态反应和变应性疾病)(1997)A.B.Kay(编辑),Blackwell Science,第1113-1130页中的含义。晚期应答可以是任何晚期应答(LPR)。优选地，肽能够引起晚期哮喘性应答(LAR)，或晚期鼻炎性应答，或晚期皮肤应答，或晚期眼部应答。可使用本领域公知方法确定特定的肽是否能够产生LPR；特别优选的方法被描述于Cromwell O,Durham SR,Shaw RJ,Mackay J和Kay AB. Provocation tests and measurements of mediators from mast cells and basophils in asthma and allergic rhinitis(哮喘和变应性鼻炎中来自肥大细胞和嗜碱性细胞的介质的激发测试和测量).于Handbook of Experimental Immunology(实验免疫学手册)(4)第127章，编辑：Weir DM,Blackwell Scientific Publications,1986。
因此，优选地，本发明的单独肽能够在已经对变应原敏感的个体中诱发LPR。可通过公知程序确定个体是否已经对变应原敏感，诸如使用变应原提取物的溶液的皮肤穿刺测试、皮肤LPR的诱发、临床史、变应原攻击和用于测量变应原特异性的IgE的放射变应原吸附试验(RAST)。可由医师基于例如这样的试验来确定特定个体是否被预期得益于治疗。
使得个体去敏化或免疫耐受变应原表示在适当地敏化的个体中抑制或减弱由变应原诱发的变应性组织反应。已显示，可选择性地活化T细胞，并随后使之无应答性。此外，使这些T细胞无反应或将其消除导致患者对特定的变应原去敏化。去敏化本身表现为在第二次或进一步施用该变应原或变应原衍生的肽时，减少或优选地消除对变应原或变应原衍生的肽的应答。第二次施用可在经过允许去敏化发生的合适时间段后进行；这优选地为一天到数周之间的任何期间。大约两周的间隔是优选的。
尽管本发明的组合物能够在豚草变应性个体中诱发LPR，应理解的是，当组合物被用于治疗患者时，优选地使用足够低浓度的组合物以致不发生可观察到的LPR，但应答将足以部分地将T细胞去敏化，以致可给予下一(优选地更高的)剂量，如此继续。以这种方式，建立剂量以提供完全的去敏化但通常从来不在患者中诱发LPR。然而，该组合物或肽能够在比所施用的较高的浓度下这样做。
本发明的组合物优选地能够在群体的一组豚草变应性个体的50％或更多中诱发晚期应答。更优选地，组合物能够在一组的55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、或者90％或更多的敏化个体中诱发LPR。可通过本领域公知方法确定组合物是否能够在一组受治疗者的某一百分比中诱发LPR。
将理解的是，本发明的肽包括由作为II类MHC结合所需要的最少必 需序列的9个核心氨基酸所组成的T细胞表位。然而，该肽还可包括在9个核心氨基酸侧翼的另外残基。因此该肽可包括包含T细胞表位的区域，其中一些残基可被修饰而不影响表位的功能。因此，如上定义的肽的功能变体包括被改变以相对于肽的天然序列提高溶解度的肽。提高的溶解度对于受治疗者对衍生本发明的肽的变应原的免疫耐受作用是有优势的，因为对受治疗者施用难溶剂导致不期望的、非免疫耐受的炎性应答。通过改变在包含T细胞表位的区域侧翼的残基，可提高肽的溶解度。可改造本发明的肽以使其更可溶，以致其包括：
i)在T细胞表位侧翼的肽的残基的N末端：一个至六个连续氨基酸，它们与衍生所述肽的蛋白序列中所述残基的N末端紧接的两个至六个连续氨基酸相对应；和/或
ii)在T细胞表位侧翼的肽的残基的C末端：一个至六个连续氨基酸，它们与衍生所述肽的蛋白序列中所述残基的C末端紧接的一个至六个连续氨基酸相对应；或
iii)在T细胞表位侧翼的肽的残基的N末端和/或C末端，选自精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的至少一个氨基酸。
任选地，可另外地改造该肽为更可溶，以使：
i)所述肽的天然序列中的任何半胱氨酸残基被丝氨酸或2-氨基丁酸代替；和/或
ii)缺失在所述肽的天然序列的N末端和/或C末端的、不包含在T细胞表位中的任何残基；和/或
iii)缺失在所述肽的天然序列的N末端和/或C末端的最多四个氨基酸中包含序列Asp-Gly的、不包含在T细胞表位中的任何两个连续氨基酸。
核酸和载体
组成本发明的组合物和产物的单独肽可被直接施用，或可通过从编码序列来表达而被间接施用。例如，可提供编码本发明的肽诸如上述任何肽的多核苷酸。因此本发明的肽可从编码并能够表达它的多核苷酸产生或以 该形式递送。本文对使用、递送或施用本发明的肽的任何提及意在包括经由从编码它的多核苷酸表达而间接使用、递送或施用这样的肽。
术语“核酸分子”和“多核苷酸”在本文可互换使用，并且指的是任何长度的核苷酸、即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物的聚合形式。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、信使RNA(mRNA)、cDNA、重组多核苷酸、质粒、载体、分离的任何序列的DNA、分离的任何序列的RNA、核酸探针和引物。本发明的多核苷酸可以以分离的或纯化的形式被提供。“编码”所选择的多肽的核酸序列是当被置于合适的调节序列控制下时，在体内被转录(在DNA的情形下)和翻译(在mRNA的情形下)为多肽的核酸分子。编码序列的边界是由在5’(氨基)末端的起始密码子和在3’(羧基)末端的翻译终止密码子所决定的。为了本发明的目的，这样的核酸序列可包括但不限于来自病毒、原核或真核mRNA的cDNA，来自病毒或原核DNA或RNA的基因组序列，和甚至合成的DNA序列。转录终止序列可位于编码序列的3’。
可根据本领域公知的方法合成本发明的多核苷酸，例如在Sambrook等人(1931,Molecular Cloning-a laboratory manual(分子克隆-实验室手册)；Cold Spring Harbor Press)中所描述的。
可以以表达盒的形式提供本发明的多核苷酸分子，其包括可操作地连接于插入序列的控制序列，从而允许本发明的肽在感兴趣受治疗者中体内表达。反过来，这些表达盒通常在适于用作核酸免疫的试剂的载体(如，质粒或重组病毒载体)中被提供。这样的表达盒可被直接施用于宿主受治疗者。可选地，包含本发明的多核苷酸的载体可被施用于宿主受治疗者。优选地，使用遗传载体制备和/或施用该多核苷酸。合适的载体可以是能够携带足够量的遗传信息并允许本发明的肽的表达的任何载体。
因此，本发明包括包含这样的多核苷酸序列的表达载体。因此，本发明提供用于通过免疫耐受作用预防或治疗对豚草的变态反应的载体，其包含编码本发明的不同多肽的四种或更多种多核苷酸序列，以及任选地编码本文定义的不同多肽的一种或多种另外的多核苷酸序列。载体可包含编码本发明的不同多肽的4、5、6或7种多核苷酸序列。
此外，将理解的是，本发明的组合物和产物可包括多肽和多核苷酸的混合物。因此，本发明提供本文所定义的组合物或产物，其中代替任何一种多肽的是能够表达所述多肽的多核苷酸。
以分子生物学技术常规地构建表达载体，而且其可例如包括使用质粒DNA和可能是必要的并以正确方向放置的合适的起始因子、启动子、增强子和其它元件，诸如例如多聚腺苷酸化信号，以允许表达本发明的肽。其它合适的载体对于本领域技术人员是明显的。在这一方面作为另外的实例，我们引用Sambrook等人。
因此，通过将这样的载体递送到细胞并允许发生从载体的转录，可提供本发明的多肽。优选地，载体中本发明的或用于本发明的多核苷酸被可操作地连接于能够提供宿主细胞对编码序列的表达的控制序列，即，该载体是表达载体。
“可操作地连接”是指元件的排列，其中如此描述的组分被设置以进行其通常的功能。因此，当存在适当的酶时，可操作地连接于核酸序列的指定的调节序列诸如启动子能够实现该序列的表达。启动子不必与序列连续，只要它起作用来指导序列表达。因此，例如，未翻译但被转录的干预序列可存在于启动子序列和核酸序列之间，并且仍可认为该启动子序列被“可操作地连接”于编码序列。
本领域中已描述了若干表达系统，其中每一种通常由包含可操作地连接于表达控制序列的感兴趣基因或核苷酸序列的载体所组成。这些控制序列包括转录启动子序列以及转录起始和终止序列。本发明的载体可以是例如拥有复制起点即任选地用于表达所述多核苷酸的启动子和任选地启动子的调节子的质粒、病毒或噬菌体载体。“质粒”是染色体外遗传元件形式的载体。载体可包含一种或多种可选择的标志物基因，例如在细菌质粒情况下的氨苄西林抗性基因或用于真菌载体的抗性基因。载体可被用于体外例如产生DNA或RNA，或者用于转染或转化宿主细胞例如哺乳动物宿主细胞。载体还可适于体内使用，例如以允许多肽的体内表达。
“启动子”是起始并调节编码多肽的多核苷酸的转录的核苷酸序列。启动子可包括诱导型启动子(其中可操作地连接于启动子的多核苷酸序列的 表达由分析物、辅因子、调节蛋白等所诱发)、阻抑型启动子(其中可操作地连接于启动子的多核苷酸序列的表达由分析物、辅因子、调节蛋白等所阻抑)和组成型启动子。术语“启动子”或“控制元件”预期包括全长启动子区域和这些区域的功能(如，控制转录或翻译的)区段。
根据本发明的多核苷酸、表达盒或载体可另外地包括信号肽序列。信号肽序列通常被插入以与启动子可操作地连接，以使信号肽被表达并促进还与启动子可操作地连接的编码序列所编码的多肽的分泌。
通常，信号肽序列编码10至30个氨基酸例如15至20个氨基酸的肽。通常这些氨基酸主要是疏水的。在典型情况下，信号肽将带有信号肽的生长中的多肽链靶向于表达细胞的内质网。信号肽在内质网中被切除，允许经高尔基体分泌多肽。因此，通过从个体中的细胞表达并从这些细胞分泌，可向个体提供本发明的肽。
可选地，本发明的多核苷酸可以以合适的方式表达以允许本发明的肽被II类MHC分子呈递在抗原呈递细胞表面。例如，本发明的多核苷酸、表达盒或载体可靶向于抗原呈递细胞，或在这样的细胞中可优先刺激或诱发被编码的肽的表达。
感兴趣多核苷酸可用于在体外、先体外后体内或体内产生本发明的肽。可施用这样的多核苷酸或通过免疫耐受作用将其用于变态反应的预防或治疗。
用于基因递送的方法是本领域已知的。参见例如美国专利第5,399,346、5,580,859和5,531,466号。核酸分子可直接引入接受的受治疗者，诸如通过标准的肌内或皮内注射；经皮的颗粒递送；吸入；局部，或通过口服、鼻内或粘膜施用方式。可选地，分子可先体外后体内引入已从受治疗者取出的细胞。例如，本发明的多核苷酸、表达盒或载体可先体外后体内引入个体的APC。将包含感兴趣核酸分子的细胞再次引入受治疗者以致可针对核酸分子编码的肽建立免疫应答。用于这种免疫的核酸分子在本文通常称为“核酸疫苗”。
本发明的多肽、多核苷酸、载体或细胞可以以基本上分离的形式存在。 它们可以与不干扰其预期用途的运载体或稀释剂混合，并仍被认为是基本上分离的。它们还可以是基本上纯化的形式，在该情况下它们通常将包括占制剂的蛋白、多核苷酸、细胞或干物质的至少90％，如至少95％、98％或99％。
抗原呈递细胞(APC)
本发明包括产生在其表面上呈递本发明的肽的APC群体的方法的体外使用，该APC群体随后可用于治疗。可对从患者获得的细胞样品先体外后体内进行这样的方法。因此以这种方式产生的APC形成可用于通过免疫耐受作用治疗或预防对豚草的变态反应的药剂。细胞应被个体的免疫系统接受，因为它们衍生于该个体。将以这种方式产生的细胞递送到最初获得细胞的个体，从而形成本发明的治疗实施方案。
制剂和组合物
本发明的肽、多核苷酸、载体和细胞可单独或组合地提供给个体。本发明的每种分子或细胞可以以分离的、基本上分离的、纯化的或基本上纯化的形式提供给个体。例如，可对个体提供基本上不含其它肽的本发明的肽。
尽管根据本发明的肽、多核苷酸或组合物可能以原料形式被呈现，但优选地作为药物制剂将它们呈现。因此，根据本发明的另一方面，本发明提供用于通过免疫耐受作用预防或治疗对豚草的变态反应的药物制剂，其包含根据本发明的组合物、载体或产物，连同一种或多种药学上可接受的运载体或稀释剂和任选地一种或多种其它治疗成分。运载体必须在与制剂的其它成分相容且不危害其接受者的意义上是“可接受的”。通常，用于注射和最终制剂的运载体是无菌和无热原的。
配制包含本发明的肽、多核苷酸或细胞的组合物可使用标准的药物配制化学和方法学进行，所有这些对于普通技术人员都易于获得。
例如，包含本发明的一种或多种分子或细胞的组合物可与一种或多种药学上可接受的赋形剂或媒介物组合。辅助物质诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和诸如此类可在赋形剂或媒介物中存在。这些赋形剂、媒介物和 辅助物质通常是在接受组合物的个体中不诱发免疫应答的药剂，而且其可被施用而没有不当毒性。药学上可接受的赋形剂包括但不限于液体诸如水、盐水、聚乙二醇、透明质酸和乙醇。其中还可包括药学上可接受的盐，例如，无机酸盐诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐和诸如此类；以及有机酸盐诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐和诸如此类。关于药学上可接受的赋形剂、媒介物和辅助物质的详尽论述可在Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)(Mack Pub.Co.,N.J.1991)中获得。
可以以适于推注施用或连续施用的形式制备、包装或销售这样的组合物。可以以单位剂量形式诸如在安瓿或含有防腐剂的多剂量容器中制备、包装或销售注射组合物。组合物包括但不限于悬液、溶液、油性或水性媒介物中的乳剂、糊剂和可植入的缓释或可生物降解的制剂。这样的组合物还可包括一种或多种另外的成分，其包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外施用的组合物的一个实施方案中，以干燥(如粉末或颗粒)形式提供活性成分以便在肠胃外施用重构的组合物之前用合适的媒介物(如无菌无热原的水)进行重构。可以以无菌可注射的水性或油性悬液或溶液形式制备、包装或销售药物组合物。这种悬液或溶液可根据已知技术配制，并且除了活性成分以外，可包括另外的成分诸如本文所述的分散剂、润湿剂或悬浮剂。例如，可使用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂诸如水或1,3-丁二醇来制备这样的无菌注射制剂。其它可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和不挥发油诸如合成的单甘油酯或二甘油酯。有用的其它的可肠胃外施用的组合物包括包含微晶形式的、在脂质体制品中的或作为可生物降解的聚合物系统的组分的活性成分的那些。用于缓释或植入的组合物可包括药学上可接受的聚合或疏水物质诸如乳液、离子交换树脂、微溶聚合物或微溶盐。
可选地，可将本发明的肽或多核苷酸包被、吸附到微粒运载体或与其缔合。合适的微粒运载体包括衍生自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的那些，以及衍生自聚(丙交酯)和丙交酯-乙交酯共聚物的PLG微粒。参见例如，Jeffery等人(1993)Pharm.Res.10:362-368。还可使用其它颗粒系统和聚 合物，例如聚合物诸如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、精胺、亚精胺以及这些分子的轭合物。
本文提到的任何肽、多核苷酸或细胞的制剂将取决于诸如物质的性质和递送方法等因素。可以以多种剂型施用任何这样的物质。可以以口服(如，作为片剂、糖锭剂、锭剂、水性或油性悬液、可分散的粉末或颗粒)、肠胃外、表皮、皮下、吸入、静脉内、肌内、胸骨内、经皮、皮内、舌下、鼻内、含服或输注技术进行施用。物质还可作为栓剂被施用。医师将能够确定每个特定个体需要的施用途径。
本发明制剂的组合物将包括有效而不导致副作用的合适浓度的每种肽/多核苷酸/细胞。通常，组合物中每种肽的浓度将在0.03nmol/ml至200nmol/ml的范围中。更优选地在0.3nmol/ml至200nmol/ml、3nmol/ml至180nmol/ml、10nmol/ml至150nmol/ml或30nmol/ml至120nmol/ml的范围中。组合物或制剂应具有大于95％或98％的纯度或至少99％的纯度。
因此在一个实施方案中，本发明的肽、多核苷酸、细胞或组合物与一种或多种其它治疗剂组合一起用于治疗。这些剂可被分别、同时或顺序地施用。它们可以在相同或不同组合物中被施用。因此，在本发明的方法中，还可用另外的治疗剂来治疗受治疗者。
因此，可配制一种组合物，其包括本发明的分子和/或细胞以及还有一种或多种其它治疗分子。可选地，本发明的组合物可与作为组合治疗的一部分的一种或多种其它治疗组合物同时、顺序或分别地使用。
治疗方法和待治疗的个体
本发明涉及能够使得人类个体去敏化或免疫耐受上述变应原并因此可用于预防或治疗豚草变态反应的肽、多核苷酸、载体和细胞。本发明提供用于通过免疫耐受作用预防或治疗对豚草的变态反应的组合物、产物、载体和制剂。本发明还提供使得豚草变应性个体免疫耐受或去敏化的方法，其包括单独或组合地施用上述本发明的多肽/多核苷酸/细胞。
将用本发明的组合物或制剂治疗或提供的个体优选地是人类。应理解 的是，待治疗的个体可以是已知对变应原敏感的个体，即处于被敏化或怀疑被敏化的风险中。可使用本领域公知和本文所述的技术来测试个体的敏化作用。可选地，个体可具有对豚草的变态反应的家族史。可能不必测试个体对豚草的敏化作用，因为当暴露于豚草时个体可展现变态反应的症状。暴露表示接近例如豚草属植物、或来源于豚草属植物的物质或产物、或含有或包含以上任一种的物质或产物。来源于豚草属植物的物质或产物通常是豚草花粉。接近表示距离上述物品10米或更少、5米或更少、2米或更少、1米或更少或者0米。变态反应的症状可包括眼睛痒、流鼻涕、呼吸困难、皮肤红痒或皮疹。
待治疗的个体可以是任何年龄。然而，优选地，该个体可处于1至90、5至60、10至40或更优选地18至35的年龄组。
优选地，待治疗的个体来自具有在白种人群体中有代表性的频率范围内的MHC等位基因频率的群体。11个常见DRB1等位基因家族的参考群体等位基因频率被显示在表1中(数据来自HLA Facts Book(HLA事件簿)，Parham和Barber)。
表1

通过分析报告频率的多个研究来获得参照频率，而所示附图是平均值。因此优选地，待治疗的个体来自如下群体：例如在这些图的范围加或减1％、2％、3％、5％、10％、15％或20％的范围内，其具有与表1所指的等位基因(诸如至少1、2、3、4、5种或所有等位基因)的参照群体相等的MHC等位基因频率。
优选地，个体来自这样的群体，其中如下DRB1等位基因的等位基因频率是：
4-至少9％
7-至少10％
11-至少8％。
个体可能已具有对豚草的变态反应达至少2周、1月、6月、1年或5年。个体可患有变态反应导致的皮疹、鼻充血、流鼻涕和/或咳嗽。个体可能已被或未被施用治疗豚草变态反应的其它组合物/化合物。
个体通常生活在具有温暖潮湿气候的地理区域中。个体通常在特定季节患有对豚草的变态反应。该季节通常对应豚草的开花季节，这通常是夏天到秋天，优选地夏末(在北半球从七月到八月)到早秋(在北半球从九月到十月)。豚草变应性个体通常对豚草花粉是变应性的。
组合免疫疗法
因为许多个体对多种多肽抗原变应性或可能需要对多种多肽抗原去敏化，本发明还提供为对多种抗原变应性的个体去敏化的手段。在个体中诱发的对第一多肽抗原或变应原的“耐受”可在个体中产生“致耐受环境”，其中可下调对其它抗原不适当的免疫应答以提供对其它抗原的耐受。
该发现是指，对多种变应原变应性的个体可以在大大减少的时间段中被治疗，而且对一些变应原(如花生)严重变应性但对其它变应原(如猫皮屑)中度变应性的个体可从如下的治疗受益：其中建立对较温和的变应原的耐受，并随后将这种致耐受环境用于提供对其它更极端变应原的耐受。此外，患有自身免疫性疾病且另外地对无关抗原或变应原敏化(或以其他方式免疫)的个体可从如下治疗方案受益：其中首先建立对无关抗原或变应原的耐受，并随后将这种致耐受环境用于提供对与自身免疫性疾病相关的自身抗原的耐受。
因此提供了用于使豚草变应性个体对上述豚草变应原和一种或多种另外的不同多肽抗原去敏化的方法。该方法要求，在第一步中向个体施用上述的根据本发明的组合物/产物/制剂(主要组合物)，其中所述施用是以足以产生针对豚草变应原的低反应状态的方式进行。一旦建立了针对豚草变应原的低反应状态，或至少发生朝向去敏化的转变，该方法要求施用包含个体将对其敏化的第二不同的多肽抗原的第二组合物。以这样的方式进行第二组合物的施用以利用通过使用主要组合物建立的致耐受环境，其中 现在可能建立对第二不同多肽抗原的耐受性。将第二组合物与第一主要组合物或主要组合物所来源的变应原的较大片段共施用。“共施用”是指同时或共同施用，例如，当两种物质存在于同一组合物中，或在不同组合物中以几乎相同时间但在不同部位施用，以及在不同时间不同组合物中的多肽抗原递送。例如，可在递送第一组合物之前或之后在相同或不同部位递送第二组合物。递送之间的时间安排可以从间隔约数秒变化到间隔约数分钟、间隔数小时或甚至间隔数天。此外，可采用不同的递送方法。
第二多肽抗原优选地是与豚草变应原不同的变应原。当然，用于本发明方法的合适的变应原可使用已知方法获得和/或产生。合适的变应原的类别包括但不限于其它豚草变应原、花粉、动物皮屑(尤其是猫皮屑)、草、霉菌、灰尘、抗生素、针昆虫毒液和多种环境(包括化学品和金属)、药物和食物变应原。常见的树变应原包括来自三角叶杨、杨树、白蜡树、桦树、枫树、橡树、榆树、山核桃树和美国山核桃树的花粉；常见的植物变应原包括来自艾蒿、豚草、英国车前草、酸模和藜的那些；植物接触性变应原包括来自毒栎、毒叶藤和荨麻的那些；常见的草变应原包括黑麦草、梯牧草、约翰逊草、百慕大草、羊茅草和蓝草变应原；常见的变应原还可从霉菌或真菌获得，诸如链格孢属、镰孢菌属、着色芽生菌属、曲霉属、小多孢菌属、毛霉属和嗜热放线菌；表皮变应原可从房屋或有机灰尘(通常来源于真菌)获得或从动物来源诸如羽毛和狗皮屑获得；常见的食品变应原包括牛奶和奶酪(乳制品)、鸡蛋、小麦、果仁(如花生)、海产品(如贝壳)、豌豆、大豆和麸质变应原；常见的环境变应原包括金属(镍和金)、化学品(甲醛、三硝基苯酚和松节油)、乳胶、橡胶、纤维(棉或羊毛)、粗麻布、染发剂、化妆品、去垢剂和香料变应原；常见的药物变应原包括局部麻醉剂和水杨酸盐变应原；抗生素变应原包括青霉素、四环素和磺胺变应原；而常见的昆虫变应原包括蜜蜂、黄蜂和蚂蚁毒液以及蟑螂萼器变应原。特别充分表征的变应原包括但不限于主要的猫变应原Fel d1、蜜蜂毒液磷脂酶A2(PLA)(Akdis等人(1996)J.Clin.Invest.98：1676-1683)、桦树花粉变应原Bet v 1(Bauer等人(1997)Clin.Exp.Immunol.107：536-541)和多表位的重组的草变应原rKBG8.3(Cao等人(1997)Immunology 90：46-51)。这些和其它合适的变应原是商业上可获得的和/或 可作为提取物按照已知技术容易地制备。
优选地，第二多肽变应原选自以下变应原序列和数据库登记号(NCBI Entrez登记号)列表。NCBI是美国国家生物技术信息中心并且是美国国家卫生研究院的分支机构。可获取进入数据库的NCBI网址是www.ncbi.nlm.nih.gov/。变应原序列和数据库登记号(NCBI Entrez登记号)：
屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)
Der p 1
MKIVLAIASLLALSAVYARPSSIKTFEEYKKAFNKSYATFEDEEAARKNFLESVKYVQSNGGAINHLSDLSLDEFKNRFLMSAEAFEHLKTQFDLNAETNACSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQHNGVVQESYYRYVAREQSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNVNKIREALAQTHSAIAVIIGIKDLDAFRHYDGRTIIQRDNGYQPNYHAVNIVGYSNAQGVDYWIVRNSWDTNWGDNGYGYFAANIDLMMIEEYPYVVIL
Der p 2
MMYKILCLSLLVAAVARDQVDVKDCANHEIKKVLVPGCHGSEPCIIHRGKPFQLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDGLEVDVPGIDPNACHYMKCPLVKGQQYDIKYTWNVPKIAPKSENVVVTVKVMGDDGVLACAIATHAKIRD
Der p 3
MIIYNILIVLLLAINTLANPILPASPNATIVGGEKALAGECPYQISLQSSSHFCGGTILDEYWILTAAHCVAGQTASKLSIRYNSLKHSLGGEKISVAKIFAHEKYDSYQIDNDIALIKLKSPMKLNQKNAKAVGLPAKGSDVKVGDQVRVSGWGYLEEGSYSLPSELRRVDIAVVSRKECNELYSKANAEVTDNMICGGDVANGGKDSCQGDSGGPVVDVKNNQVVGIVSWGYGCARKGYPGVYTRVGNFIDWIESKRSQ
Der p 4
KYXNPHFIGXRSVITXLME
Der p 5
MKFILAFFVATLAVMTVSGEDKKHDYQNEFDFLLMERIHEQIKKGELALFYLQEQINHFEEKPTKEMKDKIVAEMDTIIAMIDGVRGCLDRLMQRKDLDIFEQYNLEMAKKSGDILERDLKKEEARVKKIEV
Der p 6
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Der p 7
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Der p9
IVGGSNASPGDAVYQIAL
粉尘螨(Dermatophagoides farinae)
Der f 1
MKFVLAIASLLVLTVYARPASIKTFEFKKAFNKNYATVEEEEVARKNFLESLKYYEANKGAINHLSDLSLDEFKNRYLMSAEAFEQLKTQFDLNAETSACRINSVNVPSELDLRSLRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNTSLDLSEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQQNGVVEERSYPYVAREQRCRRPNSQHYGISNYCQIYPPDVKQIREALTQTHTAIAVIIGIKDLRAFQHYDGRTIIQHDNGYQPNYHAVNIVGYGSTQGDDYWIVRNSWDTTWGDSGYGYFQAGNNLMMIEQYPYVVIM
Der f 2
MISKILCLSLLVAAVVADQVDVKDCANNEIKKVMVDGCHGSDPCIIHRGKPFTLEALFDANQNTKTAKIEIKASLDGLEIDVPGIDTNACHFMOKCPLVKGQQYDIKYTWNVPKIAPKSENVVVTVKLIGDNGVLACAIATHGKIRD
Der f 3
MMILTIVVLLAANILATPILPSSPNATIVGGVKAQAGDCPYQISLQSSSHFCGGSILDEYWILTAAHCVNGQSAKKLSIRYNTLKHASGGEKIQVAEIYQHENYDSMTIDNDVALIKLKTPMTLDQTNAKPVPLPAQGSDVKVGDKIRVSGWGYLQEGSYSLPSELQRVDIDVVSREQCDQLYSKAGADVSENMICGGDVANGGVDSCQGDSGGPVVDVATKQIVGIVSWGYGCARKGYPGVYTRVGNFVDWIESKRSQ
Der f 4
AVGGQDADLAEAPFQISLLK
Der f 7
MMKFLLIAAVAFVAVSADPIHYDKITEEINKAIDDAIAAIEQSETIDPMKVPDHADKFERHVGIVDFKGELAMRNIEARGLKQMKRQGDANVKGEEGIVKAHLLIGVHDDIVSMEYDLAYKLGDLHPTTHVISDIQDFVVALSLEISDEGNITMTSFEVRQFANVVNHIGGLSILDPIFGVLSDVLTAIFQDTVRKEMTKVLAPAFKRELEKN
另外的螨变应原序列(NCBI entrez登记号)：
1170095；1359436；2440053；666007；487661；1545803；84702；84699；625532；404370；1091577；1460058；7413；9072；387592。
猫
猫属序列(NCBI entrez登记号)：
539716；539715；423193；423192；423191；423190；1364213；1364212；395407；163827；163823；163825；1169665；232086；1169666。
乳胶
三叶胶树序列：
Hev b 1
MAEDEDNQQGQGEGLKYLGFVQDAATYAVTTFSNVYLFAKDKSGPLQPGVDIIEGPVKNVAVPLYNRFSYIPNGALKFVDSTVVASVTIIDRSLPPIVKDASIQVVSAIRAAPEAARSLASSLPGQTKILAKVFYGEN
Hev b 3
MAEEVEEERLKYLDFRAAGVYAVDSFSTLYLYAKDISGPLKPGVDTIENVVKTVVTPVYYIPLEAVKFVDKTVDVSVTSLDGVVPPVIKQVSAQTYSVAQDAPRIVLDVASSVFNTGVQEGAKALYANLEPKAEQYAVITWRALNKLPLVPQVANVVVPTAVYFSEKYNDVVRGTTEQGYRVSSYLPLLPTEKITKVFGDEAS
另外的三叶胶树序列(NCBI entrez登记号)：
3319923；3319921；3087805；1493836；1480457；1223884；3452147；3451147；1916805；232267；123335；2501578；3319662；3288200；1942537；2392631；2392630；1421554；1311006；494093；3183706；3172534；283243；1170248；1708278；1706547；464775；266312；231586；123337；116359；123062；2213877；542013；2144920；1070656；2129914；2129913；2129912；100135；82026；1076559；82028；82027；282933；280399；100138；1086972；108697；1086976；1086978；1086978；1086976；1086974；1086972；913758；913757；913756；234388；1092500；228691；1177405；18839；18837；18835；18833；18831；1209317；1184668；168217；168215；168213；168211；168209；348137。
黑麦草
黑麦草属序列：
126385 Lo1 p 1
MASSSSVLLVVALFAVFLGSAHGIAKVPPGPNITAEYGDKWLDAKSTWYGKPTGAGPKDNGGACGYKNVDKAPFNGMTGCGNTPIFKDGRGCGSCFEIKCTKPESCSGEAVTVTITDDNEEPIAPYHFDLSGHAFGSMAKKGEEQNVRSAGELELQFRRVKCKYPDDTKPTFHVEKASNPNYLAILVKYVDGDGDVVAVDIKEKGKDKWIELKESWGAVWRIDTPDKLTGPFTVRYTTEGGTKSEFEDVIPEGWKADTSYSAK
126386 Lo1 p 2a
AAPVEFTVEKGSDEKNLALSIKYNKEGDSMAEVELKEHGSNEWLALKKNGDGVWEIKSDKPLKGPFNFRFVSEKGMRNVFDDVVPADFKVGTTYKPE
126387 Lo1 p 3
TKVDLTVEKGSDAKTLVLNIKYTRPGDTLAEVELRQHGSEEWEPMTKKGNLWEVKSAKPLTGPMNFRFLSKGGMKNVFDEVIPTAFTVGKTYTPEYN
2498581 Lo1 p 5a
MAVQKYTVALFLRRGPRGGPGRSYAADAGYTPAAAATPATPAATPAGGWREGDDRRAEAAGGRQRLASRQPWPPLPTPLRRTSSRSSRPPSPSPPRASSPTSAAKAPGLIPKLDTAYDVAYKAAEAHPRGQVRRLRHCPHRSLRVIAGALEVHAVKPATEEVLAAKIPTGELQIVDKIDAAFKIAATAANAAPTNDKFTVFESAFNKALNECTGGAMRPTSSSPPSRPRSSRPTPPPSPAAPEVKYAVFEAALTKAITAMTQAQKAGKPAAAAATAAATVATAAATAAAVLPPPLLVVQSLISLLIYY
2498582 Lo1 p 5b
MAVQKHTVALFLAVALVAGPAASYAADAGYAPATPATPAAPATAATPATPATPATPAAVPSGKATTEEQKLIEKINAGFKAAVAAAAVVPPADKYKTFVETFGTATNKAFVEGLASGYADQSKNQLTSKLDAALKLAYEAAQGATPEAKYDAYVATLTEALRVIAGTLEVHAVKPAAEEVKVGAIPAAEVQLIDKVDAAYRTAATAANAAPANDKFTVFENTFNNAIKVSLGAAYDSYKFIPTLVAAVKQAYAAKQATAPEVKYTVSETALKKAVTAMSEAEKEATPAAAATATPTPAAATATAT PAAAYATATPAAATATATPAAATATPAAAGGYKV
455288 Lo1 p 同种型9
MAVQKHTVALFLAVALVAGPAASYAADAGYAPATPATPAAPATAATPATPATPATPAAVPSGKATTEEQKLIEKINAGFKAAVAAAAVVPPADKYKTFVETFGTATNKAFVEGLASGYADQSKNQLTSKLDAALKLAYEAAQGATPEAKYDAYVATLTEALRVIAGTLEVHAVKPAAEEVKVGAIPAAEVQLIDKVDAAYRTAATAANAAPANDKFTVFENTFNNAIKVSLGAAYDSYKFIPPTLVAAVKQAYAAKQATAPEVKYTVSETALKKAVTAMSEAEKEATPAAAATATPTPAAATATATPAAAYATATPAAATATATPAAATATPAAAGGYKV
1582249 Lo1 p 11
DKGPGFVVTGRVYCDPCRAGFETNVSHNVEGATVAVDCRPFDGGESKLKAEATTDKDGWYKIEIDQDHQBEICEVVLAKSPDKSCSEIEEFRDRARVPLTSNXGIKQQGIRYANPIAFFRKEPLKECGGILQAY
另外的黑麦草属序列(NCBI entrez登记号)：
135480；417103；687261；687259；1771355；2388662；631955；542131；542130；542129；100636；626029；542132；320616；320615；320614；100638；100634；82450；626028；100639；283345；542133；1771353；1763163；310877；310875；250525；55317；515377；510911；939932；439950；2718；168316；168314；485371；2388664；2832717；2828273；548867。
橄榄树
橄榄序列
416610 Ole e 1
EDIPQPPVSQFHIQGQVYCDTCRAGFITELSEFIPGASLRLQCKDKENGDVTFTEVGYTRAEGLYSMLVERDHKNEFCEITLISSGRKDCNEIPTEGWAKPSLKFKLNTVNGTTRTVNPLGFFKKEALPKCAQVYNKLGMYPPNM
墙草属(parietaria)
墙草属序列：
2497750 Par j P2
MRTVSMAALVVIAAALAWTSSAEPAPAPAPGEEACGKVVQDIMPCLHFVKGEEKEPSKECCSGTKKLSEEVKTTEQKREACKCIVRATKGISGIKNELVAEVPKKCDIKTTLPPITADFDCSKIQSTIFRGYY
1352506 Par j P5
MVRALMPCLPFVQGKEKEPSKGCCSGAKRLDGETKTGPQRVHACECIQTAMKTYSDIDGKLVSEVPKHCGIVDSKLPPIDVNMDCKTVGVVPRQPQLPVSLRHGPVTGPSDPAHKARLERPQIRVPPPAPEKA
1532056 Par j P8
MRTVSMAALVVIAAALAWTSSAELASAPAPGEGPCGKVVHHIMPCLKFVKGEEKEPSKSCCSGTKKLSEEVKTTEQKREACKCIVAATKGISGIKNELVAEVPKKCGITTTLPPITADFDCSKIESTIFRGYY
1532058 Par j P9
MRTVSAPSAVALVVIVAAGLAWTSLASVAPPAPAPGSEETCGTVVRALMPCLPFVQGKEKEPSKGCCSGAKRLDGETKTGLQRVHACECIQTAMKTYSDIDGKLVSEVPKHCGIVDSKLPPIDVNMDCKTLGVVPRQPQLPVSLRHGPVTGPSDPAHKARLERPQIRVPPPAPEKA
2497749 Par j P9
MRTVSARS SVALVVIVAAVLVWTSSASVAPAPAPGSEETCGTVVGALMPCLPFVQGKEKEPSKGCCSGAKRLDGETKTGPQRVHACECIQTAMKTYSDIDGKLVSEVPKHCGIVDSKLPPIDVNMDCKTLGVLHYKGN
1086003 Par j 1
MVRALMPCLPFVQGKEKEPSKGCCSGAKRLDGETKTGPQRVHACECIQTAMKTYSDIDGKLVSEVPKHCGIVDSKLPPIDVNMDCKTVGVVPRQPQLPVSLRHGPVTGPSRSRPPTKHGWRDPRLEFRPPHRKKPNPAFSTLG
另外的墙草属序列(NCBI entrez登记号)：
543659；1836011；1836010；1311513；1311512；1311511；1311510；1311509；240971。
梯牧草
梯牧草属(phleum)序列：
Ph1 p 1
MASSSSVLLVVVLFAVFLGSAYGIPKVPPGPNITATYGDKWLDAKSTWYGKPTGAGPKDNGGACGYKDVDKPPFSGMTGCGNTPIFKSGRGCGSCFEIKCTKPEACSGEPVVVHITDDNEEPIAPYHFDLSGHAFGAMAKKGDEQKLRSAGELELQFRRVKCKYPEGTKVTFHVEKGSNPNYLALLVKYVNGDGDVVAVDIKEKGKDKWIELKESWGAIWRIDTPDKLTGPFTVRYTTEGGTKTEAEDVIPEGWKADTSYESK
Ph1 p 1
MASSSSVLLVVALFAVFLGSAHGIPKVPPGPNITATYGDKWLDAKSTWYGKPTAAGPKDNGGACGYKDVDKPPFSGMTGCGNTPIFKSGRGCGSCFEIKCTKPEACSGEPVVVHITDDNEEPIAAYHFDLSGIAFGSMAKKGDEQKLRSAGEVEIQFRRVKCKYPEGTKVTFHVEKGSNPNYLALLVKFSGDGDVVAVDIKEKGKDKWIALKESWGAIWRIDTPEVLKGPFTVRYTTEGGTKARAKDVIPEGWKADTAYESK
Ph1p 2
MSMASSSSSSLLAMAVLAALFAGAWCVPKVTFTVEKGSNEKHLAVLVKYEGDTMAEVELREHGSDEWVAMTKGEGGVWTFDSEEPLQGPFNFRFLTEKGMKNVFDDVVPEKYTIGATYAPEE
Ph1 p 5
ADLGYGGPATPAAPAEAAPAGKATTEEQKLIEKINDGFKAALAAAAGVPPADKYKTFVATFGAASNKAFAEGLSAEPKGAAESSSKAALTSKLDAAYKLAYKTAEGATPEAKYDAYVATLSEALRIIAGTLEVHAVKPAAEEVKVIPAGELQVIEKVDSAFKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNNAIKASTGGAYESYKFIPALEAAVKQAYAATVATAPEVKYTVFETALKKAFTAMSEAQKAAKPATEATATATAAVGAATGAATAATGGYKV
Ph1 p 5
ADLGYGGPATPAAPAEAAPAGKATTEEQKLIEKINDGFKAALAAAAGVPPADKYKTFVATFGAASNKAFAEGLSAEPKGAAESSSKAALTSKLDAAYKLAYKTAEGATPEAKYDAYVATLSEALRIIAGTLEVHAVKPAAEEVKVIPAGELQVIEKVDSAFKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNNAIKASTGGAYESYKFIPALEAAVKQAYAATVATAPEVKYTVFETALKKAITAMSEAQKAAKPATEATATATAAVGAATGAATAATGGYKV
Ph1 p 5b
AAAAVPRRGPRGGPGRSYTADAGYAPATPAAAGAAAGKATTEEQKLIEDINVGFKAAVAAAASVPAADKFKTFEAAFTSSSKAAAAKAPGLVPKLDAAYSVAYKAAVGATPEAKFDSFVASLTEALRVIAGALEVHAVKPVTEEPGMAKIPAGELQIIDKIDAAFKVAATAAATAPADDKFTVFEAAFNKAIKESTGGAYDTYKCIPSLEAAVKQAYAATVAAAPQVKYAVFEAALTKAITAMSEVQKVSQPATGAATVAAGAATTAAGAASGAATVAAGGYKV
Ph1 p 5a
ADLGYGPATPAAPAAGYTPATPAAPAGADAAGKATTEEQKLIEKINAGFKAALAGAGVQPADKYRTFVATFGPASNKAFAEGLSGEPKGAAESSSKAALTSKLDAAYKLAYKTAEGATPEAKYDAYVATLSEALRKAGTLEVHAVKPAAEEVKVIPAGELQVIEKVDAAFKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNDEIKASTGGAYESYKFIPALEAAVKQAYAATVATAPEVKYTVFETALKKAITAMSEAQKAA KPAAAATATATAAVGAATGAATAATGGYKV
Ph1 p 5
MAVQKYTVALFLAVALVAGPAASYAADAGYAPATPAAAGAEAGKATTEEQKLIEDINVGFKAAVAAAASVPAADKFKTFEAAFTSSSKAATAKAPGLVPKLDAAYSVSYKAAVGATPEAKFDSFVASLTEALRVIAGALEVHAVKPVTEEPGMAKIPAGELQIIDKIDAAFKVAATAAATAPADTVFEAAFNKAIKESTGGAYDTYKCIPSLEAAVKQAYAATVAAAPQVKYAVFEAALTKAITAMSEVQKVSQPATGAATVAAGAATTAAGAASGAATVAAGGYKV
Ph1 p 5
MAVQKYTVALFLAVALVAGPAASYAADAGYAPATPAAAGAEAGKATTEEQKLIEDINVGFKAAVAAAASVPAADKFKTFEAAFTSSSKAATAKAPGLVPKLDAAYSVAYKAAVGATPEAKFDSFVASLTEALRVIAGALEVHAVKPVTEDPAWPKIPAGELQIIDKIDAAFKVAATAAATAPADDKFTVFEAAFNKAIKESTGGAYDTYKCIPSLEAAVKQAYAATVAAAPQVKYAVFEAALTKAITAMSEVQKVSQPATGAATVAAGAATTATGAASGAATVAAGGYKV
Ph1 p 5
ADAGYAPATPAAAGAEAGKATTEEQKLIFDINVGFKAAVAAAASVPAADKFKTFEAAFTSSSKAATAKAPGLVPKLDAAYSVAYKAAVGATPEAKFDSFVASLTEALRVIAGALEVHAVKPVTEEPGMAKIPAGELQIIDKIDAAFKVAATAAATAPADDKFTVFEAAFNKAIKESTGGAYDTYKCIPSLEAAVKQAYAATVAAAPQVKYAVFEAALTKAITAMSEVQKVSQPATGAATVAAGAATTAAGAASGAATVAAGGYKV
Ph1 p 5
SVKRSNGSAEVHRGAVPRRGPRGGPGRSYAADAGYAPATPAAAGAEAGKATTEEQKLIEDINVGFKAAVAAAASVPAADKFKTFEAAFTSSSKAATAKAPGLVPKLDAAYSVAYKAAVGATPEAKFDSFVASLTEALRVIAGALEVHAVKPVTEEPGMAKIPAGELQIIDKIDAAFKVAATAAATAPADDKFTVFEAAFNKAIKES TGGAYDTYKCIPSLEAAVKQAYAATVAAAPQVKYAVFEAALTKAITAMSEVQKVSQPATGAATVAAGAATTAAGAASGAATVAAGGYKV
Ph1 p 5
MAVHQYTVALFLAVALVAGPAGSYAADLGYGPATPAAPAAGYTPATPAAPAGAEPAGKATTEEQKLIEKINAGFKAALAAAAGVPPADKYRTFVATFGAASNKAFAEGLSGEPKGAAESSSKAALTSKLDAAYKLAYKTAEGATPEAKYDAYVATVSEALRIIAGTLEVHAVKPAAEEVKVIPAGELQVIEKVDAAFKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNDAIKASTGGAYESYKFIPALEAAVKQAYAATVATAPEVKYTVFETALKKAITAMSEAQKAAKPAAAATATATAAVGAATGAATAATGGYKV
Ph1 p 5
ADLGYGGPATPAAPAEAAPAGKATTEEQKLIEKINDGFKAALAAAAGVPPADKYKTFVATFGAASNKAFAEGLSAEPKGAAESSSKAALTSKLDAAYKLAYKTAEGATPEAKYDAYVATLSEALRIIAGTLEVHAVKPAAEEVKVIPAGELQVIEKVDSAFKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNNAIKASTGGAYESYKFIPALEAAVKQAYAATVATAPEVKYTVFETALKKAFTAMSEAQKAAKPATEATATATAAVGAATGAATAATGGYKV
Ph1 p 5b
AAAAVPRRGPRGGPGRSYTADAGYAPATPAAAGAAAGKATTEEQKLIEDINVGFKAAVAAAASVPAADKFKTFEAAFTSSSKAAAAKAPGLVPKLDAAYSVAYKAAVGATPEAKFDSFVASLTEALRVIAGALEVHAVKPVTEEPGMAKIPAGELQIIDKIDAAFKVAATAAATAPADDKFTVFEAAFNKAIKESTGGAYDTYKCIPSLEAAVKQAYAATVAAAPQVKYAVFEAALTKAITAMSEVQKVSQPATGAATVAAGAATTAAGAASGAATVAAGGYKV
Ph1 p 5a
ADLGYGPATPAAPAAGYTPATPAAPAGADAAGKATTEEQKLIEKINAGFKAALAGAGVQPADKYRTFVATFGPASNKAFAEGLSGEPKGAAESSSKAALTSK LDAAYKLAYKTAEGATPEAKYDAYVATLSEALRIIAGTLEVHAVKPAAEEVKVIPAGELQVIEKVDAAFKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNDEIKASTGGAYESYKFIPALEAAVKQAYAATVATAPEVKYTVFETALKKAITAMSEAQKAAKPAAAATATATAAVGAATGAATAATGGYKV
Ph1 p 5
AVPPRGPRGGPGRSYAADAGYAPATPAAAGAEAGKATTEEQKLIEDINVGFKAAVAAAASVPAGDKFKTFEAAFTSSSKAATAKAPGLVPKLDAAYSVAYKAAVGATPEAKFDSFVASLTEALRVIAGALEVHAVKPVTEEPGMAKIPAGELQIIDKIDAAFKVAATAAATAPADDKFTVFEAAFNKAIKESTGGAYDTYKCIPSLEAAVKQAYAATVAAAPQVKYAVFEAALTKAITAMSEVQKVSQPATGAATVAAGAATTATGAASGAATVAAGGYKV
Ph1 p 5b
MAVPRRGPRGGPGRSYTADAGYAPATPAAAGAAAGKATTEEQKLIEDINVGFKAAVAARQRPAADKFKTFEAASPRHPRPLRQGAGLVPKLDAAYSVAYKAAVGATPEAKFDSFVASLTEALRVIAGALEVHAVKPVTEEPGMAKKIPAGELQIIDKIDAAFKVAATAAATAPADDKFTVFEAAFNKAIKESTGGAYDTYKCIPSLEAAVKQAYAATVAAAAEVKYAVFEAALTKAITAMSEVQKVSQPATGAATVAAGAATTAAGAASGAATVAAGGYKV
Ph1 p 5
MAVHQYTVALFLAVALVAGPAASYAADLGYGPATPAAPAAGYTPATPAAPAEAAPAGKATTEEQKLIEKINAGFKAALAAAAGVQPADKYRTFVATFGAASNKAFAEGLSGEPKGAAESSSKAALTSKLDAAYKLAYKTAEGATPEAKYDAYVATLSEALRIIAGTLEVHAVKPAAEEVKVIPAGELQVIEKVDAAFKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNDAIKASTGGAYESYKFIPALEAAVKQAYAATVATAPEVKYTVFETALKKAITAMSEAQKAAKPAAAATATATAAVGAATGAATAATGGYKV
Ph1 p 5
EAPAGKATTEEQKLIEKINAGFKAALARRLQPADKYRTFVATFGPASNKAFAEGLSGEPKGAAESSSKAALTSKLDAAYKLAYKTAEGATPEAKYDAYVATLSEALRIIAGTLEVHAVKPAAEEVKVIPAAELQVIEKVDAAFKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNDEIKASTGGAYESYKFIPALEAAVKQAYAATVATAPEVKYTVFETALKKAITAMSEAQKAAKPPPLPPPPQPPPLAATGAATAATGGYKV
Ph1 p 5
MAVHQYTVALFLAVALVAGPAASYAADLGYGPATPAAPAAGYTPATPAAPAEAAPAGKATTEEQKLIEKINAGFKAALAAAAGVQPADKYRTFVATFGAASNKAFAEGLSGEPKGAAESSSKAALTSKLDAAYKLAYKTAEGATPEAKYDAYVATLSEALRIIAGTLEVHAVKPAAEEVKVIPAGELQVIEKVDAAFKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNDAIKASTGGAYESYKFIPALEAAVKQAYAATVATAPEVKYTVFETALKKAITAMSEAQKAAKPAAAATATATAAVGAATGAATAATGGYKV
Ph1 p 5b
MAVPRRGPRGGPGRSYTADAGYAPATPAAAGAAAGKATTEEQKLIEDINVGFKAAVAARQRPAADKFKTFEAASPRHPRPLRQGAGLVPKLDAAYSVAYKAAVGATPEAKFDSFVASLTEALRVIAGALEVHAVKPVTEEPGMAKIPAGELQIIDKIDAAFKVAATAAATAPADDKFTVFEAAFNKAIKESTGGAYDTYKCIPSLEAAVKQAYAATVAAAAEVKYAVFEAALTKAITAMSEVQKVSQPATGAATVAAGAATTAAGAASGAATVAAGGYKV
Ph1 p 5a
ADLGYGPATPAAPAAGYTPATPAAPAGADAAGKATTEEQKLIEKINAGFKAALAGAGVQPADKYRTFVATFGPASNKAFAEGLSGEPKGAAESSSKAALTSKLDAAYKLAYKTAEGATPEAKYDAYVATLSEALRIIAGTLEVHAVKPAAEEVKVIPAGELQVIEKVDAAFKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNDEIKASTGGAYESYKFIPALEAAVKQAYAATVATAPEVKYTVFETALKKAITAMSEAQKAAKPPPLPPPPQPPPLAATGAATAATGGYKV
Ph1 p 5
MAVHQYTVALFLAVALVAGPAASYAADLGYGPATPAAPAAGYTPATPAAPAEAAPAGKATTEEQKLIEKINAGFKAALAAAAGVQPADKYRTFVATFGAASNKAFAEGLSGEPKGAAESSSKAALTSKLDAAYKLAYKTAEGATPEAKYDAYVATLSEALRIIAGTLEVHAVKPAAEEVKVIPAGELQVIEKVDAAFKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNDAIKASTGGAYESYKFIPALEAAVKQAYAATVATAPEVKYTVFETALKKAITAMSEAQKAAKPAAAATATATAAVGAATGAATAATGGYKV
Ph1 p 6
MAAHKFMVAMFLAVAVVLGLATSPTAEGGKATTEEQKLIEDVNASFRAAMATTANVPPADKYKTFEAAFTVSSKRNLADAVSKAPQLVPKLDEVYNAAYNAADHAAPEDKYEAFVLHFSEALRIIAGTPEVHAVKPGA
Ph1 p 6
SKAPQLVPKLDEVYNAAYNAADHAAPEDKYEAFVLHFSEALHIIAGTPEVHAVKPGA
Ph1 p 6
ADKYKTFEAAFTVSSKRNLADAVSKAPQLVPKLDEVYNAAYNAADHAAPEDKYEAFVLHFSEALHIIAGTPEVHAVKPGA
Ph1 p 6
TEEQKLIEDVNASFRAAMATTANVPPADKYKTLEAAFTVSSKRNLADAVSKAPQLVPKLDEVYNAAYNAADHAAPEDKYEAFVLHFSEALRIIAGTPEVHAVKPGA
Ph1 p 6
MAAHKFMVAMFLAVAVVLGLATSPTAEGGKATTEEQKLIEDINASFRAAMATTANVPPADKYKTFEAAFTVSSKRNLADAVSKAPQLVPKLDEVYNAAYNAA DHAAPEDKYEAFVLHFSEALHIIAGTPEVHAVKPGA
Ph1 p 6
MVAMFLAVAVVLGLATSPTAEGGKATTEEQKLIEDVNASFRAAMATTANVPPADKYKTFEAAFTVSSKRNLADAVSKAPQLVPKLDEVYNAAYNAADHAAPEDKYEAFVLHFSEALRIIAGTPEVHAVKPGA
Ph1 p 7
MADDMERIFKRFDTNGDGKISLSELTDALRTLGSTSADEVQRMMAEIDTDGDGFIDFNEFISFCNANPGLMKDVAKVF
Ph1 p 11
MSWQTYVDEHLMCEIEGHHLASAAILGHDGTVWAQSADFPQFKPEEITGIMKDFDEPGHLAPTGMFVAGAKYMVIQGEPGRVIRGKKGAGGITIKKTGQALVVGIYDEPMTPGQCNMVVERLGDYLVEQGM
另外的梯牧草属序列(NCBI entrez登记号)：
458878；548863；2529314；2529308；2415702；2415700；2415698；542168；542167；626037；542169；541814；542171；253337；253336；453976；439960。
黄蜂(和相关的)
黄胡峰(vespila)序列：
465054变应原VES V 5
MEISGLVYLIIIVTIIDLPYGKANNYCKIKCLKGGVHTACKYGSLKPNCGNKVVVSYGLTKQEKQDILKEHNDFRQKIARGLETRGNPGPQPPAKNMKNLVWNDELAYVAQVWANQCQYGHDTCRDVAKYQVGQNVALTGSTAAKYDDPVKLVKMWEDEVKDYNPKKKFSGNDFLKTGHYTQMVWANTKEVGCGSIKYIQEKWHKHYLVCNYGPSGNFMNEELYQTK
1709545变应原VES M 1
GPKCPFNSDTVSIIIETRENRNRDLYTLQTLQNHPEFKKKTITRPVVFITHGFTSSASEKNFINLAKALVDKDNYMVISIDWQTAACTNEYPGLKYAYYPTAASNTRLVGQYIATITQKLVKDYKISMANIRLIGHSLGAHVSGFAGKRVQELKLGKYSEIIGLDPARPSFDSNHCSERLCETDAEYVQIIHTSNYLGTEKILGTVDFYMNNGKNNPGCGRFFSEVCSHTRAVIYMAECIKHECCLIGIPRSKSSQPISRCTKQECVCVGLNAKKYPSRGSFYVPVESTAPFCNNKGKII
1352699变应原VES V 1
MEENMNLKYLLLFVYFVQVLNCCYGHGDPLSYELDRGPKCPFNSDTVSIIIETRENRNRDLYTLQTLQNHPEFKKKTITRPVVFITHGFTSSASETNFINLAKALVDKDNYMVISIDWQTAACTNEAAGLKYLYYPTAARNTRLVGQYIATITQKLVKHYKISMANIRLIGHSLGAHASGFAGKKVQELKLGKYSEIIGLDPARPSFDSNHCSERLCETDAEYVQIIHTSNYLGTEKTLGTVDFYMNNGKNQPGCGRFFSEVCSHSRAVIYMAECIKHECCLIGIPKSKSSQPISSCTKQECVCVGLNAKKYPSRGSFYVPVESTAPFCNNKGKII
1346323变应原VES V 2
SERPKRVFNIYWNVPTFMCHQYDLYFDEVTNFNIKRNSKDDFQGDKIAIFYDPGEFPALLSLKDGKYKKRNGGVPQEGNITIHLQKFIENLDKIYPNRNFSGIGVIDFERWRPIFRQNWGNMKIHKNFSIDLVRNEHPTWNKKMIELEASKRFEKYARFFMEETLKLAKKTRKQADWGYYGYPYCFNMSPNNLVPECDVTAMHENDKMSWLFNNQNVLLPSVYVRQELTPDQRIGLVQGRVKEAVRISNNLKHSPKVLSYWWYVYQDETNTFLTETDVKKTFQEIVINGGDGIIIWGSSSDVNSLSKCKRLQDYLLTVLGPIAINVTEAVN
549194变应原VES VI
5KVNYCKIKCLKGGVHTACKYGTSTKPNCGKMVVKAYGLTEAEKQEILKVHNDFRQKVAKGLETRGNPGPQPPAKNMNNLVWNDELANIAQVWASQCNYGHDTCKDTEKYPVGQNIAKRSTTAALFDSPGKLVKMWENEVKDFNPNIEWSKNNLKKTGHYTQMVWAKTKEIGCGSVKYVKDEWYTHYLVCNYGPSGNFRNEKLYEKK
另外的黄胡蜂属序列(NCBI entrez登记号)：
549193；549192；549191；549190；549131；117414；126761；69576；625255；627131；627188；627187；482382；112561；627186；627185；1923233；317645；317647；745570；225764；162551。
树变应原序列(主要是桦树)序列：
114922 Bet v 1
MGVFNYETETTSVIPAARLFKAFILDGDNLFPKVAPQAISSVENIEGNGGPGTIKKISFPEGFPFKYVKDRVDEVDHTNFKYNYSVIEGGPIGDTLEKISNEIKIVATPDGGSILKISNKYHTKGDHEVKAEQVKASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYN
130975 Bet v 2
MSWQTYVDEHLMCDIDGQASNSLASAIVGHDGSVWAQSSSFPQFKPQEITGIMKDFEEPGHLAPTGLHLGGIKYMVIQGEAGAVIRGKKGSGGITIKKTGQALVFGIYEEPVTPGQCNMVVERLGDYLIDQGL
1168696 Bet v 3
MPCSTEAMEKAGHGHASTPRKRSLSNSSFRLRSESLNTLRLRRIFDLFDKNSDGIITVDELSRALNLLGLETDLSELESTVKSFTREGNIGLQFEDFISLHQSLNDSYFAYGGEDEDDNEEDMRKSILSQEEADSFGGFKVFDEDGDGYISARELQMVLGKLGFSEGSEIDRVEKMIVSVDSNRDGRVDFFEFKDMMRSVLVRSS
809536 Bet v 4
MADDIHIPQDIKAERERIFKRFDANGDGKISAAELGEALKTLGSITPDEVKHMMAEIDTDGDGFISFQEFTDFGRANRGLLKDVAKIF
543675 Que a I-白栎(Quercus alba)＝橡树(片段)
GVFTXESQETSVIAPAXLFKALFL
543509 Car b I-欧洲鹅耳栎(Carpinus betulus)＝鹅耳枥树(hornbeam tree)(片段)
GVFNYEAETPSVIPAARLFKSYVLDGDKLIPKVAPQAIXK
543491 Aln g I-普通赤杨(Alnus glutinosa)＝桤木树(alder tree)(片段)
GVFNYEAETPSVIPAARLFKAFILDGDKLLPKVAPEAVSSVENI
1204056核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶
VQCMQVWPPLGLKKFETLSYLPPLSSEQLAKEVDYLLRKNLIPCLEFELEHGFVYREHNRSPGYYDGRYWTMWKLPMFGCNDSSQVLKELEECKKAYPSAFIRIIGFDDK
另外的树变应原序列(NCBI entrez登记号)：
131919；128193；585564；1942360；2554672；2392209；2414158；1321728；1321726；1321724；1321722；1321720；1321718；1321716；1321714；1321712；3015520；2935416；464576；1705843；1168701；1168710；1168709；1168708；1168707；1168706；1168705；1168704；1168703；1168702；1842188；2564228；2564226；2564224；2564222；2564220；2051993；1813311；1536831；534910；534900；534318；1340000；1339998；2149808；66207；2129477；1076249；1076247；629480；481805；81443；1361968；1361967；1361966；1361965；1361964；1361963；1361962；1361961；1361960；1361959；320546；629483；629482；629481；541804；320545；81444；541814；629484；474911；452742；1834387；298737；298736；1584322；1584321；584320；1542873；1542871；1542869；1542867；1542865；1542863；1542861；1542859；1542857；1483232；1483230；1483228；558561；551640；488605；452746；452744；452740；452738；452736；452734；452732；452730；452728；450885；17938；17927；17925；17921；297538；510951；231331；231329；166953。
花生
花生序列
1168391 Ara h 1
MRGRVSPLMLLLGILVLASVSATHAKSSPYQKKTENPCAQRCLQSCQQEPDDLKQKACESRCTKLEYDPRCVYDPRGHTGTTNQRSPPGERTRGRQPGDYDDDRRQPRREEGGRWGPAGPREREREEDWRQPREDWRRPSHQQPRKIRPEGREGEQEWGTPGSHVREETSRNNPFYFPSRRFSTRYGNQNGRIRVLQRFDQRSRQFQNLQNHRIVQIEAKPNTLVLPKHADADNILVIQQGQATVTVANGNNRKSFNLDEGHALRIPSGFISYILNRHDNQNLRVAKISMPVNTPGQFEDFFPASSRDQSSYLQGFSRNTLEAAFNAEFNEIRRVLLEENAGGEQEERGQRRWSTRSSENNEGVIVKVSKEHVEELTKHAKSVSKKGSEEEGDITNPINLREGEPDLSNNFGKLFEVKPDKKNPQLQDLDMMLTCVEIKEGALMLPHFNSKAMVIVVVNKGTGNLELVAVRKEQQQRGRREEEEDEDEEEEGSNREVRRYTARLKEGDVFIMPAAHPVAINASSELHLLGFGINAENNHRIFLAGDKDNVIDQIEKQAKDLAFPGSGEQVEKLIKNQKESHFVSARPQSQSQSPSSPEKESPEKEDQEEENQGGKGPLLSILKAFN
豚草
豚草属(ambrosia)序列
113478 Amb a 1
MGIKHCCYILYFTLALVTLLQPVRSAEDLQQILPSANETRSLTTCGTYNIIDGCWRGKADWAENRKALADCAQGFAKGTIGGKDGDIYTVTSELDDDVANPKEGTLRFGAAQNRPLWIIFARDMVIRLDRELAINNDKTIDGRGAKVEIINAGFAIYNVKNIIIHNIIMHDIVVNPGGLIKSHDGPPVPRKGSDGDAIGISGGSQIWIDHCSLSKAVDGLIDAKHGSTHFTVSNCLFTQHQYLLLFWDFDERGMLCTVAFNKFTDNVDQRMPNLRHGFVQVVNNNYERWGSYALGGSAGPTILSQGNRFLASDIKKEVVGRYGESAMSESINWNWRSYMDVFENGAIFVPSGVDPVLTPEQNAGMIPAEPGEAVLRLTSSAGVLSCQPGAPC
113479 Amb a 2
MGIKHCCYILYFTLALVTLVQAGRLGEEVDILPSPNDTRRSLQGCEAHNIIDKCWRCKPDWAENRQALGNCAQGFGKATHGGKWGDIYMVTSDQDDDVVNPKEGTLRFGATQDRPLWIIFQRDMITYLQQEMVVTSDKTIDGRGAKVELVYGGITLMNVKNVIIHNIDIHDVRVLPGGRIKSNGGPAIPRHQSDGDAIHVTGSSDIWIDHCTLSKSFDGLVDVNWGSTGVTISNCKFTHHEKAVLLGASDTHFQDLKMHVTLAYNIFTNTVHERMPRCRFGFFQIVNNFYDRWDKYAIGGSSNPTILSQGNK FVAPDFIYKKNVCLRTGAQEPEWMTWNWRTQNDVLENGAIFVASGSDPVLTAEQNAGMMQAEPGDMVPQLTMNAGVLTCSPGAPC
113477 Amb a 1.3
MGIKQCCYILYFTLALVALLQPVRSAEGVGEILPSVNETRSLQACEALNIIDKCWRGKADWENNRQALADCAQGFAKGTYGGKWGDVYTVTSNLDDDVANPKEGTLRFAAAQNRPLWIIFKNDMVINLNQELVVNSDKTIDGRGVKVEIINGGLTLMNVKNIIIHNINIHDVKVLPGGMIKSNDGPPILRQASDGDTINVAGSSQIWIDHCSLSKSFDGLVDVTLGSTHVTISNCKFTQQSKAILLGADDTHVQDKGMLATVAFNMFTDNVDQRMPRCRFGFFQVVNNNYDRWGTYAIGGSSAPTILCQGNRFLAPDDQIKKNVLARTGTGAAESMAWNWRSDKDLLENGAIFVTSGSDPVLTPVQSAGMIPAEPGEAAIKLTSSAGVFSCHPGAPC
113476 Amb a 1.2
MGIKHCCYILYFTLALVTLLQPVRSAEDVEEFLPSANETRRSLKACEAHNIIDKCWRCKADWANNRQALADCAQGFAKGTYGGKHGDVYTVTSDKDDDVANPKEGTLRFAAAQNRPLWIIFKRNMVIHLNQELVVNSDKTIDGRGVKVNIVNAGLTLMNVKNIIIHNINIHDIKVCPGGMIKSNDGPPILRQQSDGDAINVAGSSQIWIDHCSLSKASDGLLDITLGSSHVTVSNCKFTQHQFVLLLGADDTHYQDKGMLATVAFNMFTDHVDQRMPRCRFGFFQVVNNNYDRWGTYAIGGSSAPTILSQGNRFFAPDDIIKKNVLARTGTGNAESMSWNWRTDRDLLENGAIFLPSGSDPVLTPEQKAGMIPAEPGEAVLRLTSSAGVLSCHQGAPC
113475 Amb a 1.1
MGIKHCCYILYFTLALVTLLQPVRSAEDLQEILPVNETRRLTTSGAYNIIDGCWRGKADWAENRKALADCAQGFGKGTVGGKDGDIYTVTSELDDDVANPKEGTLRFGAAQNRPLWIIFERDMVIRLDKEMVVNSDKTIDGRGAKVEIINAGFTLNGVKNVIIHNINMHDVKVNPGGLIKSNDGPAAPRAGSDGDAISISGSSQIWIDHCSLSKSVDGLVDAKLGTTRLTVSNSLFTQHQFVLLFGAGDENIEDRGMLATVAFNTFTDNVDQRMPRCRHGFFQVVNNNYDKWGSYAIGGSASPTILSQGNRFCAPDERSKKNVLGRHGEAAAESMKWNWRTNKDVLENGAIFVASGVDPVLTPEQSAGMIPAEPGESALSLTSSAGVLSCQPGAPC
雪松序列
493634 Cry j IB 前体
MDSPCLVALLVFSFVIGSCFSDNPIDSCWRGDSNWAQNRMKLADCAVGFGSSTMGGKGGDLYTVTNSDDDPVNPPGTLRYGATRDRPLWIIFSGNMNIKLKMPMYIAGYKTFDGRGAQVYIGNGGPCVFIKRVSNVIIHGLYLYGCSTSVLGNVLINESFGVEPVHPQDGDALTLRTATNIWIDHNSFSNSSDGLVDVTLTSTGVTISNNLFFNHHKVMSLGHDDAYSDDKSMKVTVAFNQFGPNCGQRMPRARYGLVHVANNNYDPWTIYAIGGSSNPTILSEGNSFTAPNESYKKQVTIRIGCKTSSSCSNWVWQSTQDVFYNGAYFVSSGKYEGGNIYTKKEAFNVENGNATPHLTQNAGVLTCSLSKRC
493632 Cry j IA 前体
MDSPCLVALLVLSFVIGSCFSDNPIDSCWRGDSNWAQNRMKLADCAVGFGSSTMGGKGGDLYTVTNSDDDPVNPAPGTLRYGATRDRPLWIIFSGNMNIKLKMPMYIAGYKTFDGRGAQVYIGNGGPCVFIKRVSNVIIHGLHLYGCSTSVLGNVLINESFGVEPVHPQDGDALTLRTATNIWIDHNSFSNSSDGLVDVTLSSTGVTISNNLFFNHHKVMLLGHDDAYSDDKSMKVTVAFNQFGPNCGQRMPRARYGLVHVANNNYDPWTIYAIGGSSNPTILSEGNSFTAPNESYKKQVTIRIGCKTSSSCSNWVWQSTQDVFYNGAYFVSSGKYEGGNIYTKKEAFNVENGNATPQLTKNAGVLTCSLSKRC
1076242 Cry j II 前体-日本柳杉(japanese cedar)
MAMKLIAPMAFLAMQLIIMAAAEDQSAQIMLDSVVEKYLRSNRSLRKVEHSRHDAINIFNVEKYGAVGDGKHDCTEAFSTAWQAACKNPSAMILVPGSKKFVVNNLFFNGPCQPHFTFKVDGIIAAYQNPASWKNNRIWLQFAKLTGFTLMGKGVIDGQGKQWWAGQCKWVNGREICNDRDRPTAIKFDFSTGLIIQGLKLMNSPEFHLVFGNCEGVKIIGISITAPRDSPNTDGIDIFASKNFHLQKNTIGTGDDCVAIGTGSSNIVIEDLICGPGHGISIGSLGRENSRAEVSYVHVNGAKFIDTQNGLRIKTWQGGSGMASHIIYENVEMINSENPILINQFYCTSASACQNQRSAVQIQDVTYKNIRGTSATAAAIQLKCSDSMPCKDIKLSDISLKLTSGKIASCLNDNANGYFSGHVIPACKNLSPSAKRKESKSHKHPKTVMVENMRAYDKGNRTRILLGSRPPNCTNKCHGCSPCKAKLVIVHRIMPQEYYPQRWICSCHGKIYHP
1076241 Cry j II 蛋白-日本柳杉
MAMKFIAPMAFVAMQLIIMAAAEDQSAQIMLDSDIEQYLRSNRSLRKVEHSRHDAINIFNVEKYGAVGDGKHDCTEAFSTAWQAACKKPSAMLLVPGNKKFVVNNLFFNGPCQPHFTFKVDGIIAAYQNPASWKNNRIWLQFAKLTGFTLMGKGVIDGQGKQWWAGQCKWVNGREICNDRDRPTAIKFDFSTGLIIQGLKLMNSPEFHLVFGNCEGVKIIGISITAPRDSPNTDGIDIFASKNFHLQKNTIGTGDDCVAIGTGSSNIVIEDLICGPGHGISIGSLGRENSRAEVSYVHVNGAKFIDTQNGLRIKTWQGGSGMASHIIYENVEMINSENPILINQFYCTSASACQNQRSAVQIQDVTYKNIRGTSATAAAIQLKCSDSMPCKDIKLSDISLKLTSGKIASCLNDNANGYFSGHVIPACKNLSPSAKRKESKSHKHPKTVMVKNMGAYDKGNRTRILLGSRPPNCTNKCHGCSPCKAKLVIVHRIMPQEYYPQRWMCSRHGKIYHP
541803 Cry j I 前体-日本柳杉
MDSPCLVALLVLSFVIGSCFSDNPIDSCWRGDSNWAQNRMKLADCAVGFGSSTMGGKGGDLYTVTNSDDDPVNPPGTLRYGATRDRPLWIIFSGNMNIKLKMPMYIAGYKTFDGRGAQVYIGNGGPCVFIKRVSNVIIHGLHLYGCSTSVLGNVLINESFGVEPVHPQDGDALTLRTATNIWIDHNSFSNSSDGLVDVTLSSTGVTISNNLFFNHHKVMLLGHDDAYSDDKSMKVTVAFNQFGPNCGQRMPRARYGLVHVANNNYDPWTIYAIGGSSNPTILSEGNSFTAPNESYKKQVTIRIGCKTSSSCSNWVWQSTQDVFYNGAYFVSSGKYEGGNIYTKKEAFNVENGNATPQLTKNAGVLTCSLSKRC
541802 Cry j I 前体-日本柳杉
MDSPCLVALLVFSFVIGSCFSDNPIDSCWRGDSNWAQNRMKLADCAVGFGSSTMGGKGGDLYTVTNSDDDPVNPAPGTLRYGATRDRPLWIIFSGNMNIKLKMPMYIAGYKTFDGRGAQVYIGNGGPCVFIKRVSNVIIHGLYLYGCSTSVLGNVLINESFGVEPVHPQDGDALTLRTATNIWIDHNSFSNSSDGLVDVTLTSTGVTISNNLFFNHHKVMSLGHDDAYSDDKSMKVTVAFNQFGPNCGQRMPRARYGLVHVANNNYDPWTIYAIGGSSNPTILSEGNSFTAPNESYKKQVTIRIGCKTSSSCSNWVWQSTQDVFYNGAYFVSSGKYEGGNIYTKKEAFNVENGNATPHLTQNAGVLTCSLSKRC
犬
犬属序列：
Can f 1
MKTLLLTIGFSLIAILQAQDTPALGKDTVAVSGKWYLKAMTADQEVPEKPDSVTPMILKAQKGGNLEAKITMLTNGQCQNITVVLHKTSEPGKYTAYEGQRVVFIQPSPVRDHYILYCEGELHGRQIRMAKLLGRDPEQSQEALEDFREFSRAKGLNQEILELAQSETCSPGGQ
血清白蛋白片段
EAYKSEIAHRYNDLGEEHFRGLVL
血清白蛋白片段
LSSAKERFKCASLQKFGDRAFKAWSVARLSQRFPKADFAEISKVVTDLTKVHKECCHGDLLECADDRADLAKYMCENQDSISTKLKECCDKPVLEKSQCLAEVERDELPGDLPSLAADFVEDKEVCKNYQEAKDVFLGTFLYEYSRRHPEYSVSLLLRLAKEYEATLEKCCATDDPPTCYAKVLDEFKPLVDEPQNLVKTNCELFEKLGEYGFQNALLVRYTKKAPQVSTPTLVVEVSRKLGKVGTKCCKKPESERMSCADDFLS
Can f 2
MQLLLLTVGLALICGLQAQEGNHEEPQGGLEELSGRWHSVALASNKSDLIKPWGHFRVFIHSMSAKDGNLHGDILIPQDGQCEKVSLTAFKTATSNKFDLEYWGHNDLYLAEVDPKSYLILYMINQYNDDTSLVAHLMVRDLSRQQDFLPAFESVCEDIGLHKDQIVVLSDDDRCQGSRD
另外的犬变应原蛋白(NCBI entrez登记号)：
1731859
马
马属序列：
1575778Equ c 1
MKLLLLCLGLILVCAQQEENSDVAIRNFDISKISGEWYSIFLASDVKEKIEENGSMRVFVDVIRALDNSSLYAEYQTKVNGECTEFPMVFDKTEEDGVYSLNYDGYNVFRISEFENDEHIILYLVNFDKDRPFQLFEFYAREPDVSPEIKEEFVKIVQKR GIVKENIIDLTKIDRCFQLRGNGVAQA
3121755Equ c 2
SQXPQSETDYSQLSGEWNTIYGAASNIXK
尘螨(螨)
尘螨序列：
Eur m 1(变体)
TYACSINSVSLPSELDLRSLRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVASTESAYLAYRNMSLDLAEQELVDCASQNGCHGDTIPRGIEYIQQNGVVQEHYYPYVAREQSCHRPNAQRYGLKNYCQISPPDSNKIRQALTQTHTAVAVIIGIKDLNAFRHYDGRTIMQHDNGYQPNYHAVNIVGYGNTQGVDYWIVRNSWDTTWGDNGYGYFAANINL
Eur m 1(变体)
TYACSINSVSLPSELDLRSLRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVASTESAYLAYRNMSLDLAEQELVDCASQNGCHGDTIPRGIEYIQQNGVVQEHYYPYVAREQSCHRPNAQRYGLKNYCQISPPDSNKIRQALTQTHTAVAVIIGIKDLNAFRHYDGRTIMQHDNGYQPNYHAVNIVGYGNTQGVDYWIVRNSWDTTWGDNGYGYFAANINL
Eur m 1(变体)
ETNACSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQHNGVVQESYYRYVAREQSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNANKIREALAQTHSAIAVIIGIKDLDAFRHYDGRTIIQRDNGYQPNYHAVNIVGYSNAQGVDYWIVRNSWDTNWGDNGYGYFAANIDL
Eur m 1(变体)
ETSACRINSVNVPSELDLRSLRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNTSLDLSEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQQNGVVEERSYPYVAREQQCRRPNSQHYGISNYCQIYPPDVKQIREALTQTHTAIAVIIGIKDLRAFQHYDGR TIIQHDNGYQPNYHAVNIVGYGSTQGVDYWIVRNSWDTTWGDSGYGYFQAGNNL
早熟禾属(poa)(草)序列
113562花粉变应原POA P 9
MAVQKYTVALFLVALVVGPAASYAADLSYGAPATPAAPAAGYTPAAPAGAAPKATTDEQKMIEKINVGFKAAVAAAGGVPAANKYKTFVATFGAASNKAFAEALSTEPKGAAVDSSKAALTSKLDAAYKLAYKSAEGATPEAKYDDYVATLSEALRKAGTLEVHGVKPAAEEVKATPAGELQVIDKVDAAFKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNDAIKASTGGAYQSYKFIPALEAAVKQSYAATVATAPAVKYTVFETALKKAITAMSQAQKAAKPAAAATGTATAAVGAATGAATAAAGGYKV
113561 POA P 9
MAVHQYTVALFLAVALVAGPAASYAADVGYGAPATLATPATPAAPAAGYTPAAPAGAAPKATTDEQKLIEKINAGFKAAVAAAAGVPAVDKYKTFVATFGTASNKAFAEALSTEPKGAAAASSNAVLTSKLDAAYKLAYKSAEGATPEAKYDAYVATLSEALRIIAGTLEVHAVKPAGEEVKAIPAGELQVIDKVDAAFKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNDAIKASTGGAYQSYKFIPALEAAVKQSYAATVATAPAVKYTVFETALKKAITAMSQAQKAAKPAAAVTATATGAVGAATGAVGAATGAATAAAGGYKTGAATPTAGGYKV
113560POA P 9
MDKANGAYKTALKAASAVAPAEKFPVFQATFDKNLKEGLSGPDAVGFAKKLDAFIQTSYLSTKAAEPKEKFDLFVLSLTEVLRFMAGAVKAPPASKFPAKPAPKVAAYTPAAPAGAAPKATTDEQKLIEKINVGFKAAVAAAAGVPAASKYKTFVATFGAASNKAFAEALSTEPKGAAVASSKAVLTSKLDAAYKLAYKSAEGATPEAKYDAYVATLSEALRIIAGTLEVHGVKPAAEEVKAIPAGELQVIDKVDAAFKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNDAIKASTGGAYQSYKFIPALEAAVKQSYAATVATAPAVKYTVFETALKKAITAMSQAQKAAKPAAAVTGTATSAVGAATGAATAAAGGYKV
蟑螂序列
2833325 Cr p1
MKTALVFAAVVAFVAARFPDHKDYKQLADKQFLAKQRDVLRLFHRVHQHNILNDQVEVGIPMTSKQTSATTVPPSGEAVHGVLQEGHARPRGEPFSVNYEKHREQAIMLYDLLYFANDYDTFYKTACWARDRVNEGMFMYSFSIAVFHRDDMQGVMLPPPYEVYPYLFVDHDVIHMAQKYWMKNAGSGEHHSHVIPVNFTLRTQDHLLAYFTSDVNLNAFNTYYRYYYPSWYNTTLYGHNIDRRGEQFYYTYKQIYARYFLERLSNDLPDVYPFYYSKPVKSAYNPNLRYHNGEEMPVRPSNMYVTNFDLYYIADIKNYEKRVEDAIDFGYAFDEHMKPHSLYHDVHGMEYLADMIEGNMDSPNFYFYGSIYHMYHSMIGHIVDPYIHKMGLAPSLEHPETVLRDPVFYQLWKRVDHLFQKYKNRLPRYTHDELAFEGVKVENVDVGKLYTYFEQYDMSLDMAVYVNNVDQISNVDVQLAVRLNHKPFTYNIEVSSDKAQDVYVAVFLGPKYDYLGREYDLNDRRHYFVEMDRFPYHVGAGKTVIERNSHDSNIIAPERDSYRTFYKKVQEAYEGKSQYYVDKGHNYCGYPENLLIPKGKKGGQAYTFYVIVTPYVKQDEHDFEPYNYKAFSYCGVGSERKYPDNKPLGYPFDRKIYSNDFYTPNMYFKDVIIFHKKYDEVGVQGH
2231297 Cr p2
INEIHSIIGLPPFVPPSRRHARRGVGINGLIDDVIAILPVDELKALFQEKLETSPDFKALYDAIRSPEFQSIISTLNAMQRSEHHQNLRDKGVDVDHFIQLIRALFGLSRAARNLQDDLNDFLHSLEPISPRHRHGLPRQRRRSARVSAYLHADDFHKIITTIEALPEFANFYNFLKEHGLDVVDYINEIHSIIGLPPFVPPSRRHARRGVGINGLIDDVIAILPVDELKALFQEKLETSPDFKALYDAIRSPEFQSIISTLNAMPEYQELLQNLRDKGVDVDHFIRVDQGTLRTLSSGQRNLQDDLNDFLALIPTDQILAIAMDYLANDAEVQELVAYLQSDDFHKIITTIEALPEFANFYNFLKEHGLDVVDYINEIHSIIGLPPFVPPSQRHARRGVGINGLIDDVIAILPVDELKALFQEKLETSPDFKALYDAIDLRSSRA
1703445 B1a g 2
MIGLKLVTVLFAVATITHAAELQRVPLYKLVHVFINTQYAGITKIGNQNFLTV FDSTSCNVVVASQECVGGACVCPNLQKYEKLKPKYISDGNVQVKFFDTGSAVGRGIEDSLTISNLTTSQQDIVLADELSQEVCILSADVVVGIAAPGCPNALKGKTVLENFVEENLIAPVFSIHHARFQDGEHFGEIIFGGSDWKYVDGEFTYVPLVGDDSWKFRLDGVKIGDTTVAPAGTQAIIDTSKAIIVGPKAYVNPINEAIGCVVEKTTTRRICKLDCSKIPSLPDVTFVINGRNFNISSQYYIQQNGNLCYSGFQPCGHSDHFFIGDFFVDHYYSEFNWENKTMGFGRSVESV
1705483 B1a g 4
AVLALCATDTLANEDCFRHESLVPNLDYERFRGSWIIAAGTSEALTQYKCWIDRFSYDDALVSKYTDSQGKNRTTIRGRTKFEGNKFTIDYNDKGKAFSAPYSVLATDYENYAIVEGCPAAANGHVIYVQIRFSVRRFHPKLGDKEMIQHYTLDQVNQHKKAIEEDLKHFNLKYEDLHSTCH
2326190 B1a g 5
YKLTYCPVKALGEPIRFLLSYGEKDFEDYRFQEGDWPNLKPSMPFGKTPVLEIDGKQTHQSVAISRYLGKQFGLSGKDDWENLEIDMIVDTISDFRAAIANYHYDADENSKQKKWDPLKKETIPYYTKKFDEVVKANGGYLAAGKLTWADFYFVAILDYLNHMAKEDLVANQPNLKALREKVLGLPAIKAWVAKRPPTDL
另外的蟑螂序列(NCBI Entrez登记号)：
2580504；1580797；1580794；1362590；544619；544618；1531531；1580792；1166573；1176397；2317849。
变应原(一般的)序列：
NCBI登记号
2739154；3719257；3703107；3687326；3643813；3087805；1864024；1493836；1480457；2593176；2593174；1575778；763532；746485；163827；163823；3080761；163825；3608493；3581965；2253610；2231297；2317849；3409499；3409498；3409497；3409496；3409495；3409494；3409493；3409492；3409491；3409490；3409431；3409488；3409487；3409486；3409485；3409484；3409483；3409482；3409481；3409480；3409479；3409478；3409477；3409476；3409475；3409474；3409473；3409472； 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特别优选的变应原/抗原包括：猫皮屑蛋白Fel d1；豚草蛋白Der P1、Der P2和Der P7；豚草蛋白amb a 1.1、a 1.2、a1.3或a1.4；黑麦草蛋白lol p1和lol p5；梯牧草蛋白phl p1和phl p5；百慕大草蛋白Cyn d 5；互隔交链孢霉(Alternaria alternate)蛋白Alt a 1、Alt a 2和烯醇酶(Alt a 6)；桦树蛋白Bet v1和P14；德国蟑螂蛋白Bla g 1、Bla g 2、Bla g 3、Bla g 4、Bla g 5和Bla g 6；艾属植物(mugwort)蛋白Art v 1；俄国蓟(russian thistle)蛋白Sal k 1和Sal k 2；花生Ara h1、Ara h2、Ara h3、Ara h4、Ara h5、Ara h6；植物抑制蛋白或脂转移蛋白或人类白细胞抗原。
递送方法
配制之后，可使用多种已知途径和技术将本发明的组合物在体内递送到受治疗者。例如，可作为注射溶液、悬液或乳液提供组合物，并使用常规针头和注射器或使用液体喷射注射系统通过肠胃外、皮下、皮内(epicutaneous)、表皮、皮内、肌内、动脉内、腹膜内、静脉内注射施用。组合物还可局部施用于皮肤或粘膜组织，诸如鼻内、气管内、肠内、直肠或阴道，或作为适于呼吸道或肺部施用的细碎的喷雾而被提供。其它施用方式包括口服施用、栓剂、舌下施用、主动或被动的经皮递送技术。
当将施用本发明的肽时，优选地将肽施用到身体中的部位，在那里该肽将具有接触合适的抗原呈递细胞的能力，并且在那里该肽将具有接触个体的T细胞的能力。当将施用APC时，优选地将APC施用到身体中的部位，在那里APC将具有接触并活化个体的合适的T细胞的能力。
递送方案
可通过上述任何合适的方法施用肽/多核苷酸/细胞(诸如包含多种肽的组合物)。可由经验确定肽的合适量，但其通常是在以下提供的范围中。单次施用每种肽可足以对患者产生有益的作用，但将理解的是，如果肽施用多于一次那么它可能是有益的，在这种情况下典型的施用方案可以是，例如，每6个月中每周一次或两次持续2-4周，或每四到六个月中每天一次持续一周。将被理解的是，每种肽或多核苷酸或者肽和/或多核苷酸的组合可被单独或组合地施用于患者。
用于施用的剂量将取决于若干因素，包括组合物的性质、施用途径和施用方案的时间表和时间安排。本发明的分子的合适剂量可以在每次施用中多达15μg、多达20μg、多达25μg、多达30μg、多达50μg、多达100μg、多达500μg或更多的量级。合适的剂量可少于15μg，但至少1ng、或至少2ng、或至少5ng、或至少50ng、或至少100ng、或至少500ng、或至少1μg、或至少10μg。对于本发明的一些分子，使用的剂量可更高，例如，多达1mg、多达2mg、多达3mg、多达4mg、多达5mg或更高。这样的剂量可以以液态制剂提供，其浓度适于允许由所选途径施用适当体积。
试剂盒
本发明还涉及本文所述的适于用于本发明的治疗的成分的组合，其以试剂盒的形式被包装在容器中。这样的试剂盒可包括允许本发明的治疗的一系列成分。例如，试剂盒可包括本发明的一种或多种不同肽、多核苷酸和/或细胞，或本发明的一种或多种肽、多核苷酸或细胞和适于同时施用或者用于顺序或分别施用的一种或多种另外的治疗剂。试剂盒可任选地包含其它合适的试剂或说明书和类似物。
本发明由以下实施例阐释：
实施例1
可能的T细胞表位
下述Amb a 1的各区域被鉴定为可能包含一个或多个T细胞表位：
表2


在优先权申请GB 0815258.3中对区域G、I和J提供的序列如下：GEAAIKLTSSAGVLSCRP(区域G)、HGFFQVVNNNYDRGTYA(区域I)和ETRRLTTSGAYN(区域J)。已在表2中校正这些序列以使其对应于如以下提供的Amb a 1同种型1.3全长序列的相关区域。
然后进一步分析表2中所示的区域以寻找其中哪一个在如下所示的4个不同Amb a1同种型(1.1、1.2、1.3和1.4)中高度保守。对于以下序列，如下文本样式用于指明感兴趣的区域：区域A、区域B、区域C、区域D、区域E、区域F、区域G、区域H、区域I、区域J。
Amb 1.1
MGIKHCCYILYFTLALVTLLQPVRSAEDLQEILPVNETRRLTTSGAYNIIDGCWRGKADWAENRKALADCAQGFGKGTVGGKDGDIYTVTSELDDDVANPKEGTLRFGAAQNRPLWIIFERDMVIRLDKEMVVNSDKTIDGRGAKVEIINAGFTLNGVKNVIIHNINMHDVKVNPGGLIKSNDGPAAPRAGSDGDAISISGSSQIWIDHCSLSKSVDGLVDAKLGTTRLTVSNSLFTQHQFVLLFGAGDENIEDRGMLATVAFNTFTDNVDQRMPRCRHGFFQVVNNNYDKWGSYAIGGSASPTILSQGNRFCAPDERSKKNVLGRHGEAAAESMKWNWRTNKDVLENGAIFVASGVDPVLTPEQSAGMIPAEPGESALSLTSSAGVLSCQPGAPC
Amb 1.2
MGIKHCCYILYFTLALVTLLQPVRSAEDVEEFLPSANETRRSLKACEAHNIIDKCWRCKADWANNRQALADCAQGFAKGTYGGKHGDVYTVTSDKDDDVANPKEGTLRFAAAQNRPLWIIFKRNMVIHLNQELVVNSDKTIDGRGVKVNIVNAGLTLMNVKNIIIHNINIHDIKVCPGGMIKSNDGPPILRQQSDGDAINVAGSSQIWIDHCSLSKASDGLLDITLGSSHVTVSNCKFTQHQFVLLLGADDTHYQDKGMLATVAFNMFTDHVDQRMPRCRFGFFQVVNNNYDRWGTYAIGGSSAPTILSQGNRFFAPDDIIKKNVLARTGTGNAESMSWNWRTDRDLLENGAIFLPSGSDPVLTPEQKAGMIPAEPGEAVLRLTSSAGVLSCHQGAPC
Amb 1.3
MGIKQCCYILYFTLALVALLQPVRSAEGVGEILPSVNETRSLQACEALNIIDKCWRGKADWENNRQALADCAQGFAKGTYGGKWGDVYTVTSNLDDDVANPKEGTLRFAAAQNRPLWIIFKNDMVINLNQELVVNSDKTIDGRGVKVEIINGGLTLMNVKNIIIHNINIHDVKVLPGGMIKSNDGPPILRQASDGDTINVAGSSQIWIDHCSLSKSFDGLVDVTLGSTHVTISNCKFTQQSKAILLGADDTHVQDKGMLATVAFNMFTDNVDQRMPRCRFGFFQVVNNNYDRWGTYAIGGSSAPTILCQGNRFLAPDDQIKKNVLARTGTGAAESMAWNWRSDKDLLENGAIFVTSGSDPVLTPVQSAGMIPAEPGEAAIKLTSSAGVFSCHPGAPC
Amb 1.4MGIKHCCYILYFTLALVTLLQPVRSAEDLQQILPSANETRSLTTCGTYNIIDGCWRGKADWAENRKALADCAQGFAKGTIGGKDGDIYTVTSELDDDVANPKEGTLRFGAAQNRPLWIIFARDMVIRLDRELAINNDKTIDGRGAKVEIINAGFAIYNVKNIIIHNIIMHDIVVNPGGLIKSHDGPPVPRKGSDGDAIGISGGSQIWIDHCSLSKAVDGLIDAKHGSTHFTVSNCLFTQHQYLLLFWDFDERGMLCTVAFNKFTDNVDQRMPNLRHGFVQVVNNNYERWGSYALGGSAGPTILSQGNRFLASDIKKEVVGRYGESAMSESINWNWRSYMDVFENGAIFVPSGVDPVLTPEQNAGMIPAEPGEAVLRLTSSAGVLSCQPGAPC
认为以下肽是高度保守的，因此取其用于进一步试验：
表3

将明显的是，以上序列不必与感兴趣区域的天然序列相同。尤其是，本发明的肽可被改造以相比于天然序列改进溶解度和/或减少二聚体形成和/或减少IgE交联的可能性。以下表(表4)提供以上原理的具体阐释，本发明的发明人采用这些原理来产生表3的肽(SEQ ID NO:1至31)。
表4

上表中以灰色突出显示的行代表区域的天然序列。根据本发明修饰的肽在每种天然序列之下显示。黑体和加下划线的残基代表对天然序列的添加或取代。
细胞因子测定和优选组合的选择
使用SEQ ID NO 1至31的肽来分析50个个体的PBMC应答于肽刺激的细胞因子分泌概况。使用多重微珠阵列测定来测试来自细胞因子释放测定的上清液中IL-13和IFN-γ的存在。
典型的细胞因子释放测定需要每个受治疗者的40×106个PBMC。更详细地，将250μl的具有适当抗原或肽浓度的200μg/ml溶液分配到48孔板的适当孔中。将板在37℃下加湿的5％CO2培养箱中孵育最多4小时。随后向每孔添加250μl的5×106个细胞/ml的PBMC悬液，并将板送回培养箱孵育5天。刺激后，收集培养上清液的样品以根据标准实验方案通过多重微珠测定来测试。分析对干扰素γ或IL-13具有>100pg/ml的应答的受治疗者的数据，将各肽基于％应答者率排序，如表5所示。
表5


基于以上，选择本发明的优选组合以包含：
RGW01(可能以RGW01A或RGW01B代替)；和RGW03、RGW03A或RGW03B之一；和RGW04或RGW04A之一。
对于其余的肽，其次最有效力的是RGW02、RGW09、RGW06、RGW06A、RGW10或RGW10A、RGW05或RGW05A。优选的肽组合通常可包括选自该组的至少一种另外的肽。
因为溶解度是将被施用于患者的肽的关键标准，进行进一步的体外溶解度试验来评价肽在酸性环境(pH 2.97、0.1mM HCl、0.5％(w/v)、1-硫代甘油(约46mM)、230mM海藻糖)中的溶解度。例如，发现RGW03B具有3.85mg/ml的溶解度，与之相比RGW03的溶解度<0.62mg/ml。因此，本发明的发明人确定RGW03B比RGW03优选。
图1显示对RGW01、RGW03B和RGW04A的核心混合物应答的个体数目。对核心混合物中呈递的肽的阳性IFNγ或IL-13应答的组合分析显示这3种肽提供38/50豚草变应性个体(研究群体的76％)的覆盖。这表示，核心混合物的肽结合大多数MHC II类DR分子，且这些复合体被大多数变应性个体中的T细胞识别。还显示了加入RGW02、RGW05和RGW06A的增量作用。清楚地显示了加入来自第二组肽的表位的益处。
进行进一步的细胞因子测定以评价从同一组个体被肽SEQ ID NO.1至31诱导的IL-10释放。IL-10应答的分析显示，RGW07和RGW07B诱导显著量的IL-10(图2)。RGW07本身在49/50的个体诱导IL-10。因此，优选的肽组合通常可能包含选自RGW07组的至少一种另外的肽。对图1中标出的6种肽(RGW01+RGW03B+RGW04A+RGW02+RGW05+RGW06A)的混合物连同RGW07中呈递的肽的阳性IFNγ或IL-13应答的组合分析在49/50的受治疗者获得阳性IFNγ或IL-13应答。因此，这 一肽组合有效地覆盖全部研究群体，将预期完全的覆盖用于改进的RGW07溶解度变体(参见以下)。包含RGW01+RGW03B+RGW04A+RGW02+RGW05+RGW06A或其变体与RGW07或其变体一起的肽组合也具有提供阳性IL-10应答的优势(参见以下和图3)。
溶解度试验显示RGW07在酸性环境具有差的溶解度，所以向RGW07加入另外的赖氨酸残基(在表6中标出)。检验修饰的肽的溶解度和在图1标出的肽混合物(RGW01+RGW03B+RGW04A+RGW02+RGW05+RGW06A)存在下从PBMC诱导IL-10的能力。对照包括无RGW07变体的肽混合物和具有完整Amb a 1变应原。结果显示在图3。
表6-RGW07和变体的溶解度

基于这些分析，发现RGW07D在溶解度和在其它六种肽存在下诱导IL-10的能力两方面是优选的。
实施例2-组胺释放测定
这一测定的目的是鉴定能够活化血液嗜碱性细胞(作为组织肥大细胞替代品)、造成可能导致治疗期间变应性反应的组胺释放的单独肽。频繁地诱导组胺释放的肽或肽组合可能认为不适于包含在肽疫苗中。
组胺释放要求在嗜碱性细胞表面上交联相邻的特异性IgE分子。被评价的肽是小的(长度为11至18氨基酸)，因此不应具备使得其能够保持完整分子的IgE-结合表位的构象的显著三级结构。而且，溶液中的肽单体，即使被IgE结合，应该不能交联相邻的IgE分子。
评价了从来自豚草变应性受治疗者的新鲜外周全血的组胺释放。外周血嗜碱性细胞用作组织肥大细胞的替代品，组织肥大细胞对于测定不实用。将血液与实施例1中鉴定的单独肽(RGW01、RGW02、RGW03B、RGW04A、RGW05、RGW06A、RGW07和RGW07D)体外孵育。另外，分析了对实施例1中鉴定的7种肽的优选混合物的应答。检验的7种肽的优选混合物由以下组成：i)RGW01、RGW02、RGW03B、RGW04A、RGW05、RGW06A、RGW07和ii)RGW01、RGW02、RGW03B、RGW04A、RGW05、RGW06A和RGW07D。
在每个受治疗者中测量应答于完整豚草变应原提取物的组胺释放以证实嗜碱性细胞敏化。代表总组胺释放的阳性对照通过冷冻/融化细胞两次而产生，所述阳性对照包括在每个测定中。自发组胺释放的阴性对照通过在仅缓冲液中孵育细胞而产生。
按照制造商的说明书利用Immunotech组胺释放免疫测定试剂盒进行测定。以微量滴定板孔中的肽、肽混合物、完整变应原或缓冲液体外攻击血液嗜碱性细胞后，除去上清液，将样品中的组胺转变为乙酰组胺。由竞争性乙酰组胺ELISA检验乙酰化的样品。
测定肽在5log10范围(1至10,000ng/ml)诱导组胺释放的能力。基于可在治疗期间达到的肽的理论体内剂量，选择测定的浓度范围。例如，31μg剂量(大约3nmol/肽等效物)的每种肽进入5升的血液体积，将导致6ng/ml的血浓度，处于组胺释放测定剂量范围的低端。在略高的浓度范围(10至100,000ng/ml)使用完整豚草变应原提取物。
对每个稀释度进行单次测量。完成ELISA后，通过从ELISA测定中产生的标准曲线的内插法而确定单独组胺水平。调整来自样品的结果以允许稀释。当肽/变应原制品的两个或更多连续稀释引出在冻融的阳性对照中观察到的>15％的总组胺释放(>15％阳性对照)时，或当在检验的最高浓度(对于肽，10μg/mL)达到>15％阳性对照的单个值时，认为是“阳性组胺释放”。
研究中完成共49个组胺释放测定。因为在培养基加缓冲液阴性对照孔中不可接受地高水平(>15％阳性对照)的自发释放，其中6个测定被 排除。因此该分析中包括共43个受治疗者。对这些受治疗者中的20个检验RGW07D肽和包含其的混合物。研究发现概述于表7。
表7

*肽1-6与RGW07D组合在两个受治疗者仅10μg/ml时>15％。
对测定中检验的最高剂量肽(10μg/ml)显示结果。豚草变应原对照在43个受治疗者的65％诱导显著组胺释放。即使在10ng/ml的最低浓度，完整变应原提取物在22/43(51％)的个体诱导显著组胺释放，43个受治疗者的平均释放为阳性对照的30％。粗制完整豚草提取物包含大约0.5％的主要变应原Amb a1，加强了用于评价肽安全性的体外嗜碱性细胞测定的强烈灵敏性，所述用于评价的肽以10ug/ml存在，比10ng/ml的粗制提取物中的Amb a1过量>10,000倍。
数据显示，与完整变应原相比，八种单独肽不引发从豚草变应性个体的嗜碱性细胞的显著组胺释放。肽RGW01、RGW02、RGW03B、RGW04A、 RGW05、RGW06A、RGW07的组合也未能在43个受治疗者引发显著组胺释放。
肽RGW01、RGW02、RGW03B、RGW04A、RGW05、RGW06A和RGW07D的组合在2个个体中获得弱的阳性应答，其值是在最高肽浓度10μg/mL阳性对照的16％和20％。在检验的四个较低浓度的％释放值是<15％，即，阴性。考虑到与在临床给药后可能的血液肽浓度相比，这一测定中检验的大大过量的肽剂量—检验的最高浓度代表高于预期血液浓度>1000倍过量—预期这一肽组合通过IgE-介导的或直接肽-介导的嗜碱性细胞或肥大细胞的活化和脱粒不导致显著的组胺释放。
实施例3：肽组合的临床试验
在随机的、安慰剂对照的、盲的临床试验中检验由肽RGW01、RGW02、RGW03B、RGW04A、RGW05、RGW06A和RGW07D组成的7种肽的优选混合物。评价这一混合物在减少变应性症状中的效力。临床试验的研究设计是按照良好临床实践指南(good clinical practice guidelines)。
筛选豚草变应性受治疗者以鉴定用豚草变应原攻击后的晚期皮肤应答(LPSR)和结膜刺激检验(CPT)得分。LPSR和CPT测定的详情在以下提供。进行滴定以鉴定完整变应原产生适当LPSR和CPT得分的最低有效浓度。获取血液样品以评价豚草特异性IgE水平。
对所有受治疗者，对豚草变应原的基线皮肤和结膜应答利用基线攻击建立，所述基线攻击在研究药物施用前1至4周进行。真皮内注射筛选中鉴定的最低有效浓度的豚草变应原施用于所选前臂的手掌表面。评价受治疗者以确保其经历对完整豚草变应原的早期皮肤应答(EPSR)、CPT和晚期皮肤应答(LPSR)，基线反应的量值如下记录：
注射后15分钟(±3分钟)，用圆珠笔在皮肤上画出任何EPSR的轮廓。测量和记录对每次应答的最长正交直径，并计算每个臂中的应答面积。
注射后最少30分钟，将筛选中鉴定的最低有效浓度的豚草变应原滴 注到所选的眼中。然后在5分钟(±2分钟)后对受治疗者评定的痒和观察者评定的发红和流泪评分。评分系统显示于以下表8。
每次注射八小时(±10分钟)后，用圆珠笔在皮肤上画出任何晚期应答的轮廓。测量和记录对每次应答的最长正交直径，并计算每个臂中的应答面积。
产生适当基线反应的受治疗者被分配到给药组，随机化并进入治疗期。
表8

对于每个受治疗者，治疗期由6周的阶段构成。在这一阶段期间，一组受治疗者第一天在第1次治疗期拜访接受优选混合物(每剂量0.03、0.3、3、1、12nmol的每种肽)或稀释剂安慰剂的单次真皮内注射。真皮内注射在所选前臂的屈肌表面进行。然后在每间隔两周(14±2天)的第2、3和4次治疗期拜访进行重复施用。10个受治疗者的群组接受每个剂量水平的治疗(8个接受优选混合物，2个接受安慰剂)。第一群组接受混合物中0.03nmol的每种肽，组中的随后每个群组接受下一高剂量水平。
开始治疗19至28周后，在治疗后攻击(PTC)中重新检验受治疗者 对完整变应原的皮肤和结膜应答。对豚草变应原的皮肤应答通过如上所述地测量EPSR和LPSR来评价。应答的平均面积如上所述地计算。对豚草变应原的结膜应答通过如上所述地测量CPT来评价。获取血液样品以测量豚草特异性IgE。
对于每个受治疗者，将治疗后的平均EPSR面积与基线EPSR面积比较。然后评价每个群组中所有十个患者EPSR面积的总变化。对于每个受治疗者，将治疗后的平均LPSR面积与基线LPSR面积比较。然后评价每个群组中所有十个患者LPSR面积的总变化。对于每个受治疗者，将治疗后的CPT得分与基线CPT得分比较。然后评价每个群组中所有十个患者CPT得分的总变化。
本发明的进一步实施方案
I.一种用于通过免疫耐受作用预防或治疗对豚草的变态反应的组合物，该组合物包括至少三种多肽，其中所述多肽独立地选自以下任一种：
(i)SEQ ID NO.1至31的任一个的多肽；或
(ii)根据(i)的多肽的变体，其中所述变体是长度为9至30个氨基酸的多肽，所述多肽包含由以下所组成的区域：
-(i)的任何序列；或
-与(i)的任何序列具有至少65％同源性的序列，所述序列能够使得个体免疫耐受(i)的任何序列，或
(iii)根据(i)的多肽的变体，其中所述变体是长度为9至30个氨基酸的多肽，所述多肽包含由表示以下任一个的序列所组成的区域：
-(i)的任何序列的片段；或
-(i)的任何序列的片段的同系物，
所述序列能够使得个体免疫耐受(i)的任何序列并具有至少9个氨基酸的长度，而且其中所述同系物与(i)的任何序列中任何9个连续氨基酸具有至少65％的同源性。
II.根据条目I所述的组合物，其中所述组合物：
a)能够使得群体中一组豚草变应性个体的至少50％或至少60％免疫耐受；和/或
b)包括至少三种选自条目I(i)的多肽或条目I(ii)或I(iii)中定义的其变体，和/或
c)包括至少一种另外的多肽，最多总共十三种独特的/不同的多肽，其中所述另外的多肽：
-包含与以上SEQ ID NO：1至31中任一个的至少9个或更多个连续氨基酸具有至少65％的序列同一性、在(a)中未被选择的序列；且
-长度是9至30个氨基酸；和/或
d)包括最多达十三种多肽。
III.根据条目I或II所述的组合物，所述组合物包括至少一种根据条目II(c)的多肽，所述多肽长度是9至20或13至17个氨基酸，和/或其中所述多肽与SEQ ID NO：1至31中任一个的至少9个或更多个连续氨基酸具有至少70％的序列同一性。
IV.根据前述条目任一项所述的组合物，所述组合物包括选自RGW01、RGW01A或RGW01B(SEQ ID NO:1、2或3)的多肽的至少一种多肽，或条目I(ii)或(iii)定义的其变体。
V.根据条目IV所述的组合物，其中所述至少一种多肽是多肽RGW01或其变体。
VI.根据条目IV或V所述的组合物，所述组合物包括选自RGW03B、RGW03A或RGW03(SEQ ID NO:9、8或7)的多肽的至少一种多肽，或条目I(ii)或(iii)定义的其变体。
VII.根据条目VI所述的组合物，其中所述至少一种多肽是多肽RGW03B或其变体。
VIII.根据条目IV至VII任一项所述的组合物，所述组合物包括选自RGW04或RGW04A(SEQ ID NO:10或11)的多肽的至少一种多肽，或 条目I(ii)或(iii)定义的其变体。
IX.根据条目IV至VIII任一项所述的组合物，所述组合物包括选自RGW02、RGW09、RGW06、RGW06A、RGW10或RGW10A、RGW05或RGW05A(SEQ ID NO:4、26、14、15、27、12或13)的多肽的至少一种多肽，或条目I(ii)或(iii)定义的其变体。
X.根据条目IV至IX任一项所述的组合物，所述组合物包括选自RGW07、RGW07C或RGW07D(SEQ ID NO:16、19或20)的多肽的至少一种多肽，或条目I(ii)或(iii)定义的其变体。
XI.根据条目X所述的组合物，其中所述至少一种多肽是RGW07D(SEQ ID NO:20)。
XII.根据前述条目任一项所述的组合物，由以下组成：
a)RGW01、RGW01A或RGW01B(SEQ ID NO:1、2或3)的多肽的至少一种，或条目I(ii)或(iii)定义的其变体；和
b)RGW03B、RGW03A或RGW03(SEQ ID NO:9、8或7)的多肽的至少一种，或条目I(ii)或(iii)定义的其变体；和
c)RGW04或RGW04A(SEQ ID NO:10或11)的多肽的至少一种，或条目I(ii)或(iii)定义的其变体；和任选地
d)RGW02、RGW09、RGW06、RGW06A、RGW10或RGW10A、RGW05或RGW05A(SEQ ID NO:4、26、14、15、27、12或13)的多肽的至少一种，或条目I(ii)或(iii)定义的其变体；和任选地
e)RGW07、RGW07C或RGW07D(SEQ ID NO:16、19或20)的多肽的至少一种，或条目I(ii)或(iii)定义的其变体。
XIII.根据前述条目任一项所述的组合物，其中所述多肽中的一种或多种具有选自以下的一种或多种修饰：
(i)N末端乙酰化；
(ii)C末端酰胺化；
(iii)精氨酸和/或赖氨酸侧链胺上的一个或多个氢被亚甲基代替；
(iv)糖基化；和
(v)磷酸化。
XIV.根据前述条目任一项所述的组合物，其中所述肽的至少一种已被改造为可溶以使其包含：
i)在T细胞表位侧翼的所述肽的残基的N末端：一个至六个连续氨基酸，它们与衍生所述肽的蛋白序列中所述残基的N末端紧接的两个至六个连续氨基酸相对应；和/或
ii)在T细胞表位侧翼的所述肽的残基的C末端：一个至六个连续氨基酸，它们与衍生所述肽的蛋白序列中所述残基的C末端紧接的一个至六个连续氨基酸相对应；或
iii)在T细胞表位侧翼的所述肽的残基的N末端和/或C末端，选自精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的至少一个氨基酸，
其中所述多肽具有至少3.5mg/ml的溶解度，而且所述T细胞表位具有少于3.5mg/ml的溶解度。
XV.根据前述条目任一项所述的组合物，其中所述肽的至少一种已被改造为可溶以使另外地：
i)所述肽的天然序列中的任何半胱氨酸残基被丝氨酸或2-氨基丁酸代替；和/或
ii)缺失了在所述肽的天然序列的N末端和/或C末端的最多三个氨基酸中、不包含在T细胞表位中的任何疏水残基；和/或
iii)缺失了在所述肽的天然序列的N末端和/或C末端的最多四个氨基酸中包含序列Asp-Gly的、不包含在T细胞表位中的任何两个连续氨基酸。
XVI.根据前述条目任一项所述的组合物，其中每种多肽具有在0.03nmol/ml至200nmol/ml、0.3nmol/ml至200nmol/ml或30nmol/ml至120nmol/ml的范围内的浓度。
XVII.一种用于通过免疫耐受作用预防或治疗对豚草的变态反应的 组合物，所述组合物包括至少三种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列在被表达时导致条目I至XVI任一项定义的组合物的产生。
XVIII.根据条目XVII所述的组合物，其中能够表达不同多肽的每种多核苷酸序列存在于相同或不同的多核苷酸载体中。
XIX.一种用于通过免疫耐受作用预防或治疗对豚草的变态反应的载体，所述载体包括各自编码条目I定义的不同多肽的至少三种多核苷酸序列和任选地编码条目II定义的不同多肽的一种或多种另外的多核苷酸序列。
XX.一种用于通过免疫耐受作用预防或治疗对豚草的变态反应的载体，所述载体包括各自编码条目I或II定义的不同多肽的三种到十三种不同的多核苷酸序列，其中至少一种多核苷酸编码选自以下多肽组的每一组的多肽：
a)RGW01、RGW01A或RGW01B(SEQ ID NO:1、2或3)；
b)RGW03B、RGW03A或RGW03(SEQ ID NO:9、8或7)；和
c)RGW04或RGW04A(SEQ ID NO:10或11)。
XXI.一种包括三种到十三种多肽的产物，其中至少一种多肽选自以下多肽组的每一组：
a)RGW01、RGW01A或RGW01B(SEQ ID NO:1、2或3)或条目I(ii)或(iii)定义的其变体；和
b)RGW03B、RGW03A或RGW03(SEQ ID NO:9、8或7)或条目I(ii)或(iii)定义的其变体；和
c)RGW04或RGW04A(SEQ ID NO:10或11)或条目I(ii)或(iii)定义的其变体；
其中每种不同多肽是为了同时、分别或顺序地用于通过免疫耐受作用预防或治疗对豚草的变态反应。
XXII.一种包括各自编码条目I或II定义的不同多肽的三种到十三种多核苷酸序列的产物，其中至少一种所述多核苷酸编码选自以下多肽组的 每一组的多肽：
a)RGW01、RGW01A或RGW01B(SEQ ID NO:1、2或3)；
b)RGW03B、RGW03A或RGW03(SEQ ID NO:9、8或7)；和
c)RGW04或RGW04A(SEQ ID NO:10或11)；
而且其中每种不同多肽是为了同时、分别或顺序地用于预防或治疗人类对豚草的变态反应。
XXIII.一种用于通过免疫耐受作用预防或治疗对豚草的变态反应的药物制剂，所述药物制剂包括根据条目I至XVIII任一项的组合物；根据条目XIX或XX任一项的载体；或根据条目XXI或XXII任一项的产物；和药学上可接受的运载体或稀释剂。
XXIV.根据条目XXIII的组合物、载体或产物，所述组合物、载体或产物被配制为用于口服施用、鼻内施用、表皮施用、皮下施用、舌下施用、皮内施用、口腔施用或用于通过吸入或通过注射施用。
XXV.如条目I至XVIII任一项定义的组合物或如条目XXI或XXII定义的产物，所述组合物或产物另外地包括另外的多肽变应原，用于使得个体免疫耐受所述另外的多肽变应原。
XXVI.一种确定T细胞是否识别条目I定义的多肽的体外方法，所述方法包括将所述T细胞与所述多肽接触并检测所述T细胞是否被所述多肽刺激。
XXVII.一种确定个体是否患有疾患或处于疾患风险中的体外方法，其中所述疾患以应答于豚草变应原的变应性症状为特征，所述方法包括测试个体是否具有对条目I至XVIII任一项定义的组合物应答的T细胞，从而确定所述个体是否患有疾患或处于疾患风险中。
XXVIII.根据条目XXVII所述的方法，其中针对所述组合物的T细胞免疫应答通过如下来测量：在允许所述组合物与所述T细胞相互作用的条件下将所述组合物与从受治疗者获取的样品中的T细胞接触；并确定是否有任何T细胞被刺激了，从而确定是否存在或不存在T细胞免疫应答。