中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂 EsCystatin 基因编码 蛋白及应用 技术领域 ：
本发明属于分子生物学和生物化学技术领域， 涉及中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑 制剂 (EsCystatin) 基因的体外重组表达技术及其活性鉴定。本发明利用体外重组表达技 术获得了中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂 EsCystatin 蛋白， 该重组蛋白对木瓜蛋白酶 具有一定抑制作用， 以及在开发抗菌类药物和饲料添加剂等方面具有潜在应用价值。 背景技术 ：
半胱氨酸蛋白酶抑制剂是广泛存在于动植物组织和体液中的蛋白酶抑制剂， 它能 与木瓜蛋白酶、 组织蛋白酶等半胱氨酸蛋白酶形成紧密的复合物， 抑制他们的活性， 从而保 护蛋白质的二硫键不被半氨酸蛋白酶破坏， 阻止蛋白的降解。半胱氨酸蛋白抑制剂是抑制 半胱氨酸蛋白酶的一类超家族， 根据它们的结构特征可分为三个家族。第一类半胱氨酸蛋 白酶抑制剂家族是一类低分子量蛋白， 无二硫键 ； 第二类半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族， 也 是只有一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域， 至少有两个分子内二硫键， 第三类半胱氨酸蛋 白酶抑制剂家族是含有多个半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域， 每个结构域中的二硫键的位置 类似于第二类家族。在脊椎动物中， 半胱氨酸蛋白酶抑制剂是抑制半胱氨酸蛋白水解酶的 一类蛋白家族， 主要是组织蛋白酶家族的强抑制剂。它们可保护和调控内源蛋白水解酶活 性。在人类抵抗心血管疾病， 脑梗死高血压病、 糖尿病、 原发性肾病、 恶性肿瘤时， 出现难以 控制蛋白质水解和组织损伤， 半胱氨酸蛋白酶抑制剂起到调控和保护的功能。近年来， 无 脊椎动物的半胱氨酸蛋白酶抑制剂也有零星报道， 比如在肝吸虫 (Fasciola hepatica)， 线虫 (Acanthocheilonema viteae)， 马来丝虫 (Brugia malayi)， 盘尾丝虫 (Onchocerca volvulus)， 巴西日圆线虫 (Nippostrongylus brasiliensis)， 捻转血矛线虫 (Haemonchus contortus) 和马蹄蟹 (Trachypleus tridentatus) 中的半胱氨酸蛋白酶可参与机体的免 疫防御。但是在甲壳动物中还没有半胱氨酸蛋白酶抑制剂的研究报道。
中华绒鳌蟹 (Eriocheir sinensis) 属于甲壳动物， 是我国重要的水产养殖品种之 一。然而， 随着养殖规模和养殖条件的恶化， 病害发生日益频繁， 尤其是病毒、 细菌、 真菌等 微生物引起的传染性疾病， 每年均造成巨大的经济损失， 严重阻碍了甲壳动物养殖业的发 展。因此， 开展中华绒螯蟹免疫机制研究， 为蟹病的防治寻找更科学有效的途径， 以期通过 蟹自身免疫抵抗力的提高来防止和减少蟹病的发生， 具有十分重要的理论与实践意义。因 此从中华绒螯蟹中克隆半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因， 并对其体外原核重组表达蛋白的抑制 活性进行深入研究， 将有助于开发天然的水产药物用于人类疾病的治疗。 发明内容 ：
本发明的目的是从中华绒螯蟹中克隆到半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因， 为进一步研 究中华绒螯蟹防御机制提供基础， 并为中华绒螯蟹的病害防治， 开发医药产品和饲料添加 剂奠定应用基础。为实现上述目的， 本发明采用的技术方案是 ：
一种中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因 EsCystatin， 具有序列 SEQIDNo.1 中 碱基序列。其是从中华绒螯蟹中克隆到半胱氨酸蛋白酶抑制剂 EsCystatin 的 cDNA 序列， 该序列全长为 1486bp， 包括开放阅读框 363bp， 编码 120 个氨基酸， 5’ 非编码区长为 92bp， 3’ 非编码区长为 1031bp， 有一个多聚腺苷酸加尾信号 (AATAAA)， 和多聚腺苷酸尾巴。利用 pEASY-E1 表达载体在大肠杆菌中 Rosetta-gami 表达菌株中重组表达了该蛋白， 表达产物 -1 对木瓜蛋白酶具有明显的抑制活性。木瓜蛋白酶浓度为 1μg mL 。当重组蛋白浓度达到 300μgmL-1 时， 接近 89％的木瓜蛋白酶活性被抑制， 当重组蛋白浓度达到 350μg mL-1 时， 木 瓜蛋白酶活性 100％被抑制。
其编码蛋白具有 SEQIDNo.2 所示的氨基酸序列， 分子量为 13.39kDa， 等电点为 5.48， 具有一个半胱氨酸蛋白酶样结构域， 没有半胱氨酸残基， 没有二硫键。
本发明利用表达序列标签技术和 cDNA 末端快速扩增技术从中华绒螯蟹中克隆到 半胱蛋白酶抑制剂的 cDNA 的全长序列， 通过 PCR 技术， 扩增该基因的全部编码区片段克隆 到 pEASY-E1 表达载体中， 在大肠杆菌 Rosetta-gami 中实现原核体外重组表达。重组产物 经镍琼脂糖凝胶纯化， 透析复性后， 对木瓜蛋白酶具有明显的抑制活性。 当重组蛋白浓度达 -1 到 300μg mL 时， 接近 89％的木瓜蛋白酶活性被抑制， 当重组蛋白浓度达到 350μg mL-1 时， 木瓜蛋白酶活性完全被抑制。 本发明为中华绒螯蟹防御机制提供理论基础， 并为中华绒 螯蟹的病害防治， 开发医药产品和饲料添加剂奠定应用基础。 附图说明
图示为本发明中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂对木瓜蛋白酶的抑制作用图。具体实施方式 ：
下面的实验例中将对本发明作进一步的阐述， 但本发明不限于此。
实验例 1 ：
中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的 cDNA 克隆
用 T3 引物对中华绒螯蟹血细胞 cDNA 文库测序获得了 7535 条高质量的 EST 序列， 这些序列被拼接成 911 条 contigs 和 2032 条 singletons， 通称为 Unigenes。其中一条拼 接序列推导出的氨基酸序列与高等动物人， 鼠中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂蛋白具有较高的 同源性， 经 SMART 软件进行预测， 该序列具有一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂样结构域， 序列的 3’ 端有一个加尾信号 (AATAAA) 和多聚腺苷酸尾巴 (poly A)。根据这条拼接序列设计正向 引物 P1(5’ -AATGGCGTTCAACACTTCAC-3’ ) 和正向引物 P2(5’ -CATCACAATACTATCCTCGCTCAC3’ ) 和 adaptor dT 引物 (5’ -GGCCACGCGTCGACTAGTACT17-3’ ) 采用 3’ 末端的快速扩增技术 扩增半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的 3’ 末端， 所得序列进行拼接。然后采用引物 P3(5’ -TCGA ATTCCCTCAGCACCGGACG-3’ ) 和引物 P4(5’ -TTGAGATTTGCTAAGCTTTATTTAGT-3’ ) 扩增中华绒 螯蟹半胱蛋白酶抑制基因的 cDNA 全长， 克隆到 pMD-18T 载体， 选取阳性克隆送至生物公司 进行测序。测序结果与经 BLAST 分析显示该扩增片段为半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因。
实验例 2 ：
本发明的中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因编码区体外原核重组表达与抑制活性测定
1、 重组载体的构建
本发明中采用的重组载体为 Novagen 公司的 pEASY-E1 原核表达载体。通过 PCR 技术， 引物 P5(5’ -ATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGCGAATT-3’ ) 和 P6(5’ -G AAATAGGAGATGGGTCGGTCCAAT-3’ ) 扩增中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因编码区片段。 反应条件为 ： 首先 94℃预变性 5 分钟， 然后进入下列循环 ： 94℃变性 30 秒， 65℃退火 30 秒， 72℃延伸 30 秒， 共进行 35 个循环， 最后 72℃延伸 10 分钟。 将 PCR 产物直接连接到 pEASY-E1 原核表达载体， 连接液转化大肠杆菌 TOP10， 菌落 PCR 筛选并测序。
2、 重组蛋白的表达和纯化
用构建好的重组载体转化 Rosetta-gami 表达菌株， 并筛选阳性克隆， 测序确认表 达框的正确性。挑取单克隆， 接种于 50mL LB 液体培养基中， 37℃震荡摇床中培养 12-16 小 时， 然后以 1 ∶ 100 的比例接种 200mL LB 液体培养基中， 37℃培养至 OD600 ＝ 0.5-0.7。 加入 IPTG， 使终浓度达到 1mmol/mL， 继续培养 4h。4℃， 5000rpm， 离心 10min， 收集菌体， 于 -20℃ 冻存备用。同时做未诱导对照， 取 1ml 菌液离心， 弃去上清后， 加入 80μL 水和 20μL 5X 蛋 白上样缓冲液， 100℃沸水煮沸 10 分钟， 稍离心， 收集上清液和和沉淀， SDS-PAGE 检测表达 产物。 重组蛋白以包涵体形式存在， 以常规方法经过包涵体纯化、 复性获得重组中华绒 螯蟹半胱氨酸蛋白抑制剂蛋白。
3、 重组蛋白的抑制活性测定
在 每 支 EP 管 中 加 入 50μL 酪 蛋 白 (5.0mg mL-1)， 37 ℃ 保 温 10min 后， 加入 -1 30μL 木 瓜 蛋 白 酶 (1mg mL ) 和 200μL 适 量 纯 化 后 的 重 组 蛋 白， 再 加 缓 冲 液 (50mmol -1 -1 -1 L pH7.6Tris-HCl， 2mmol L 半胱氨酸盐酸盐， 0.1mmol L EDTA) 至终体积 300μL， 37℃保 温 20min 后， 加入 3mL 考马斯亮蓝 G250 溶液， 混匀， 室温放置 20min， 在 595nm 波长下测剩余 木瓜蛋白酶活性。每一数据测定 3 次， 取平均值。
实验结果 ：
当重组蛋白浓度达到 300μg mL-1 时， 接近 89％的木瓜蛋白酶活性被抑制， 当重组 -1 蛋白浓度达到 350μg mL 时， 木瓜蛋白酶活性 100％被抑制 ( 附图所示 )。
6101851627 A CN 101851628序列 序列表表1/2 页SEQ ID No.1 <110> 中国科学院海洋研究所 <120> 中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂 EsCystatin 基因编码蛋白及应用 <141>2010-02-01 <160>2 <210>1 <211>1486 <212>cDNA <213> 中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis) <221> 中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂 <222>(1)...(1486) <400>1 tcgaattccc tcagcaccgg acgagagagc tacatttttt cctcctctga agtgatttgt cttcgtcttc gtccacgacc ccaaggaaca agatgggtct cagggtcatc agtgtaggac tcttcattac tacagtgttg ttaggcatga aagcaaccgc tgtcgggatg cctggaggac tgtcagagga gaagccgatg actcccgagg tgcaggagct catcaacgaa gtcaggcccg atgtggagga gcacctgggt cgccccgtgt ctcgcttcga ggggttgaac tacaagaccc aggtggtgtc aggcctcaac tacttcgtca aggttgacat cggtgacaac gaggtggtgc acatcagggt gtaccatacc ttcgacggca ccaacaccct gaatggcgtt caacacttca ccgacaaatt ggaccgaccc atctcctatt tctgaggcac ccatccaccc atgatatagt aactaagaaa gcagagtccc ctcggtggtt aactatacta tatgcaccca cccaccgcca tcacaatact atcctcgctc actcgcatac atacctttcg tttttaaaag attgattata gtctatcgac tctataactt gagcactgtg gcttggcccg gggaaccccc cattgtttac acaactagcg atgacctgcg catggcgatc tgtctcactg ttagtctacg ttatctattt atgcagtata tatataaatt cataatacaa ttacatggtg ttatgaatgg cttgggattt gagggaaaga gaacgactcg ggaaaccctc catttcactt gtcaacgtgg ctcatgcgac cttgccgcct gaaggacctt ggcaacaggc gccaagccgc actgttaatt cacccttcct ccaccatggg aaactcacgt cctgcacagc caagcaaaag agatcatata taacactaat aagagagaga gagagaggta gcgagcccct ctgatctcga gtagagtgat ggagccatgt ggcgcagaag ctcggtctcc ctgagcaacg cctaaaggct gaagttagag tcgatggagt ataattatat cgttcatgat tttactgtta caaaagatat atagacccac aaggaaatat tgattagttt attcatgatt ttagtgttgc aagagagata tgcccacaac tatgtaagga gaattgaagt gcttaaatgt atggttgatt cctattttaa atgttgcaag gagatattaa agcaaattat agagaaagga tcgtggtgct tgatttgtca tttcagacgt taaacataaa acaaaggttt agagtgaaaa tgtttataag cagaatttaa ctttcaagta aactcgatta ctcattcaac tatatatata gtattataca taatctctgg tggagggtat ttttacatga760 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440101851627 A CN 101851628序列表2/2 页ttactaaata aagcttagca aatctcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa SEQ ID No.2 <110> 中国科学院海洋研究所 <120> 中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂 EsCystatin 基因编码蛋白及应用 <140> <141>2010-02-01 <160>1 <170>PatentIn version 3.5 <210>2 <211>120 <212>PRT <213> 中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis) <222>(1)...(120) <400>2 Met Gly Leu Arg Val Ile Ser 5 Leu Leu Gly Met Lys Aal Thr 20 Ser Glu Glu Lys Pro Met Thr 35 Glu Val Arg Pro Asp Val Glu 50 Arg Phe Glu Gly Leu Asn Tyr 65 Asn Tyr Phe Val Lys Val Asp 80 Ile Arg Val Tyr His Thr Phe 95 Val Gln His Phe Thr Asp Lys 110 Val Gly Leu Phe Ile Thr Thr Val 10 15 Ala Val Gly 25 Pro Glu Val 40 Glu His Leu 55 Lys Thr Gln 70 Ile Gly Asp 85 Asp Gly Thr 100 Leu Asp Arg 115 Met Pro Gly Gly Leu 30 Gln Glu Leu Ile Asn 45 Gly Arg Pro Val Ser 60 Val Val Ser Gly Leu 75 Asn Glu Val Val His 90 Asn Thr Leu Asn Gly 105 Pro Ile Ser Tyr Phe 1201486