西花蓟马特异性COI引物、检测方法及试剂盒.pdf

本发明涉及分子生物学领域，具体地，本发明涉及西花蓟马特异性COI引物、检测方法及试剂盒。根据本发明的西花蓟马特异性COI引物的核苷酸序列如SEQ IDNo：1和2所示。本发明根据西花蓟马特有的线粒体DNA序列，设计一对特异性引物，该引物只对西花蓟马具有扩增能力。是对西花蓟马RFLP技术和mtDNA COI技术检测方法的补充和改进。

权利要求书
1.  西花蓟马特异性COI引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ IDNo：1所示。

2.  西花蓟马特异性COI引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ IDNo：2所示。

3.  西花蓟马特异性基因片段，其特征在于，所述基因片段的核苷酸序列如SEQID No：3所示。

4.  一种西花蓟马特异性检测方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1和2所述的COI引物进行PCR扩增的步骤。

5.  一种西花蓟马特异性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1和2所述的COI引物。

说明书西花蓟马特异性COI引物、检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地，本发明涉及西花蓟马特异性COI引物、检测方法及试剂盒。
背景技术
西花蓟马Frankliniella occidentalis(Pergande)属缨翅目，锯尾亚目，蓟马科，花蓟马属，是一种世界性检疫害虫，欧洲和地中海植物保护组织(EPPO)将其列为A2检疫性有害生物，对加勒比海区域植物保护委员会(CPPC)以及国际植物保护与动物卫生组织(OIRSA)亦具有检疫重要性。西花蓟马为多食性害虫，寄主范围非常广泛，目前已知的寄主植物有62科500多种，并且随着研究的深入，新的寄主植物种类不断发现。西花蓟马的寄主植物包括各种重要的经济作物、蔬菜、花卉以及杂草，不仅可为害保护地蔬菜花卉，对大田作物、果树、蔬菜以及棉花、烟草等亦可造成严重损失。据报道，1998年西花蓟马在荷兰造成的损失达3000万美元，1999年在英国仅对观赏植物所造成的损失即有1800万美元。除以成虫产卵和成/幼虫锉吸直接造成为害以外，西花蓟马还可以以持久性的方式传播多种植物病毒，其中最为重要的是番茄斑萎病毒属病毒(Tospoviruses)——番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，TSWV)和凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot virus，INSV)。而且其传播病毒所造成的损失远远大于直接取食，如1989年番茄斑萎病毒在夏威夷曾导致苜蓿减产50～90％；1999年美国乔治亚州因为此病毒的为害使烟草减产30％以上，损失达28亿美元。
西花蓟马原产于北美洲，1955年首先在美国夏威夷考艾岛发现，曾是美国加利福尼亚洲最常见的一种蓟马。20世纪70年代以前西花蓟马只分布于北美洲西部，自80年代初期以来迅速扩散至各大洲，目前已在69个国家和地区有报道，成为世界性的重要害虫之一。我国农业部于1996年将西花蓟马列为进境地植物检疫潜在性害虫。之后，2000年在昆明国际花卉节上参展的缅甸盆景上曾发现西花蓟马，同年5月台湾在来自马来西亚的切花上截获西花蓟马，但此后再未发现其踪迹。然而，2003年在北京市郊某大棚的辣椒上发现了西花蓟马；随后对北京地区西花蓟马的发生为害情况进行了调查，发现其发生地已由2003年的2个点扩大为2005年的6个区，为害的植物也从最初的辣椒到2005年的28科65种，受害严重的植物被锉食的叶片面积超过50％，呈扩散蔓延趋势。同时，云南省蒙自地区的调查表明，已约有90％的辣椒受西花蓟马的为害；之后，2007年在山东青岛也发现西花蓟马的发生。西花蓟马是传入我国的一种外来入侵生物，鉴于其目前仅在我国局部地区发现，而且已经在国外一些地区造成了严重为害，在我国具有进一步扩散和蔓延的趋势。并且事实上，西花蓟马近些年在世界各地迅速蔓延，成为制约蔬菜花卉产业发展的主要因素。而种苗、花卉及其它农产品尤其切花的运输等人为因素是西花蓟马远距离传播扩散的主要方式，因此需加强对西花蓟马的检疫和监测，杜绝人为传播。
西花蓟马体型微小，成虫体长不足1.5mm，卵长0.2mm；而且，成虫常将卵产在寄主植物组织中，预蛹和蛹期则在土壤中度过。而加强检疫和监测必需建立一套快速而准确的分子检测方法。目前国际上用于西花蓟马鉴定的方法主要有：1)形态特征鉴定；2)PCR技术等，但目前国内针对西花蓟马尚没有标准的检测方法。
RFLP技术和mtDNA COI技术曾用于鉴别西花蓟马及其近缘种。RFLP技术是根据不同品种(个体)基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种(个体)的DNA水平的差异(即多态性)，多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。检测是以基因组DNA为模板，以单个人工合成的随机多态核苷酸序列为引物，在DNA聚合酶的催化下，进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离、溴化乙锭染色后，在紫外透视仪上根据多态性来判断检测结果。然而，RFLP分析技术对样品的纯度要求较高，且样品用量大，多态性水平过分依赖于限制性内切酶的种类和数量；此外，RFLP技术步骤较为繁琐、工作量大、成本较高，因此其应用受到了一定的限制。mtDNA COI技术检测是利用通用型的引物，在DNA聚合酶的催化下，对目标DNA进行体外扩增，然后将PCR产物回收、纯化、测序，根据序列比对和系统发育树构建来判断检测结果。但是，由于需要对扩增产物进行测序，成本较高且费时，因此难以满足高通量快速检测的需求。Species-Specific-COI PCR技术检测是在mtDNA COI技术的基础上发展起来的特异序列扩增区域标记，是利用特异性的引物，根据预期DNA条带的有无来判断检测结果，无需测序和序列比对，具有灵敏度高、特异性强、快速、简便且重现性和稳定性强等优点。
发明内容
本发明的目的之一是提供西花蓟马特异性COI引物。
本发明的再一目的是提供西花蓟马特异性基因片段。
本发明的再一目的是提供西花蓟马特异性检测方法。
本发明的再一目的是提供西花蓟马特异性检测试剂盒。
本发明根据西花蓟马的线粒体DNA序列，设计一对种特异性引物，该引物只对西花蓟马具有扩增能力，是对西花蓟马RFLP技术和mtDNA COI技术检测方法的补充和改进，其中，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示：
引物FOZLCE：5′-TTGACTTCTTCCACCCTCT-3′。
根据本发明的另一西花蓟马特异性COI引物，其中，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示：
引物FOZLCF：5′-TGTATTTAAGTTTCGGTCTG-3′。
使用本发明的西花蓟马特异性COI引物，可以特异性扩增得到340bp的基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID No：3所示：
ttgacttctt ccaccctctt taacattgtt aattataggt ttatcaaaag atggtgcagg aacaggatga    70
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根据本发明的西花蓟马种特异性检测方法包括使用上述Species-Specific-COI引物进行PCR扩增的步骤。
根据本发明的西花蓟马特异性检测试剂盒，包括上述西花蓟马特异性COI引物。
本发明根据西花蓟马的线粒体DNA序列，设计一对种特异性引物，该引物只对西花蓟马具有扩增能力，是对西花蓟马RFLP技术和mtDNA COI技术检测方法的补充和改进。同时，本方法采用种特异性COI PCR技术，提高了检测的准确性和灵敏度，节约了检测时间，在西花蓟马检测/监测方面具有很高的应用价值，可以试剂盒的形式在我国口岸、花博会园区、国际鲜花港以及蔬菜、观赏植物和果树种苗/植株调运中推广。
本发明的西花蓟马种特异性Species-Specific-COI引物及快速PCR检测方法，用于快速检测西花蓟马。与国际现有方法相比，本发明具有以下的技术优势：
1)检测准确性高，本方法根据西花蓟马种特异性Species-Specific-COI标记设计的引物FOZLCE和FOZLCF，在PCR快速检测西花蓟马时，可扩增出340bp的片段，不仅对西花蓟马的单头成虫、预蛹、蛹和2龄幼虫可以进行检测，对于单粒卵、单头初孵幼虫以及来自不同国家和我国不同发生区的西花蓟马也能准确检测。
2)操作简便快捷，本发明采用PCR技术，操作过程简单、快速、高效，一般整个过程可在5个小时内完成。
3)特异性强，本发明设计的引物可特异性检测西花蓟马，在其近缘种、属蓟马中无扩增产物。
因此本方法实用性强，可满足植物检疫及害虫监测/检测的需要。
附图说明
图1为引物FOZLCE/FOZLCF对西花蓟马及其近缘种、属蓟马的Species-Specific-COI PCR扩增结果，
M：分子量标准DGL2000；泳道1，16，17，32：西花蓟马Frankliniella occidentalis，1和16为实验室种群，17和32为采自北京市海淀区的田间种群；2：花蓟马F.intonsa(Trybom)；3：禾花蓟马F.tenuicornis(Uzel)；4：八节黄蓟马Thrips flavidulus(Bagnall)；5：黄胸蓟马T.hawaiiensis(Morgan)；6：烟蓟马T.tabaci L.；7：葱韭蓟马T.alliorum(Priesner)；8：黄蓟马T.flavus Schrank；9：杜鹃蓟马T.andrewsi(Bagnall)；10：普通蓟马T.vulgatissimus Haliday；11：普通大蓟马Megalurothrips usitatus(Bagnal)；12：丝大蓟马Meg.sjostadti Trybom；13：端大蓟马Meg.distalis(Karny)；14：茶黄硬蓟马Scirtothrips dorsalis Hood；15：塔六点蓟马Scolothrips takahashii Priesner；18：带蓟马属Taeniothrips sp.；19：阳针蓟马属Heliothrips sp.；20：棍蓟马属Dendrothrips sp.；21：伪棍蓟马属Pseudodendrothrips sp.；22：苏丹呆蓟马Anaphothrips sudunensisTrybom；23：菊花蓟马Microcephalothrips abdominalis(Crawford)；24：横纹蓟马Aeolothrips fasciatus(L.)；25：Aeo.melaleucus(Haliday)黑白纹蓟马；26：基白黑蓟马Melanthrips pallidior Priesner；27：稻简管蓟马Haplothrips aculeatus(Fabricius)；28：简管蓟马属Haplothrips sp.；29：榕母管蓟马Gynaikothrips ficorum(Marchal)；30：榕端宽管蓟马Mesothrips jordani Zimmermann；31：捕虱管蓟马Aleurodothripsfasciapennis(Franklin)。
图2为引物FOZLCE/FOZLCF对西花蓟马不同虫态和性别的Species-Specific-COI PCR扩增结果，
M：分子量标准DGL2000；1：卵；2：一龄幼虫；3：二龄幼虫；4：预蛹；5：蛹；6：雌性成虫；7：雄性成虫。
图3为引物FOZLCE/FOZLCF对西花蓟马最低检出量的测定，
M：分子量标准DGL2000；1-10分别为1：1/15；2：1/30；3：1/60；4：1/120；5：1/240；6：1/480头雌性成虫。
图4为引物FOZLCE/FOZLCF对不同国家和地区西花蓟马的检测结果，
M：分子量标准DGL2000；泳道1为室内饲养种群(北京，阳性对照)；2-16为田间种群，其中，2-4：澳大利亚，5：荷兰，6-8：美国，9，10：西班牙，11：北京市昌平区(为2003年在我国最初发现的种群)，12：北京市海淀区，13：云南省呈贡县，14：云南省昆明市，15：山东省青岛市，16：山东省泰安市，17：水(阴性对照)。
具体实施方式
实施实例1：引物FOZLCE/FOZLCF对西花蓟马的扩增效果
1)蓟马模板线粒体DNA的制备
将单头蓟马置于滴有20μL提取缓冲液(50mM Tris-HCl、1mM EDTA、1％SDS、20mM NaCl，pH 8.0)的parafilm膜上，以0.2mL的PCR管底部作为匀浆器充分研磨，匀浆液以微量移液器移入1.5mL离心管；然后以200μL缓冲液分4次清洗匀浆器，移入同一离心管，混匀，加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀后于60℃水浴1h(中途混匀1次)；然后沸水浴5min，加入220μL氯仿/异戊醇(V∶V＝24∶1)抽提液，轻柔混匀数十次后，冰上放置30min；4℃、12000r/min离心15min，取上清液，加入440μL预冷的无水乙醇，轻轻混匀，待出现少量絮状沉淀后于-30℃放置30min；4℃、12000r/min离心15min，小心弃去上清液。加入500μL预冷的75％乙醇洗涤，4℃、12000r/min离心15min，小心弃去上清液；然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥20min后每管加入30μL超纯水，充分溶解后于-30℃保存备用。
2)检验西花蓟马的特异性引物的合成
Primer FOZLCE：5′-TTGACTTCTTCCACCCTCT-3′
Primer FOZLCF：5′-TGTATTTAAGTTTCGGTCTG-3′由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
3)PCR扩增反应
反应体系为20μL，其中10×PCR buffer 2.0μL、dNTP(10mM)0.4μL、Taq聚合酶(5U/μL)0.2μL、上游引物和下游引物(20ng/μL)各2.0μL、模板DNA 2.0μL、超纯水11.4μL。
4)PCR扩增程序
94℃预变性3min；35个循环：94℃60sec、68℃60sec、72℃60sec；最后72℃延伸5min。
5)PCR产物的鉴定
取6μL PCR产物用1.5％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定结果。
实施结果
利用引物primer FOZLCE/FOZLCF以西花蓟马线粒体DNA为模板，以花蓟马、禾花蓟马以及烟蓟马、葱韭蓟马等28种其他常见种类的蓟马为对照进行Species-Specific-COI PCR扩增。在1，16，17，32泳道的西花蓟马中扩增出了340bp的目的条带(见图1的1、6、17、32泳道)，在其他28种近缘种、属的蓟马中均无扩增产物。说明我们所筛选的来自西花蓟马线粒体DNA的特异性Species-Specific-COI PCR扩增引物的特异性强。回收上述340bp的目的条带，并测序，其序列如下所示(SEQ ID No：3)
340bp片段的序列：
ttgacttctt ccaccctctt taacattgtt aattataggt ttatcaaaag atggtgcagg aacaggatga    70
acagtttacc cacctttgtc aactttttat cactctggac catcagtaga tttaactatt ttttcccttc    140
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aaaattaaca acggaaaaga taactttatt tgtttgatca gttattttaa cagctatttt attattattg    280
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实施实例2：引物FOZLCE/FOZLCF对西花蓟马不同虫态和性别的扩增效果
1)西花蓟马模板线粒体DNA的制备
将不同虫态和性别的单头/单粒西花蓟马置于滴有20μL提取缓冲液(50mMTris-HCl、1mM EDTA、1％SDS、20mM NaCl，pH 8.0)的parafilm膜上，以0.2mL的PCR管底部作为匀浆器充分研磨，匀浆液以微量移液器移入1.5mL离心管；然后以200μL缓冲液分4次清洗匀浆器，移入同一离心管，混匀，加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀后于60℃水浴1h(中途混匀1次)；然后沸水浴5min，加入220μL氯仿/异戊醇(V∶V＝24∶1)抽提液，轻柔混匀数十次后，冰上放置30min；4℃、12000r/min离心15min，取上清液，加入440μL预冷的无水乙醇，轻轻混匀，待出现少量絮状沉淀后于-30℃放置30min；4℃、12000r/min离心15min，小心弃去上清液。加入500μL预冷的75％乙醇洗涤，4℃、12000r/min离心15min，小心弃去上清液；然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥20min后每管加入30μL超纯水，充分溶解后于-30℃保存备用。
2)检验西花蓟马的特异性引物的合成
Primer FOZLCE：5′-TTGACTTCTTCCACCCTCT-3′
Primer FOZLCF：5′-TGTATTTAAGTTTCGGTCTG-3′由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
3)PCR扩增反应
反应体系为20μL，其中10×PCR buffer 2.0μL、dNTP(10mM)0.4μL、Taq聚合酶(5U/μL)0.2μL、上游引物和下游引物(20ng/μL)各2.0μL、模板DNA 2.0μL、超纯水11.4μL。
4)PCR扩增程序
94℃预变性3min；35个循环：94℃60sec、68℃60sec、72℃60sec；最后72℃延伸5min。
5)PCR产物的鉴定
取6μL PCR产物用1.5％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定结果。
实施结果
利用引物FOZLCE/FOZLCF以不同虫态和性别的西花蓟马线粒体DNA为模板进行PCR扩增。西花蓟马的雌性成虫和雄性成虫均扩增出了340bp的目的条带(见附图2的6、7泳道)；同时西花蓟马的单粒卵、单头初孵幼虫、二龄若虫、预蛹和蛹也扩增出了340bp的目的条带(见附图2的1、2、3、4、5泳道)，说明本发明所筛选的西花蓟马的种特异性Species-Specific-COI PCR扩增引物的准确性高。回收上述340bp的目的条带，并测序，序列如SEQ ID No：3所示。
实施实例3：引物FOZLCE/FOZLCF对西花蓟马最低检出量的测定
1)西花蓟马模板线粒体DNA的制备
将单头西花蓟马雌性成虫置于滴有20μL提取缓冲液(50mM Tris-HCl、1mMEDTA、1％SDS、20mM NaCl，pH 8.0)的parafilm膜上，以0.2mL的PCR管底部作为匀浆器充分研磨，匀浆液以微量移液器移入1.5mL离心管；然后以200μL缓冲液分4次清洗匀浆器，移入同一离心管，混匀，加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀后于60℃水浴1h(中途混匀1次)；然后沸水浴5min，加入220μL氯仿/异戊醇(V∶V＝24∶1)抽提液，轻柔混匀数十次后，冰上放置30min；4℃、12000r/min离心15min，取上清液，加入440μL预冷的无水乙醇，轻轻混匀，待出现少量絮状沉淀后于-30℃放置30min；4℃、12000r/min离心15min，小心弃去上清液。加入500μL预冷的75％乙醇洗涤，4℃、12000r/min离心15min，小心弃去上清液；然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥20min后每管加入30μL超纯水。然后原模板溶液以2倍进行递减梯度稀释至1/480头，取2μL作为PCR扩增的模板，直接加到PCR反应体系中。
2)检验西花蓟马的特异性引物的合成
Primer FOZLCE：5′-TTGACTTCTTCCACCCTCT-3′
Primer FOZLCF：5′-TGTATTTAAGTTTCGGTCTG-3′由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
3)PCR扩增反应
反应体系为20μL，其中10×PCR buffer 2.0μL、dNTP(10mM)0.4μL、Taq聚合酶(5U/μL)0.2μL、上游引物和下游引物(20ng/μL)各2.0μL、模板DNA 2.0μL、超纯水11.4μL。
4)PCR扩增程序
94℃预变性3min；35个循环：94℃60sec、68℃60sec、72℃60sec；最后72℃延伸5min。
5)PCR产物的鉴定
取6μL PCR产物用1.5％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定结果。
实施结果
利用引物primer FOZLCE/FOZLCF做最低检出量的测定，以不同稀释倍数的西花蓟马线粒体DNA为模板进行PCR扩增，能检测到的最低模板DNA浓度为1/120头雌性成虫(见附图3)。回收340bp的目的条带，并测序，序列如SEQ ID No：3所示。
实施实例4：引物FOZLCE/FOZLCF对不同国家和地区西花蓟马的检测结果
1)西花蓟马模板线粒体DNA的制备
将单头西花蓟马成虫置于滴有20μL提取缓冲液(50mM Tris-HCl、1mMEDTA、1％SDS、20mMNaCl，pH 8.0)的parafilm膜上，以0.2mL的PCR管底部作为匀浆器充分研磨，匀浆液以微量移液器移入1.5mL离心管；然后以200μL缓冲液分4次清洗匀浆器，移入同一离心管，混匀，加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀后于60℃水浴1h(中途混匀1次)；然后沸水浴5min，加入220μL氯仿/异戊醇(V∶V＝24∶1)抽提液，轻柔混匀数十次后，冰上放置30min；4℃、12000r/min离心15min，取上清液，加入440μL预冷的无水乙醇，轻轻混匀，待出现少量絮状沉淀后于-30℃放置30min；4℃、12000r/min离心15min，小心弃去上清液。加入500μL预冷的75％乙醇洗涤，4℃、12000r/min离心15min，小心弃去上清液；然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥20min后每管加入30μL超纯水，充分溶解后于-30℃保存备用。
2)检验来自不同国家和地区西花蓟马的特异性引物的合成
Primer FOZLCE：5′-TTGACTTCTTCCACCCTCT-3′
Primer FOZLCF：5′-TGTATTTAAGTTTCGGTCTG-3′由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
3)PCR扩增反应
反应体系为20μL，其中10×PCR buffer 2.0μL、dNTP(10mM)0.4μL、Taq聚合酶(5U/μL)0.2μL、上游引物和下游引物(20ng/μL)各2.0μL、模板DNA 2.0μL、超纯水11.4μL。
4)PCR扩增程序
94℃预变性3min；35个循环：94℃60sec、68℃60sec、72℃60sec；最后72℃延伸5min。
5)PCR产物的鉴定
取6μL PCR产物用1.5％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定结果。
实施结果
以室内继代饲养的西花蓟马为阳性对照，以来自不同国家和我国不同发生地的西花蓟马线粒体DNA为模板，利用引物FOZLCE/FOZLCF进行PCR扩增。在室内饲养的西花蓟马种群(见附图4的1泳道)以及来自澳大利亚(见附图4的2、3、4泳道)、荷兰(见附图4的5泳道)、美国(见附图4的6、7、8泳道)、西班牙(见附图4的9、10泳道)等国的田间种群和2003年在我国首次发现的西花蓟马(见附图4的11泳道)以及分别采自北京(见附图4的12泳道)、云南(见附图4的13、14泳道)、山东(见附图4的15、16泳道)等地的西花蓟马中均扩增出了340bp的目的片段，且条带清晰。回收上述340bp的目的条带，并测序，序列如SEQ IDNo：3所示。表明本发明的特异性引物和方法对来自不同国家/地区和我国不同发生地的西花蓟马均具有很好的检测效果。
序列表
<110>中国农业科学院植物保护研究所
<120>西花蓟马特异性COI引物、检测方法及试剂盒
<160>3
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>西花蓟马(Frankliniella occidentalis)
<400>1
ttgacttctt ccaccctct                                                 19
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>西花蓟马(Frankliniella occidentalis)
<400>2
tgtatttaag tttcggtctg                                                20
<210>3
<211>340
<212>DNA
<213>西花蓟马(Frankliniella occidentalis)
<400>3
ttgacttctt ccaccctctt taacattgtt aattataggt ttatcaaaag atggtgcagg    60
aacaggatga acagtttacc cacctttgtc aactttttat cactctggac catcagtaga    120
tttaactatt ttttcccttc atttagcagg tatttcttca attctaggag ctttaaattt    180
tattacaacg attttaaatt taaagatcaa aaaattaaca acggaaaaga taactttatt    240
tgtttgatca gttattttaa cagctatttt attattattg tcgttaccag ttttagcagg    300
agctattaca atattattaa cagaccgaaa cttaaataca                          340