使用纤维素类生物质的物质转化方法 【技术领域】
本发明涉及借助于酶反应和微生物发酵以良好的效率从纤维素类生物质容易地得到有用物质如乙醇的转化方法。
背景技术
目前，据报道，需要全球降低二氧化碳的排放以防止全球变暖。在这种情况下，得自于未使用的生物质、尤其是纤维素类生物质的能量的使用，已经引起了关注。造成所述情况的一个原因是这种生物质能够为所谓的碳中性生物质。具体地，生物质含有最初得自大气二氧化碳中的碳，所述二氧化碳已经被植物吸收或固定。因此，通过能够吸收所排放二氧化碳的植物的再生，能够抵消因从这种生物质中提取能量而排放的二氧化碳(±0)。另外，由于可从生物质中得到燃料物质如乙醇或甲烷，所以期望在将来用生物质代替将耗尽的化石燃料(非专利文献1)。
目前，已经在巴西使用源自甘蔗的糖且在美国使用玉米的可食用部分来积极生产衍生自生物质的乙醇(生物乙醇)。实际上，在各个国家中已经将其用作石油的替代品。已经从还能够用作人的食物或牲畜饲料的部分制造了这种形式的生物乙醇。因此，例如如果逐渐将生物乙醇用作燃料物质，则要当心食物价格会急剧升高。
因此，由不可食用植物或木材制造的纤维素类生物质，作为生物乙醇的原料已经引起了关注。然而，难以将纤维素类生物质转化成燃料物质。这是因为用作燃料物质起始物质的纤维素的结晶度高，且在用于获得燃料物质的这种生物质中所包含的纤维素被持久的木素所包围，因此难以使用纤维素。因此，为了使用纤维素类生物质中的纤维素，需要例如降低结晶度并从这种生物质中所包含的纤维素中除去木素等，从而获得可利用的形式的纤维素(非专利文献2、3和4)。
当单独考虑将纤维素类生物质转化成糖和乙醇时，大致有两种方法可用于这种转化。一种方法是酸水解法，使用酸等将纤维素类生物质中的纤维素水解而得到葡萄糖，然后通过发酵将葡萄糖转化成乙醇。对这种方法的测试和研究已经进行了多年。然而，这些反应是在强酸性、高温和高压条件下进行的，因此，能够在这种条件下使用的装置的成本和维护成本增加，这是突出的问题(非专利文献2和3)。
同时，另一种方法是酶糖化法，由此使用纤维素降解酶(纤维素酶)将纤维素降解成葡萄糖。与酸水解法相比，酶糖化法在装置建造方面有优势，因为能够在温和条件下进行反应。为了促进降解，需要将纤维素酶与木质生物质中所包含的纤维素接触。然而，如上所述木素的存在和纤维素的结晶阻止了这种接触。因此，需要在酶促反应之前进行某种预处理。用于酶促糖化纤维素类生物质方法的预处理的实例包括涉及稀硫酸处理、碱处理和精细粉碎的各种方法。然而，确定的方法尚未确定起来(非专利文献3和5)。
精细粉碎法是利用粉碎装置如球磨机将生物质加工成细颗粒，使得生物质中包含的纤维素的表面积增大，从而易于纤维素降解的方法。在这种情况中，据说生物质的粒度应尽可能小。然而，当生物质粒度尽可能小时，用于这种尺寸降低的能量和成本增加，这是不利的(非专利文献6)。另外，作为改良的精细粉碎法，已经提出了一种包括在湿粉碎期间将生物质糖化的方法。然而，其仅包括糖化，至今仍未实现乙醇的转化(非专利文献7)。
作为精细粉碎方法的实例，已经开发了在过渡金属存在下对生物质进行机械磨碎从而由生物质制造氢的方法(专利文献1)。然而，通过该方法不能制造乙醇等。
专利文献1：日本专利公报2006-312690A
非专利文献1：山地意治(2002)，バイオマスエネルギ一の特性とエネルギ一変換·利用技術(生物质能的特性和能量转化和使用的技术)，NTS，3-36页
非专利文献2：坂士朗ら(2001)，Biomass/Energy/Environment(生物质/能量/环境)，IPC，251-260页
非专利文献3：杉浦純(2002)，Biomass energy characteristics andtechnology of energy conversion and use(生物质能的特性和能量转化和使用的技术)，NTS，283-312页
非专利文献4：George P.Philippidis(1996)，Handbook onBioethanol(生物乙醇手册)，Taylor & Francis，253-285页
非专利文献5：The-An Hsu(1996)，Handbook on Bioethanol(生物乙醇手册)，Taylor & Francis，183-212页
非专利文献6：Merill A.Millet，et al.(1976)，Biotechnol.& Bioeng.Symp.(生物技术和生物工程论坛)，No.6，125-153页
非专利文献7：Rick G.Kelsey，et al.(1980)，Biotechnology andBioengineering(生物技术和生物工程)，No.22，1025-1036页
【发明内容】
本发明要解决的问题
本发明的目的是开发一种转化方法，以借助于酶反应和微生物发酵在良好收率下由纤维素类生物质容易地获得有用物质如乙醇。
解决问题的手段
作为为了实现上述目的而进行广泛研究的结果，本发明人已经发现，在使用酶(多种酶)将纤维素类生物质转化成糖，并然后使用微生物(多种微生物)转化成有用物质如乙醇时，使用硬球能够提高转化效率。从而完成了本发明。
具体地，本发明涉及通过促进酶反应和发酵以高收率获得产物的方法，包括将纤维素类生物质、硬球以及含有酶(多种酶)和微生物(多种微生物)的反应溶液引入单个反应容器内，并振荡整个反应容器使得所述球与所述纤维素类生物质相互剧烈接触。下面将详细地描述本发明。
本发明涉及下列内容。
(1)一种进行乙醇转化的方法，包括：将纤维素类生物质、硬物质和反应溶液在单个反应容器中进行混合，在振荡所述反应容器的同时借助于单独的酶反应或酶反应与发酵的组合对纤维素类生物质进行物质转化。
(2)如(1)所述的进行物质转化的方法，其中使用基于纤维素酶的酶作为转化纤维素类生物质的酶来进行转化，并通过发酵进一步将产物的一部分或全部转化成乙醇。
(3)如(1)或(2)所述的进行物质转化的方法，其中通过在单个反应容器中进行基于纤维素酶的酶反应和乙醇发酵将纤维素类生物质转化成乙醇。
(4)如(1)～(3)中任一项所述的进行物质转化的方法，其中所述硬物质为由氧化锆、氧化铝、不锈钢、铁、氟树脂或尼龙制成的球。
(5)如(1)～(4)中任一项所述的进行物质转化的方法，其中在纤维素类生物质发生转化时，首先将所述反应容器进行剧烈振荡，然后以比以前温和的方式振荡或者静置，将此过程进行一次，或反复进行两次以上。
(6)如(1)～(5)中任一项所述的进行物质转化的方法，其中所述反应容器安装有热传感器和能够在所述反应容器周围循环温水的夹套，在纤维素类生物质转化期间通过所述热传感器和所述夹套控制温度。
(7)如(6)所述的进行物质转化的方法，其中所述反应溶液的温度和振荡处于联动方式，使得在纤维素类生物质转化期间，当温度达到预定温度时停止振荡，当温度降至低于预定温度时重新开始振荡，以此方式反复进行。
(8)如(1)～(7)中任一项所述的进行物质转化的方法，其中所述反应容器安装有包含pH传感器和能够控制pH的装置的设备，在纤维素类生物质转化期间对所述反应溶液的pH进行控制。
用于本发明方法中的纤维素类生物质可以为干燥状态或湿润状态，且未对其水分含量进行限制。未对生物质的大小进行限制，只要其能够引入所使用的反应容器中即可。然而，当其使用尺寸小时，能够加速反应。另外，不需要对纤维素类生物质进行特殊预处理，就能够获得本转化方法的效果。然而，纤维素类生物质可以进行适当处理，如酸处理、碱处理、精细粉碎、臭氧处理、爆破处理或细菌处理。
将上述纤维素类生物质引入反应容器内。然后，向其中添加足够量的硬球、用于转化的酶溶液、用于同时发酵的微生物(多种微生物)，如果需要还添加用于发酵的营养源。结果，由于硬球之间的碰撞，使得在比不使用硬球的反应高的效率下发生酶反应。此外，由于酶反应的产物会被在容器中共存的微生物立即消耗掉，所以所述产物不会抑制酶反应。因此，获得的发酵产物如乙醇的量比通过通常同时发酵而得到的产物的量大。
能够使用的纤维素类生物质的实例包括：草质生物质如稻杆、米糠、麦秆、甘蔗渣、玉米的任一部分、或不同的植物如柳枝稷；和任意木质生物质如软木或硬木屑、木材间苗(間伐材)、建筑碎屑或废蘑菇床。此外，能够使用纸、棉花等。
作为硬球，优选使用由例如氧化锆、氧化铝、氟树脂或尼龙制成的球。可使用同种球或由不同材料制成的且具有不同尺寸的球的混合物。应当根据生物质的条件适当使用这种球。
作为反应容器，能够使用由任意材料如塑料、不锈钢、铁或不同金属制成的容器，只要其能够封闭而避免液体泄漏和氧气渗入且不会因引入到所述容器中的球等造成损伤即可。
当进行酶反应和发酵时，通过向容器提供热传感器、pH传感器等来监测和控制反应溶液的温度和pH，能够有效地进行反应。例如，关于温度控制，通过在反应容器外部提供用于温水循环的夹套，能够将温度保持在恒定水平。另外，根据本发明，通过硬物质的振荡会产生热。能够将所产生的热用作反应热。为了达到这种目的，为振荡装置提供具有热传感器的振荡系统。当温度因振荡而达到预定的上限温度时，振荡停止。在温度因停止振荡而降至预定的下限温度时，重新开始振荡。因此，能够降低加热所需能量的浪费。这对于生产乙醇尤其有利，其中期望将所述乙醇用作石油的替代品。
关于振荡方法，能够使用任意手段进行振荡，只要所述手段可产生剧烈振荡而达到纤维素类生物质和硬球在反应容器内移动的程度。当使用小型反应容器时，振荡培养箱是适当的振荡手段。同时，当使用大型反应容器时，使用用于在鼓状罐中混合的混合机械是有效的。即使在简单的往复振荡的情况中也能够获得所述振荡方法的效果。然而，在加快速度的更复杂形式振荡的情况中，能够预期更有利的效果。
用于转化的酶(多种酶)可以为市售产品、通过培养丝状真菌而得到的培养液、或这种培养液的提纯产物，只要能够实现本发明的目的即可。例如在利用纤维素酶进行糖化的情况中，在许多情况下，将纤维素酶和半纤维素酶与商购获得的酶或粗提纯的酶混合。能够适当确定所使用酶的量。然而，向废蘑菇床中添加含半纤维素酶的12.5～50FPU(滤纸单位，滤纸降解活性)的纤维素酶。还可通过将酶悬浮在水中来制备酶溶液。使用含有醋酸或柠檬酸的缓冲剂将pH保持为4～5也是有利的。利用尺寸为0.45μm以下的过滤器，通过除去细菌能够防止对酶溶液造成细菌污染。在纤维素酶糖化之后不进行微生物发酵而结束所述过程，能够由纤维素得到糖如葡萄糖。在使用半纤维素酶如木聚糖酶的条件下，能够从纤维素类生物质中所包含的半纤维素得到糖如木糖、甘露糖、阿拉伯糖或半乳糖。另外，在使用含有半纤维素酶的纤维素酶的条件下，可同时获得糖如得自纤维素的葡萄糖和糖如得自半纤维素的木糖。通过发酵能够将由此得到的糖进一步转化成诸如乙醇和乳酸的物质。
当通过发酵将糖转化成不同物质时，添加微生物(多种微生物)。例如，在乙醇发酵的情况中，使用酿酒酵母菌属(
Saccharomycescerevisiae)酵母作为所使用的微生物是方便且有效的。然而，如果对戊糖如得自半纤维素的木糖进行乙醇发酵，能够使用树干毕赤酵母(
Pichia stipitis)。另外，根据条件能够使用耐盐的裂殖酵母(
Shizosaccharomyces pombe)等。此外，除了酵母，还能够使用引发乙醇发酵的任意微生物，包括基因重组体如运动发酵单胞菌(
Zymomonas mobilis)，只要其引发乙醇发酵。当使用酿酒酵母(
S.cereviciae)时，能够使用以斜面保存或冷冻保存的产品。另外，可以使用商购获得的面包酵母。当使用面包酵母时，通过直接将酵母引入发酵系统中在使用干燥或生酵母的条件下可获得良好的发酵效率，这是因为开始发酵时酵母存在的浓度高。当使用斜面或相似方法保存的酵母时，最好在同时发酵之前使用液体介质进行预培养，从而增加酵母的量和活性。
在微生物发酵的情况中，在利用硬球振荡下，可能不会引起发酵，这取决于所使用的微生物。在这种情况中，通过剧烈振荡特定的时间周期，然后进行温和振荡或在完全静止条件下放置以促进发酵，或者通过以交替方式进行剧烈振荡以及温和振荡或静止条件下的放置，可解决发酵不足的问题。
发明效果
根据本发明，在使用纤维素类生物质进行物质转化、尤其是在利用酶(多种酶)将所述生物质转化成糖或利用微生物(多种微生物)将所述生物质转化成乙醇期间，通过添加硬球而进行的振荡能够明显增加转化物质的收率。
该说明书包括日本专利申请2007-264041的说明书和/或附图中所公开内容的一部分或全部，所述专利申请是本申请的优先权文献。
【附图说明】
图1显示了本发明和常规方法(未添加硬球)之间乙醇收率的比较。
图2显示了反复进行在静止条件下的放置和振荡的效果。
图3显示了在振荡期间水温的升高。
本发明的最佳实施方式
下面，将参考下列实施例来更加详细地描述本发明，但不能将本发明限制于此。
实施例1
在使用舞茸废蘑菇床时乙醇转化的效果
下面描述本发明使用舞茸废蘑菇床作为纤维素类生物质的实例，所述废蘑菇床为木质生物质。所述舞茸废蘑菇床基本上由水分含量为60％以上的硬木锯屑构成。在用作反应容器的带夹套的不锈钢圆柱状容器中，放入干重为1.0kg的这种废蘑菇床(已进行热干燥)。向其中倒入纤维素酶酵母溶液(10L)。所述纤维素酶酵母溶液包含含有作为纤维素酶的GODO-TCD(Godo Shusei Co.，Ltd.)(0.6FPU/ml)和Kameriya酵母(Nisshin Seifun)(1g/L)的离子交换水。此外，向容器中添加直径为10mm的氧化锆球(10kg)。在不添加氧化锆球的条件下进行对照试验。在所述容器中放置pH计、热传感器和脱气管。用盖子封闭所述容器并放入摇摆振荡器(RS-100；Seiwa Giken Co.，Ltd.)中。将脱气管的一段导入水中，使得外部空气不会进入容器内。通过向夹套内引入温水将所述容器的内部环境调节至37℃。将振荡器的振荡速度预设为50Hz。然后，开始振荡操作。在转化反应期间，适当进行抽样。通过气相色谱(GB-14；Shimadzu Corporation)确定上清液中的乙醇浓度。图1显示了结果。利用得到的乙醇量相对于根据废蘑菇床中纤维素量计算的乙醇理论量的百分比来表示乙醇的收率。结果发现，通过本方法的转化而得到的乙醇收率是通过常规方法的转化而得到的收率的2.9倍。
实施例2
在振荡期间改变振荡速度时的效果
根据条件，即使在与实施例1中所使用条件相同的条件下，仍可能不发生乙醇的转化。为了解决这种问题，可改变转化期间的振荡速度。具体地，在转化反应的第一个24小时内进行振荡。其后，停止振荡并将所述容器静置3～4天。除了使用未加工的废蘑菇床(干重为1.0kg)作为底物且纤维素酶-酵母溶液的量为5L之外，在与实施例1中相同的那些条件下进行转化。表1显示了利用适当抽样确定上清液中乙醇浓度的结果。结果，通过本方法的转化得到的乙醇收率是通过常规方法的转化得到的乙醇收率的1.6倍，所述常规方法未添加硬球。另外，在不改变振荡速度的情况中，将乙醇收率为0作为前提条件。
表1
实施例3
振荡期间振荡速度变化的效果
通过轻微改变振荡速度来进行实施例2中所使用方法的改进方案。具体地，在转化反应开始的1小时内不振荡，然后振荡1小时并停止1小时。重复进行这种操作。除了使用干燥的废蘑菇床(干重为0.5kg)作为底物且纤维素酶-酵母溶液的量为5L之外，在与实施例1和2中相同的条件下进行转化。表2显示了利用适当抽样确定上清液中乙醇浓度的结果。在上述条件下，连续振荡是否导致发酵不能被确定。然而，在对容器以交替方式反复进行静置条件下的放置和振荡之后，开始发酵。此外，在连续振荡的情况中，在停止振荡之后开始发酵。
实施例4
振荡期间所产生热的使用
在利用硬球的振荡期间产生热。因此，使用振荡期间所产生的热在成本和能量衡算方面是有效的，因为不需要使用其他热源。图3显示了在使用实施例1、2和3中所使用装置的条件下在50Hz下振荡时离子交换水水温的上升，条件是将离子交换水(5L)和氧化锆球(：10mm)(20kg)放入反应容器中并将夹套中的温水放掉。应理解，温度随着振荡而升高且所述温度始终保持在高于室温的水平上。在这种情况下，通过单独振荡，能够获得同时发酵的最佳温度37℃。因此，即使不利用其他热源，也能够实现同时发酵。
本文中所引用的所有出版物、专利和专利申请都通过参考以其完整的形式并入本文中。