人胚胎干细胞的分化 技术领域 本专利申请是 2007 年 4 月 18 日提交的美国专利申请 No.11/736,908 的部分 继续申请， 其要求 2006 年 4 月 28 日提交的美国临时申请 No.60/745,899、 2006 年 9 月 30 日提交的美国临时申请 No.60/827,695 以及 2006 年 12 月 29 日提交的美国临时申请 No.60/882,670 的优先权， 这些临时申请的全部内容以引用的方式并入本文。
本发明提供促进多能干细胞分化的方法。 具体地讲， 本发明提供形成胰腺内胚层、 胰腺激素表达细胞和胰腺激素分泌细胞的改进方法。 本发明还提供在不使用饲养细胞层的 情况下促进多能干细胞分化的方法。
背景技术
由于 I 型糖尿病细胞替代疗法的进步和可移植胰岛数量的不足， 人们已重点关注 于开发适于移植的胰岛素生成细胞或 β 细胞来源。一种方法是从多能干细胞 ( 例如为胚 胎干细胞 ) 产生功能性 β 细胞。在脊椎动物胚胎发育中， 多能细胞在已知为原肠胚形成的过程中产生一群包括三 胚层 ( 外胚层、 中胚层和内胚层 ) 的细胞。例如为甲状腺、 胸腺、 胰腺、 肠和肝脏组织将由内 胚层经过中间阶段发育而成。这一过程中的中间阶段是定形内胚层的形成。定形内胚层细 胞表达多种标志物， 例如 HNF-3β、 GATA4、 Mixl1、 CXCR4 和 Sox-17。
由定形内胚层分化成的胰腺内胚层形成胰腺。 胰腺内胚层细胞表达胰十二指肠同 源盒基因 Pdx1。在不存在 Pdx1 的情况下， 胰腺不能超越腹胰芽和背胰芽的形成而发育。因 此， Pdx1 的表达标志着胰腺器官形成中的关键步骤。除了其他类型的细胞以外， 成熟胰腺 还包含外分泌组织和内分泌组织。外分泌组织和内分泌组织由胰腺内胚层分化形成。
据报道， 具有胰岛细胞特征的细胞衍生自小鼠胚胎细胞。例如， Lumelsky 等人 (Science 292 ： 1389， 2001) 记录了小鼠胚胎干细胞分化出类似于胰岛细胞的胰岛素分泌 结构。Soria 等人 (Diabetes 49 ： 157， 2000) 记录了衍生自小鼠胚胎干细胞的胰岛素分泌 细胞使链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠血糖正常化。
在一个实例中， Hori 等人 (PNAS 99 ： 16105， 2002) 公开了用磷脂酰肌醇 3- 激酶 (LY294002) 的抑制剂处理小鼠胚胎干细胞得到类似 b 细胞的细胞。
又如， Blyszczuk 等人 (PNAS 100 ： 998， 2003) 记录了从组成性表达 Pax4 的小鼠胚 胎干细胞产生胰岛素生成细胞。
Micallef 等人记录了视黄酸可以调控胚胎干细胞的定型以形成 Pdx1 阳性胰腺内 胚层细胞。在胚胎干细胞分化的第 4 天 ( 对应于胚胎中的原肠胚形成末期 ) 将视黄酸添加 到培养基中， 此时视黄酸诱导 Pdx1 表达最有效 (Diabetes 54 ： 301， 2005)。
Miyazaki 等人记录了过量表达 Pdx1 的小鼠胚胎干细胞系。他们的结果表明外 源 Pdx1 的表达明显增强了所得分化细胞中胰岛素、 生长抑素、 葡糖激酶、 神经元素 3、 P48、 Pax6 和 HNF6 基因的表达 (Diabetes 53 ： 1030， 2004)。
Skoudy 等人记录了激活素 A(TGFβ 超家族的成员 ) 上调了小鼠胚胎干细胞中的外
分泌胰腺基因 (p48 和淀粉酶基因 ) 和内分泌基因 (Pdx1、 胰岛素和高血糖素 ) 的表达。使 用 1nM 激活素 A 时观察到最大效应。他们也观察到胰岛素和 Pdx1 mRNA 的表达水平不受视 黄酸影响 ； 然而， 3nMFGF7 处理导致 Pdx1 的转录水平提高 (Biochem.J.379 ： 749， 2004)。
Shiraki 等人研究了特别地增强胚胎干细胞分化为 Pdx1 阳性细胞的生长因子的 效应。 他们观察到 TGFβ2 可再现地得出较高比例的 Pdx1 阳性细胞 (Genes Cells.2005-6 ； 10(6) ： 503-16.)。
Gordon 等 人 证 实 了 在 不 存 在 血 清 的 情 况 下 和 在 存 在 激 活 素 连 同 Wnt 信 号 抑 制 剂 的 情 况 下， 从 小 鼠 胚 胎 干 细 胞 诱 导 brachyury+/HNF-3β+ 内 胚 层 细 胞 (US 2006/0003446A1)。
Gordon 等人 (PNAS， Vol 103， page 16806， 2006( 国家科学院院刊， 第 103 卷， 第 16806 页， 2006 年 )) 提出 “前原条的形成需要同时伴有 Wnt 和 TGF-β/nodal/ 激活素信号” 。
然而， 小鼠胚胎干细胞发育模型未必能准确模拟高等哺乳动物 ( 例如为人类 ) 的 发育程序。
Thomson 等人从人囊胚中分离出胚胎干细胞 (Science 282 ： 114， 1998)。同时， Gearhart 及其同事从胎儿性腺组织衍生人胚胎生殖 (hEG) 细胞系 (Shamblott 等人， Proc. Natl.Acad.Sci.USA 95 ： 13726， 1998)。 与小鼠胚胎干细胞不同 ( 其只是通过采用白血病抑 制因子 (LIF) 进行培养便可抑制分化 )， 人胚胎干细胞必须在十分特殊的条件下培养 ( 美国 专利 No.6,200,806 ； WO 99/20741 ； WO 01/51616)。
D’ Amour 等人描述了在存在高浓度激活素和低血清的情况下， 制备由人胚胎干 细胞衍生的定形内胚层细胞的增菌培养基 (D’ Amour KA 等人， 2005 年 )。将这些细胞移 植到小鼠肾被膜下导致了分化为具有某些内胚层器官特征的更为成熟的细胞。在添加 FGF-10 之后， 人胚胎干细胞衍生的定形内胚层细胞可以进一步分化成 Pdx1 阳性细胞 (US 2005/0266554A1)。
D’ Amour 等人 (Nature Biotechnology(《自然生物技术》 )-24， 1392-1401(2006)) 声称 ： “我们已开发出将人胚胎干细胞 (hES) 转化成能合成胰腺激素胰岛素、 高血糖素、 生 长抑素、 胰多肽和生长激素释放肽的内分泌细胞的分化方法。该方法通过引导细胞经过类 似于定形内胚层、 肠管内胚层、 胰腺内胚层和内分泌前体的阶段转变为表达内分泌激素的 细胞来模拟体内胰腺器官发生。 ”
又 如， Fisk 等 人 记 录 了 用 于 从 人 胚 胎 干 细 胞 制 备 胰 岛 细 胞 的 体 系 (US2006/0040387A1)。在这种情况下， 分化途径划分为三个阶段。首先， 使用正丁酸盐和激 活素 A 的组合， 使人胚胎干细胞分化为内胚层。然后， 与 EGF 或 β 细胞素结合采用 TGFβ 拮抗剂 ( 例如 Noggin) 培养细胞， 以生成 Pdx1 阳性细胞。通过烟酰胺诱导终末分化。
在 一 个 实 例 中， Benvenistry 等 人 声 称 ： “我 们 得 出 如 下 结 论 ： Pdx1 的 过 量 表 达增强了胰富集基因的表达， 胰岛素表达的诱导可能需要仅存在于体内的额外的信 号。 ” (Benvenistry 等人， Stem Cells 2006 ； 24 ： 1923-1930)。
因此， 仍然非常需要开发用于建立可被扩增以满足当前临床需要的多能干细胞系 的条件， 同时保持分化为胰腺内分泌细胞、 胰腺激素表达细胞或胰腺激素分泌细胞的潜能。 我们已采用替代方法， 以提高使人胚胎干细胞朝胰腺内分泌细胞分化的效率。发明内容
在一个实施例中， 本发明提供了用于分化多能干细胞的方法， 该方法包括如下步骤： a. 培养多能干细胞 ； 以及
b. 使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞 ；
c. 使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达所述胰腺内胚层谱系 特征性标志物的细胞 ； 以及
d. 使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征 性标志物的细胞。
在一个实施例中， 通过如下方法中的任何一种处理多能干细胞， 使表达定形内胚 层谱系特征性标志物的细胞从多能干细胞分化而成 ：
a. 在不存在血清的情况下， 在含有激活素 A 的培养基中培养多能干细胞， 然后用 激活素 A 和血清培养细胞， 再用激活素 A 和不同浓度的血清培养细胞 ； 或
b. 在不存在血清的情况下， 在含有激活素 A 的培养基中培养多能干细胞， 然后用 激活素 A 和另一个浓度的血清培养细胞 ； 或
c. 在不存在血清的情况下， 在含有激活素 A 和 Wnt 配体的培养基中培养多能干细 胞， 然后清除 Wnt 配体， 再用激活素 A 和血清培养细胞 ； 或
d. 在涂布有细胞外基质的组织培养基质上培养多能干细胞， 并用激活素 A 和 Wnt 配体培养多能干细胞 ； 或
e. 在涂布有细胞外基质的组织培养基质上培养多能干细胞， 然后在具有激活素 A 和 Wnt 配体的含有血清的第一培养基中培养多能干细胞， 再在具有激活素 A 的含有血清的 第二培养基中培养多能干细胞 ； 或
f. 在涂布有细胞外基质的组织培养基质上培养多能干细胞， 然后在具有激活素 A 和 Wnt 配体的含有血清的第一培养基中培养多能干细胞， 再在具有激活素 A 和 Wnt 配体的 含有不同浓度血清的第二培养基中培养多能干细胞 ； 或
g. 在补充有 B27 并含有 Wnt 配体和激活素 A 的培养基中培养多能干细胞 ； 或
h. 在涂布有细胞外基质的组织培养基质上培养多能干细胞， 培养基补充有 B27， 并含有激活素 A。
在一个实施例中， 通过如下方法中的任何一种处理表达定形内胚层谱系特征性标 志物的细胞， 使表达胰腺内胚层细胞特征性标志物的细胞由表达定形内胚层谱系特征性标 志物的细胞分化而成 ：
a. 用成纤维细胞生长因子和刺猬蛋白信号通道抑制剂处理表达定形内胚层谱系 特征性标志物的细胞， 然后清除含有成纤维细胞生长因子和刺猬蛋白信号通道抑制剂的培 养基， 随后在含有视黄酸、 成纤维细胞生长因子和刺猬蛋白信号通道抑制剂的培养基中培 养细胞 ； 或
b. 用视黄酸和至少一种成纤维细胞生长因子处理表达定形内胚层谱系特征性标 志物的细胞 ； 或
c. 用视黄酸处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞， 然后清除视黄酸， 随 后用至少一种成纤维细胞生长因子处理细胞。
在一个实施例中， 通过如下方法中的任何一种处理表达胰腺内胚层谱系特征性标 志物的细胞， 使表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞由表达胰腺内胚层谱系特征性标 志物的细胞分化而成 ：
a. 在含有 DAPT 和 exendin 4( 肠促胰岛素类似物 ) 的培养基中培养表达胰腺 内胚层谱系特征性标志物的细胞， 然后清除含有 DAPT 和 exendin4 的培养基， 随后在含有 exendin 1、 IGF-1 和 HGF 的培养基中培养细胞 ； 或
b. 在含有 exendin 4 的培养基中培养表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞， 然后清除含有 exendin 4 的培养基， 随后在含有 exendin 1、 IGF-1 和 HGF 的培养基中培养 细胞 ； 或
c. 在含有 DAPT 和 exendin 4 的培养基中培养表达胰腺内胚层谱系特征性标志物 的细胞 ； 或
d. 在含有 exendin 4 的培养基中培养表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞 ； 或
e. 用抑制 Notch 信号通道的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
在一个实施例中， 本发明提供了治疗糖尿病患者的方法， 该方法包括如下步骤 ： a. 培养多能干细胞 ；
b. 使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞 ；
c. 使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征 性标志物的细胞 ；
d. 使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化为 β 细胞谱系的细胞 ； 以及
e. 将 β 细胞谱系的细胞移植到患者体内。
附图说明 图 1 中， 屏面 a 示出在用 100ng/ml 激活素 A 进行处理两天、 五天和八天后， 定形内 胚层标志物 CXCR4、 GATA4、 HNF-3β、 Mixl1、 Sox-17 在人胚胎干细胞系 H9 中的表达。定形内 胚层标志物的表达在 mRNA 水平上被分析， 并归一化到未处理的人胚胎干细胞中的表达水 平。 屏面 b 示出在用 100ng/ml 激活素 A 进行处理三天和五天后， 前内胚层标志物 Cerberus、 Otx-1 和 Hex 基因在人胚胎干细胞系 H9 中的表达。
图 2 示出在用 100ng/ml 激活素 A 进行处理五天后， 定形内胚层标志物在人胚胎干 细胞系 H9 中的表达。通过免疫组织化学方法检测定形内胚层标志物的表达。屏面 (a) 示 出 Sox-17 的表达。屏面 (b) 示出 HNF-3β 的表达。屏面 (c) 示出 Oct3/4 的表达。
图 3 示出在执行步进式分化方案后， 定形内胚层标志物在人胚胎干细胞系 H9 中的 表达。定形内胚层标志物的表达在 mRNA 水平上被分析， 并归一化到未处理的人胚胎干细胞 中的表达水平。屏面 (a) 示出 GATA4 的表达。屏面 (b) 示出 Sox-17 的表达。屏面 (c) 示 出 HNF-3β 的表达。屏面 (d) 示出 Mixl1 的表达。标记为 “AA” 的数据点表示激活素 A 处 理时间为一天 (1d)、 三天 (3d)、 五天 (5d) 或七天 (7d)。标记为 “UT” 的数据点表示培养了 一天 (1d)、 三天 (3d)、 五天 (5d) 或七天 (7d) 的空白对照。
图 4 示出在执行步进式分化方案后， 胚外内胚层标志物在人胚胎干细胞系 H9 中 的表达。胚外内胚层标志物的表达在 mRNA 水平上被分析， 并归一化到未处理的人胚胎干
细胞中的表达水平。屏面 (a) 示出 100ng/ml 激活素 A 对 AFP 表达的影响。屏面 (b) 示出 100ng/ml 激活素 A 对 Sox7 表达的影响。标记为 “AA” 的数据点表示激活素 A 处理时间为一 天 (1d)、 三天 (3d)、 五天 (5d) 或七天 (7d)。标记为 “UT” 的数据点表示培养了一天 (1d)、 三天 (3d)、 五天 (5d) 或七天 (7d) 的空白对照。
图 5 示出在执行步进式分化方案后， 中胚层和外胚层标志物在人胚胎干细胞系 H9 中的表达。中胚层和外胚层标志物的表达在 mRNA 水平上被分析， 并归一化到未处理的人胚 胎干细胞中的表达水平。屏面 (a) 示出 100ng/ml 激活素 A 对 Brachyury 表达的影响。屏 面 (b) 示出 100ng/ml 激活素 A 对 Zic1 表达的影响。标记为 “AA” 的数据点表示激活素 A 处理时间为一天 (1d)、 三天 (3d)、 五天 (5d) 或七天 (7d)。标记为 “UT” 的数据点表示培养 了一天 (1d)、 三天 (3d)、 五天 (5d) 或七天 (7d) 的空白对照。
图 6 示出在用 100ng/ml 激活素 A 处理一天、 三天、 五天和七天后， 定形内胚层标志 物 Brachyury( 屏面 a)、 CXCR4( 屏面 b)、 Mixl1( 屏面 c)、 Sox17( 屏面 d)、 HNF-3β( 屏面 e)、 Oct4( 屏面 f) 在人胚胎干细胞系 H7 中的表达。定形内胚层标志物的表达在 mRNA 水平 被分析， 并归一化到未处理的人胚胎干细胞中的表达水平。
图 7 示出在应用分化方案后， 定形内胚层标志物在人胚胎干细胞系 H9 中的表达。 通过免疫组织化学方法检测定形内胚层标志物的表达。屏面 (a) 和屏面 (b) 示出 Sox-17 的表达。屏面 (c) 和屏面 (d) 示出 HNF-3β 的表达。屏面 (e) 和屏面 (f) 示出 GATA4 的表 达。屏面 (b)、 屏面 (d) 和屏面 (f) 示出采用 DAPI 进行的细胞核复染法。标记为 “处理过” 的柱形图表示激活素 A(100ng/ml) 处理时间为五天。标记为 “未处理” 的柱形图表示空白 对照。
图 8 示出在应用第二种分化方案后， 胰腺内胚层标志物在人胚胎干细胞系 H9 中的 表达。胰腺内胚层标志物的表达通过 PCR 分析， 并归一化到用激活素 A 处理的人胚胎干细 胞中的表达水平。屏面 (a) 示出 Pdx1 的表达。屏面 (b) 示出 GLUT-2 的表达。屏面 (c) 示 出 PTF1a 的表达。
图 9 示出在应用第二种分化方案后， 胰腺内胚层标志物在人胚胎干细胞系 H9 中的 表达。通过免疫组织化学方法检测胰腺内胚层标志物的表达。屏面 (a) 示出空白对照中 Pdx1 的表达， 而屏面 (b) 示出采用步进式分化方案培养的细胞中 Pdx1 的表达。
图 10 示出在应用第三种分化方案后， 胰腺内分泌标志物在人胚胎干细胞系 H9 中 的表达。胰腺内分泌标志物的表达通过 PCR 分析， 并归一化到用激活素 A 处理的人胚胎干 细胞中的表达水平。屏面 (a) 示出 NeuroD1 的表达。屏面 (b) 示出 Ngn3 的表达。屏面 (c) 示出胰岛素的表达。屏面 (d) 示出 Hes-1 的表达， 表达水平归一化到胰腺内胚层细胞的表 达水平。
图 11 示出在应用分化方案后， 胰腺内胚层标志物在人胚胎干细胞系 H9 中的表达。 胰腺内胚层标志物的表达通过 PCR 分析， 并归一化到用激活素 A 处理的人胚胎干细胞中的 表达水平。屏面 (a) 示出 Nkx2.2 的表达。屏面 (b) 示出 Pdx1 的表达。
图 12 示出培养基中每一传代 (P0、 P1 和 P2) 细胞的 PDX-1 表达。PDX-1 的表达通 过 PCR 分析， 并归一化到用激活素 A 处理的人胚胎干细胞 H9 中的表达水平。
图 13 示出在应用第三种分化方案后， 肝细胞标志物在人胚胎干细胞系 H9 中的表 达。肝细胞标志物的表达通过 PCR 分析， 并归一化到用激活素 A 处理的人胚胎干细胞中的表达水平。屏面 (a) 示出 AFP 的表达。屏面 (b) 示出白蛋白的表达。
图 14 示出多能标志物在人胚胎干细胞系 H9 中的表达。通过免疫组织化学方法分 析多能标志物的表达。屏面 (a) 示出 Oct-4 的表达。屏面 (b) 示出碱性磷酸酶的表达。
图 15 示出人胚胎细胞系 H9 的染色体核型。确定了小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上 培养的、 传代数为 P36 的细胞的染色体核型。
图 16 描绘本发明分化方案的概要， 其中人胚胎干细胞在无饲养层的体系中分化 成定形内胚层。
图 17 描绘传代数为 44 的人胚胎干细胞系 H9 的 FACS 图， 在浓度变化的 MATRIGEL 上进行培养， 并采用低血清 (0.5-2％ ) 和高激活素 A(100ng/ml) 处理 5 天。定形内胚层标 志物 CXCR4(CD184) 的表达在 Y 轴上示出， 胚胎干细胞标志物 CD9 的表达在 X 轴上示出。
图 18 示出定形内胚层标志物的实时 PCR 结果， 标志物来自于传代数为 44 的人胚 胎干细胞系 H9 的培养物， 培养体系分别是稀释度为 1 ∶ 10 的 MATRIGEL( ■ )、 稀释度为 1 ∶ 20 的 MATRIGEL( ■ ) 或稀释度为 1 ∶ 30 的 MATRIGEL( □ )， 采用实例 14 中公开的分 化方案进行处理。诱导倍数是相对于传代数为 44 的人胚胎干细胞系 H9 的未分化细胞的诱 导倍数， 该细胞系在使用小鼠胚胎成纤维细胞调节过的培养基中培养。
图 19 示出未分化多能干细胞和从分化多能干细胞获得的定形内胚层细胞的全基 因表达散点图。所示数据来自小鼠胚胎成纤维细胞上培养的、 传代数为 44 的人胚胎干细胞 系 H9 的培养物 ( 右屏面 ) 和 MATRIGEL 上培养的、 传代数为 83 的人胚胎干细胞系 H9 的培 养物 ( 左屏面 )。
图 20 示出用实例 4 中公开的定形内胚层分化方案进行处理并在小鼠胚胎成纤维 细胞饲养层上培养至第 5 天时人胚胎干细胞系 H1( 屏面 a)、 人胚胎干细胞系 H7( 屏面 b) 和 人胚胎干细胞系 H9( 屏面 c) 中 CXCR4 的表达， 通过 FACS 进行测定。
图 21 示出小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养的人胚胎干细胞系 H7( 屏面 a) 和人 胚胎干细胞系 H9( 屏面 b) 的培养物中， 指定定形内胚层标志物表达的实时 PCR 结果。结果 以相对于未分化细胞的增加倍数表示。
图 22 示出用实例 4 中公开的定形内胚层分化方案处理并且在 MATRIGEL(1 ∶ 30 稀释度 ) 上培养至第 5 天时人胚胎干细胞系 H1( 屏面 a)、 人胚胎干细胞系 H7( 屏面 b) 和人 胚胎干细胞系 H9( 屏面 c) 中 CXCR4 的表达， 通过 FACS 进行测定。
图 23 示出在人胚胎干细胞系 H7( 屏面 a)、 人胚胎干细胞系 H9( 屏面 b) 和人胚胎 干细胞系 H1( 屏面 c) 的培养物中， 指定定形内胚层标志物表达的实时 PCR 结果。结果以相 对于未分化细胞的增加倍数表示。根据实例 4 中公开的方法处理细胞。
图 24 示出在存在 100ng/ml 激活素 A( 屏面 a) 或 100ng/ml 激活素 A+20ng/ml 的 Wnt-3a( 屏面 b) 的情况下的培养基中、 传代数为 46 的人胚胎干细胞系 H9 培养物的相差图。 细胞处理五天。
图 25 示出在根据实例 4 中公开的方法进行处理后， 通过 FACS 测定的传代数为 44 的人胚胎干细胞系 H7( 屏面 a 和屏面 b) 和传代数为 46 的人胚胎干细胞系 H9( 屏面 c 和屏 面 d) 培养物中 CXCR4 的表达。屏面 b 和屏面 d 示出 20ng/ml 的 Wnt-3a 对 CXCR4 表达的影 响。屏面 a 和屏面 c 示出在不存在 Wnt-3a 的情况下 CXCR4 的表达。在处理完成 5 天后获 得结果。图 26 示出人胚胎干细胞系 H7( 屏面 a) 和 H9( 屏面 b) 培养物中指定基因的表 达的实时 PCR 数据。培养物用实例 4 中公开的分化方案处理。另外检测了 Wnt 激动剂 Wnt-3a(20ng/ml)、 Wnt-5a(20ng/ml) 和 Wnt-7a(20ng/ml) 的作用， 如屏面所示。细胞处理 5 天。结果以相对于未分化细胞的增加倍数表示。
图 27 示出处理完成五天后， 通过 FACS 测定的传代数为 46 的人胚胎干细胞系 H9 培养物中 CXCR4 的表达。屏面 (a) 示出在不存在 Wnt-3a 的情况下 CXCR4 的表达。屏面 (b) 示出在用 10ng/ml 的 Wnt-3a 处理后 CXCR4 的表达。屏面 (c) 示出在用 20ng/ml 的 Wnt-3a 处理后 CXCR4 的表达， 而屏面 (d) 示出在用 50ng/ml 的 Wnt-3a 处理后 CXCR4 的表达。
图 28 示出处理 5 天后， 人胚胎干细胞系 H9 培养物中指定定形标志物的表达。结 果示出为相对于未处理细胞表达水平的增加倍数， 通过实时 PCR 测定。 屏面 (a) 示出 10、 20 和 50ng/ml 的 Wnt-3a 对指定定形内胚层标志物基因表达的影响。 屏面 (b) 示出在处理完成 两天 (2d) 和 5 天 (5d) 后， 1、 5 或 10ng/ml 的 Wnt-3a(x 轴标签 ： 10、 5、 1) 对 goosecoid( ■ ) 和 CXCR4( □ ) 表达的影响。屏面 (c) 示出在两天 ( □ ) 或 5 天 ( ■ ) 后 1、 5 或 10ng/ml 的 Wnt-3a 对细胞数量的影响。
图 29 示出在用实例 4 中公开的分化方案处理 5 天后， 通过 FACS 测定的人胚胎干 细胞系 H9 培养物中 CXCR4 的表达。细胞在不存在 Wnt-3a 或 GSK-3B 抑制剂 ( 屏面 a) 的情 况下培养、 整个 5 天使用 20ng/ml 的 Wnt-3a( 屏面 b)、 整个 5 天使用 1000nM 的 GSK-3B 抑制 剂 IX( 屏面 c)、 整个 5 天使用 500nM 的 GSK-3B 抑制剂 IX( 屏面 d)、 整个 5 天使用 100nM 的 GSK-3B 抑制剂 IX( 屏面 e)、 整个 5 天使用 10nM 的 GSK-3B 抑制剂 IX( 屏面 f)、 第 1-2 天使 用 100nM 的 GSK-3B 抑制剂 IX( 屏面 g)、 第 1-2 天使用 10nM 的 GSK-3B 抑制剂 IX( 屏面 h)。
图 30 示出通过实时 PCR 测定的定形内胚层标志物的基因表达。结果以相对于未 处理细胞的增加倍数表示。屏面 (a) 示出得自传代数为 48 的人胚胎干细胞系 H9 的数据， 根据实例 4 中公开的定形内胚层方案进行处理， 包含在指定浓度和时间的条件下的 Wnt-3a 或 GSK-3B 抑制剂。屏面 (b) 示出得自传代数为 46 的人胚胎干细胞系 H9 的数据， 根据实例 4 中公开的定形内胚层方案进行处理， 包含在指定浓度和时间的条件下的 Wnt-3a 或 GSK-3B 抑制剂。
图 31 示出通过 FACS 测定的本发明所用胚胎干细胞系中 CXCR4 的表达。 屏面 (a-d) 示出得自传代数为 49 的人胚胎干细胞系 H9 的数据。屏面 (e-f) 示出得自传代数为 46 的 人胚胎干细胞系 H1 的数据。数据在处理完成 5 天后获取。细胞处理条件如下 ： 屏面 (a) ： 使用 10ng/ml 激活素 A 处理整个五天， 在最初两天加入 20ng/ml 的 Wnt-3a ； 屏面 (b) ： 使 用 100ng/ml 激活素 A 处理整个五天， 在最初两天加入 20ng/ml 的 Wnt-3a ； 屏面 (c) ： 使用 100ng/ml 激活素 A 处理整个五天， 在最初两天加入 100nM 的 GSK-3B 抑制剂 IX ； 屏面 (d) ： 使 用 10ng/ml 激活素 A 处理整个五天， 在最初两天加入 100nM 的 GSK-3B 抑制剂 IX ； 屏面 (e) ： 使用 100ng/ml 激活素 A 处理整个五天， 在最初两天加入 20ng/ml 的 Wnt-3a ； 以及屏面 (f) ： 使用 10ng/ml 激活素 A 处理整个五天， 在最初两天加入 20ng/ml 的 Wnt-3a。
图 32 示出通过实时 PCR 测定的传代数为 49 的人胚胎干细胞系 H9 培养物中定形 内胚层标志物的基因表达 ； 细胞用 10、 50、 或 100ng/ml 激活素 A 加入 20ng/ml 的 Wnt-3a 处 理： 屏面 (a) ： AFP、 Bry、 CXCR4、 GSC、 HNF-3B 和 POU5F(Oct-4) 的表达 ； 屏面 (b) ： SOX-17 和 GATA4 的表达。结果表示为相对于未处理细胞的增加倍数。图 33 示出通过 FACS 测定的传代数为 53 的胚胎干细胞系 H9 中 CXCR4 的表达。数 据在处理完成 5 天后获取。细胞处理条件如下 ： 屏面 (a) ： 使用 100ng/ml 激活素 A 处理整 个五天， 在最初两天加入 20ng/ml 的 Wnt-3a， 第 3-5 天加入 25ng/ml 的 BMP-4 ； 屏面 (b) ： 使 用 100ng/ml 激活素 A 处理整个五天， 在最初两天加入 20ng/ml 的 Wnt-3a ； 屏面 (c) ： 使用 100ng/ml 激活素 A 处理整个五天， 在最初两天加入 100nM 的 GSK-3B 抑制剂 IX ； 屏面 (d) ： 使用 20ng/ml 的 Wnt-3a+25ng/ml 的 BMP-4 处理整个五天 ； 屏面 (e) ： 使用 100ng/ml 激活素 A 处理整个五天， 在最初两天加入 20ng/ml 的 Wnt-3a+100nM 的 GSK-3B 抑制剂 IX ； 以及屏面 (f) ： 使用 100ng/ml 激活素 A+25ng/ml 的 BMP-4 处理整个五天。就所有屏面而言， X 轴都表 示 CD9 的表达， Y 轴都表示 CXCR4(CD184) 的表达。
图 34 示出通过实时 PCR 测定的传代数为 46 的人胚胎干细胞系 H1 培养物中定形 内胚层标志物的基因表达 ； 细胞用 10 或 100ng/ml 激活素 A 和 20ng/ml 的 Wnt-3a 或 100nM 的 GSK-3B 抑制剂处理 ； 屏面 (a) ： AFP、 Bry、 CXCR4、 GSC 和 POU5F(Oct-4) 的表达 ； 屏面 (b) ： SOX-17、 HNF-3B 和 GATA4 的表达。结果以相对于未处理细胞的增加倍数表示。
图 35 示出通过实时 PCR 测定的传代数为 49 的人胚胎干细胞系 H9 培养物中定形 内胚层标志物的基因表达 ； 细胞用 50 或 100ng/ml 激活素 A 和 10 或 100nM 的 GSK-3B 抑制 剂处理 ； 屏面 (a) ： AFP、 Bry、 CXCR4、 GSC、 HNF-3B 和 POU5F(Oct-4) 的表达 ； 屏面 (b) ： SOX-17 和 GATA4 的表达。结果以相对于未处理细胞的增加倍数表示。
图 36 示出通过实时 PCR 测定的传代数为 53 的人胚胎干细胞系 H9 培养物中定形 内胚层标志物的基因表达 ； 细胞用激活素 A、 Wnt-3a、 GSK-3 抑制剂和 BMP-4 的组合处理五 天； 屏面 (a) ： AFP、 Bry、 CXCR4、 GSC、 HNF-3B 和 SOX7 的表达 ； 屏面 (b) ： SOX-17、 HNF-3B 和 GATA4 的表达。
图 37 示出通过 FACS 测定的、 用实例 22 中所列条件处理的人胚胎干细胞系 H9 培 养物中 CXCR4 的表达百分比。
图 38 示出通过 FACS 测定的、 纤粘蛋白 ( 屏面 a) 或 MATRIGELTM( 屏面 b) 上培养的 人胚胎干细胞系 H9 培养物中定形内胚层标志物的表达。
图 39 示出通过实时 PCR 测定的、 纤粘蛋白 ( □ ) 或稀释度为 1 ∶ 10 的生长因子 减少的 MATRIGEL( ■ ) 上培养的人胚胎干细胞系 H9 培养物中定形内胚层标志物的表达。
图 40 示出在存在低血清、 100ng/ml 激活素 A 和 20ng/ml 的 Wnt-3a 的情况下， 多种 浓度的 MATRIGEL 如何影响人胚胎干细胞向定形内胚层的分化。根据实例 4 中公开的方法 处理细胞。所示结果是通过实时 PCR 测定的指定基因的表达水平。
图 41 示出 Wnt-3a 在通过人胚胎干细胞形成定形内胚层中的作用， 人胚胎干细胞 在 MATRIGEL 上培养， 但在小鼠胚胎成纤维细胞上分化。屏面 (a-d) 示出指定基因的实时 PCR 数据。屏面 (e-g) 示出指定条件下的 FACS 数据。
图 42 示出在用 Wnt 抑制剂 DKK-1 处理后， 在涂布有 MATRIGELTM 的组织培养基质上 培养的人胚胎干细胞分化成定形内胚层。所示结果是通过实时 PCR 测定的 H9 细胞中指定 基因的表达， 该细胞在存在 20ng/ml 的 Wnt-3a 和 100ng/ml 的 DKK1(DE+DKK1) 的情况下或 在不存在 DKK1(DE) 的情况下， 根据实例 4 中公开的方法进行处理。
图 43 示出人胚胎干细胞系 H9 培养物中定形内胚层标志物的免疫荧光染色， 该细 胞在涂布有 MATRIGEL 的组织培养基质上培养， 并且在没有 ( 屏面 a) 或具有 ( 屏面 b)20ng/ml 的 Wnt-3a 的条件下， 在加入 100ng/ml 激活素 A 的低血清环境中分化。Ecad ＝上皮细胞 钙粘蛋白， NCAM ＝神经性钙粘蛋白。
图 44 示出传代数为 38 的人胚胎干细胞系 SA002 分化成定形内胚层。以指定条件 处理细胞五天后， 通过实时 PCR 测定屏面中指定基因的表达。
图 45 示 出 在 用 100ng/ml 激 活 素 A( 屏 面 a)、 100ng/ml 激 活 素 A+20ng/ml 的 Wnt-3a( 屏面 b)、 或 100ng/ml 激活素 A+100nM 的 GSK-3B 抑制剂 IX( 屏面 c) 进行处理后， 通过 FACS 测定的传代数为 38 的人胚胎干细胞系 SA002 中 CXCR4 的表达。细胞处理时间为 五天。
图 46 示出传代数为 55 的人胚胎干细胞系 H1 在涂布有人血清的组织培养基质上 分化成定形内胚层。细胞用指定条件处理， 通过实时 PCR 测定屏面中指定基因的表达。 TM
图 47 示出在涂布有 MATRIGEL 的组织培养基质上的传代数为 54 的人胚胎干细 胞系 H1 培养物分化成定形内胚层。按照五天 DE 方案检测多种 GSK-B 抑制剂的作用。在最 初两天的处理中， 检测浓度为 100nM 的下列 GSK-3B 抑制剂的作用 ： GSK-3B VIII、 IX、 XI、 和 XII。
图 48 示出传代数为 49 的人胚胎干细胞系 H9 培养物中 AFP( 屏面 a)、 Pdx-1( 屏 面 b)、 Cdx-2 和 Glut-2( 屏面 c)、 以及 HNF-3β、 HNF-6 和生长抑素 ( 屏面 d) 的表达， 该 细胞根据实例 4 中公开的方法， 在处理的最初两天， 在存在 20ng/ml 的 Wnt-3a 的情况 下进行培养和处理。在该处理后， 细胞用 2 ％胎牛血清加入 1mM 视黄酸、 0.1 至 1mM 的 TTNPB(4-[(E)-2-(5， 6， 7， 8- 四氢 -5， 5， 8， 8- 四甲基 -2- 萘基 )-1- 丙烯基 ] 苯甲酸芳维甲 酸 )、 或 0.1 至 10mM 的 AM-580(4-[(5， 6， 7， 8- 四氢 -5， 5， 8， 8- 四甲基 -2- 萘基 ) 甲酰胺基 ] 苯甲酸 ) 处理额外的三天。下一步， 细胞在 2％胎牛血清加入 20ng/ml 的 bFGF 中处理额外 的三天。
图 49 示出人胚胎干细胞系 H1 培养物中屏面 a 和屏面 b 中指定的定形内胚层标志 物表达的实时 PCR 结果， 该细胞用激活素 A 和 Wnt-1 在指定时间和浓度条件下进行处理。
图 50 示出将 EXPRES01、 BGO1V 和 H1 P50 细胞系暴露于限定分化培养基中或低血 清分化培养基中在第 4-5 天时通过 FACS 测定的 CXCR4 和 CD9 的表达。
图 51 显示用低血清或限定培养基 + 激活素 A+WNT3A 处理的 EXPRES01、 BGO1V 和 H1 培养物在第 4-5 天时的实时 PCR 数据。
图 52 描 绘 用 1 ％ 的 b27+DM-F12+ 激 活 素 A+WNT3A+GSK03B 抑 制 剂 处 理 五 天 后， EXPRES 01 P49 细胞分化成 DE 的免疫荧光图。
图 53 示出暴露于不是低血清 + 激活素 A 就是限定培养基 + 激活素 A 的 H1 细胞在 第 1-5 天的实时 PCR 数据。 具体实施方式
为使公开清楚明了、 并且并非通过限制的方法， 将本发明的具体实施方式分为以 下几个小节 ： 描述或图解本发明的某些特征、 实施例或应用。
定义
干细胞是由它们在单细胞水平上自我更新和分化以产生后代细胞的能力定义的 未分化细胞， 这些后代细胞包括自我更新的祖细胞、 非更新的祖细胞以及终末分化的细胞。干细胞的特征还在于它们能够在体外分化成多种胚层 ( 内胚层、 中胚层和外胚层 ) 的多种 细胞谱系的功能细胞， 以及在移植后产生多种胚层组织， 并在注射进囊胚后形成基本上大 部分 ( 如果不是全部 ) 组织。
干细胞根据其发育潜能分为 ： (1) 全能， 指能够产生所有的胚胎和胚胎外细胞类 型； (2) 多能， 指能够产生所有的胚胎细胞类型 ； (3) 多能， 指能够产生细胞谱系的亚群， 但 在特定组织、 器官或生理系统内能产生所有的细胞 ( 例如造血干细胞 (HSC) 可产生的后代 细胞包括 ： HSC( 自我更新 )、 局限于血细胞的寡能祖细胞以及作为血液正常组分的所有细 胞类型和成分 ( 如血小板 )) ； (4) 寡能， 指能够产生比多能干细胞更具限制性的细胞谱系亚 群； 以及 (5) 单能， 指能够产生单一细胞谱系 ( 如生精干细胞 )。
分化是非特化 (“未定型的” ) 或较少特化的细胞获得特化细胞 ( 例如为神经细胞 或肌肉细胞 ) 特征的过程。分化的或分化诱导的细胞是在细胞谱系内占据更特化 (“定型 的” ) 位置的细胞。当用于分化过程时， 术语 “定型的” 是指如下所述的细胞 ： 该细胞在分化 途径中进行到某个点， 它在正常环境下会继续分化成特定的细胞类型或细胞类型的亚群， 并且在正常环境下不能分化成不同的细胞类型或者退回到少分化的细胞类型。 去分化是指 细胞返回到细胞谱系中较少特化的 ( 或定型的 ) 位置的过程。如本文所用， 细胞谱系定义 细胞的遗传性， 即源于何种细胞以及会产生什么细胞。细胞谱系将细胞置于发育和分化的 遗传图内。谱系特异性标志物是指与关注的谱系细胞的表型特异性相关的特征， 其可用于 评估未定型的细胞向关注的谱系的分化。
如本文所用， “AFP” 或 “α- 甲胎蛋白” 是指在肝脏发育开始时产生的抗原。AFP 另 外可以在胚胎外细胞中表达。
“白蛋白” 是可溶性单体蛋白， 其构成成人中所有血清蛋白的约一半。
“β- 细胞谱系” 是指具有用于转录因子 PDX-1 和下列转录因子中的至少一种的阳 性基因表达的细胞 ： NGN-3、 Nkx2.2、 Nkx6.1、 NeuroD、 Isl-1、 HNF-3β、 MAFA、 Pax4 和 Pax6。 表达 β 细胞谱系特征性标志物的细胞包括 β 细胞。
如本文所用， “Brachyury” 是 T-box 基因家族成员。它是原条和中胚层细胞的标 志物。
如本文所用， “表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞” 是指表达下列标志物中 的至少一种的细胞 ： SOX-17、 GATA-4、 HNF-3β、 GSC、 Cer1、 Nodal、 FGF8、 Brachyury、 Mix 样 同源盒蛋白、 FGF4、 CD48、 脱中胚蛋白 (EOMES)、 DKK4、 FGF17、 GATA-6、 CXCR4、 C-Kit、 CD99 或 OTX2。 表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞包括原条前体细胞、 原条细胞、 中内胚层细 胞和定形内胚层细胞。
“c-Kit” 和 “CD117” 均指具有 Genbank 登录号 X06182 中所公开的序列或其天然存 在的变体序列 ( 如等位变体 ) 的细胞表面受体酪氨酸激酶。
如本文所用， “CD99” 是指由登录号为 NM_002414 的基因编码的蛋白。
如本文所用， “表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞” 是指表达下列标志物中 的至少一种的细胞 ： PDX-1、 HNF-1β、 PTF-1α、 HNF-6 或 HB9。表达胰腺内胚层谱系特征性 标志物的细胞包括胰腺内胚层细胞。
如本文所用， “表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞” 是指表达下列标志物中 的至少一种的细胞 ： NGN-3、 NeuroD、 Islet-1、 PDX-1、 NKX6.1、 Pax-4、 Ngn-3 或 PTF-1α。表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞包括胰腺内分泌细胞、 胰腺激素表达细胞、 胰腺激 素分泌细胞和 β- 细胞谱系的细胞。
如本文所用， “Cer1” 或 “Cerebrus” 是半胱氨酸结蛋白质超家族的成员。
如本文所用， “CXCR4” 是指基质细胞衍生因子 1(SDF-1) 受体， 也称为 “LESTR” 或 “融合素” 。在形成原肠胚的小鼠胚胎中， CXCR4 在定形内胚层和中胚层中表达， 但不在胚外 内胚层中表达。
如本文所用， “定形内胚层” 是指下述细胞 ： 在原肠胚形成期间具有来源于上胚 层的细胞的特征， 并形成胃肠道及其衍生物。定形内胚层细胞表达下列标志物 ： HNF-3β、 GATA-4、 SOX-17、 Cerberus、 OTX2、 goosecoid、 C-Kit、 CD99 和 Mixl1。
如本文所用， “胚外内胚层” 是指表达下列标志物中的至少一种的细胞群 ： SOX-7、 AFP 和 SPARC。
如本文所用， “FGF-2” 、 “FGF-4” 、 “FGF-8” 、 “FGF-10” 和 “FGF-17” 是成纤维细胞生 长因子家族的成员。
“GATA-4” 和 “GATA-6” 是 GATA 转录因子家族的成员。该转录因子家族由 TGF-β 信号诱导， 并有助于早期内胚层标志物的维护。
如本文所用， “GLUT-2” 是指葡萄糖转运分子， 其在许多胎儿组织和成人组织 ( 包 括胰腺、 肝脏、 肠、 脑和肾 ) 中表达。
如本文所用， “Goosecoid” 或 “GSC” 是指在胚孔背唇中表达的同源结构域转录因 子。
如本文所用， “HB9” 是指同源盒基因 9。
“HNF-1α” 、 “HNF-1β” 、 “HNF-3β” 和 “HNF-6” 属于转录因子的肝脏核因子家族， 其特征在于高度保守的 DNA 结合域和两个短羧基端结构域。
如本文所用， “Islet-1” 或 “Isl-1” 是转录因子的 LIM/ 同源结构域家族的成员， 并在发育中的胰腺中表达。
如本文所用， “MafA” 是在胰腺中表达的转录因子， 并控制胰岛素生物合成和分泌 中涉及的基因的表达。
如本文所用， “标志物” 是在关注的细胞中差异表达的核酸分子或多肽分子。在上 下文中， 差异表达意指对于阳性标志物来说水平增加， 对于阴性标志物来说水平降低。 与其 他细胞相比， 在关注的细胞中核酸或多肽标志物的可测水平充分地较高或较低， 使得可使 用本领域已知的多种方法中的任何一种辨别关注的细胞并将其与其他细胞区分开。
如本文所用， “中内胚层细胞” 是指表达下列标志物中的至少一种的细胞 ： CD48、 脱 中胚蛋白 (EOMES)、 SOX-17、 DKK4、 HNF-3β、 GSC、 FGF17、 GATA-6。
如本文所用， “Mixl1” 是指同源盒基因， 其为原条、 中胚层和内胚层中的细胞的标 志物。
如本文所用， “NeuroD” 是神经形成中牵涉的碱性螺旋 - 环 - 螺旋 (bHLH) 转录因 子。
如本文所用， “NGN-3” 是碱性环 - 螺旋 - 环转录因子神经元素家族的成员。
如本文所用， “Nkx-2.2” 和 “Nkx-6.1” 是 Nkx 转录因子家族的成员。
如本文所用， “Nodal” 是 TGFβ 蛋白质超家族的成员。“Oct-4”是 POU 结构域转录因子的成员， 并被广泛认为是多能干细胞的标志。 Oct-4 与多能干细胞的关系由其对未分化的多能干细胞的严格局限的表达所指出。分化到 体细胞谱系时， Oct-4 的表达很快消失。
如本文所用， “胰腺内分泌细胞” 或 “胰腺激素表达细胞” 是指能够表达下列激素中 的至少一种的细胞 ： 胰岛素、 胰高血糖素、 生长抑素和胰腺多肽。
如本文所用， “胰腺激素分泌细胞” 是指能够分泌下列激素中的至少一种的细胞 ： 胰岛素、 胰高血糖素、 生长抑素和胰腺多肽。
如本文所用， “Pax-4” 和 “Pax-6” 是胰岛发育中牵涉的胰腺 b 细胞特异性转录因 子。
如本文所用， “PDX-1” 是指胰腺发育中牵涉的同源结构域转录因子。
如本文所用， “前原条细胞” 是指表达下列标志物中的至少一种的细胞 ： Nodal 或 FGF8
如本文所用， “原条细胞” 是指表达下列标志物中的至少一种的细胞 ： Brachyury、 Mix 样同源盒蛋白或 FGF4。
如本文所用， “PTF-1α” 是指 48kD 的碱性螺旋 - 环 - 螺旋蛋白质， 其为三聚胰腺 转录因子 -1(PTF1) 的序列特异性 DNA 结合亚基。 如本文所用， “SOX-1” 、 “SOX-2” 、 “SOX-7” 和 “SOX-17” 是 SOX 转录因子家族的成 员， 并在胚胎形成中被牵涉。
如本文所用， “SPARC” 也称为 “富含半胱氨酸酸性分泌蛋白” 。
“SSEA-1” ( 阶段特异性胚胎抗原 -1) 是在鼠畸胎癌干细胞 (EC)、 鼠和人胚胎生殖 细胞 (EG) 和鼠胚胎干细胞 (ES) 的表面上存在的糖脂表面抗原。
“SSEA-3” ( 阶段特异性胚胎抗原 -3) 是在人畸胎癌干细胞 (EC)、 人胚胎生殖细胞 (EG) 和人胚胎干细胞 (ES) 的表面上存在的糖脂表面抗原。
“SSEA-4” ( 阶段特异性胚胎抗原 -4) 是在人畸胎癌干细胞 (EC)、 人胚胎生殖细胞 (EG) 和人胚胎干细胞 (ES) 的表面上存在的糖脂表面抗原。
“TRA1-60” 是在人畸胎癌干细胞 (EC)、 人胚胎生殖细胞 (EG) 和人胚胎干细胞 (ES) 的表面上表达的硫酸角蛋白相关抗原。
“TRA1-81” 是在人畸胎癌干细胞 (EC)、 人胚胎生殖细胞 (EG) 和人胚胎干细胞 (ES) 的表面上表达的硫酸角蛋白相关抗原。
“TRA2-49” 是在人畸胎癌干细胞 (EC) 和人胚胎干细胞 (ES) 的表面上表达的碱性 磷酸酶同工酶。
如本文所用， “UTF-1” 是指在多能胚胎干细胞和胚胎外细胞中表达的转录辅激活 因子。
如本文所用， “Zic1” 是 Zic 转录因子家族的成员。Zic1 调控神经基因和神经嵴特 异性基因的表达， 其在背神经管和迁移前 (premigratory) 神经嵴的细胞中表达。
多能干细胞的分离、 扩增和培养
多能干细胞的表征
多能干细胞可表达阶段特异性胚胎抗原 (SSEA)3 和 4 中的一种或多种和可使 用 称 为 Tra-1-60 和 Tra-1-81(Thomson 等 人， Science 282 ： 1145， 1998) 的 抗 体 检 测 的
标 志 物。 多 能 干 细 胞 的 体 外 分 化 导 致 SSEA-4、 Tra-1-60 和 Tra-1-81( 如 果 存 在 ) 的 缺失以及 SSEA-1 表达的增加。未分化的多能干细胞通常具有碱性磷酸酶活性， 其可通 过用 4 ％的多聚甲醛固定细胞然后用 Vector Red 作为基质进行显影来检测， 如制造商 (VectorLaboratories(Burlingame Calif.)) 所述。 未分化的多能干细胞通常还表达 Oct-4 和 TER， 如通过 RT-PCR 所检测。
增殖的多能干细胞的另一种可取表型是分化成以下所有三种胚层细胞的潜能 ： 内 胚层、 中胚层和外胚层。可通过 ( 例如 ) 以下方法来确认多能干细胞的多能性 ： 将细胞注入 严重联合免疫缺陷 (SCID) 小鼠的体内， 使用 4％的多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤， 然后用 组织学方法检查来自三种胚层的细胞类型的证据。或者， 可以通过形成胚状体并评估胚状 体是否存在与三种胚层相关的标志物来确定多能性。
可以使用标准的 G 显带技术对增殖的多能干细胞系进行核型分析， 并与公布的相 应灵长类物种的核型进行比较。希望获得具有 “正常核型” ( 指细胞是整倍体的 ) 的细胞， 其中所有人染色体都存在并且无明显的改变。
多能干细胞的来源
可以使用的多能干细胞的类型包括衍生自妊娠后形成的组织的已建立的多能细 胞系， 这些组织包括在妊娠期任意时间采集的胚胎前期组织 ( 例如为囊胚 )、 胚胎组织或胎 儿组织， 所述时间通常 ( 但不必须 ) 在妊娠的前大约 10-12 周。非限制性实例为已建立的 人胚胎干细胞系或人胚胎生殖细胞系， 例如为人胚胎干细胞系 H1、 H7 和 H9(WiCell)。另外 还设想了本公开的组合在这种细胞的初步建立或稳定期间的用途， 在此情况下， 源细胞可 以为直接取自源组织的原代多能细胞。取自在不存在饲养细胞的情况下已经培养的多能 干细胞群的细胞也是合适的。突变人胚胎干细胞系也是合适的， 例如为 BGO1v(BresaGen， Athens， GA)。
在 一 个 实 施 例 中， 人 胚 胎 干 细 胞 如 Thomson 等 人 ( 美 国 专 利 No.5,843,780 ； Science 282 ： 1145， 1998 ； Curr.Top.Dev.Biol.38 ： 133ff.， 1998 ； Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.92 ： 7844， 1995) 所述进行制备。
多能干细胞的培养
在一个实施例中， 多能干细胞通常在以多种方式支持多能干细胞的饲养细胞层上 培养。或者， 多能干细胞在下述培养体系中培养 ： 其基本上不含饲养细胞， 但仍支持多能干 细胞在不发生明显分化的情况下增殖。使用此前培养了另一种细胞的条件培养基， 来支持 多能干细胞在无饲养层培养体系中不分化的生长。或者， 使用化学成分确知培养基来支持 多能干细胞在无饲养层培养体系中不分化的生长。在一个实施例中， 使用由补充有 B27 的 培养基组成的化学成分确知培养基支持多能干细胞在无饲养层培养体系中不分化的生长。
例 如， Reubinoff 等 人 (Nature Biotechnology(《自 然 生 物 技 术》 )18 ： 399-404(2000)) 和 Thompson 等 人 (Science 6 November 1998 ： Vol.282.no.5391， pp.1145-1147(《科学》 ， 1998 年 11 月 6 日， 第 282 卷， 第 5391 号， 第 1145-1147 页 )) 公开 了使用小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞层培养来自人囊胚的多能干细胞系。
Richards 等人 (Stem Cells 21 ： 546-556， 2003) 评价了一组 11 种不同的人成体、 胎儿和新生儿饲养细胞层在支持人多能干细胞培养方面的能力。Richards 等人指出 ： “在 成人皮肤成纤维细胞饲养层上培养的人胚胎干细胞系可保持人胚胎干细胞形态并保留多能性” 。 US20020072117 公开了可产生支持灵长类多能干细胞在无饲养层培养体系中生长 的培养基的细胞系。所用的细胞系为间充质和成纤维细胞样细胞系， 它们得自胚胎组织或 者从胚胎干细胞分化而来。US20020072117 还公开了所述细胞系作为原代饲养细胞层的用 途。
又如， Wang 等人 (Stem Cells 23 ： 1221-1227， 2005) 公开了使人多能干细胞在衍 生自人胚胎干细胞的饲养细胞层上长期生长的方法。
又如， Stojkovic 等人 (Stem Cells 2005 23 ： 306-314， 2005) 公开了衍生自人胚 胎干细胞自发分化的饲养细胞体系。
在其它实例中， Miyamoto 等人 (Stem Cells 22 ： 433-440， 2004) 公开了得自人胎 盘的饲养细胞来源。
Amit 等人 (Biol.Reprod 68 ： 2150-2156， 2003) 公开了衍生自人包皮的饲养细胞 层。
又如， Inzunza 等人 (Stem Cells 23 ： 544-549， 2005) 公开了来自人出生后包皮成 纤维细胞的饲养细胞层。
US6642048 公开了支持灵长类多能干细胞 (pPS) 在无饲养层培养体系中生长的培 养基， 以及可用于产生此类培养基的细胞系。US6642048 指出 ： “本发明包括得自胚胎组织 或由胚胎干细胞分化而来的间充质和成纤维细胞样细胞系。 本公开将描述和说明衍生此类 细胞系、 处理培养基以及使用条件培养基培养干细胞的方法。 ”
又如， WO2005014799 公开了用于维持、 增殖和分化哺乳动物细胞的条件培养基。 WO2005014799 指出 ： “根据本发明产生的培养基通过小鼠细胞的细胞分泌活性进行调整， 特别是那些分化的和无限增殖化的转基因肝细胞， 称为 MMH(Me t 小鼠肝细胞 )。 ”
又如， Xu 等人 (Stem Cells 22 ： 972-980， 2004) 公开了得自人胚胎干细胞衍生物 ( 经过遗传修饰以过表达人端粒酶逆转录酶 ) 的条件培养基。
又如， US20070010011 公开了用于维持多能干细胞的化学成分确知培养基。
一种替代性培养体系采用补充有能够促进胚胎干细胞增殖的生长因子的无血清 培养基。例如， Cheon 等人 (BioReprodDOI ： 10.1095/biolreprod.105.046870， 2005 年 10 月 19 日 ) 公开了无饲养层、 无血清的培养体系， 其中胚胎干细胞在使用血清替代品 (SR) 的 非条件培养基 ( 补充有能够触发胚胎干细胞自我更新的不同生长因子 ) 中维持。
又如， Levenstein 等人 (Stem Cells 24 ： 568-574， 2006) 公开了在无成纤维细胞 或条件培养基的情况下使用补充有 bFGF 的培养基长期培养人胚胎干细胞的方法。
又如， US20050148070 公开了在无血清、 无成纤维细胞饲养层的限定培养基中培养 人胚胎干细胞的方法， 该方法包括 ： 在含有白蛋白、 氨基酸、 维生素、 矿物质、 至少一种转铁 蛋白或转铁蛋白替代物、 至少一种胰岛素或胰岛素替代物的培养基中培养干细胞， 所述培 养基基本上不含哺乳动物胎儿血清， 并含有至少约 100ng/ml 的能够活化成纤维细胞生长 因子信号受体的成纤维细胞生长因子， 其中所述生长因子并非仅来自成纤维细胞饲养层， 所述培养基支持在无饲养细胞或条件培养基的情况下干细胞在不分化的状态下增殖。
又如， US20050233446 公开了可用于培养干细胞 ( 包括未分化的灵长类原始干细 胞 ) 的限定培养基。在溶液中， 与被培养的干细胞相比， 所述培养基基本上为等渗的。在给
定的培养中， 具体的培养基包含基础培养基和支持原始干细胞基本上不分化生长必需的一 定量的 bFGF、 胰岛素和抗坏血酸中的每一个。
又如， US6800480 指出 ： “在一个实施例中， 提供了用于在基本上不分化的状态下 培养灵长类来源的原始干细胞的细胞培养基， 其包含有效支持灵长类来源的原始干细胞生 长的低渗透压、 低内毒素基础培养基。 基础培养基与营养血清和基质相结合， 所述营养血清 有效支持灵长类来源的原始干细胞的生长， 所述基质选自由饲养细胞和衍生自饲养细胞的 细胞外基质成分组成的组。所述培养基还包含非必需氨基酸、 抗氧化剂和选自由核苷和丙 酮酸盐组成的组的第一生长因子。 ”
又如， US20050244962 指出 ： “在一个方面， 本发明提供培养灵长类胚胎干细胞的 方法。 一种方法在基本上不含哺乳动物胎儿血清 ( 还优选地基本上不含任何动物血清 )、 存 在成纤维细胞生长因子 ( 并非仅来自成纤维细胞饲养层 ) 的培养体系中培养干细胞。在一 个优选的形式中， 通过加入足够的成纤维细胞生长因子， 使得此前支持干细胞培养所需的 成纤维细胞饲养层不再是必需的。 ”
在其它实例中， WO2005065354 公开了限定、 等渗培养基， 其基本上不含饲养层和 血清， 而含 ： a. 基础培养基 ； b. 一定量的足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞生长的 bFGF ； c. 一定量的足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞生长的胰岛素 ； 以及 d. 一定量 的足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞生长的抗坏血酸。
又如， WO2005086845 公开了维持未分化干细胞的方法， 所述方法包括使干细胞暴 露于足量的以将细胞维持在未分化状态的转化生长因子 β(TGFβ) 蛋白质家族成员、 成纤 维细胞生长因子 (FGF) 蛋白质家族成员或烟酰胺 (NIC)， 并维持足够的时间以实现所需的 结果。
可以将多能干细胞平铺到合适的培养基质上。在一个实施例中， 合适的培养基 质为细胞外基质成分， 例如为衍生自基底膜或可以形成粘附分子受体 - 配体偶联之部分 的那些。在一个实施例中， 所述合适的培养基质为 (Becton Dickenson)。 是来自于 Engelbreth-Holm-Swarm 肿瘤细胞的可溶性制剂， 其在室温下会发生 胶化从而形成重组基底膜。
其他细胞外基质组分和组分混合物适于用作替代物。根据待增殖的细胞类型， 这 可以包括层粘连蛋白、 纤粘蛋白、 蛋白聚糖、 巢蛋白、 硫酸乙酰肝素等等， 它们可以单独使用 或多种组合使用。
在存在促进细胞存活、 增殖和保持所需特性的培养基的情况下， 可以将多能干细 胞以合适的分布平铺到基质上。所有这些特征得益于密切注意接种分布， 并可由本领域的 技术人员轻易地确定。
合适的培养基可以由下列组分制成， 例如为 ： 达尔伯克改良伊格尔培养基 (DMEM)， Gibco#11965-092 ； Knockout 达尔伯克改良伊格尔培养基 (KO DMEM)， Gibco#10829-018 ； Ham′ s F12/50％ DMEM 基础培养基 ； 200mM 的 L- 谷氨酰胺， Gibco#15039-027 ； 非必需氨基 酸溶液， Gibco 11140-050 ； β- 巯基乙醇， Sigma#M7522 ； 人重组碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)， Gibco#13256-029。
多能干细胞向表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的分化
适用于本发明的多能干细胞包括 ( 例如 ) 人胚胎干细胞系 H9(NIH 代码 ： WA09)、 人胚胎干细胞系 H1(NIH 代码 ： WA01)、 人胚胎干细胞系 H7(NIH 代码 ： WA07) 和人胚胎干细胞系 SA002(Cellartis， Sweden)。表达下列多能细胞特征性标志物中的至少一种的细胞也适用 于本发明 ： ABCG2、 cripto、 CD9、 FoxD3、 Connexin43、 Connexin45、 Oct4、 Sox2、 Nanog、 hTERT、 UTF-1、 ZFP42、 SSEA-3、 SSEA-4、 Tra1-60、 Tra1-81。
定形内胚层谱系特征性标志物选自由下列组成的组 ： SOX-17、 GATA4、 Hnf-3β、 GSC、 Cer1、 Nodal、 FGF8、 Brachyury、 Mix 样同源盒蛋白、 FGF4、 CD48、 脱中胚蛋白 (EOMES)、 DKK4、 FGF17、 GATA6、 CXCR4、 C-Kit、 CD99 和 OTX2。表达定形内胚层谱系特征性标志物中的 至少一种的细胞适用于本发明。在本发明的一个方面， 表达定形内胚层谱系特征性标志物 的细胞为原条前体细胞。在一个替代方面， 表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞为中 内胚层细胞。在一个替代方面， 表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞为定形内胚层细 胞。
胰腺内胚层谱系特征性标志物选自由下列组成的组 ： Pdx1、 HNF-1β、 PTF1a、 HNF-6、 HB9 和 PROX1。表达胰腺内胚层谱系特征性标志物中的至少一种的细胞适用于本发 明。在本发明的一个方面， 表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞为胰腺内胚层细胞。
胰腺内分泌谱系特征性标志物选自由下列组成的组 ： NGN-3、 NeuroD、 Islet-1、 Pdx-1、 NKX6.1、 Pax-4、 Ngn-3 和 PTF-1α。在一个实施例中， 胰腺内分泌细胞能够表达下列 激素中的至少一种 ： 胰岛素、 胰高血糖素、 生长抑素和胰腺多肽。表达胰腺内分泌谱系特征 性标志物中的至少一种的细胞适用于本发明。在本发明的一个方面， 表达胰腺内分泌谱系 特征性标志物的细胞为胰腺内分泌细胞。 胰腺内分泌细胞可以是胰腺激素表达细胞。 或者， 胰腺内分泌细胞可以是胰腺激素分泌细胞。
在本发明的一个方面， 胰腺内分泌细胞是表达 β 细胞谱系特征性标志物的细胞。 表达 β 细胞谱系特征性标志物的细胞表达 Pdx1 和下列转录因子中的至少一种 ： NGN-3、 Nkx2.2、 Nkx6.1、 NeuroD、 Isl-1、 HNF-3β、 MAFA、 Pax4 和 Pax6。在本发明的一个方面， 表达 β 细胞谱系特征性标志物的细胞是 β 细胞。
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成
可以通过本领域的任何方法或本发明中提出的任何方法， 将多能干细胞分化成表 达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如， 可以根据 D’ Amour 等人在 Nature Biotechnology(《自然生物技术》 )23， 1534-1541(2005) 中公开的方法， 将多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物 的细胞。
例如， 可以根据 Shinozaki 等人在 Development 131， 1651-1662(2004) 中公开的 方法， 将多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如， 可以根据 McLean 等人在 Stem Cells 25， 29-38(2007) 中公开的方法， 将多 能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如， 可以根据 D’ Amour 等人在 Nature Biotechnology(《自然生物技术》 )24， 1392-1401(2006) 中公开的方法， 将多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物 的细胞。
例如， 可以通过以下方法， 将多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志 物的细胞 ： 在不存在血清的情况下， 在含激活素 A 的培养基中培养多能干细胞， 然后将细胞与激活素 A 和血清一起培养， 随后将细胞与激活素 A 和不同浓度的血清一起培养。此方法 的一个实例在 NatureBiotechnology(《自然生物技术》 )23， 1534-1541(2005) 中有所公开。
例如， 可以通过以下方法， 将多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志 物的细胞 ： 在不存在血清的情况下， 在含激活素 A 的培养基中培养多能干细胞， 然后将细 胞与激活素 A 和另一浓度的血清一起培养。此方法的一个实例在 D’ Amour 等人的 Nature Biotechnology(《自然生物技术》 )， 2005 中有所公开。
例如， 可以通过以下方法， 将多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志 物的细胞 ： 在不存在血清的情况下， 在含激活素 A 和 Wnt 配体的培养基中培养多能干细胞， 然后移除 Wnt 配体， 再将细胞与激活素 A 和血清一起培养。此方法的一个实例在 Nature Biotechnology(《自然生物技术》 )24， 1392-1401(2006) 中有所公开。
在本发明的一个方面， 可以通过如下方法， 将多能干细胞分化成表达定形内胚层 谱系特征性标志物的细胞 ： 将多能干细胞平铺在涂布有细胞外基质的组织培养基质上， 然 后在含血清的第一培养基中将多能干细胞与激活素 A 和 Wnt 配体一起培养一段时间， 然后 在含更高浓度血清的第二培养基中将多能干细胞与激活素 A 一起培养约另一段时间。
上文公开的第一培养基中的血清浓度可以为约 0 至约 0.5％， 培养时间可以从约 一天至约三天。上文公开的第二培养基中的血清浓度可以为约 0.5％至约 2％， 培养时间可 以从约一天至约四天。
在本发明的一个替代实施例中， 可以通过如下方法， 将多能干细胞分化成表达定 形内胚层谱系特征性标志物的细胞 ： 将多能干细胞铺在涂布有细胞外基质的组织培养基质 上， 然后在含血清的第一培养基中将多能干细胞与激活素 A 和 Wnt 配体一起培养约一段时 间， 然后在含更高浓度血清的第二培养基中将多能干细胞与激活素 A 和 Wnt 配体一起培养 另一段时间。
上文公开的第一培养基中的血清浓度可以为约 0 至约 0.5％， 培养时间可以从约 一天至约三天。上文公开的第二培养基中的血清浓度可以为约 0.5％至约 2％， 培养时间可 以从约一天至约四天。
在一个实施例中， 本发明提供了分化表达定形内胚层谱系特征性标志物的多能干 细胞的方法， 该方法包括以下步骤 ：
a. 将多能干细胞平铺在涂布有细胞外基质的组织培养基质上， 以及
b. 将多能干细胞与激活素 A 和 Wnt 配体一起培养。
将多能干细胞与激活素 A 和 Wnt 配体一起培养可以在单一培养基中进行。单一培 养基可以是补充有血清的培养基。 或者， 单一培养基可以是化学成分确知培养基， 包括补充 有 B27 的培养基。或者， 将多能干细胞与激活素 A 和 Wnt 配体一起培养可以在不止一种培 养基中独立地或一起进行。在一个实施例中， 将多能干细胞与激活素 A 和 Wnt 配体一起培 养在两种培养基中进行。所述不止一种培养基可以是补充有血清的培养基。或者， 所述不 止一种培养基可以是化学成分确知培养基， 包括补充有 B27 的培养基。
细胞外基质
在本发明的一个方面， 多能干细胞在涂布有细胞外基质的组织培养基质上培养和 分化。细胞外基质可以是从小鼠恶性毒瘤细胞提取的可溶性基质膜制备物 ( 其以商品名 MATRIGEL 由 BD Biosciences 出售 )。或者， 细胞外基质可以是生长因子减少的 MATRIGEL。或者， 细胞外基质可以是纤粘蛋白。 在替代实施例中， 在用人血清涂布的组织培养基质上培 养和分化多能干细胞。
细胞外基质可以在涂布到组织培养基质之前进行稀释。稀释细胞外基质以及 涂布组织培养基质的合适方法的实例可见于 Kleinman， H.K.etal.， Biochemistry 25 ： 312(1986) 和 Hadley， M.A. 等人 .， J.Cell.Biol.101 ： 1511(1985)。
在一个实施例中， 细胞外基质为 MATRIGEL。 在一个实施例中， 使用按 1 ∶ 10 进行稀 释的 MATRIGEL 涂布组织培养基质。在替代实施例中， 使用按 1 ∶ 15 进行稀释的 MATRIGEL 涂布组织培养基质。在替代实施例中， 使用按 1 ∶ 30 进行稀释的 MATRIGEL 涂布组织培养 基质。在替代实施例中， 使用按 1 ∶ 60 进行稀释的 MATRIGEL 涂布组织培养基质。
在一个实施例中， 细胞外基质为生长因子减少的 MATRIGEL。 在一个实施例中， 使用 按 1 ∶ 10 进行稀释的生长因子减少的 MATRIGEL 涂布组织培养基质。 在替代实施例中， 使用 按 1 ∶ 15 进行稀释的生长因子减少的 MATRIGEL 涂布组织培养基质。在替代实施例中， 使 用按 1 ∶ 30 进行稀释的生长因子减少的 MATRIGEL 涂布组织培养基质。在替代实施例中， 使用按 1 ∶ 60 进行稀释的生长因子减少的 MATRIGEL 涂布组织培养基质。
使用单一培养基在细胞外基质上将多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征 性标志物的细胞
当使用单一培养基时， 其应含有足够低浓度的某些因子以允许多能干细胞分化 成定形内胚层， 这些因子例如为胰岛素和 IGF( 如 WO2006020919 中所公开 )。这可以通过 降低血清浓度来实现， 或作为另外一种选择， 可以通过使用无胰岛素和 IGF 的化学成分确 知培养基来实现。化学成分确知培养基的实例在 Wiles 等人 (Exp Cell Res.2/25/1999 ； 247(1) ： 241-8.) 中有所公开。
所述培养基可以具有在约 0％至约 10％范围内的血清浓度。在替代实施例中， 该 浓度可以在约 0％至约 5％的范围内。在替代实施例中， 该浓度可以在约 0％至约 2％的范 围内。在替代实施例中， 该浓度可以为约 2％。
或者， 培养基可以添加约 0.5％至约 1％的 B27。
与激活素 A 和 Wnt 配体一起培养的时间可以在约 1 天至约 7 天的范围内。在替代 实施例中， 所述培养时间可以在约 1 天至约 3 天的范围内。在替代实施例中， 所述培养时间 可以为约 3 天。
激活素 A 可以任何适于引起多能干细胞分化的浓度使用。 该浓度可以从约 1pg/ml 至约 100μg/ml。在替代实施例中， 该浓度可以为约 1pg/ml 至约 1μg/ml。在另一个替代 实施例中， 该浓度可以为约 1pg/ml 至约 100ng/ml。在另一个替代实施例中， 该浓度可以为 约 50ng/ml 至约 100ng/ml。在另一个替代实施例中， 该浓度可以为约 100ng/ml。
可优化 Wnt 配体的选择以提高分化过程的效率。 Wnt 配体可选自由下列组成的组 ： Wnt-1、 Wnt-3a、 Wnt-5a 和 Wnt-7a。在一个实施例中， Wnt 配体为 Wnt-1。在替代实施例中， Wnt 配体为 Wnt-3a。
Wnt 配体的浓度可以为约 1ng/ml 至约 1000ng/ml。在替代实施例中， 所述浓度可 以为约 10ng/ml 至约 100ng/ml。
单一培养基也可以包含 GSK-3B 抑制剂。GSK-3B 抑制剂可选自由下列组成的组 ： GSK-3B 抑制剂 IX 和 GSK-3B 抑制剂 XI。在一个实施例中， GSK-3B 抑制剂为 GSK-3B 抑制剂IX。本人没有看到 IX 和 XI 抑制剂的定义， 本人在原来的 WNT 专利申请中确实有这些。
当使用 GSK-3B 抑制剂培养多能干细胞时， GSK-3B 抑制剂的浓度可以从约 1nM 至 约 1000nM。在替代实施例中， 使用浓度为约 10nM 至约 100nM 的 GSK-3B 抑制剂培养多能干 细胞。
单一培养基也可以包含至少一种其他额外的因子， 其可以增强从多能干细胞形成 表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。或者， 所述至少一种其他额外的因子可以增强 通过本发明方法形成的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的增殖。 所述至少一种其 他额外的因子还可以增强通过本发明方法形成的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细 胞形成其他类型细胞的能力， 或提高任何其他额外的分化步骤的效率。
所述至少一种额外的因子可以是 ( 例如 ) 烟酰胺， TGF-β 家族的成员， 包括 TGF-β1、 2 和 3， 血清白蛋白， 成纤维细胞生长因子家族的成员， 血小板衍生生长因子 -AA 和 -BB， 富血小板血浆， 胰岛素生长因子 (IGF-I、 II)， 生长分化因子 (GDF-5、 -6、 -8、 -10、 11)， 胰高血糖素样肽 -I 和 II(GLP-I 和 II)， GLP-1 和 GLP-2 拟似体， Exendin-4， 视黄酸， 甲 状旁腺素， 胰岛素， 孕酮， 抑酶肽， 氢化可的松， 胆胺， β 巯基乙醇， 表皮生长因子 (EGF)， 胃 泌素 I 和 II， 铜螯合剂 ( 例如为三亚乙基五胺 )， 毛喉素， 丁酸钠， 激活素， β 细胞素， ITS， noggin， 神经突生长因子， nodal， 丙戊酸， 曲古霉素 A， 丁酸钠， 肝细胞生长因子 (HGF)， 鞘氨 醇 1， VEGF， MG132(EMD， CA)， N2 和 B27 添加剂 (Gibco， CA)， 甾体类生物碱 ( 例如为环巴胺 (EMD， CA))， 角化细胞生长因子 (KGF)， Dickkopf 蛋白质家族， 牛垂体提取物， 胰岛再生相关 蛋白 (INGAP)， 印度刺猬因子， 音猬因子， 蛋白酶体抑制剂， notch 通道抑制剂， 音猬因子抑 制剂， 或其组合。
所述至少一种其他额外的因子可以由条件培养基提供， 所述培养基得自胰腺细 胞系， 例如为 PANC-1(ATCC No ： CRL-1469)、 CAPAN-1(ATCC No ： HTB-79)、 BxPC-3(ATCC No ： CRL-1687)、 HPAF-II(ATCC No ： CRL-1997) ； 肝细胞系， 例如为 HepG2(ATCC No ： HTB-8065) ； 肠细胞系， 例如为 FHs 74(ATCC No ： CCL-241)， 以及原代或转化的内皮细胞。
使用两种培养基在细胞外基质上将多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征 性标志物的细胞
可以通过两种培养基将多能干细胞与激活素 A 和 Wnt 配体一起培养来实现多能干 细胞向定形内胚层谱系的细胞分化。因此， 可以按照如下方法完成多能干细胞的分化 ：
a. 将多能干细胞平铺在涂布有细胞外基质的组织培养基质上，
b. 将多能干细胞与激活素 A 和 Wnt 配体在第一培养基中一起培养， 以及
c. 将多能干细胞与激活素 A 在第二培养基中一起培养。
第一培养基可以包含低浓度的血清， 第二培养基可以包含比第一培养基浓度更高 的血清。
第二培养基可以包含 Wnt 配体。
第一培养基 ： 第一培养基应含有足够低浓度的某些因子以允许多能干细胞 分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞， 这些因子例如为胰岛素和 IGF( 如 WO2006020919 中所公开 )。这可以通过降低血清浓度来实现， 或作为另外一种选择， 可以 通过使用无胰岛素和 IGF 的化学成分确知培养基来实现。化学成分确知培养基的实例在 Wiles 等人 (Exp Cell Res.2/25/1999 ； 247(1) ： 241-8.) 中有所公开。在第一培养基中， 可存在比第二培养基中浓度更低的血清。增加第二培养基中的 血清浓度可增加细胞存活率， 或作为另外一种选择， 可增强细胞的增殖。 第一培养基的血清 浓度可以在约 0％至约 10％的范围内。或者， 第一培养基的血清浓度可以在约 0％至约 2％ 的范围内。或者， 第一培养基的血清浓度可以在约 0％至约 1％的范围内。或者， 第一培养 基的血清浓度可以为约 0.5％。
当使用至少两种培养基将多能干细胞与激活素 A 和 Wnt 配体一起培养时， 在第一 培养基中的培养时间可以在约 1 天至约 3 天的范围内。
可使用适于引起多能干细胞分化的任何浓度的激活素 A。该浓度可以从约 1pg/ml 至约 100μg/ml。在替代实施例中， 该浓度可以为约 1pg/ml 至约 1μg/ml。在另一个替代 实施例中， 该浓度可以为约 1pg/ml 至约 100ng/ml。在另一个替代实施例中， 该浓度可以为 约 50ng/ml 至约 100ng/ml。在另一个替代实施例中， 该浓度可以为约 100ng/ml。
可优化 Wnt 配体的选择以提高分化过程的效率。 Wnt 配体可选自由下列组成的组 ： Wnt-1、 Wnt-3a、 Wnt-5a 和 Wnt-7a。在一个实施例中， Wnt 配体为 Wnt-1。在替代实施例中， Wnt 配体为 Wnt-3a。
Wnt 配体的浓度可以为约 1ng/ml 至约 1000ng/ml。在替代实施例中， 该浓度可以 为约 10ng/ml 至约 100ng/ml。
第一培养基也可以含有 GSK-3B 抑制剂。 可将 GSK-3B 抑制剂添加到第一培养基中， 添加到第二培养基中， 或既添加到第一培养基中、 又添加到第二培养基中。
GSK-3B 抑制剂可选自由下列组成的组 ： GSK-3B 抑制剂 IX 和 GSK-3B 抑制剂 XI。 在 一个实施例中， GSK-3B 抑制剂为 GSK-3B 抑制剂 IX。
当将多能干细胞与 GSK-3B 抑制剂一起培养时， GSK-3B 抑制剂的浓度可以为从约 1nM 至约 1000nM。在替代实施例中， 将多能干细胞与约 10nM 至约 100nM 浓度的 GSK-3B 抑 制剂一起培养。
第一培养基也可以含有至少一种其他额外的因子， 其可增强从多能干细胞形成表 达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。或者， 所述至少一种其他额外的因子可增强通过 本发明方法形成的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的增殖。另外， 所述至少一种 其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞 形成其他类型细胞的能力， 或提高任何其他额外的分化步骤的效率。
所述至少一种额外的因子可以是 ( 例如 ) 烟酰胺， TGF-β 家族的成员， 包括 TGF-β1、 2 和 3， 血清白蛋白， 成纤维细胞生长因子家族的成员， 血小板衍生生长因子 -AA 和 -BB， 富血小板血浆， 胰岛素生长因子 (IGF-I、 II)， 生长分化因子 (GDF-5、 -6、 -8、 -10、 11)， 胰高血糖素样肽 -I 和 II(GLP-I 和 II)， GLP-1 和 GLP-2 拟似体， Exendin-4， 视黄酸， 甲 状旁腺素， 胰岛素， 孕酮， 抑酶肽， 氢化可的松， 胆胺， β 巯基乙醇， 表皮生长因子 (EGF)， 胃 泌素 I 和 II， 铜螯合剂 ( 例如为三亚乙基五胺 )， 毛喉素， 丁酸钠， 激活素， β 细胞素， ITS， noggin， 神经突生长因子， nodal， 丙戊酸， 曲古霉素 A， 丁酸钠， 肝细胞生长因子 (HGF)， 鞘氨 醇 1， VEGF， MG132(EMD， CA)， N2 和 B27 添加剂 (Gibco， CA)， 甾体类生物碱 ( 例如为环巴胺 (EMD， CA))， 角化细胞生长因子 (KGF)， Dickkopf 蛋白质家族， 牛垂体提取物， 胰岛再生相关 蛋白 (INGAP)， 印度刺猬因子， 音猬因子， 蛋白酶体抑制剂， notch 通道抑制剂， 音猬因子抑 制剂， 或其组合。所述至少一种其他额外的因子可以由条件培养基提供， 所述培养基得自胰腺细 胞系， 例如为 PANC-1(ATCC No ： CRL-1469)、 CAPAN-1(ATCC No ： HTB-79)、 BxPC-3(ATCC No ： CRL-1687)、 HPAF-II(ATCC No ： CRL-1997) ； 肝细胞系， 例如为 HepG2(ATCC No ： HTB-8065) ； 以及肠细胞系， 例如为 FHs 74(ATCC No ： CCL-241)。
第二培养基 ： 第二培养基应含有某些因子， 例如为胰岛素和 IGF( 如 WO2006020919 中所公开 )， 其浓度足以促进培养细胞的存活。这可以通过增加血清浓度来实现， 或作为另 外一种选择， 可以通过使用其中胰岛素和 IGF 的浓度相对第一培养基有所增加的化学成分 确知培养基来实现。 化学成分确知培养基的实例在 Wiles 等人 (Exp Cell Res.2/25/1999 ； 247(1) ： 241-8.) 中有所公开。
在具有更高浓度血清的第二培养基中， 第二培养基的血清浓度可以在约 0.5％至 约 10％的范围内。或者， 第二培养基的血清浓度可以在约 0.5％至约 5％的范围内。或者， 第二培养基的血清浓度可以在约 0.5％至约 2％的范围内。或者， 第二培养基的血清浓度可 以为约 2％。当将多能干细胞与第二培养基一起培养时， 培养时间可以为约 1 天至约 4 天。
与第一培养基类似， 可使用适于引起多能干细胞分化的任何浓度的激活素 A。 该浓 度可以为约 1pg/ml 至约 100μg/ml。在替代实施例中， 该浓度可以为约 1pg/ml 至约 1μg/ ml。在另一个替代实施例中， 该浓度可以为约 1pg/ml 至约 100ng/ml。在另一个替代实施 例中， 该浓度可以为约 50ng/ml 至约 100ng/ml。在另一个替代实施例中， 该浓度可以为约 100ng/ml。
Wnt 配体的浓度可以为约 1ng/ml 至约 1000ng/ml。在替代实施例中， 所述浓度可 以为约 10ng/ml 至约 100ng/ml。
Wnt 配体可选自由下列组成的组 ： Wnt-1、 Wnt-3a、 Wnt-5a 和 Wnt-7a。在一个实施 例中， Wnt 配体为 Wnt-1。在替代实施例中， Wnt 配体为 Wnt-3a。
第二培养基也可以包含 GSK-3B 抑制剂。 可将 GSK-3B 抑制剂添加到第一培养基中， 添加到第二培养基中， 或既添加到第一培养基中、 又添加到第二培养基中。
GSK-3B 抑制剂可选自由下列组成的组 ： GSK-3B 抑制剂 IX 和 GSK-3B 抑制剂 XI。 在 一个实施例中， GSK-3B 抑制剂为 GSK-3B 抑制剂 IX。
当将多能干细胞与 GSK-3B 抑制剂一起培养时， GSK-3B 抑制剂的浓度可以为从约 1nM 至约 1000nM。在替代实施例中， 将多能干细胞与浓度为约 10nM 至约 100nM 的 GSK-3B 抑制剂一起培养。
与第一培养基类似， 第二培养基也可以包含至少一种其他额外的因子， 其可以增 强从多能干细胞形成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。或者， 所述至少一种其他 额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的增 殖。另外， 所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达定形内胚层谱 系特征性标志物的细胞形成其他类型细胞的能力， 或提高任何其他额外的分化步骤的效 率。
所述至少一种额外的因子可以是 ( 例如 ) 烟酰胺， TGF-β 家族的成员， 包括 TGF-β1、 2 和 3， 血清白蛋白， 成纤维细胞生长因子家族的成员， 血小板衍生生长因子 -AA 和 -BB， 富血小板血浆， 胰岛素生长因子 (IGF-I、 II)， 生长分化因子 (GDF-5、 -6、 -8、 -10、 11)， 胰高血糖素样肽 -I 和 II(GLP-I 和 II)， GLP-1 和 GLP-2 拟似体， Exendin-4， 视黄酸， 甲状旁腺素， 胰岛素， 孕酮， 抑酶肽， 氢化可的松， 胆胺， β 巯基乙醇， 表皮生长因子 (EGF)， 胃 泌素 I 和 II， 铜螯合剂 ( 例如为三亚乙基五胺 )， 毛喉素， 丁酸钠， 激活素， β 细胞素， ITS， noggin， 神经突生长因子， nodal， 丙戊酸， 曲古霉素 A， 丁酸钠， 肝细胞生长因子 (HGF)， 鞘氨 醇 1， VEGF， MG132(EMD， CA)， N2 和 B27 添加剂 (Gibco， CA)， 甾体类生物碱 ( 例如为环巴胺 (EMD， CA))， 角化细胞生长因子 (KGF)， Dickkopf 蛋白质家族， 牛垂体提取物， 胰岛再生相关 蛋白 (INGAP)， 印度刺猬因子， 音猬因子， 蛋白酶体抑制剂， notch 通道抑制剂， 音猬因子抑 制剂， 或其组合。
所述至少一种其他额外的因子可以由条件培养基提供， 所述培养基得自胰腺细 胞系， 例如为 PANC-1(ATCC No ： CRL-1469)、 CAPAN-1(ATCC No ： HTB-79)、 BxPC-3(ATCC No ： CRL-1687)、 HPAF-II(ATCC No ： CRL-1997) ； 肝细胞系， 例如为 HepG2(ATCC No ： HTB-8065) ； 和肠细胞系， 例如为 FHs 74(ATCC No ： CCL-241)。
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的检测
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成可以通过在特定方案前后检测 标志物的存在情况来确定。多能干细胞通常不表达这些标志物。因此， 多能细胞的分化在 细胞开始表达这些标志物时被检测。
可以通过以下方法测定分化效率 ： 将处理过的细胞群暴露于特别地识别蛋白质标 志物的试剂 ( 例如抗体 ) 中， 所述蛋白质标志物由表达定形内胚层谱系特征性标志物的细 胞表达。
评估培养或分离细胞中蛋白质和核酸标志物表达的方法是本领域的标准。 这些方 法包括定量逆转录酶聚合酶链反应 (RT-PCR)、 Northern 印迹、 原位杂交 ( 参见如 Current Protocols in Molecular Biology(Ausubelet al.， eds.2001 supplement)( 《最新分子生 物学实验方法汇编》 ， Ausubel 等人编辑， 2001 补遗本 ))、 免疫分析 ( 例如切片材料的免疫 组化分析 )、 Western 印迹， 以及对于完好细胞中可触及的标志物的流式细胞计量术 (FACS) ( 参 见 如 Harlow and Lane， Using Antibodies ： ALaboratory Manual， New York ： Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998)(Harlow 和 Lane， 《使用抗体 ： 实验室手册》 ， New York ： ColdSpring Harbor Laboratory Press， 1998))。
可用于检测某些蛋白质标志物的抗体的实例列于表 IA 中。应该指出的是， 涉及由 表 IA 所列抗体识别的相同标志物的替代抗体是可用、 或易于开发的。这种替代抗体也可用 于评估根据本发明分离的细胞中的标志物的表达。
例如， 多能干细胞的特征是本领域技术人员熟知的， 并且其他特征有待继续辨 别。多能干细胞标志物包括 ( 例如 ) 下列中的一种或多种的表达 ： ABCG2、 cripto、 FoxD3、 Connexin43、 Connexin45、 Oct4、 Sox2、 Nanog、 hTERT、 UTF-1、 ZFP42、 SSEA-3、 SSEA-4、 Tra1-60、 Tra1-81。
在用本发明的方法处理多能干细胞后， 可以通过以下方法纯化分化的细胞 ： 将处 理过的细胞群暴露于特别地识别蛋白质标志物 ( 例如 CXCR4) 的试剂 ( 例如抗体 ) 中， 所述 蛋白质标志物由表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞表达。
表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成
可以通过本领域的任何方法或本发明提出的任何方法， 将表达定形内胚层谱系特 征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。例如， 可以根据 D’ Amour 等人在 Nature Biotechnology(《自然生物技术》 )24， 1392-1401(2006) 中公开的方法， 将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达 胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如， 还通过下述方法， 将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达 胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞 ： 用成纤维细胞生长因子和刺猬蛋白信号通道抑制 剂 KAAD- 环巴胺处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞， 然后移除含有成纤维细 胞生长因子和 KAAD- 环巴胺的培养基， 随后将细胞在含有视黄酸、 成纤维细胞生长因子和 KAAD- 环巴胺的培养基中进行培养。此方法的一个实例在 Nature Biotechnology(《自然 生物技术》 )24， 1392-1401(2006) 中有所公开。
在本发明的一个方面， 还通过下述方法， 将表达定形内胚层谱系特征性标志物的 细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞 ： 用视黄酸和至少一种成纤维细胞生 长因子处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞一段时间。 这段时间可以为约一天至 约六天。
在本发明的替代方面， 还通过下述方法， 将表达定形内胚层谱系特征性标志物的 细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞 ： 用视黄酸处理细胞一段时间。该段 时间可以为约一天至约三天。随后移除视黄酸， 并且用至少一种成纤维细胞生长因子处理 细胞另一段时间。该段时间可以为约一天至约三天。
在一个实施例中， 本发明提供了将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化 成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的方法， 该方法包括以下步骤 ：
a. 培养表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞， 以及
b. 用视黄酸和至少一种成纤维细胞生长因子处理表达定形内胚层谱系特征性标 志物的细胞。
任何表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞均适用于使用本方法分化成表达 胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。可以在化学成分确知培养基中处理细胞， 包括补充 有 B27 的培养基。或者， 可以在无血清培养基中处理细胞。或者， 可以在补充有血清的培养 基中处理细胞。
在一个实施例中， 用视黄酸和至少一种成纤维细胞生长因子处理表达定形内胚层 特征性标志物的细胞约一天至约六天。在一个实施例中， 用视黄酸和至少一种成纤维细胞 生长因子处理表达定形内胚层特征性标志物的细胞约六天。
所述至少一种成纤维细胞生长因子选自由 FGF-2、 FGF-4 和 FGF-10 组成的组。
任何表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞均适于使用本方法分化成表达胰 腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。可以在化学成分确知培养基中处理细胞， 包括补充有 B27 的培养基。或者， 可以在无血清培养基中处理细胞。或者， 可以在补充有血清的培养基 中处理细胞。
在替代实施例中， 本发明提供了将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化 成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的方法， 该方法包括以下步骤 ：
a. 培养表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，
b. 用视黄酸处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞， 以及
c. 移除视黄酸， 随后用至少一种成纤维细胞生长因子处理细胞。任何表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞均适于使用本方法分化成表达胰 腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。可以在化学成分确知培养基中处理细胞， 包括补充有 B27 的培养基。或者， 可以在无血清培养基中处理细胞。或者， 可以在补充有血清的培养基 中处理细胞。
在一个实施例中， 用视黄酸处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞约一天 至约三天。在一个实施例中， 用视黄酸处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞约三 天。在一个实施例中， 用至少一种成纤维细胞生长因子处理表达定形内胚层谱系特征性标 志物的细胞约一天至约三天。在一个实施例中， 用至少一种成纤维细胞生长因子处理表达 定形内胚层谱系特征性标志物的细胞约三天。
所述至少一种成纤维细胞生长因子选自由 FGF-2、 FGF-4 和 FGF-10 组成的组。
任何表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞均适于使用本方法分化成表达胰 腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。可以在化学成分确知培养基中处理细胞， 包括补充有 B27 的培养基。或者， 可以在无血清培养基中处理细胞。或者， 可以在补充有血清的培养基 中处理细胞。
在一个实施例中， 用视黄酸处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。 或者， 用 FGF-2 或 FGF-4 或 FGF-10 处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。在替代实施 例中， 用下列因子中的至少一种处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞 ： 视黄酸、 FGF-2、 FGF-4 或 FGF-10。在替代实施例中， 用视黄酸和下列成纤维细胞生长因子中的至少 一种处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞 ： FGF-2、 FGF-4 或 FGF-10。在一个实施 例中， 用视黄酸和 FGF-2 处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。在另一个实施例 中， 用视黄酸和 FGF-4 处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。在另一个实施例中， 用视黄酸和 FGF-10 处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
视黄酸可以约 1nM 至约 1mM 的浓度使用。在一个实施例中， 视黄酸以 1μM 的浓度 使用。
FGF-2 可以约 50pg/ml 至约 50μg/ml 的浓度使用。在一个实施例中， FGF-2 以 50ng/ml 的浓度使用。
FGF-4 可以约 50pg/ml 至约 50μg/ml 的浓度使用。在一个实施例中， FGF-4 以 50ng/ml 的浓度使用。
FGF-10 可以约 50pg/ml 至约 50μg/ml 的浓度使用。在一个实施例中， FGF-10 以 50ng/ml 的浓度使用。
可用至少一种其他额外的因子处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞， 该 因子可增强表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成。或者， 所述至少一种其他额 外的因子可增强通过本发明方法形成的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的增殖。 另外， 所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达胰腺内胚层谱系特 征性标志物的细胞形成其他类型细胞的能力， 或提高任何其他额外的分化步骤的效率。
所述至少一种额外的因子可以是 ( 例如 ) 烟酰胺， TGF-β 家族的成员， 包括 TGF-β1、 2 和 3， 血清白蛋白， 成纤维细胞生长因子家族的成员， 血小板衍生生长因子 -AA 和 -BB， 富血小板血浆， 胰岛素生长因子 (IGF-I、 II)， 生长分化因子 (GDF-5、 -6、 -8、 -10、 11)， 胰高血糖素样肽 -I 和 II(GLP-I 和 II)， GLP-1 和 GLP-2 拟似体， Exendin-4， 视黄酸， 甲状旁腺素， 胰岛素， 孕酮， 抑酶肽， 氢化可的松， 胆胺， β 巯基乙醇， 表皮生长因子 (EGF)， 胃 泌素 I 和 II， 铜螯合剂 ( 例如为三亚乙基五胺 )， 毛喉素， 丁酸钠， 激活素， β 细胞素， ITS， noggin， 神经突生长因子， nodal， 丙戊酸， 曲古霉素 A， 丁酸钠， 肝细胞生长因子 (HGF)， 鞘氨 醇 1， VEGF， MG132(EMD， CA)， N2 和 B27 添加剂 (Gibco， CA)， 甾体类生物碱 ( 例如为环巴胺 (EMD， CA))， 角化细胞生长因子 (KGF)， Dickkopf 蛋白质家族， 牛垂体提取物， 胰岛再生相关 蛋白 (INGAP)， 印度刺猬因子， 音猬因子， 蛋白酶体抑制剂， notch 通道抑制剂， 音猬因子抑 制剂， 或其组合。
所述至少一种其他额外的因子可以由条件培养基提供， 所述培养基得自胰腺细 胞系， 例如为 PANC-1(ATCC No ： CRL-1469)、 CAPAN-1(ATCC No ： HTB-79)、 BxPC-3(ATCC No ： CRL-1687)、 HPAF-II(ATCC No ： CRL-1997) ； 肝细胞系， 例如为 HepG2(ATCC No ： HTB-8065) ； 和肠细胞系， 例如为 FHs 74(ATCC No ： CCL-241)。
表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的检测
胰腺内胚层谱系特征性标志物是本领域技术人员熟知的， 并且其他的胰腺内胚层 谱系特征性标志物有待继续辨别。这些标志物可用于确认根据本发明处理的细胞已分化， 以获得胰腺内胚层谱系的特征性的性质。 胰腺内胚层谱系特异性标志物包括一种或多种转 录因子的表达， 这些因子例如为 Hlxb9、 PTF-1a、 PDX-1、 HNF-6、 HNF-1β。
可以通过将处理过的细胞群暴露于特别地识别蛋白质标志物 ( 由表达胰腺内胚 层谱系特征性标志物的细胞表达 ) 的试剂 ( 例如抗体 ) 来测定分化效率。
评估培养或分离细胞中蛋白质和核酸标志物表达的方法是本领域的标准。 这些方 法包括定量逆转录酶聚合酶链反应 (RT-PCR)、 Northern 印迹、 原位杂交 ( 参见如 Current Protocols in Molecular Biology(Ausubelet al.， eds.2001 supplement)( 《最新分子生 物学实验方法汇编》 ， Ausubel 等人编辑， 2001 补遗本 ))、 免疫分析 ( 例如切片材料的免疫 组化分析 )、 Western 印迹， 以及对于完好细胞中可触及的标志物的流式细胞计量术 (FACS) ( 参 见 如 Harlow and Lane， Using Antibodies ： ALaboratory Manual， New York ： Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998)(Harlow 和 Lane， 《使用抗体 ： 实验室手册》 ， New York ： ColdSpring Harbor Laboratory Press， 1998))。
可用于检测某些蛋白质标志物的抗体的实例列于表 IA 中。应该指出的是， 涉及由 表 IA 所列抗体识别的相同标志物的替代抗体是可用、 或易于开发的。这种替代抗体也可用 于评估根据本发明分离的细胞中的标志物的表达。
表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的形成 ：
可以通过本领域的任何方法或本发明公开的任何方法， 将表达胰腺内胚层谱系特 征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
例 如， 根 据 D’ Amour 等 人 在 Nature Biotechnology(《自 然 生 物 技 术》 )24， 1392-1401(2006) 中公开的方法， 将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达 胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
例如， 还通过下述方法， 将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表 达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞 ： 在含有 DAPT 和 exendin4 的培养基中培养表 达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞， 然后移除含有 DAPT 和 exendin 4 的培养基， 随 后在含有 exendin 1、 IGF-1 和 HGF 的培养基中培养细胞。此方法的一个实例在 NatureBiotechnology(《自然生物技术》 )24， 1392-1401(2006) 中有所公开。
例如， 还通过下述方法， 将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表 达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞 ： 在含有 exendin 4 的培养基中培养表达胰腺内 胚层谱系特征性标志物的细胞， 然后移除含有 exendin 4 的培养基， 随后在含有 exendin 1、 IGF-1 和 HGF 的 培 养 基 中 培 养 细 胞。 此 方 法 的 一 个 实 例 在 D’ Amour 等 人 的 Nature Biotechnology(《自然生物技术》 ， 2006 年 ) 中有所公开。
例如， 还通过下述方法， 将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表 达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞 ： 在含有 DAPT 和 exendin4 的培养基中培养表 达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。此方法的一个实例在 D’ Amour 等人的 Nature Biotechnology(《自然生物技术》 ， 2006 年 ) 中有所公开。
例如， 还通过下述方法， 将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成 表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞 ： 在 含 有 exendin 4 的 培 养 基 中 培 养 表 达 胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。此方法的一个实例在 D’ Amour 等人的 Nature Biotechnology(《自然生物技术》 ， 2006 年 ) 中有所公开。
在本发明的一个方面， 还通过下述方法， 将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的 细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞 ： 用抑制 Notch 信号通道的因子处理 表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。抑制 Notch 信号通道的因子可以是 Notch 细胞 外受体的拮抗剂。或者， 所述因子可抑制 Notch 受体的生物活性。或者， 所述因子可在细胞 内抑制 Notch 信号转导通道中的元件或者是其拮抗剂。可以在化学成分确知培养基中处理 细胞， 包括补充有 B27 的培养基。或者， 可以在无血清培养基中处理细胞。或者， 可在补充 有血清的培养基中处理细胞。
在一个实施例中， 抑制 Notch 信号通道的因子是 γ- 分泌酶抑制剂。 在一个实施例 中， γ- 分泌酶抑制剂为 1S 苄基 -4R-[1-(1S- 氨基甲酰基 -2- 苯乙基氨基甲酰基 )-1S-3- 甲 基丁基氨基甲酰基 ]-5 2R 羟基 -5 苯基戊基 ] 氨基甲酸叔丁酯， 也称为 L-685,458。
L-685,458 可以约 0.1μM 至约 100μM 的浓度使用。在一个实施例中， L-685,458 以约 90μM 的浓度使用。在一个实施例中， L-685,458 以约 80μM 的浓度使用。在一个实施 例中， L-685,458 以约 70μM 的浓度使用。在一个实施例中， L-685,458 以约 60μM 的浓度 使用。在一个实施例中， L-685,458 以约 50μM 的浓度使用。在一个实施例中， L-685,458 以约 40μM 的浓度使用。在一个实施例中， L-685,458 以约 30μM 的浓度使用。在一个实 施例中， L-685,458 以约 20μM 的浓度使用。在一个实施例中， L-685,458 以约 10μM 的浓 度使用。
在一个实施例中， 本发明提供了将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化 成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的方法， 该方法包括以下步骤 ：
a. 培养表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞， 以及
b. 用抑制 Notch 信号通道的因子处理细胞。
任何表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞均适于使用本方法分化成表达胰 腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。可以在化学成分确知培养基中处理细胞， 包括补充有 B27 的培养基。或者， 可以在无血清培养基中处理细胞。或者， 可以在补充有血清的培养基 中处理细胞。在一个实施例中， 抑制 Notch 信号通道的因子是 γ- 分泌酶抑制剂。在一个 实施例中， γ- 分泌酶抑制剂为 1S- 苄基 -4R-[1-(1S- 氨基甲酰基 -2- 苯乙基氨基甲酰 基 )-1S-3- 甲基丁基氨基甲酰基 ]-2R- 羟基 -5- 苯基戊基 ] 氨基甲酸叔丁酯， 也称为 L-685,458。
用抑制 Notch 信号通道的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞约 一天至约五天。或者， 用抑制 Notch 信号通道的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志 物的细胞约三天至约五天。或者， 用抑制 Notch 信号通道的因子处理表达胰腺内胚层谱系 特征性标志物的细胞约五天。
在一个实施例中， 抑制 Notch 信号通道的因子是 γ- 分泌酶抑制剂。在一个 实施例中， γ- 分泌酶抑制剂为 1S- 苄基 -4R-[1-(1S- 氨基甲酰基 -2- 苯乙基氨基甲酰 基 )-1S-3- 甲基丁基 氨基甲酰基 ]-2R- 羟基 -5- 苯基戊基 ] 氨基甲酸叔丁酯， 也称为 L-685,458。
L-685,458 可以约 0.1μM 至约 100μM 的浓度使用。在一个实施例中， L-685,458 以约 90μM 的浓度使用。在一个实施例中， L-685,458 以约 80μM 的浓度使用。在一个实施 例中， L-685,458 以约 70μM 的浓度使用。在一个实施例中， L-685,458 以约 60μM 的浓度 使用。在一个实施例中， L-685,458 以约 50μM 的浓度使用。在一个实施例中， L-685,458 以约 40μM 的浓度使用。在一个实施例中， L-685,458 以约 30μM 的浓度使用。在一个实 施例中， L-685,458 以约 20μM 的浓度使用。在一个实施例中， L-685,458 以约 10μM 的浓 度使用。
可用至少一种其他额外的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞， 该 因子可增强表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的形成。或者， 所述至少一种其他额 外的因子可增强通过本发明方法形成的表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的增殖。 另外， 所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达胰腺内分泌谱系特 征性标志物的细胞形成其他类型细胞的能力， 或提高任何其他额外的分化步骤的效率。
所述至少一种额外的因子可以是 ( 例如 ) 烟酰胺， TGF-β 家族的成员， 包括 TGF-β1、 2 和 3， 血清白蛋白， 成纤维细胞生长因子家族的成员， 血小板衍生生长因子 -AA 和 -BB， 富血小板血浆， 胰岛素生长因子 (IGF-I、 II)， 生长分化因子 (GDF-5、 -6、 -8、 -10、 11)， 胰高血糖素样肽 -I 和 II(GLP-I 和 II)， GLP-1 和 GLP-2 拟似体， Exendin-4， 视黄酸， 甲 状旁腺素， 胰岛素， 孕酮， 抑酶肽， 氢化可的松， 胆胺， β 巯基乙醇， 表皮生长因子 (EGF)， 胃 泌素 I 和 II， 铜螯合剂 ( 例如为三亚乙基五胺 )， 毛喉素， 丁酸钠， 激活素， β 细胞素， ITS， noggin， 神经突生长因子， nodal， 丙戊酸， 曲古霉素 A， 丁酸钠， 肝细胞生长因子 (HGF)， 鞘氨 醇 1， VEGF， MG132(EMD， CA)， N2 和 B27 添加剂 (Gibco， CA)， 甾体类生物碱 ( 例如为环巴胺 (EMD， CA))， 角化细胞生长因子 (KGF)， Dickkopf 蛋白质家族， 牛垂体提取物， 胰岛再生相关 蛋白 (INGAP)， 印度刺猬因子， 音猬因子， 蛋白酶体抑制剂， notch 通道抑制剂， 音猬因子抑 制剂， 或其组合。
所述至少一种其他额外的因子可以由条件培养基提供， 所述培养基得自胰腺细 胞系， 例如为 PANC-1(ATCC No ： CRL-1469)、 CAPAN-1(ATCC No ： HTB-79)、 BxPC-3(ATCC No ： CRL-1687)、 HPAF-II(ATCC No ： CRL-1997) ； 肝细胞系， 例如为 HepG2(ATCC No ： HTB-8065) ； 以及肠细胞系， 例如为 FHs 74(ATCC No ： CCL-241)。表达胰腺内公泌谱系特征性标志物的细胞的检测
胰腺内分泌谱系特征性标志物是本领域技术人员熟知的， 并且其他的胰腺内分泌 谱系特征性标志物有待继续辨别。这些标志物可用于确认根据本发明处理的细胞已分化， 以获得胰腺内分泌谱系的特征性的性质。 胰腺内分泌谱系特异性标志物包括一种或多种转 录因子的表达， 这些因子例如为 NGN-3、 NeuroD、 Islet-1。
β 细胞谱系特征性标志物是本领域技术人员熟知的， 并且其他的 β 细胞谱系 特征性标志物有待继续辨别。这些标志物可用于确认根据本发明处理的细胞已分化， 以 获得 β- 细胞谱系特征性的性质。除了别的以外， β 细胞谱系特异性特征包括一种或 多种转录因子的表达， 这些因子例如为 Pdx1( 胰腺和十二指肠同源盒基因 -1)、 Nkx2.2、 Nkx6.1、 Isl1、 Pax6、 Pax4、 NeuroD、 Hnf1b、 Hnf-6、 Hnf-3β 和 MafA。这些转录因子用于 鉴定内分泌细胞在本领域中已被广为接受。参见如 Edlund(Nature ReviewsGenetics 3 ： 524-632(2002))。
可通过将处理过的细胞群暴露于特别地识别蛋白质标志物 ( 由表达胰腺内分泌 谱系特征性标志物的细胞表达 ) 的试剂 ( 例如抗体 ) 来测定分化效率。 或者， 可以通过将处 理过的细胞群暴露于特别地识别以下蛋白质标志物的试剂 ( 例如抗体 ) 来测定分化效率， 该标志物由表达 β 细胞谱系特征性标志物的细胞表达。
评估培养或分离细胞中蛋白质和核酸标志物表达的方法是本领域的标准。 这些方 法包括定量逆转录酶聚合酶链反应 (RT-PCR)、 Northern 印迹、 原位杂交 ( 参见如 Current Protocols in Molecular Biology(Ausubelet al.， eds.2001 supplement)( 《最新分子生 物学实验方法汇编》 ， Ausubel 等人编辑， 2001 补遗本 ))、 免疫分析 ( 例如切片材料的免疫 组化分析 )、 Western 印迹， 以及对于完好细胞中可触及的标志物的流式细胞计量术 (FACS) ( 参 见 如 Harlow and Lane， Using Antibodies ： ALaboratory Manual， New York ： Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998)(Harlow 和 Lane， 《使用抗体 ： 实验室手册》 ， New York ： ColdSpring Harbor Laboratory Press， 1998))。
可用于检测某些蛋白质标志物的抗体的实例列于表 IA 中。应该指出的是， 涉及由 表 IA 所列抗体识别的相同标志物的替代抗体是可用、 或易于开发的。这种替代抗体也可用 于评估根据本发明分离的细胞中的标志物的表达。
治疗
在一个方面， 本发明提供了一种治疗患有 1 型糖尿病或具有发生 1 型糖尿病风险 的患者的方法。此方法涉及 ： 培养多能干细胞， 在体外将多能干细胞分化成 β- 细胞谱系， 以及将 β- 细胞谱系的细胞植入患者体内。
在另一个方面， 本发明提供了治疗患有 2 型糖尿病或具有发生 2 型糖尿病风险的 患者的方法。此方法涉及 ： 培养多能干细胞， 在体外将多能干细胞分化成 β- 细胞谱系， 以 及将 β- 细胞谱系的细胞植入患者体内。
在适当时， 还可使用促进移植细胞存活和发挥功能的药剂或生物活性剂治疗患 者。 除了别的以外， 这些药剂可以包括 ( 例如 ) 胰岛素， TGF-β 家族的成员 ( 包括 TGF-β1、 2 和 3)， 骨形态发生蛋白 (BMP-2、 -3、 -4、 -5、 -6、 -7、 -11、 -12 和 -13)， 成纤维细胞生长因 子 -1 和 -2， 血小板衍生生长因子 -AA 和 -BB， 富血小板血浆， 胰岛素生长因子 (IGF-I、 II)， 生长分化因子 (GDF-5、 -6、 -7、 -8、 -10、 -15)， 血管内皮细胞衍生生长因子 (VEGF)， 多效生长因子， 内皮素。其他的药物化合物可以包括 ( 例如 ) 烟酰胺、 胰高血糖素样肽 -I(GLP-1) 和 II、 GLP-1 和 2 拟似体、 Exendin-4、 视黄酸、 甲状旁腺激素、 MAPK 抑制剂， 例如已公布的美国 专利申请 2004/0209901 和已公布的美国专利申请 2004/0132729 中所公开的化合物。
在移植到受体中之前， 可将多能干细胞分化成胰岛素生成细胞。在一个具体实施 例中， 在移植到受体中之前， 将多能干细胞完全分化成 β- 细胞。或者， 可以未分化或部分 分化的状态将多能干细胞移植到受体中。进一步的分化可在受体中发生。
定形内胚层细胞或者胰腺内胚层细胞或者 b 细胞可作为分散细胞或形成集落， 通 过输注到肝门静脉中植入。 或者， 可以在生物相容性可降解的聚合物支承体、 多孔非降解的 器械中提供细胞， 或者可以包封细胞以避免宿主免疫应答。 可将细胞植入受体的合适部位。 植入部位包括 ( 例如 ) 肝脏、 天然胰腺、 肾包膜下空间、 网膜、 腹膜、 浆膜下空间、 肠、 胃或皮 下袋。
为了增强进一步的分化， 增强移植细胞的存活或活性， 可在给予细胞之前、 与之同 时或者之后给予其他因子， 例如生长因子、 抗氧化剂或抗炎剂。在某些实施例中， 利用生长 因子使给予的细胞在体内分化。 这些因子可由内源细胞分泌， 并原位暴露于所给予的细胞。 可通过本领域已知的内源性及外源性生长因子的任何组合来诱导移植细胞的分化。 移植中所用的细胞数量取决于多种不同的因素 ( 包括患者的症状以及对治疗的 应答 )， 并可由本领域的技术人员确定。
在一个方面， 本发明提供了治疗患有糖尿病或具有发生糖尿病风险的患者的方 法。本方法涉及 ： 培养多能干细胞， 在体外将培养的细胞分化成 β- 细胞谱系， 以及将细胞 并入三维支承体中。在植入患者体内之前， 可将细胞在体外维持在此支承体上。或者， 可将 含细胞的支承体直接植入患者体内， 而不进行另外的体外培养。支承体可任选地含有至少 一种药剂， 该药剂有助于移植细胞的存活及发挥功能。
适用于本发明的支承体材料包括可用于组织修复的组织模板、 导管、 屏障和容 器。具体地讲， 已在体外和体内用于重建或再生生物组织以及递送趋化剂以诱导组织生 长的泡沫、 海绵、 凝胶、 水凝胶、 织物和非织造结构形式的合成和天然材料适用于实施本发 明的方法。参见， 例如美国专利 5,770,417、 美国专利 6,022,743、 美国专利 5,567,612、 美 国 专 利 5,759,830、 美 国 专 利 6,626,950、 美 国 专 利 6,534,084、 美 国 专 利 6,306,424、 美国专利 6,365,149、 美国专利 6,599,323、 美国专利 6,656,488、 已公布的美国专利申请 2004/0062753 A1、 美国专利 4,557,264 和美国专利 6,333,029 中所公开的材料。
为了形成含有药剂的支承体， 可在形成支承体前将药剂与聚合物溶液混合。 或者， 可将药剂涂布在经加工的支承体上， 优选地在存在药物载体的情况下进行。 药剂可以液体、 细分固体或者任何其他合适的物理形式存在。或者， 可将赋形剂添加到支承体上以改变药 剂的释放速率。 在替代实施例中， 支承体含有至少一种为抗炎化合物的药物化合物， 例如美 国专利 6,509,369 中所公开的化合物。
支承体可含有至少一种为抗凋亡化合物的药物化合物， 例如美国专利 6,793,945 中所公开的化合物。
支 承 体 可 含 有 至 少 一 种 为 纤 维 变 性 抑 制 剂 的 药 物 化 合 物， 例如美国专利 6,331,298 中所公开的化合物。
支承体可含有至少一种能够增强血管生成的药物化合物， 例如已公布的美国专利
申请 2004/0220393 和已公布的美国专利申请 2004/0209901 中所公开的化合物。
支承体也可以含有至少一种为免疫抑制化合物的药物化合物， 例如已公布的美国 专利申请 2004/0171623 中所公开的化合物。
除 了 别 的 以 外， 支承体也可以含有至少一种为生长因子的药物化 合 物，例 如 TGF-β 家 族 的 成 员 ( 包 括 TGF-β1、 2 和 3)、骨 形 态 发 生 蛋 白 (BMP-2、 -3、 -4、 -5、 -6、 -7、 -11、 -12 和 -13)、 成纤维细胞生长因子 -1 和 -2、 血小板衍 生 生 长 因 子 -AA 和 -BB、 富 血 小 板 血 浆、 胰 岛 素 生 长 因 子 (IGF-I、 II)、 生长分化因子 (GDF-5、 -6、 -8、 -10、 -15)、 血管内皮细胞衍生生长因子 (VEGF)、 多效生长因子、 内皮素。 其他 药物化合物可包括 ( 例如 ) 烟酰胺、 缺氧诱导因子 1-α、 胰高血糖素样肽 -I(GLP-1)、 GLP-1 和 2 拟似体、 和 II、 Exendin-4、 nodal、 noggin、 NGF、 视黄酸、 甲状旁腺激素、 肌腱蛋白 C、 原弹 性蛋白、 凝血酶衍生肽、 导管素 / 抗菌肽 (Cathelicidin)、 防御素、 层粘连蛋白、 含粘附细胞 外基质蛋白的细胞结合域和肝素结合域的生物肽 ( 例如纤粘蛋白和玻连蛋白 )、 MAPK 抑制 剂 ( 例如为已公布的美国专利申请 2004/0209901 和已公布的美国专利申请 2004/0132729 中公开的化合物 )。
将本发明的细胞并入支架中可只需将细胞沉积在支架上即可。细胞可通过单纯 扩散进入支架 (J.Pediatr.Surg.23(1 Pt 2) ： 3-9(1988))。已经开发了若干其他方法来提 高细胞接种的效率。例如， 已把转瓶用于将软骨细胞接种到聚乙醇酸支架上 (Biotechnol. Prog.14(2) ： 193-202(1998))。另一种接种细胞的方法是使用离心作用， 其对接种细胞产 生的应力最小， 并可提高接种效率。例如， Yang 等人开发了一种细胞接种方法 (J.Biomed. Mater.Res.55(3) ： 379-86(2001))， 这种方法称为离心细胞固定法 (CCI)。
本发明通过下述实例进一步说明， 但并不受其限制。
实例
实例 1
人胚胎干细胞培养
人胚胎干细胞系 H1、 H7 和 H9 得自 WiCell Research Institute， Inc.， (Madison， WI) 并根据来源机构提供的说明进行培养。 简而言之， 在 ES 细胞培养基中， 在小鼠胚胎成纤 维细胞 (MEF) 饲养层上培养细胞， 所述培养基由补充有 20％的 Knockout 血清替代品、 100nM 的 MEM 非必需氨基酸、 0.5mM 的 β- 巯基乙醇、 2mM 的 L- 谷氨酰胺和 4ng/ml 人碱性成纤维 细胞生长因子 (bFGF)( 全部得自 Invitrogen/GIBCO) 的 DMEM/F12(Invitrogen/GIBCO) 组 成。衍生自 E13 至 13.5 小鼠胚胎的 MEF 细胞购自 Charles River。MEF 细胞在补充有 10％ 的 FBS(Hyclone)、 2mM 谷氨酰胺和 100mM 的 MEM 非必需氨基酸的 DMEM 培养基中扩增。用 10mg/ml 丝裂霉素 C(Sigma(St.Louis， MO)) 处理亚融汇态 MEF 细胞培养物 3 小时， 以阻止 4 2 细胞分裂， 然后用胰蛋白酶处理并以 2×10 /cm 的密度平铺在用 0.1％牛明胶涂布的培养 皿上。将二至四传代的 MEF 细胞用作饲养层。将铺在 MEF 细胞饲养层上的人胚胎干细胞在 润湿的组织培养箱 (37℃， 含 5％的 CO2 的大气 ) 中培养。当融汇时 ( 铺板后大约 5-7 天 )， 用 1mg/ml 胶原酶 IV 型 (Invitrogen/GIBCO) 处理人胚胎干细胞 5-10 分钟， 然后使用 5ml 吸量管轻轻刮去表面。以 900rpm 的转速将细胞旋转 5 分钟， 在新鲜培养基中将粒料重悬并 以 1 ∶ 3 至 1 ∶ 4 的细胞比率重新铺板。
实例 2定形内胚层的形成
检测激活素 A 对定形内胚层标志物表达的影响。将激活素 A(100ng/ml) 加到在小 鼠胚胎成纤维细胞上培养的人胚胎干细胞群中。在存在激活素 A 的情况下连续培养细胞， 并在所示时间收获细胞。通过 PCR( 图 1)、 FACS( 结果汇总于表 II) 以及免疫组织化学 ( 图 2) 检测定形内胚层标志物的表达水平。
激活素 A 在 H9 细胞系中引起 CXCR4、 GATA4、 HNF-3β、 Mixl1 和 Sox-17mRNA 表达 的时间依赖性增加 ( 图 1， 屏面 a)。也观察到前内胚层标志物 Cerberus、 Otx-1 和 Hex 基 因的显著上调 ( 图 1， 屏面 b)。在用激活素 A 处理后， 通过 FACS 分析观察到了 CXCR4 蛋白 的增加。在用激活素 A 处理后， 上皮细胞钙粘蛋白和神经性钙粘蛋白的表达并未改变 ( 表 IIA)。CXCR4 阳性细胞也为 C-kit、 EPCAM、 CD99 高度阳性， 并为 CD9 阴性。这些标志物的表 达模式在所检测的全部三种 hES 细胞系中一致 (H7 结果见表 IIB， H1 结果见表 IIC)。对用 激活素 A 处理了五天的细胞进行的免疫组织化学分析表明， 在经处理的培养中， 30-40％的 细胞为 Sox17 和 HNF-3β 阳性。同时， 几乎 100％的分化细胞仍为 Oct4 阳性 ( 图 2)。随着 多能性表面标志物表达的降低， 结合定形内胚层标志物表达的增加， 这些数据表明激活素 A 促进人胚胎干细胞向定形内胚层分化。
实例 3
胰腺内胚层的形成
将已知可诱导人胚胎干细胞分化成胰腺内胚层的生长因子加入细胞培养物中。 具 体地讲， 将已知可诱导胰腺内胚层形成的激活素 A、 bFGF 和视黄酸加入细胞培养物中。
在第一系列实验中， 将激活素 A 加入人胚胎干细胞群中， 这些干细胞在补充有 0％ 至 2 ％血清和激活素 A(100ng/ml) 的 DMEM/F12 中， 在小鼠胚胎成纤维细胞上培养长达七 天。在图 3 所示的时间点收获细胞， 并通过 PCR 分析所示基因的表达 ( 图 3、 图 4 和图 5)。 在图 3 中， PCR 分析表明用激活素处理的细胞表达了广谱的与内胚层发育相关的基因， 包括 GATA4( 图 3， 屏面 a)、 Sox-17( 图 3， 屏面 b)、 HNF-3β( 图 3， 屏面 c) 和 Mixl-1( 图 3， 屏面 d)。然而， 未观察到 Pdx1 基因的表达。在用激活素处理的 H7 细胞中观察到了相同的内胚 层谱系标志物表达模式 ( 图 6， 屏面 a 至屏面 f)。在此阶段， Oct4 的表达无明显降低。
激活素 A 引起了胚外内胚层标志物 Sox7( 图 4， 屏面 a) 和 AFP( 图 4， 屏面 b) 表达 的时间依赖性降低。激活素 A 降低了 Brachyury( 图 5， 屏面 a) 的表达， 但对神经元标志物 Zic1( 图 5， 屏面 b) 的表达没有影响。
综上所述， 这些数据表明， 对应于响应激活素 A 处理而形成定形内胚层， Sox-17、 Mixl1、 Gata4 和 HNF-3β 的表达增加， 连同前内胚层标志物 Otx1、 Cer1 和 Hex 基因上调。对 定形内胚层标志物的免疫组织化学分析表明， 这些基因的蛋白质表达也反映了 mRNA 表达 中观察到的趋势。HNF-3β、 Sox-17 和 GATA4 的表达水平在未处理的细胞中较低， 大约占全 部细胞的 10％至 20％。而用激活素 A(100ng/ml) 处理五天， 则将 HNF-3β、 Sox-17 和 GATA4 的表达增加到占所有细胞的大约 50％至 90％ ( 图 7)。
在第二系列实验中， 根据实例 1 所述的方法， 将人胚胎干细胞培养物在未分化的 培养条件下维持 2-3 天。在细胞融汇率达到 70-80％后， 将培养基变为添加了 100ng/ml 激 活素 A 且含 0 至 2％的 FBS 的 DMEM/F12， 并在激活素 A 存在下培养三天、 五天或七天。在此 时间间隔后， 用视黄酸和 bFGF 的组合进一步处理细胞五至六天， 如图 8 所示。收获培养物，并收集 mRNA 样品用于分析。也包括由单独地采用激活素 A 处理五天的细胞组成的对照培 养物。
基因表达分析表明， 单独的激活素 A 或视黄酸没有诱导 Pdx 1 的表达。对于在激 活素 A 存在下用视黄酸与 FGF 联合处理的细胞培养物， 也观察到类似结果 ( 图 8， 屏面 a)。 然而， 在不存在激活素 A 下用视黄酸和 FGF 处理细胞， 则更进一步增加了 Pdx1 的表达 ( 图 8， 屏面 a)。用激活素 A 处理细胞三天， 然后在不存在激活素 A 的情况下用 1μM 视黄酸和 50ng/ml 的 bFGF( 也称为 FGF-2) 处理 5 天， 结果显示 Pdx 1 的表达水平大约为单独地采用 激活素 A 处理 5 天的样品中观察到的表达水平高 3500 倍 ( 图 8， 屏面 a)。免疫细胞化学分 析显示， 所有细胞中的 5％至 20％表达了 Pdx1( 图 9)。
在 不 存 在 激 活 素 A 的 情 况 下 用 1μM 视 黄 酸 和 bFGF 处 理 也 导 致 了 GLUT-2 和 PTF1a( 图 8， 屏面 c) 表达的增加， 这在单独存在激活素 A 的情况下处理的细胞中未观察到。 在用 1mM 视黄酸和 50ng/ml 的 bFGF 处理的细胞中观察到了最大的 GLUT-2 和 PTF1a 表达增 加。综上所述， 这些数据表明， 在定形内胚层形成之后， 从细胞培养物中移除激活素 A 进一 步增强了胰腺内胚层的形成。
实例 4
胰腺内分泌细胞的形成
根据实例 1 所述的方法， 将人胚胎干细胞培养物在未分化的培养条件下维持 3-4 天。 在细胞融汇率达到 50-60％后， 将培养基变为含 100ng/ml 激活素 A 无 FBS 的 DMEM/F12， 然后在此培养基中将细胞培养一天。在此为期一天的培养后， 移除培养基， 换为含 0.5％的 FBS 和 100ng/ml 激活素 A 的培养基， 并且将细胞培养一天。 在此第二个为期一天的培养后， 移除培养基， 换为含 2％的 FBS 和 100ng/ml 激活素 A 的培养基， 并且将细胞培养一天。在此 时间间隔后， 如实例 2 中概述， 用视黄酸和 FGF 的组合处理细胞六天， 然后移除培养基， 换为 含 2％的 FBS 和 γ- 分泌酶抑制剂 L-685,458(10mM) 的 DMEM/F12 培养基培养三天。收获培 养物， 并收集 mRNA 样品用于分析。也包括由单独地采用激活素 A 处理五天的细胞组成的对 照培养物。
基因表达分析表明， 单独的激活素 A 或视黄酸与 FGF 的组合没有诱导 Ngn3 或胰 岛素的表达 ( 图 10， 屏面 a、 屏面 c)。在用 L-685,458 处理后也观察到了 Hes-1 表达的降 低。处理后第三天观察到了最大抑制 ( 图 10， 屏面 d)。然而， 用 L-685,458 处理细胞诱导 了 Ngn 3 的表达， 其水平大约比单独用激活素 A 或者用视黄酸和 FGF 的组合处理的样品中 观察到的水平高 50 倍。在用 γ- 分泌酶抑制剂处理的样品中观察到胰岛素表达增加了 70 倍。L-685,458 处理也进一步增加了 NeuroD1 的表达 ( 图 10， 屏面 a)。综上所述， 这些数据 表明， 在胰腺内胚层形成后， 从细胞培养物中移除视黄酸和 FGF 并加入 γ- 分泌酶抑制剂进 一步增强了内分泌细胞的形成。
实例 5
表达 Nkx2.2 的胰腺内分泌细胞的形成
将根据实例 2 中所述的方法获得的定形内胚层细胞进行如下处理 ： 在基础培养基 中将细胞培养 3 到 5 天， 所述培养基包含 ： DMEM/F12、 2％的 FBS、 50ng/ml 激活素 A、 50ng/ml 碱性 FGF 和 1μM 视黄酸。在单独地含 1mM 视黄酸或还含有 bFGF 的基础培养基中将细胞再 连续培养 3 到 5 天。在此过程的多个时间点从细胞中收获 RNA 样品， 以帮助评价细胞的定向分化。此外， 在整个分化方案中定期移除和补充培养基及因子。加入激活素 A 显示， 与无 激活素 A 的样品相比， Nkx2.2 的表达增加了约 35 倍。在培养的前三天， 对于用激活素 A 处 理的样品， 其 Pdx1 表达维持在类似于不含激活素 A 的样品的水平上 ( 图 11)。综上所述， 这 些数据表明， 向视黄酸和 bFGF 处理的前三天添加激活素 A 进一步增强了胰腺内分泌标志物 Nkx2.2 的表达。
实例 6
培养中胰腺内胚层细胞的传代和扩增
本实例证明， 本文衍生自人胚胎干细胞的胰腺内胚层细胞可在细胞培养中维持并 传代， 而不发生进一步分化。胰腺内胚层细胞在存在 100ng/ml 激活素 A 的情况下的低血 清 DMEM/F12 中分化。低血清 DMEM/F12 在第 1 天含 0％ (v/v) 胎牛血清 (FBS)， 在第二天含 0.5％ (v/v) 的 FBS， 在之后的每天含 2％ (v/v) 的 FBS。分化四天后， 在含有 2％ (v/v) 的 FBS、 1mM 视黄酸和 50ng/ml 的 bFGF 的低血清 DMEM/F12 中将细胞再培养共六天。分化六天 后， 将细胞在存在 50ng/ml 的 FGF10 的情况下含 2％ (v/v) 的 FBS 的低血清 DMEM/F12 中共 维持 6 天。在这六天的培养期中， 将胰腺内胚层细胞传代两次， 在这 6 天培养中细胞群体倍 增时间为约 36 至 48 小时。在培养的第 0 天、 第 3 天和第 6 天， 使用 Q-PCR 测定表征胰腺内 胚层的标志物基因的表达。图 12 示出在存在 50ng/ml 的 FGF10 的情况下， 生长的细胞在其 衍生后的六天培养期内维持了胰腺内胚层标志物 Pdx1 的表达。
实例 7
由人胚胎干细胞衍生肝细胞
根据实例 1 中所述的方法， 将人胚胎干细胞培养物在未分化的培养条件下维持 2-3 天。在细胞融汇率达到 70-80％后， 将培养基变为含 2％的 FBS 和 100ng/ml 激活素 A 的 DMEM/F12， 在存在激活素 A 的情况下将细胞培养七天。用激活素 A 处理 7 天后， 用图 13 所 示的条件将细胞处理五天。之后， 收获细胞， 并采集 mRNA 样品用于分析。
在不存在激活素 A 的情况下培养的细胞中， 观察到了 a- 甲胎蛋白 (AFP) 和白蛋白 的表达增加 ( 图 13， 屏面 a)。视黄酸和 FGF-4 使其进一步增加 ( 图 13， 屏面 b)。综上所述， 这些数据表明， 人胚胎干细胞的培养物在经过上述处理后能够表达肝细胞标志物。 此外， 人 胚胎干细胞能够分化成表达肝细胞特征性标志物的细胞。
实例 8
H9 人胚胎干细胞系的表征
通过评价由未分化的 ES 细胞表达的几种标志物的表达来监测 H9 细胞随时间而变 化的品质 (Carpenter 等人， 2001 ； Reubinoff 等人， 2000 ； Thomson 等人， 1998a)。H9 细胞 表现出阶段特异性胚胎抗原的交互表达 ( 表 III)。H9 细胞对 SSEA-3、 SSEA-4、 Tra-1-60、 Tra-1-81、 AP 和 CD9 抗原具有较强的免疫反应性， 所有这些抗原均为未分化的人胚胎干细 胞的特征性。
通过 RT-PCR 评估了胚胎干细胞特征性基因的表达， 例如 OCT3/4、 SOX-2、 UTF-1、 REX-1、 Cx43、 Cx45、 ABCG-2 和 TERT， 从而确定本实例中生长的细胞看起来类似于此前所述 的未分化胚胎干细胞 ( 表 III)。通过免疫染色确定 OCT3/4 蛋白的表达和碱性磷酸酶的活 性 (Chemicon)。大部分 H9 细胞为 OCT3/4 和 AP 阳性 ( 图 14)。综上所述， 这些结果表明 ： 本实例中所用的 H9 细胞在形态、 抗原免疫染色或多能标志物表达方面与其他实验室的记录相比并无明显差异。
实例 9
荧光激活细胞分选 (FACS) 分析
通过与 TrypLETM Express 溶液 (Invitrogen， CA) 一起培育五分钟， 将贴壁细胞从 培养板上移除。 将释放下来的细胞重悬于人胚胎干细胞培养基中， 通过离心作用回收， 然后 洗涤并将细胞重悬于染色缓冲液中， 该缓冲液由 PBS(Sigma， MO) 中的 2％的 BSA、 0.05％叠 氮化钠组成。 根据需要， 使用 0.1％的 γ- 球蛋白 (Sigma) 溶液封闭细胞的 Fc 受体 15 分钟。 5 将等分试样 ( 大约 10 个细胞 ) 要么与藻红蛋白 (PE) 标记的、 要么与别藻蓝素 (APC) 标记的 6 单克隆抗体 (5μl 抗体 /10 个细胞 ) 一起培育， 如表 I 所指出的那样， 要么与未标记的一抗 一起培育。 对照包括相应的同型匹配抗体、 未染色的细胞以及仅用标记的二抗染色的细胞。 所有与抗体一起进行的培育均在 4℃下进行 30 分钟， 之后用染色缓冲液洗涤细胞。将用未 标记的一抗染色的样品与 PE 或 APC 标记的二抗在 4℃下再培育 30 分钟。所用二抗的列表 参见表 I。粒化洗涤后的细胞， 并在染色缓冲液中重悬， 使用 FACSArray(BD Biosciences) 仪器鉴定细胞表面分子， 采集至少 10,000 个事件。
实例 10
免疫细胞化学
用 4％的多聚甲醛在室温下将接种在用 0.1％的 Matrigel(BD) 涂布的平皿上的细 胞固定 20 分钟。在室温下用 PBS/0.1 ％的 BSA/10％正常鸡血清 /0.5 ％的 Triton X-100 将固定细胞封闭 1 小时， 然后在 PBS/0.1％的 BSA/10％正常鸡血清中与一抗在 4℃下培育 过夜。一抗及其工作稀释度的列表示于表 IB 中。在 PBS/0.1％的 BSA 中洗涤三次后， 将在 PBS 中以 1 ∶ 100 稀释的荧光二抗与细胞在室温下培育一小时， 使之结合。对照样品包括 下列反应 ： 省略一抗， 或一抗被相同浓度的对应匹配阴性对照免疫球蛋白替代。漂洗染色 后的样品 ； 向每一个样品中加入一滴含二脒基 -2- 苯基吲哚二盐酸盐 (DAPI) 的 (Invitrogen， CA) 以复染细胞核并用作抗褪色剂。使用 Nikon Confocal Eclipse C-1 倒 置显微镜 (Nikon， Japan) 和 10-60X 物镜采集图像。
实例 11
未分化细胞的 PCR 分析
RNA 提取、 纯化和 cDNA 合成。RNA 样品通过以下方法纯化 ： 在存在含乙醇的高盐缓 冲液的情况下结合到硅胶膜 (Rneasy Mini Kit， Qiagen， CA)， 然后洗涤以移除杂质。使用 TURBO DNA-free 试剂盒 (Ambion， INC) 进一步纯化 RNA， 然后在水中洗提高质量 RNA。通过 分光光度计上的 A260 和 A280 读数评估收率和纯度。使用 ABI(ABI， CA) 大容量 cDNA 库试 剂盒由纯化的 RNA 制成 cDNA 拷贝。
实 时 PCR 扩 增 和 定 量 分 析。 除 非 另 外 指 明， 否 则 所 有 试 剂 均 购 自 Applied 7900 序列检测系统进行实时 PCR 反应。使用 (ABI， CA) 和 20ng 反转录 RNA， 使反应总体积为 20ml。每 探针以Biosystems。使用 ABI UNIVERSAL PCR MASTER一个 cDNA 样品以一式两份运行， 以修正移液误差。引物和 FAM 标记的200nM 的浓度使用。使用此前由 Applied Biosystem 开发的人甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶 (GAPDH) 内源性对照对每一个目标基因的表达水平进行归一化。引物和探针组列举如下 ：Oct3/4(Hs00742896)、 SOX-2(Hs00602736)、 UTF-1(Hs00747497)、 Rex-1(Hs00399279)、 Connexin 43(Hs00748445) 、 Connexin 45(Hs00271416) 、 ABCG2(Hs00184979) 、 Tert (Hs 00162669) 、 HNF 3b(Hs00232764) 、 GATA-4(Hs00171403) 、 Mixl1(Hs00430824) 、 Sox7(Hs00846731)、 AFP(Hs00173490)、 Brachyury(Hs00610080)、 GSC(Hs00418279_m1)、 Pdx-1(Hs00426216)、 PTF1a(Hs00603586)、 Ngn3(Hs00360700)、 NeuroD1(Hs00159598)、 胰岛 素 (Hs00355773) 和 Glu2(Hs00165775)。使用 PRIMERS 程序 (ABI， CA) 设计 Sox17 引物， 序 列如下， Sox17 ： TGGCGCAGCAGATACCA( 序列标识号 1)、 AGCGCCTTCCACGACTTG( 序列标识号 2) 和 CCAGCATCTTGCTCAACTCGGCG( 序列标识号 3)。先在 50℃下培育 2 分钟， 然后在 95℃下培 育 10 分钟， 样品按以下两个阶段循环 40 轮 ： 变性步骤， 95℃下 15 秒 ； 退火 / 延伸步骤， 60℃ 下 1 分钟。使用 7000 序列检测系统软件进行数据分析。对于每一组引物 / 探 针， Ct 值确定为荧光强度达到扩增指数区中间特定值时的循环数。使用比较性 Ct 法计算相 对基因表达水平。简而言之， 对于每一个 cDNA 样品， 从关注的基因的 Ct 值减去内源对照的 -ΔCt Ct 值， 得到 ΔCt 值 (DCt)。根据 2 计算归一化的目标量， 假定扩增率为 100％。最终的数 据相对于校准样品进行表示。
实例 12 核型分析
通过标准 G 显带核型分析确定 H9 细胞的核型。评价总共 100 个中期染色体涂片 (Applied Genetics Laboratories， Inc.)。在分析的 100 个细胞中未发现染色体畸变。细 胞遗传学分析表明， 细胞具有正常数量的常染色体， 染色体数为 46。图 15 示出得自人胚胎 干细胞系 H9 的典型核型。
实例 13
在涂布有细胞外基质的组织培养基质上的人胚胎干细胞培养
人胚胎干细胞系 H1、 H7 和 H9 得自 WiCell Research Institute， Inc.， (Madison， WI)， 并根据来源机构所提供的说明进行培养。简而言之， 在 ES 细胞培养基中， 在小鼠胚胎 成纤维细胞 (MEF) 饲养层上培养细胞， 所述培养基由补充有 20％的 Knockout 血清替代品、 100nM 的 MEM 非必需氨基酸、 0.5mM 的 β 巯基乙醇、 2mM 的 L- 谷氨酰胺以及 4ng/ml 人碱性成 纤维细胞生长因子 (bFGF) 的 DMEM/F12(Invitrogen/GIBCO) 组成。 衍生自 E13 至 13.5 小鼠 胚胎的 MEF 细胞购自 Charles River。MEF 细胞在补充有 10％的 FBS(Hyclone)、 2mM 谷氨酰 胺和 100mM 的 MEM 非必需氨基酸的 DMEM 培养基中扩增。 用 10μg/ml 丝裂霉素 C(Sigma(St. Louis， MO)) 处理亚融汇的 MEF 细胞培养物 3 小时， 以阻止细胞分裂， 然后用胰蛋白酶处理， 并以 2×104/cm2 的密度铺在 0.1％牛明胶涂布的平皿上。 使用二至四传代的 MEF 细胞作为 饲养层。 将铺在 MEF 细胞饲养层上的人胚胎干细胞在潮湿的组织培养箱 (37℃， 含 5％的 CO2 的大气 ) 中培养。当融汇时 ( 铺板后大约 5 至 7 天 )， 用 1mg/ml 胶原酶 IV 型 (Invitrogen/ GIBCO) 处理人胚胎干细胞 5 至 10 分钟， 然后用 5ml 玻璃吸量管轻轻刮下表面。将细胞以 900rpm 的转速离心处理 5 分钟， 重悬粒料， 以 1 ∶ 3 至 1 ∶ 4 的细胞比率重新铺在涂布有 TM 生长因子减少的 MATRIGEL (BD Biosciences)(1 ∶ 30 的稀释液 ) 的平板上。然后， 在补 充有 8ng/ml 的 bFGF 的 MEF 条件培养基中培养细胞， 并在 MATRI GEL 涂布的平板上用胶原 TM 酶传代至少五传代。在 MATRIGEL 上培养的细胞用胶原酶 IV(Invitrogen/GIBCO)、 分散酶
(BDBiosciences) 或 Liberase 酶 (Roche， IN) 进行常规地传代。实例 14
在涂布有细胞外基质的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内胚层分化
如此前在 Nature Biotechnology(《自然生物技术》 )23， 1534-1541(2005 年 12 月 ) 中所述进行胚胎干细胞向定形内胚层的分化。简而言之， 将大约 60 至 70％融汇率的 H9 培养物暴露于补充有 0.5 ％的 FBS 和 100ng/ml 激活素 A 的 DMEM ： /F12 培养基两天， 然 后用补充有 2 ％的 FBS 和 100ng/ml 激活素 A(AA) 的 DMEM/F12 培养基再处理三天。H9 细 胞在用生长因子减少的 MATRIGEL(1 ∶ 30 至 1 ∶ 10 的稀释液 ) 涂布的平板上， 或在常规 MATRIGEL(1 ∶ 30 至 1 ∶ 10 的稀释液 ) 上培养。将平板用 MATRIGEL 在室温下涂布 1 小时。
在第 5 天， 通过 FACS 分析培养物的 CXCR4、 上皮细胞钙粘蛋白、 CD9 和神经性钙粘 蛋白表达， 通过实时 PCR 分析 SOX-17、 SOX-7、 α- 甲胎蛋白 (AFP)、 CXCR4、 Brychyury(Bry)、 gooscecoid(GSC)、 HNF-3β 和 GATA4。AFP 和 SOX-7 被认为是内脏内胚层标志物， 而 GATA4、 HNF-3β 和 SOX-17 则代表定形内胚层标志物， GSC、 Bry 和 CXCR4 代表原条标志物。 图 17 示出 FACS 检测的 CXCR4 表达。与较低浓度的 MATRIGEL 相比， 对于在用 1 ∶ 10 稀释的 MATRIGEL 涂布的平板上培养的细胞， 其 CXCR4 表达存在明显的增加。此外， 与常规 MATRIGEL 相比， 生 长因子减少的 MATRIGEL 在定形内胚层细胞形成上并非那么有效。
图 18 示出实时 PCR 的结果， 其证实了与 1 ∶ 30 稀释的 MATRIGEL 上培养的细胞相 比， 在用 1 ∶ 10 稀释的 MATRIGEL 涂布的平板上培养的细胞表现出定形内胚层标志物的明 显上调。
实例 15
在形成定形内胚层后胚胎干细胞中基因表达改变的微阵列分析
使用 RNeasy 微量提取试剂盒 (Qiagen) 从下列人胚胎干细胞培养物中分离总 RNA ： H9P83 细胞在 MATRIGEL 涂布的平板上培养， 并且暴露于补充有 0.5 ％的 FBS 和 100ng/ml 激活素 A 的 DMEM/F12 培养基两天， 然后用补充有 2％的 FBS 和 100ng/ml 激活素 A(AA) 的 DMEM/F12 培养基再处理三天 ； H9P44 细胞在 MEF 上培养， 并且暴露于补充有 0.5％的 FBS 和 100ng/ml 激活素 A 的 DMEM/F12 培养基两天， 然后用补充有 2％的 FBS 和 100ng/ml 激活素 A 的 DMEM/F12 培养基再处理三天。每一个组的对照包括铺在 MATRIGEL 涂布的平皿上并在 MEF 条件培养基中培养的细胞， 或铺在 MEF 上并在 ES 培养基中培养的细胞。
根据 Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array 进行样品制备、 杂交和图 像分析。在归一化和对数转换后， 使用 软件 (MA) 和 GENESIFTER(VizXLabs， WA) 进行数据分析。使用 Pearson 相关系数比较每一个处理内以及不同处理间的差异。在不同 处理之间基因表达谱的差异连同细胞系之间的相关系数在图 19 中示出。使用方差分析和 F 检验评价样品之间基因表达的显著性差异， 其具有≤ 0.05 的调整后 P 值 (Benjamini 和 Hochberg 校正 )。分析中仅包括当前调用的基因。表 IV 列出了多个样品之间差异至少达 5 倍的差异表达基因。列出了显著表达的基因的归一化强度值连同每一个基因的均值标准 差 (SEM)。
实例 16
在用 MATRIGELTM 涂布的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内胚层的分 化
如此前在 Nature Biotechnology(《自然生物技术》 )23， 1534-1541(2005 年 12月 ) 中所述进行胚胎干细胞向定形内胚层的分化。简而言之， 将接种于生长因子减少的 TM MATRIGEL (1 ∶ 30 的稀释液 ) 培养基上的 H9、 H7 或 H1 细胞在约 60％至 70％融汇率时暴 露于补充有 0.5％的 FBS 和 100ng/ml 激活素 A(R&D Systems， MN) 的 DMEM/F12 培养基两天， 然后用补充有 2％的 FBS 和 100ng/ml 激活素 A(AA) 的 DMEM/F12 培养基再处理三天。在所 有后续的实例中， 除非另外指明， 否则此处理方案均称为定形内胚层 (DE) 方案。同时， 将在 MEF 饲养层上培养的 H9、 H7 或 H1 细胞也暴露于上述同一 DE 方案。
在第 5 天， 通过 FACS 分析培养物的 CXCR4、 上皮细胞钙粘蛋白、 CD9、 CD99 和神经 性钙粘蛋白 (CD56) 的表达， 通过实时 PCR 分析 SOX-17、 SOX-7、 α- 甲胎蛋白 (AFP)、 CXCR4、 Brychyury(Bry)、 gooscecoid(GSC)、 HNF-3β 和 GATA4。AFP 和 SOX-7 被认为是内脏内胚层 标志物， 而 GATA4、 HNF-3β 和 SOX-17 则代表定形内胚层标志物， GSC、 Bry 和 CXCR4 代表原 条标志物。
将 H 细胞系在小鼠饲养细胞上培养并暴露于 DE 方案， 通过 FACS 发现稳定表达了 DE 标志物， 并表达了 CXCR4( 图 20)。在用 DE 方案处理后， 上皮细胞钙粘蛋白表达存在显著 的降低。最后， CXCR4+ 细胞群也为 CD117 染色阳性。图 21 示出相比于未处理的 H7( 图 21， 屏面 a) 和 H9 细胞 ( 图 21， 屏面 b)， 定形内胚层标志物显著上调。
不同于在 MEF 饲养层上培养的 H 细胞系， 在 MATRIGELTM(1 ∶ 30 的稀释液 ) 上培养 并用定形内胚层方案处理的 H 细胞系未表现出定形内胚层标志物的稳定表达。具体地讲， 通过 FACS 和实时 PCR 分析发现， 与在小鼠胚胎成纤维细胞上培养的细胞相比， 在 MATRIGELTM 上培养的细胞的 CXCR4 表达明显更低。定形内胚层标志物的表达遵循一般的反应模式， 即 H1 大于 H9 大于 H7( 图 22 和图 23)。与 H7 和 H9 细胞系相比， H1 细胞从图 22 示出明显的 CXCR4 表达增加。应注意在所有的情况中， 与在小鼠胚胎成纤维细胞上培养的细胞相比， 在 TM MATRIGEL (1 ∶ 30 的稀释液 ) 上培养的细胞的 CXCR4 表达较低。图 23( 屏面 a-c) 示出实 时 PCR 结果， 其显示在 H7( 图 23， 屏面 a) 和 H9( 图 23， 屏面 b) 细胞系中定形内胚层标志物 的上调存在适度的提高。然而， 与 H7 和 H9 细胞系相比， H1( 图 23， 屏面 c) 细胞系示出定形 内胚层标志物更稳定的上调。
实例 17
在用 MATRIGELTM 涂布的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内胚层 (DE) 的分化 -Wnt 配体的作用
将 H7P44 和 H9P46 胚胎干细胞在 MATRIGELTM(1 ∶ 10 的稀释液 ) 涂布的平皿上培 养， 并暴露于补充有 0.5％的 FBS 和 100ng/ml 激活素 A(R&DSystems， MN) 的 DMEM/F12 培养 基两天， 然后用补充有 2％的 FBS 和 100ng/ml 激活素 A(AA) 的 DMEM/F12 培养基再处理三 天。在一些培养中， 在整个五天处理期内补充有 20ng/ml 的 Wnt-3a( 目录 #1324-WN-002， R&DSystems， MN)、 20ng/ml 的 Wnt-5a( 目 录 #654-WN-010， R&D Systems， MN)、 25ng/ml 的 Wnt-7a( 目录 #3008-WN-025， R&D Systems， MN) 或 25ng/ml 的 Wnt-5b( 目录 #3006-WN-025， R&D Systems， MN)。图 24 示出 H9P46 定形内胚层培养物在高浓度 (a)AA 或 (b)AA+20ng/ml 的 Wnt-3a 的情况下的相差图。图 25 示出对于在 MATRIGELTM(1 ∶ 30 的稀释液 ) 上培养并 暴露于 DE 方案 +Wnt-3a( 图 25， 屏面 b 和屏面 d) 和 -Wnt-3a( 图 25， 屏面 a 和屏面 c) 的 H7P44 和 H9P46 细胞系在第 5 天通过 FACS 检测的 CXCR4 表达。与用低血清加高浓度 AA 处 理的 DE 培养物相比， DE 培养物中存在 Wnt-3a 导致了 CXCR4(CD184) 的稳定表达。图 26 示出用低血清 +AA±Wnt 配体处理的 a)H7 和 b)H9 培养物的实时 PCR 数据。对于两 H 细胞系， 添加 WNT-3a 导致了定形内胚层标志物的显著上调。相比之下， Wnt5a、 Wnt-5b 和 Wnt-7a 对 定形内胚层标志物的表达影响甚微。
实例 18
在用 MATRIGELTM 涂布的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内胚层的分 化： Wnt-3a 的有效剂量
将 H9P46 胚胎干细胞在 MATRIGELTM(1 ∶ 10 的稀释液 ) 涂布的平皿上培养， 并暴露 于补充有 0.5％的 FBS、 100ng/ml 激活素 A(AA) 和 10-50ng/ml 的 Wnt-3a(R&D Systems， MN) 的 DMEM/F12 培养基两天， 然后用补充有 2％的 FBS、 100ng/ml 激活素 A(AA) 和 10-50ng/ml 的 Wnt-3a 的 DMEM/F12 培养基再处理三天。对照培养物不用 Wnt-3a 处理。图 27 屏面示出 a) 在不存在 Wnt-3a、 b) 含 10ng/ml 的 Wnt-3a、 c) 含 20ng/ml 的 Wnt-3a 和 d) 含 50ng/ml 的 Wnt-3a 的情况下在第 5 天通过 FACS 检测的 CXCR4 表达。在不存在 Wnt-3a 的情况下， CXCR4 的表达非常低。相比之下， 添加 10-50ng/ml 的 Wnt-3a 明显增加了 CXCR4 阳性细胞的数量。 此外， 添加 10ng/ml 的 Wnt-3a 与添加 50ng/ml 的 Wnt-3a 一样有效。实时 PCR 结果 ( 图 28， 屏面 a) 也证实了这一发现。
在一项单独的研究中， 将 H9p52 细胞平铺在 1 ∶ 30 低生长因子 MATRIGELTM 上。在 DE 方案的最初两天， 使用了一系列的 Wnt3A 剂量 ： 10ng/ml、 5ng/ml 和 1ng/ml。图 28 屏面 b 示出处理 5 天后 DE 标志物的 PCR 分析。实验结束时的细胞数在图 28 屏面 c 中示出。这表 明在使用高剂量 Wnt-3a 时细胞发生增殖。将 Wnt3a 处理延长到 5 天 (5D)， 通过 PCR 分析发 现其对 DE 标志物几乎没有影响， 并且未显著增加细胞数 ( 图 28， 屏面 c)。这些数据表明， 用 10ng/ml 的 Wnt3a 处理两天即足以达到最优的细胞扩增和定形内胚层分化。
实例 19
在用 MATRIGELTM 涂布的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内胚层 (DE) 的分化 -GSK-3B 抑制剂的作用
为了确认 Wnt-3a 是通过 Wnt 通道发挥作用的， 使用 GSK-3 抑制剂活化 Wnt 的下游 靶标， 例如 β- 连锁蛋白。 将 H9P46-P48 胚胎干细胞在 MATRIGELTM 涂布 (1 ∶ 10 的稀释液 ) 的 平皿上培养， 并暴露于补充有 0.5％的 FBS、 100ng/ml 激活素 -A(AA) 和 10-1000nM 的 GSK-3B 抑制剂 IX( 目录 #361550， Calbiochem， CA) 的 DMEM/F12 培养基两天， 然后用补充有 2％的 FBS、 100ng/ml 激活素 A(AA) 和 0-1000nM 的 GSK-3B 抑制剂 IX( 目录 #361550， Calbiochem， CA) 的 DMEM/F12 培养基再处理三天。 用低血清加高剂量激活素 A±Wnt-3a 处理对照培养物。 图 29， 屏面 a 示出在以下情况下于第 5 天通过 FACS 检测的 CXCR4 表达 ： 无 Wnt-3a 或 GSK-3B 抑制剂 ； b)+20ng/ml 的 Wnt-3a ； c)+1000nM 的 GSK-3B 抑制剂 IX ； d)+500nM 的 GSK-3B 抑制 剂 IX ； e)+100nM 的 GSK-3B 抑制剂 IX ； f)+10nM 的 GSK-3B 抑制剂 IX ； g)+100nM 的 GSK-3B 抑 制剂 IX， 第 1-2 天 ； 以及 h)+10nM 的 GSK-3B 抑制剂 IX， 第 1-2 天。
在不存在 Wnt-3a 的情况下或存在 10nM 的 GSK-3B 抑制剂时， CXCR4 的表达极低。 相比之下， 添加 20ng/ml 的 Wnt-3a 或 100-1000nM 的 GSK-3B 抑制剂明显增加了 CXCR4 阳性 细胞数。此外， 在第 1-2 天添加 100nM 的 GSK-3B 抑制剂与整个五天都添加 100nM 的 GSK-3B 抑制剂一样有效。图 30 示出 ( 屏面 a)H9P48 细胞和 ( 屏面 b)H9P46 细胞的定形内胚层标 志物基因表达。图 16 示出本发明中分化方案的概要， 其中在无饲养层体系中将胚胎干细胞分化 成定形内胚层。
实例 20
在用 MATRIGELTM 涂布的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内胚层 (DE) 的分化 - 在存在 GSK-3B 抑制剂或 Wnt-3A 的情况下激活素 A 的有效剂量
将 H9P49 和 H1P46 胚胎干细胞在 MATRIGELTM 涂布 (1 ∶ 10 的稀释液 ) 的平皿上 培养， 并暴露于补充有 0.5％的 FBS、 10-100ng/ml 激活素 A(AA) 和 100nM 的 GSK-3B 抑制剂 IX( 目录 #361550， Calbiochem， CA) 或 20ng/ml 的 Wnt-3a 的 DMEM/F12 培养基两天， 然后用 补充有 2％的 FBS、 10-100ng/ml 激活素 A(AA) 的 DMEM/F12 培养基再处理三天。用低血清加 100ng/ml 激活素 A 处理对照培养物。图 31 示出在以下处理情况下于第 5 天通过 FACS 检 测的 H9P49 和 H1P46 的 CXCR4 表达 ： a) 在整个五天 ±10ng/ml 激活素 A， 以及在最初两天使 用 20ng/ml 的 Wnt-3a ； b) 在整个五天 ±100ng/ml 激活素 A， 以及在最初两天使用 20ng/ml 的 Wnt-3a ； c) 在整个五天 ±100ng/ml 激活素 A， 以及在最初两天使用 100nM 的 GSK-3B 抑 制剂 IX ； d) 在整个五天 ±10ng/ml 激活素 A， 以及在最初两天使用 100nM 的 GSK-3B 抑制剂 IX ； e) 在整个五天 ±100ng/ml 激活素 A， 以及在最初两天使用 20ng/ml 的 Wnt-3a ； f) 在整 个五天 ±10ng/ml 激活素 A， 以及在最初两天使用 20ng/ml 的 Wnt-3a。图 31 的屏面 a-d 针 对 H9P49 细胞， 而屏面 e-f 则针对 H1P46 细胞。图 32 示出用 10、 50 或 100ng/ml 激活素 A 加 20ng/ml 的 Wnt-3a 处理的 H9P49 培养物的定形内胚层标志物的基因表达 ： 屏面 a ： AFP、 Bry、 CXCR4、 GSC、 HNF-3B 和 POU5F(Oct-4) 的表达 ； 以及屏面 b ： SOX-17 和 GATA4 的表达。这并非 合计， 可能有附图数字问题或为剪切和粘贴问题。看来可通过使用 50ng/ml 的 AA+20ng/ml 的 Wnt-3a 或 100nM 的 GSK-3B 抑制剂 IX 获得定形内胚层标志物的稳定表达。较低剂量的 激活素 A 导致了胚外内胚层的形成。
实例 21
在用 MATRIGELTM 涂布的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内胚层 (DE) 的分化 -Wnt-3a 和 GSK-3B 抑制剂的组合
将 H9P53 胚胎干细胞在 MATRIGELTM 涂布 (1 ∶ 30 的稀释液 ) 的平皿上培养， 并 暴露于补充有 0.5 ％的 FBS、 100ng/ml 激活素 A(AA) 和 100nM 的 GSK-3B 抑制剂 IX( 目录 #361550， Calbiochem， CA)±20ng/ml 的 Wnt-3a 的 DMEM/F12 培养基两天， 然后用补充有 2％ 的 FBS、 10-100ng/ml 激活素 A(AA) 的 DMEM/F12 培养基再处理三天。同时， 用 25ng/ml 的 BMP-4( 目录 #314-BP-010， R&D Systems， MN)±20ng/ml 的 Wnt-3a±100ng/ml 激活素 A 处 理 H9P53 培养物。用低血清加 100ng/ml 激活素 A 处理对照培养物。图 33 示出在以下处理 情况下于第五天通过 FACS 检测的 CXCR4 表达 ： a) 在整个五天使用 100ng/ml 激活素 A， 在最 初两天使用 20ng/ml 的 Wnt-3a， 以及在第 3-5 天使用 25ng/ml 的 BMP-4 ； b) 在整个五天使 用 100ng/ml 激活素 A， 以及在最初两天使用 20ng/ml 的 Wnt-3a ； c) 在整个五天使用 100ng/ ml 激活素 A， 以及在最初两天使用 100nM 的 GSK-3B 抑制剂 IX ； d) 在整个五天使用 20ng/ ml 的 Wnt-3a+25ng/ml 的 BMP-4 ； e) 在整个五天使用 100ng/ml 激活素 A， 以及在最初两天 使用 20ng/ml 的 Wnt-3a+100nM 的 GSK-3B 抑制剂 IX ； f) 在整个五天使用 100ng/ml 激活素 A+25ng/ml 的 BMP-4。图 34 示出， 对于用 10 或 100ng/ml 激活素 A 加 20ng/ml 的 Wnt-3a 或 100nM 的 GSK-3B 抑制剂处理的人胚胎干细胞系 H1 的培养物在第 46 传代时， 通过实时 PCR测定的定形内胚层标志物的基因表达 ： 屏面 (a) ： AFP、 Bry、 CXCR4、 GSC 和 POU5F(Oc t-4) 的 表达 ； 屏面 (b) ： SOX-17、 HNF-3B 和 GATA4。 结果以相对于未处理的细胞的增加倍数表示。 图 35 示出， 对于用 50 或 100ng/ml 激活素 A 加 10 或 100nM 的 GSK-3B 抑制剂处理的人胚胎干细 胞系 H9 在第 49 传代时， 通过实时 PCR 测定的定形内胚层标志物的基因表达 ： 屏面 (a) ： AFP、 Bry、 CXCR4、 GSC、 HNF-3B 和 POU5F(Oct-4) 的表达 ； 屏面 (b) ： SOX-17 和 GATA4。结果以相对 于未处理的细胞的增加倍数表示。图 36 示出用激活素 A、 Wnt-3a、 GSK-3 抑制剂和 BMP-4 的 组合处理的 H9P53 培养物的定形内胚层标志物的基因表达 ： a)AFP、 Bry、 CXCR4、 GSC、 HNF-3B 和 SOX7 的表达 ； b)SOX-17、 HNF-3B 和 GATA4。将 BMP-4 加入 DE 方案似乎诱导了中胚层标 志物 BRY 的形成， 在存在激活素 A 的情况下， 与添加每一种试剂本身相比， Wnt-3A 和 GSK-4B 抑制剂的组合不导致定形内胚层标志物显著上调。
实例 22
在 MEF 上培养的人胚胎干细胞向定形内胚层 (DE) 的分化 - 低血清中 Wnt-3a、 激活 素 A、 Wnt-5a、 BMP-2、 BMP-4、 BMP-6、 BMP-7、 IL-4 和 SDF-1 的组合
将 H9P44 细胞平铺在此前经丝裂霉素处理的小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 涂布的 6 孔板上。在 ES 细胞培养基中让细胞生长到 70 ％至 80 ％的融汇率， 该培养基由补充有 20％的 Knockout 血清替代品、 100nM 的 MEM 非必需氨基酸、 0.5mM 的 β- 巯基乙醇、 2mM 的 L- 谷氨酰胺 ( 均得自 Invitrogen/GIBCO) 和 8ng/ml 人碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) (R&DSystems) 的 DMEM/F12(Invitrogen/GIBCO) 组成。 对于 DE 的形成， 除了下面详述的其他生长因子外， 还在存在或不存在激活素 A(100ng/ml) 的情况下处理细胞。如下述方案所示， 将生长因子加到浓度递增的 FBS 中 ：
第0天： DMEM/F12 中 0％的 FBS
第1天： DMEM/F12 中 0.5％的 FBS
第2天： DMEM/F12 中 2％的 FBS
第3天： 收获细胞以用于 FACS 和 RT-PCR 分析。
所有生长因子均购自 R&D Systems， MN。每一个处理组中生长因子的详细说明和 浓度如下所示。
1. 对照 - 不添加生长因子
2. 激活素 A(100ng/ml)
3. 激活素 A(100ng/ml)+Wnt-3a(10ng/ml)+Wnt5a(10ng/ml)
4. 激活素 A(100ng/ml)+Wnt-3a(10ng/ml)+Wnt5a(10ng/ml)+
BMP2(100ng/ml)
5. 激活素 A(100ng/ml)+BMP-4(100ng/ml)
6. 激活素 A(100ng/ml)+BMP-6(100ng/ml)
7. 激活素 A(100ng/ml)+BMP-7(100ng/ml)
8. 激活素 A(100ng/ml)+BMP-4(100ng/ml)+BMP-6(100ng/ml)+BMP-7(100ng/ml)
9.IL-4(10ng/ml)
10.SDFla(20ng/ml) 11. 激活素 A(100ng/ml)+IL-4(10ng/ml)+SDFla(20ng/ml) 12.BMP2(100ng/ml)+BMP-4(100ng/ml)+BMP-6(100ng/ml)+BMP-7(100ng/ml)13. 激 活 素 A(100ng/ml)BMP-2(100ng/ml)+BMP-4(100ng/ml)+BMP-6(100ng/ ml)+BMP-7(100ng/ml)
14. 激活素 A(100ng/ml)+IL-4(10ng/ml)
15. 激活素 A(100ng/ml)+(SDFla(20ng/ml)
16. 激活素 A(100ng/ml)+Wnt-3a(10ng/ml)+Wnt-5a(10ng/ml)+Wnt-7a(10ng/ml)
17. 激活素 A(100ng/ml)+IL-4(10ng/ml)+SDF1a(20ng/ml)+BMP-4(100ng/ml)
结果 ：
在 DE 方案处理的第 3 天收获细胞。为了分析， 将经处理的细胞的等分试样用于制 备 RNA 以进行 RT-PCR， 剩下的细胞则用于 FACS 分析。CXCR4 的频率 (％ ) 在图 37 中示出。 添加上述生长因子并未使 CXCR4 的表达增加到高于含 100ng/ml 的 AA 的低血清处理。
对于 RT-PCR 分析， 分析细胞的所选组的定形内胚层标志物的表达。所示结果相对 于在基础培养基中生长、 但未用激活素 A 或其他生长因子中的任何因子处理的细胞进行了 校正。与 FACS 数据相符， 表 V 示出， 将生长因子 ( 例如 Wnt-3a) 加入用低血清、 高剂量激活 素 A 处理的培养物中没有显著上调定形内胚层标志物。这与此前的实例相比之下， 此前的 实例显示在存在激活素 A、 WNT3A 和低血清的情况下在无饲养层条件下培养的 ES 细胞的 DE 标志物显著增加。
实例 23
在用 MATRIGELTM 或人纤粘蛋白涂布的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定 形内胚层 (DE) 的分化
H9P55 细胞在人纤粘蛋白或常规生长因子 MATRIGELTM(BDBiosciences) 上生长 和分化。向 6 孔组织培养处理板中的每一个孔中加入 1ml 含 1ug/ml 人纤粘蛋白 (R&D systems， MN) 的 DMEM/F12(Invitrogen/GIBCO)。 或 者， 将 常 规 生 长 因 子 MATRIGELTM 在 DMEM/F12 中 1 ∶ 10 的稀释液， 向 6 孔组织培养处理板中的每一个孔中加入 1ml 经稀释的 TM MATRIGEL 。用胶原酶进行细胞传代。在细胞达到 80％融汇率之后， 进行如下处理 ： 用含有 10ng/ml 小鼠重组 Wnt3a(R&D) 和 100ng/ml 激活素 A(R&D) 的 0.5 ％的 FBS 处理两天。然 后用 2 ％的 FBS 加 100ng/ml 激活素 A 处理 3 天。图 38 屏面 a-b 分别示出在纤粘蛋白和 MATRIGEL 上培养的胚胎干细胞的 CXCR4 表达。实时 PCR 结果 ( 图 39) 证实了在纤粘蛋白和 MATRIGELTM 涂布的平板上定形内胚层的形成相当。
实例 24
在用不同浓度的 MATRIGELTM 涂布的组织培养基质上人胚胎干细胞向定形内胚层 的分化
将大约 60 ％至 70 ％融汇率的 H9 培养物暴露于补充有 0.5 ％的 FBS、 20ng/ml 的 Wnt-3a 和 100ng/ml 激活素 A 的 DMEM/F12 培养基两天， 然后用补充有 2 ％的 FBS、 20ng/ ml 的 Wnt-3a 和 100ng/ml 激 活 素 A(AA) 的 DMEM/F12 培 养 基 再 处 理 三 天。 在 用 常 规 MATRIGEL(1 ∶ 60 至 1 ∶ 10 的稀释液 ) 涂布的平板上培养 H9 细胞。用 MATRIGEL 在室温下 涂布平板 1 小时。
实时 PCR 结果在图 40 中示出。用低血清、 激活素 A 和 Wnt3a 处理人胚胎干细胞导 致了 CXCR4、 GATA4、 Goosecoid、 HNF-3β 和 SOX-17 基因的表达， 提示细胞正在向定形内胚 TM 层阶段分化。然而， 在存在 Wnt-3A 的情况下， MATRIGEL 涂层的浓度在分化中似乎并不起重要作用。
实例 25
在涂布有细胞外基质的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞的分化以及随后在 MEF 上培养并向定形内胚层分化 -wnt-3a 的作用
将得自在 MATRIGELTM 上培养至少五传代的人胚胎干细胞系 H9 的细胞接种到 ES 培 养基中的 MEF 饲养层上。当细胞达到 60％至 70％融汇率时， 将它们暴露于补充有 0.5％的 FBS 和 100ng/ml 激活素 A 的 DMEM/F12 培养基两天， 然后用补充有 2％的 FBS 和 100ng/ml 激活素 A(AA) 的 DMEM/F12 培养基再处理三天。附加的处理组包括用 20ng/ml 的 Wnt-3a 处 理 ( 整个五天 ) 以及用 10-100ng/ml 的激活素 A 处理。
在第 3 天和第 5 天， 通过实时 PCR 分析培养物的 SOX-17、 SOX-7、 α- 甲胎蛋白 (AFP)、 CXCR4、 Brychyury(Bry)、 gooscecoid(GSC)、 HNF-3β、 GATA4、 hTERT 和 Oct4。AFP 和 SOX-7 被认为是内脏内胚层标志物， 而 GATA4、 HNF-3β 和 SOX-17 则代表定形内胚层标志物， GSC、 Bry 和 CXCR4 代表原条标志物。hTERT 和 Oct-4 分别是自我更新和多能性标志物。实 时 PCR 结果在图 41 屏面 a-d 中示出。在第 3 天和第 5 天还进行了 FACS 分析。分析 CXCR-4 和 CD9 的表达水平， 并记录在图 41 屏面 e 中。
在不存在 Wnt3a 的情况下， 在 100ng/ml 激活素 A 中培养的细胞的 AFP 表达水平与 未处理对照中所见相似。 然而， 向在 100ng/ml 激活素 A 中培养的细胞添加 Wnt3a 增加了 AFP 的表达 ( 随时间而增加 )。当使用较低浓度的激活素 A 时， AFP 表达非常高， 不论是否存在 Wnt3a( 图 41， 屏面 a)。这表明高浓度的激活素 A 是避免细胞分化成胚胎外组织所必需的。
通过 FACS 分析发现， 在第 3 天， CXCR4 阳性细胞在用高浓度激活素 A 处理但不用 Wnt3a 处理的样品中占细胞群的 32-42％， 相比之下， 在用高浓度的激活素 A 和 Wnt 3a 处理 的样品中则占细胞群的 23-33％ ( 图 41， 屏面 e)。到处理的第 5 天， 在用高浓度激活素 A 处理但不用 Wnt3a 处理的细胞中有 28-32％表达 CXCR4， 相比之下， 用高浓度的激活素 A 和 Wnt3a 处理的细胞则有 43-51％表达 CXCR4( 图 41， 屏面 f)。在用低浓度激活素 A 处理的细 胞中， 与 Wnt-3a 处理组 (3％至 4％ ) 相比， 不用 Wnt3a 的处理组中存在更多的 CXCR4 阳性 细胞 (11％至 20％ )( 图 41， 屏面 g)。综上所述， 对于在 MEF 上培养的人胚胎干细胞向定形 内胚层的分化， Wnt-3a 似乎并不发挥重要作用。 这表明饲养层可能会分泌足够的 Wnt-3a 或 类似配体以增强激活素 A 诱导的定形内胚层形成。
实例 26
用 Wnt 抑制剂 DKK-1 处理后在涂布有细胞外基质的组织培养基质上培养的人胚胎 干细胞向定形内胚层的分化
为了确定加入 Wnt-3a 是否会造成分化增加， 将 Wnt-3 信号抑制剂加入培养物。将 大约 60％至 70％融汇率的 H9 培养物暴露于补充有 0.5％的 FBS、 20ng/ml 的 Wnt3a、 100ng/ ml 的 Dikkopf-1(DKK-1) 和 100ng/ml 激活素 A 的 DMEM/F12 培养基两天， 然后用补充有 2％ 的 FBS 和 100ng/ml 激活素 A(AA) 的 DMEM/F12 培养基再处理三天。在用生长因子减少的 MATRIGEL(1 ∶ 30 的稀释液 ) 涂布的平板上培养 H9 细胞。用 MATRIGEL 在室温下涂布平板 1 小时。
在第 5 天， 通过实时 PCR 分析培养物的 SOX-17、 SOX-7、 α- 甲胎蛋白 (AFP)、 CXCR4、 Brychyury(Bry)、 gooscecoid(GSC)、 HNF-3β、 GATA4、 hTERT 和 Oct4。AFP 和 SOX-7 被认为是内脏内胚层标志物， 而 GATA4、 HNF-3β 和 SOX-17 则代表定形内胚层标志物， GSC、 Bry 和 CXCR4 代表原条标志物。hTERT 和 Oct-4 分别是自我更新和多能性标志物。结果示于图 42 中。
在存在 Wnt3a 的情况下， 细胞表达了 CXCR4、 GATA4、 HNF-3β 和 SOX17， 即所有的定 形内胚层标志物。也测得原条形成的标志物 ( 如 goosecoid) 的水平高于未处理对照中测 得的水平。在加入 DKK1 的条件下， 上述分化标志物的表达水平大大降低到类似于未经处理 的细胞的水平。
实例 27
在 MATRIGEL 涂布的组织培养基质上培养以及在低血清加激活素 a 和 ±Wnt-3a 中 分化的 H9 胚胎干细胞的 DE 标志物的免疫荧光染色
在第 5 天， 根据实例 10 将 H9 细胞的 DE 培养物针对 SOX-17、 HNF-3B、 GATA-4、 神经 性钙粘蛋白和上皮细胞钙粘蛋白进行染色。所有细胞核均用 DAPI 进行复染。与在不存在 Wnt-3a 的情况下分化的培养物相比， 20ng/ml 的 Wnt-3a 导致 SOX-17、 HNF-3β 和 GATA-4 染 色阳性的细胞核数量明显更高。此外， 加入 Wnt-3a 还导致了上皮细胞钙粘蛋白表达的显著 缺失， 以及神经性钙粘蛋白表达的提高 ( 图 43 屏面 a 和图 43 屏面 b)。
实例 28
在 MEF 上与在 MATRIGELTM 上相比， 定形内胚层形成后胚胎干细胞中基因表达变化 的微阵列分析
使用 RNeasy 微量提取试剂盒 (Qiagen) 从下述胚胎干细胞培养物中分离总 RNA ： A)H9P33 细胞， 其在 MATRIGELTM(1 ∶ 30 的稀释液 ) 涂布的平板上培养并暴露于补充有 0.5 ％的 FBS 和 100ng/ml 激活素 A 的 DMEM/F12 培养基两天， 然后用补充有 2 ％的 FBS 和 100ng/ml 激活素 A(AA) 的 DMEM/F12 培养基再处理三天 ； B)H9P44 细胞， 其在 MEF 上培养 并暴露于补充有 0.5％的 FBS 和 100ng/ml 激活素 A 的 DMEM/F12 培养基两天， 然后用补充 有 2％的 FBS 和 100ng/ml 激活素 A 的 DMEM/F12 培养基再处理三天 ； 和 C)H9P48 细胞， 其在 TM MATRIGEL (1 ∶ 30 的稀释液 ) 涂布的平板上培养并暴露于补充有 0.5％的 FBS 和 100ng/ml 激活素 A 加 20ng/ml 的 Wnt-3a 的 DMEM/F12 培养基两天， 然后用补充有 2％的 FBS 和 100ng/ ml 激活素 A(AA) 的 DMEM/F12 培养基再处理三天。每一个组的对照包括铺在 MATRIGEL 涂布 的平皿上并培养于 MEF 条件培养基中的细胞， 或铺在 MEF 上并培养于 ES 培养基中的细胞。 所有组均含有三个生物学复制， 每一个生物学复制在两个独立的基因芯片上重复。
根据 Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array 进行样品制备、 杂交和图 像分析。 在归一化和对数转换之后， 使用 软件 (MA) 和 GENESIFTER(VizXLabs， WA) 进行数据分析。使用方差分析和 F 检验评价样品间基因表达的显著差异， 其具有≤ 0.05 的 调整后 P 值 (Benjamini 和 Hochberg 校正 )。分析中仅包括当前调用的基因 ( 在至少一组 中 )。表 IV 列出了 A 组、 B 组和 C 组之间差异至少 5 倍的基因的平均归一化对数转换信号 强度， 以及每一个基因的调整后 P 值。
实例 29
在用 MATRIGELTM 涂布的组织培养基质上培养的 SA002 ES 细胞系向定形内胚层 (DE) 的分化
将此前在补充有 8ng/ml 的 bFGF 的 MEF-CM 中， 在 MATRIGEL(1 ∶ 30 的稀释液 ) 涂布的平板上培养了至少三传代的 SA002P38 细胞 (Cellartis， Sweden) 暴露于补充有 0.5％ 的 FBS 和 100ng/ml 激 活 素 A(R&D Systems， MN)±20ng/ml 的 Wnt-3a 或 100nM 的 GSK-3B IX 抑制剂的 DMEM/F12 培养基两天， 然后用补充有 2％的 FBS 和 100ng/ml 激活素 A(AA) 的 DMEM/F12 培养基再处理三天。实时 PCR 结果示于图 44， 屏面 a 和屏面 b 中。类似于 H1、 H7 和 H9 细胞系， SA002 细胞系也需要加入 Wnt-3A 才能稳定表达 DE 标志物。CXCR4 的表达在 图 45 中显示 ： a)AA 处理 ； b)AA+Wnt-3a ； c)AA+GSK-3B 抑制剂。
实例 30
在用人血清涂布的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内胚层 (DE) 的分 化
使第 55 传代人胚胎干细胞系 H1 的培养物在人血清 (Sigma， #H1388， MO) 涂布的平 板上生长和分化。 将 0.5ml 人血清加入 6 孔组织培养处理板中的每一个孔中， 室温培育 1 小 时， 然后在加入人胚胎干细胞前将其吸出。在细胞达到 80％融汇率后， 进行如下处理 ： 用含 10ng/ml 小鼠重组 Wnt3a(R&D) 或 100nM 的 GSK-3B 抑制剂 IX( 目录 #361550， Calbiochem， CA) 和 100ng/ml 激活素 A(R&D) 的 0.5％的 FBS 处理两天。接下来用 2％的 FBS 加 100ng/ ml 激活素 A 处理 3 天。然后通过实时 PCR 分析培养物 ( 图 46 屏面 a 和屏面 b)。我们注意 到， 用激活素 A+GSK-3B 抑制剂或 Wnt-3A 处理的细胞相比仅用激活素 A 处理的细胞稳定表 达了定形内胚层标志物。 这些发现与我们对在 MATRIGELTM 或人纤粘蛋白涂布的平板上培养 的人胚胎干细胞的发现一致。
实例 31
在用 MATRIGELTM 涂布的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内胚层 (DE) 的分化 - 评价多种 GSK-3B 抑制剂
评价多种市售 GSK-3B 抑制剂在人胚胎干细胞形成 DE 中的有效性。评价了下列 GSK-3B 抑制剂 (100nM) ： GSK-3B 抑制剂 VIII( 目录 #361549， Calbiochem， CA)、 GSK-3B 抑制 剂 IX( 目录 #361550， Calbiochem， CA)、 GSK-3B 抑制剂 XI( 目录 #361553， Calbiochem， CA)、 TM GSK-3B 抑制剂 XII( 目录 #361554， Calbiochem， CA)。将 H1P54ES 细胞在 MATRIGEL (1 ∶ 30 的稀释液 ) 涂布的平皿上培养并暴露于补充有 0.5％的 FBS、 100ng/ml 激活素 A(AA)+/- 多 种 GSK-3B 抑制剂的 DMEM/F12 培养基两天， 然后用补充有 2％的 FBS、 100ng/ml 激活素 A(AA) 的 DMEM/F12 培养基再处理三天。用低血清加高剂量 AA 处理对照培养物。图 47 屏面 a 和 屏面 b 示出在第 5 天时定形内胚层标志物的基因表达。相比 GSK-3B 抑制剂 VIII 和 XII， GSK-3B 抑制剂 IX 和 XI 对诱导 DE 的形成均有效。
实例 32
在无饲养层条件下培养的人胚胎干细胞形成胰腺内胚层 - 评价视黄酸类似物
将 H9P49 胚胎干细胞在 MATRIGELTM(1 ∶ 30 的稀释液 ) 涂布的平皿上培养并暴 露于补充有 0.5 ％的 FBS、 20ng/ml 的 Wnt-3a( 目录 #1324-WN-002， R&D Systems， MN) 和 100ng/ml 激活素 A(R&D Systems， MN) 的 DMEM/F12 培养基两天， 然后用补充有 2 ％的 FBS 和 100ng/ml 激活素 A(AA) 的 DMEM/F12 培养基再处理三天。在第 5 天， 收集细胞用于通过 FACS 和实时 PCR 进行评价。如此前实例所示， 此方案导致定形内胚层标志物 ( 例如 CXCR4 和 SOX-17) 稳定上调。将在第 5 天所得的定形内胚层细胞暴露于下述培养基条件以诱导胰 腺内胚层的形成 ： 在补充有 2％的 FBS 和 1mM 全反视黄酸 (RA)( 目录 #R2625， Sigma， MO))或 0.1-10mM 的 AM-580(4-[(5， 6， 7， 8- 四氢 -5， 5， 8， 8- 四甲基 -2- 萘基 ) 甲酰胺基 ] 苯甲 酸， 目录 #A8843， Sigma， MO) 或 0.1-1mM 的 TTNPB(4-[(E)-2-(5， 6， 7， 8- 四氢 -5， 5， 8， 8- 四 甲基 -2- 萘基 )-1- 丙烯基 ] 苯甲酸芳维 A 酸， 目录 #T3757， Sigma， MO) 的 DMEM/F12 培养基 中培养 3 天。AM-580 和 TTNPB 为视黄酸类似物， 其对视黄酸受体具有亲和性。RA 处理后， 在补充有 2％的 FBS 和 20-50ng/ml 的 bFGF( 目录 #F0291， Sigma， MO) 的 DMEM/F12 培养基 中再处理三天。收获培养物， 并采集 mRNA 样品用于分析。
基因表达分析表明 ( 图 48 屏面 a-d) 添加 1mM RA 然后暴露于 bFGF 显著上调了胰 腺内胚层标志物， 例如 PDX-1。此外， 此方案导致前肠内胚层标志物 ( 例如 CDX-2 和 AFP) 稳 定表达。 在 1mM 的浓度下， 添加 RA 类似物导致相当的胰腺内胚层和前肠标志物。 然而， 与全 反视黄酸相比， 添加 1mM 的 RA 类似物导致了更稳定的 AFP 表达。然而， 添加 10mM 的 AM-580 抑制了 AFP 和 CDX-2 的表达， 但维持了 PDX-1 的高表达。
实例 34
Wnt-3a 处理对人胚胎干细胞中细胞因子表达的影响
使用蛋白质芯片分析 Wnt-3a 处理对细胞因子表达的影响。根据实例 15 中所述的 方法培养人胚胎干细胞系 H9 的细胞。在第 54 传代， 细胞在存在 100ng/ml 激活素 A±10ng/ ml 的 Wnt3a 的情况下， 在 0.5％的 FBSDMEM/F12 中分化两天。然后在 100ng/ml 激活素 A 和 2％的 FBS DMEM/F12 中再培养三天。 在第 5 天结束时， 通过 FACS 测定每一个处理组的 CXCR4 表达。在仅用激活素 A 处理的细胞中， 有 1％的细胞表达 CXCR4。在用激活素 A 和 Wnt3a 处 理的细胞中， 有 73％的细胞为 CXCR4 表达阳性。
使用哺乳动物细胞裂解试剂盒 (Sigma-Aldrich， MO) 由每一个处理组的细胞制备 细胞溶胞产物。从每一个处理组收集条件培养基并浓缩。使用 RayBiotech， GA(http:// www.raybiotech.com/) 提供的细胞因子芯片板完成细胞因子芯片分析。 表 VII 列出了数据 归一化和背景减除后的细胞因子、 生长因子和受体表达。 对于每一个板， 也包括阳性对照和 阴性对照。所示数据为每个细胞处理组的两个独立样品 (1、 2)。
在 Wnt3 处理的细胞条件培养基中发现了血管生成素、 IGFBP-1 和 EGF 的明显上调。 在 Wnt3a 处理的细胞溶胞产物中许多蛋白上调， 包括 IGFBP-1、 TGFβ-1 和 TGFβ-3。可将 这些上调的蛋白回加到分化培养基中， 以替代或增强 Wnt3a 对定形内胚层形成的作用。
实例 35
在用 MATRIGELTM 涂布的组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内胚层的分 化： Wnt1 的作用
将 H1P55ES 细胞在 MATRIGELTM(1 ∶ 30 的稀释液 ) 涂布的平皿上培养并暴露于补充 有 0.5％的 FBS 和 100ng/ml 激活素 A±10-20ng/ml 的 Wnt-1(PeproTech， NJ， 目录 #120-17) 的 DMEM/F12 培养基两天， 然后用补充有 2％的 FBS、 100ng/ml 激活素 A(AA) 和 ±10 或 20ng/ ml 的 Wnt-1 的 DMEM/F12 培养基再处理三天。测试下列 WNT1+AA 组合 ：
a) 第 1-2 天 ： 0.5 ％的 FBS+DM-F12 中 20ng/ml 的 Wnt 1+100ng/ml 的 AA， 然后第 三天 ： 2％的 FBS+DM-F12+100ng/ml 的 AA ； b) 第 1-2 天 ： 0.5％的 FBS+DM-F12 中 20ng/ml 的 Wnt1+100ng/ml 的 AA， 然后第 3-5 天 ： 2％的 FBS+DM-F12+100ng/ml 的 AA ； c) 第 1-2 天 ： 0.5％ 的 FBS+DM-F12 中 10ng/ml 的 Wnt1+100ng/ml 的 AA， 然后第三天 ： 2％的 FBS+DM-F12+100ng/ ml 的 AA ； d) 第 1-2 天 ： 0.5％的 FBS+DM-F12 中 10ng/ml 的 Wnt1+100ng/ml 的 AA， 然后第 3-5天： 2 ％ 的 FBS+DM-F12+100ng/ml 的 AA ； e) 第 1-2 天 ： 0.5 ％ 的 FBS+DM-F12 中 20ng/ml 的 Wnt1+100ng/ml 的 AA， 然后第三天 ： 2％的 FBS+DM-F12+100ng/ml 的 AA+20ng/ml 的 Wnt1 ； f) 第 1-2 天 ： 0.5％的 FBS+DM-F12 中 20ng/ml 的 Wnt1+100ng/ml 的 AA， 然后第 3-5 天 ： 2％的 FBS+DM-F12+100ng/ml 的 AA+20ng/ml 的 Wnt1。图 49 屏面 a 和屏面 b 示出在用低血清、 AA 和 Wnt-1 处理 H1 细胞后定形内胚层标志物的实时 PCR 数据。在 100ng/ml 的 AA 存在下添 加 20ng/ml 的 Wnt1 导致了定形内胚层标志物 (Bry、 CXCR4、 GSC、 SOX17、 HNF-3B 和 GATA-4) 的明显上调。
实例 36
在限定培养基中， 在组织培养基质上培养的人胚胎干细胞向定形内胚层的分化
将在缺氧条件下 ( 大约 3 ％的 O2) 培养并铺在 MATRIGELTM(1 ∶ 30 的稀释液 ) 涂 布的平皿上的 H1 胚胎干细胞在 MEF 条件培养基中培养至大约 60％至 70％的融汇率， 然后 暴露于补充有 0.5％的 FBS、 20ng/ml 的 Wnt-3a( 目录 #1324-WN-002， R&D Systems， MN) 和 100ng/ml 激活素 A(R&D Systems， MN) 的 DMEM/F12 培养基两天， 接着用补充有 2％的 FBS 和 100ng/ml 激活素 A(AA) 的 DMEM/F12 培养基再处理 3 至 4 天。同时， 将在 MATRIGEL 上培养 的 H1 细胞暴露于补充有 0.5-1％的 B27(Invitrogen， Ca)+20g/ml 的 WNT-3a+100ng/ml 激 活素 A±GSK-3B 抑制剂 IX( 目录 #361550， Calbiochem， CA) 的 DMEM-F12 或 DMEM-LG 中 4-5 天。在一些培养物中， 使用 1％的 N2 添加剂 (Invitrogen， Ca) 代替 1％的 B27。
此外， 将从称为 “EXPRES” 细胞 ( 可扩增的前原条细胞 ) 的母 H9 ES 细胞系分离的 细胞系也暴露于上述相同的培养基配方中， 以诱导定形内胚层 (DE) 的形成。EXPRES 细胞 的性质此前已在美国专利申请 60/913,475 中有所公开。最后， 将从 Invitrogen 获得的并 在 MATRIGEL 涂布的平板上于 MEF 条件培养基 +8ng/ml 的 bFGF 中培养的 BGO1V 系的细胞暴 露于上述分化培养基中， 以诱导 DE 的形成。图 50 示出， 对于暴露到限定分化培养基或低血 清分化培养基的 EXPRES01、 BGO1V 和 H1 P50 细胞系， 在第 4-5 天通过 FACS 检测的 CXCR4 和 CD9 表达。对于所有的供试细胞系， 当使用基于 1％的 B27 添加剂的限定培养基时， 与基于 FBS 的培养相比， CXCR4 的表达相当。此外， 1％的 N2 添加剂不能诱导 DE 的形成， 可能是由 于 N2 添加剂中存在高浓度的胰岛素 (8.6mM)。 图 51 示出用低血清或限定培养基 +AA+WNT3A 处理的 EXPRES01、 BGO1V 和 H1 培养物在第 4-5 天时的实时 PCR 数据。此方案导致了 DE 标 志物的显著上调。图 52 示出通过 1％的 B27+DM-F12+ 激活素 A+WNT3A+GSK03B 抑制剂处理 五天将 EXPRES 01 P49 细胞分化成 DE 的免疫荧光图像。大多数细胞为 GATA-4、 SOX-17 和 HNF-3B 染色阳性， 少数细胞为 OCT-4、 SOX-2 和 Nanog 染色阳性。
实例 37
在限定培养基中， 在 MEF 上培养的人胚胎干细胞向定形内胚层的分化
将 H1 细胞平铺在此前用丝裂霉素处理的小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 接种的 6 孔板上。让细胞在 ES 细胞培养基中生长到 70-80 ％的融汇率， ES 细胞培养基由补充有 20％的 Knockout 血清替代品、 100nM 的 MEM 非必需氨基酸、 0.5mM 的 β- 巯基乙醇、 2mM 的 L- 谷氨酰胺 ( 均得自 Invitrogen/GIBCO) 和 8ng/ml 人碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) (R&DSystems) 的 DMEM/F12(Invitrogen/GIBCO) 组成。
对于 DE 的形成， 除了下面详述的其他生长因子之外， 还在存在或不存在激活素 A(100ng/ml) 的情况下处理细胞。如下列方案所示， 将生长因子加入浓度递增的 FBS ：第0天： 在 DMEM-LG 或 RPMI 中 0％的 FBS 或 1％的 B27
第1天： 在 DMEM/F12 或 RPMI 中 0.5％的 FBS 或 1％的 B27
第 2-5 天 ： 在 DMEM/F12 或 RPMI 中 2％的 FBS 或 1％的 B27
或者， 在 HESGro 培养基 (Chemicon， Ca)+100nM 的 LY 化合物 (EMD， CA)+100ng/ml 的 AA 中将细胞处理 1-5 天。
在 第 1-5 天， 收 获 细 胞 用 于 FACS 和 RT-PCR 分 析。 所 有 生 长 因 子 均 购 自 R&D Systems， MN。图 53 示出暴露于低血清 + 激活素 A 或限定培养基 + 激活素 A 的 H1 细胞在第 1-5 天时的实时 PCR 数据。表达水平的倍数改变相对于第 1 天的值进行归一化。
本文通篇引用的出版物据此全文以引用方式并入本文。 尽管上文以引用实例和优 选实施例的方式阐述了本发明的多个方面， 但应当理解， 本发明的范围并不由上述说明限 定， 而是由根据专利法的原则正确解释的以下权利要求书限定。
表 IA ： 用于 FACS 和免疫染色分析的一抗列表
抗体 SSEA-1 SSEA-3 SSEA-4 TRA 1-60 TRA 1-81 TRA 1-85 AP HNF3b PDX1供应商 Chemicon(CA) Chemicon(CA) Chemicon(CA) Chemicon(CA) Chemicon(CA) Chemicon(CA) R&D Systems R&D Systems Santa Cruz Biotechnology， INC R&D Systems R&D Systems BD同型 小鼠 IgM 小鼠 IgG3 大鼠 IgM 小鼠 IgM 小鼠 IgM 小鼠 IgG1 小鼠 IgG1 山羊 IgG 山羊 IgG克隆号 MC-480 MC-631 MC-813-70 TRA 1-60 TRA 1-81 TRA 1-85 B4-78A-17GATA4 Sox 17 CD 9
山羊 IgG 山羊 IgG 小鼠 IgG1 M-L13表 IB ： 用于 FACS 和免疫染色分析的标记二抗列表标记二抗 APC 标记的山羊抗小鼠 IgG PE 标记的山羊抗小鼠 IgG PE 或 APC 标记的驴抗兔 PE 或 APC 标记的驴抗山羊 PE 标记的山羊抗小鼠 IgM PE 标记的山羊抗大鼠 IgM PE 标记的山羊抗小鼠 IgG3 供应商 Jackson ImmunoResearch(PA) Jackson ImmunoResearch(PA) Jackson ImmunoResearch(PA) Jackson ImmunoResearch(PA) SouthernBiotech(AL) SouthernBiotech(AL) SouthernBiotech(AL) 稀释度 1 ∶ 200 1 ∶ 200 1 ∶ 200 1 ∶ 200 1 ∶ 200 1 ∶ 200 1 ∶ 200
表 IIA ： 在激活素 A 处理后的人胚胎干细胞蛋白表达随时间的变化0- 天 SSEA-3 CD9 ECAM NCAM CXCR4 98.67％ 92.64％ 61.23％ 7.33％ 8.53％ 2- 天 92.14％ 29.42％ 20.87％ 5.04％ 20.2％ 5- 天 42.9％ 7.27％ 14.17％ 21.1％ 55.26％ 8- 天 22.05％ 4.1％ 1.02％ 8.86％ 56.92％
表 IIB ： 在激活素 A 处理后的人胚胎干细胞蛋白表达随时间的变化表 IIC ： 在激活素 A 处理后的人胚胎干细胞蛋白表达随时间的变化 第 5 天 AA 处理 CXCR4+ CXCR4+/C-kit+ CXCR4+/EPCAM CXCR4+/CD99+ CXCR4+/CD9+ 92.78％ 92.90％ 87.99％ 88.78％ 7.03％
表 III ： 本发明所用胚胎干细胞的多能性标志物表达谱
表 IV ： 经过 5 天的处理之后， 在 MATRIGEL(TM) 或小鼠胚胎成纤维细胞上培养的未 分化胚胎干细胞和定形内胚层期细胞之间的基因的差异表达
表V： 在实例 10 中概述条件下定形内胚层标志物的相对表达。所有值都相对于第 1 组 ( 对照 ) 进行归一化。Sox17 第 1 组 - 对照 第2组 第3组 第4组 第5组 第6组 第7组 第8组 第9组 第 10 组 第 11 组 第 12 组 1 45 45 8 23 41 25 6 1 22 54 68 CXCR4 1 19.5 30 14 16 5.8 19.5 15.9 1.4 1.5 23 0.7 Goosecoid 1 2.8 2.9 2.7 3.1 3.0 2.7 2.9 0.9 1.4 2.5 0.9 HNF-3B 1 0.64 0.74 1.11 1.76 1.87 0.62 2.0 0.89 1.20 0.71 1.51 SOX-2 1 0.91 0.70 0.18 0.16 0.61 0.34 0.13 1.2 1.36 0.66 0.02 Oct-4 1 1.1 0.76 0.36 0.41 0.57 0.48 0.43 0.85 0.68 0.65 0.30128101861386 A CN 101861387说Sox17 CXCR4 12.7 20.6 27.7 21 14.9明书HNF-3B 2.1 0.82 0.68 0.79 2.12 SOX-2 0.11 0.69 0.68 0.46 0.22126/181 页Goosecoid 3.0 2.9 2.9 2.4 3.5Oct-4 0.30 0.70 0.85 0.72 0.44第 13 组 第 14 组 第 15 组 第 16 组 第 17 组
13.9 52.6 68 13.9 52表 VI ： H9 胚胎干细胞衍生的定形内胚层期细胞 ( 在 MATRIGELTM 或 MEFS+/-Wnt-3A 上培养 ) 基因的平均归一化强度值 ( 以对数格式表示 )。
表 VII ： wnt-3a 处理对源于人胚胎干细胞系 h9 的细胞群中细胞因子表达的影响