基因重组 Exendin-4 的表达和制备新方法 技术领域 ：
本发明是关于基因重组制备 Exendin-4 的工艺， 重点是经优化后的工程菌构建、 发酵表达、 纯化的工艺。 技术背景 ：
近二十年来， 随着人们生活方式的改变， 糖尿病患病率急剧升高。 全球糖尿病患者 已近 2.5 亿， 并且以 10％以上的速度递增。目前我国糖尿病患者已逾 7000 万， 并且糖尿病 患者增长率是欧美国家的 2 倍。 胰高血糖素样肽 -1(glucagon-like peptide-1 receptor， GLP-1) 受体激动剂为 II 型糖尿病的治疗提供了新的思路。此类药物促胰岛素分泌作用呈 明显的血糖依赖性， 低血糖发生几率低 ； 同时改善胰岛 β 细胞功能并促进 β 细胞增殖， 并 且可以减轻体重， 降低血压， 在 II 型糖尿病治疗领域具有独特优势， 成为近来糖尿病治疗 领域的研究热点。
人体内源性激动剂 GLP-1 在可以被 DPPIV 和中性肽链内切酶 24.11 迅速降解， 体 内半衰期仅 1-2min。
Exendin-4 是从希拉毒蜥 (Heloderma suspectum) 唾液中分离得到的， 其具有 GLP-1 相同的调控血糖功能， 并且这一天然化合物对 DPPIV 具有很高的耐受性， 在体内的稳 定性远高于 GLP-1， 体内半衰期达 2-4 小时。Exendin-4 的临床实验效果充分体现了 GLP-1 受体激动剂的优势， 每天注射两次， 控制血糖、 降低体重的效果良好。并且其优势还在于不 需要根据糖化血红蛋白 (HbA1c) 或血糖水平来调整剂量， 在早餐和晚餐前给予固定剂量即 可， 从而减少监测血糖的不便。该药物已由美国 Amylin 和礼来合作开发上市， 最初批准和 二甲双胍、 磺脲类药物联合使用治疗使用口服降糖药未能取得良好效果的 II 型糖尿病患 者。2009 年 10 月， FDA 批准扩大 Byetta 的适应症， 可用于单一疗法， 结合饮食和锻炼控制 血糖。
Exendin-4 多肽的制备方法有化学合成法和基因重组法， 目前用化学合成法的比 较多， 已上市的 Byetta 是化学合成的。但是合成仪器昂贵、 成本较高， 过程涉及有害化学物 质。基因重组法易于规模放大， 对环境影响小， 制备成本低。
研究内容 ：
本发明提供的 Exendin-4 生产方法， 采用基因重组法， 步骤简捷， 安全高效， 周期 短， 易于规模放大。
研究内容包括表达工程菌的构建、 工程菌发酵表达、 目的蛋白的纯化工艺和活性 理化性质分析鉴定。
1. 工程菌的构建 ：
内容包括根据密码子偏爱性设计序列、 合成全基因序列、 酶切连接转导， 构建了 以大肠杆菌 BL21(DE3)plysS 为宿主菌、 以 pET32a(+) 为表达载体的 Exendin-4 融合表达 系统。全基因序列中包括构建克隆所需的 BglII、 XhoI 酶切位点、 肠激酶酶切位点， 序列 如 “序列表” 所述。基因全序列的合成、 BL21(DE3)plysS 宿主菌都购自 invitrogen 公司 ；pET32a(+) 表达载体购自 Novagen 公司， 是基因重组表达的常用菌株， 融合蛋白表达量高、 可溶性高、 便于捕获纯化。
工程菌构建完成后， 经目的片段测序鉴定， 结果表明工程菌构建正确。
2. 工程菌发酵表达
本发明的工程菌发酵采用乳糖诱导法。以葡萄糖、 乳糖为碳源， 在优先利用葡萄 糖后， 添加乳糖为碳源， 同时诱导融合蛋白表达。而常用的诱导剂 IPTG， 对人体有潜在的毒 性， 价格也比较昂贵 ； 乳糖诱导则兼备提供碳源、 无毒、 价格低， 也可获得诱导产生相同量的 表达蛋白。如果试验设计合理， 还可减少了补加诱导剂步骤， 操作简便， 减少污染机会。
确立了工程菌株后， 通过对种子培养基、 接种浓度、 发酵培养基、 发酵过程参数的 摸索， 确定工艺步骤如下 ：
(1) ： 将冻存种子按 1 ∶ 100 接种于含 50 微克 / 毫升氨苄青霉素的 LB 培养基， 在 37℃、 180rpm 下摇瓶培养约 8-12 小时， 为一级种子液 ；
(2) ： 将一级种子液按适当比例接种于含适量抗生素的 LB 培养基， 在 37℃、 200rpm 下摇瓶培养约 6-8 小时， OD600 ＝ 2.0 ～ 3.0 时为二级种子 ； 菌体此时处于对数生长期初期， 生长旺盛， 更容易适应新的生长环境 ； (3) ： 二级种子液接种比例为 1 ∶ 10 接种入发酵起始培养基 ； 发酵过程培养温度 控制在 37℃， 氨水调节 pH 至 7.00±0.2， 溶氧率通过搅拌速度和通气量维持在 30％以上， 用 20％的泡敌溶液做消泡剂， 根据发酵过程各培养阶段工程菌生长补料。
工程菌生长达合适密度时， 开始乳糖诱导。诱导培养要保证适合浓度的乳糖碳源 和氮源， 维持溶氧率在 20％以上， 诱导表达 3.5 小时终止发酵离心收菌。 乳糖诱导发酵可选 择①批式培养 ： 初始培养基含有葡萄糖 (5-10g/L) 和乳糖 (5g/L)， 大肠杆菌在优先利用葡 萄糖后， 用自行启动乳糖做碳源， 既可促进菌体生长， 又可促进蛋白表达。但是若乳糖浓度 过高， 则会产生抑制作用。批式培养适合摇瓶培养摸索乳糖浓度和小试规模。②乳糖诱导 液补料培养 ： 在 M9 发酵培养基加葡萄糖培养工程菌至合适密度时， 开始流加乳糖和酵母提 取物的诱导培养液。此种方式， 适合于中试及以上规模， 乳糖浓度相对恒定， 诱导培养时间 容易掌握。
3. 目的蛋白的纯化工艺
研究内容包括融合蛋白的捕获、 肠激酶酶切融合蛋白、 酶切混合物的纯化。 其中第 三步， 与以往的二次 Ni 柱收集流穿的粗分离， 结合 SOURCE 反相、 离子交换的精细纯化相比， 本发明提供的 C4 反相工艺实现了一步纯化得 99％以上纯品的目标。 该工艺简化了流程， 节 省时间、 空间、 试剂耗材， 易于规模放大。
具体步骤如下 ：
(1) ： Ni-Sepharose 6FF 亲和层析法捕获带 His-S-Trx 标签的 Exendin-4 融合蛋 白；
(2) ： 适宜浓度的肠激酶酶切融合蛋白， 得到标签蛋白与目的多肽的混合液 ；
(3) ： 制 备 级 HPLC 的 C4 反 相 柱 纯 化， 得到高纯度的目的多肽 ； 后续可通过 Superdex30 或 SephadexG-25 将目的多肽置换到制剂溶液中。
4. 活性理化性质分析鉴定
经 SDS-PAGE 电泳、 HPLC、 质谱、 相应的细胞活性检测分析鉴定， 获得的目的多肽与
设计的完全一致。 具体实施方式 ：
实施例一
摇瓶批式发酵， 摸索乳糖诱导浓度
(1) ： 将冻存种子按 1 ∶ 100 接种于含 50μg/mL Amp 的 20mL/ 瓶 LB 培养基 1 瓶， 在 37℃、 180rpm 下摇瓶过夜培养 ；
(2) ： 将上述种子液按 1 ∶ 100 接种于含 50μg/mLAmp 的 200mL/ 瓶 LB 培养基 7 瓶， 在 37℃、 200rpm 下培养 ； 约 2 小时后， OD600 ＝ 0.6 时， 开始诱导， 分别加入 0g/L 乳糖、 3g/L 乳糖、 6g/L 乳糖、 9g/L 乳糖、 12g/L 乳糖、 15g/L 乳糖、 0.4mMIPTG。37℃继续培养 4h， 收菌。
(3) 取相同重量的每份菌产物， 稀释为相同浓度， 超声破碎， 取上清， 观察蛋白表达 量 ( 见图 2)。
实施例二
乳糖诱导液补料发酵培养
(1) ： 将冻存种子按 1 ∶ 100 接种于含 50μg/mL Amp 的 20mL/ 瓶 LB 培养基 1 瓶， 在 37℃、 180rpm 下摇瓶培养约 12 小时， 为一级种子液 ；
(2) ： 将一级种子液按 1 ∶ 100 接种于含 50μg/mLAmp 的 200mL/ 瓶 LB 培养基 5 瓶， 在 36℃、 200rpm 下摇瓶培养约 8 小时， 为二级种子 ；
(3) ： 二 级 种 子 液 接 种 比 例 为 1 ∶ 10 接 种 入 9L 基 础 培 养 基 ( 培 养 基 成 分 g/ L： glucose 2.5， tryptone 10， yeast extract 5， KH2PO42， K2HPO44， NaH2PO4·12H2O 7， (NH4)2SO41.2， NH4C10.2， MgSO4· 7H2O 0.2， NaCI 1) 的发酵罐 ； 温度控制在 37℃， 氨水调节 pH 至 7.0±0.2， 初始搅拌速度为 250rpm， 通过逐步增加搅拌速度和通气量维持溶氧量在 30％ 以上。
约 2 ～ 2.5h 后， 溶氧急剧上升到 80％以上时， 按 0.2 ～ 0.3mL/L/min 的速度补加 20％葡萄糖溶液 (glucose 200g/L， yeast extract 50g/L)， 60 ～ 120min 后停止。 此时 OD600 为 11 ～ 13， 首次快速加入至乳糖终浓度 9g/L， 之后按 0.15 ～ 0.3mL/L/min 的速度补加乳 糖诱导液 (lactose200g/L， yeast extract 50g/L)， 诱导 5h 后收菌。经离心后称重共获得 湿菌 400 克。
取诱导 0h、 1h、 2h、 3h、 4h、 5h 的菌体， 相同浓度超声破碎， 取上清。 经 15％ SDS-PAGE 胶检验， 分子量约为 21KD， 目的蛋白表达量约为 15 ～ 20％ ( 见图 3)。
实施例三
目的多肽的纯化
菌体处理 ： 取 100g 湿菌， 溶于 1.0L Tris 缓冲液 (50mM Tris， 300mM NaCl) 中， 超 声破碎， 4℃， 8000rpm 离心 20min， 取上清， 0.45μm 滤膜过滤。
(1) ： 加 20mL1M 咪 唑 于 细 胞 裂 解 液， 使 上 样 缓 冲 液 含 20mM 咪 唑 ； 选用含 100mLNiSepharose 6FF 柱料的柱子， 经平衡 (20mM 咪唑 )、 上样 (20mM 咪唑 )、 清洗 (40mM 咪 唑 )、 洗脱 (100 ～ 150mM 咪唑 )， 收集 Exendin-4 融合蛋白 ；
(2) ： 用 50mMTris 溶液将融合蛋白稀释到酶切缓冲液 (50mMTris， 50mMNaCl， 15 ～ 25mM 咪唑 )， 加入合适浓度的肠激酶， 30 ～ 37 度酶切 6 ～ 12h ；(3) ： 选用制备级 HPLC 的 C4 反相柱 (250mm×10mm)， 检测波长为 214nm， 柱温 30℃； 以 H2O(0.1 ％ TFA) 为流动相 A， 以乙腈 (0.1 ％ TFA) 为流动相 B ； 上样 100mL， 流速 4.0mL/ min， 线性梯度洗脱， 收集第 11 峰， 其保留时间为 16.470( 见图 4)。
经检测， 收集的目的多肽组分纯度为 99.8％。
后续可用 SephadexG-25 将目的多肽置换到制剂缓冲液中。 Exendin-4 多肽纯化过 程的 Tris-Tricine 电泳图 ( 见图 5)。
实施例四
部分性质分析鉴定
(1) 纯度检测 ： 选用 C4 色谱柱 (100mm×4.6mm)， 检测波长为 214nm， 柱温 30℃， 流 速 0.8mL/min ； 以 H2O(0.1％ TFA) 为流动相 A， 以乙腈 (0.1％ TFA) 为流动相 B ； 线性梯度洗 脱从 20％ B 到 60％ B。结果表明 ： 目的多肽纯度为 99％ ( 见图 6)。
(2) 分子量检测 ： 基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF， ABI-4700 型 ) 进行分子量测定， 结果表明 ： 所纯化多肽的分子量为 4186.4， 与理论值一致 ( 见图 7)。
(3) 细胞体外活性检测 ： 选用大鼠胰岛素瘤细胞株 RINm-5F， 接种处于对数生长期 的细胞 1.0X105 个 /mL， 100μL 于 96 孔板→培养 2 天后， 待细胞长至 90％覆盖率→换为无 血清 1640 培养基， 饥饿孵育 2h →用 1640 培养基将样品和对照品预稀释到一定浓度， 然后 做 2 倍系列稀释梯度， 用此稀释梯度刺激 10min →去上清， 收集细胞， 用 R&D 公司的 cAMP 酶 免试剂盒检测各样品中的 cAMP 值。 经数据处理分析， 用 Exendin-4 样品浓度的 lg 值做 X 轴， cAMP 值做 Y 轴 ； 样品与 2 2 参考品的四点直线回归部分 ： R ( 参考品 ) ＝ 0.96、 R ( 样品 ) ＝ 0.95， 斜率无显著性差异， 活性与参考品相当 ( 见图 8)。
附图说明 ：
图1： 工程菌的质粒目的序列测序图 ；
图2： 批式培养发酵工艺过程， 融合蛋白表达图
各泳道是不同诱导剂作用下产生的菌体裂解上清， 诱导剂分别为 1 ： 0g/L 乳糖 ； 2： 3g/L 乳糖 ； 3： 6g/L 乳糖 ； 4： 9g/L 乳糖 ； 5： 12g/L 乳糖 ； 6： 15g/L 乳糖 ； 7： 0.4mMIPTG ； M： Marker。
图3： 乳糖诱导液补料发酵培养过程， 融合蛋白表达图
各泳道是发酵过程不同时间点样品的裂解上清， 分别是 1 ： 诱导 0h ； 2： 诱导 1h ； 3： 诱导 2h ； 4： 诱导 3h ； 5： 诱导 4h ； 6： 诱导 5h ； M： Marker。
图4： 纯化过程， 在线检测图 ；
图5： 纯化全程及目的多肽的 Tris-Tricine 图
各泳道分别为 1 ： 工程菌发酵诱导前上清 ； 2： 工程菌发酵诱导后上清 ； 3： Ni Sepharose6FF 亲和纯化融合蛋白 ； 4： 肠激酶酶切融合蛋白混合物 ； 5： C4 反相柱纯化后原 液的 3μL 上样 ； M： Marker ； 6： C4 反相柱纯化后原液的 6μL 上样 ； 7： C4 反相柱纯化后原液 的 10μL 上样 ；
图6： 目的多肽的 HPLC 纯度分析图 ；
图7： 目的多肽的质谱分析图 ；图8： 目的多肽的细胞活性检测分析图。 序列表 ： <110> 扬子江药业集团北京海燕药业有限公司 扬子江药业集团 <120> 基因重组 Exendin-4 的表达和制备新方法 <160>1 <170>Patentln 3.3 <210>1 <211>148 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 含酶切位点 <400>1 agatctggac gacgacgaca agcatggtga aggtaccttc accagcgatc tgtctaagca60aatggaagag gaggccgtgc gtctgtttat tgaatggctg aaaaacggtg gcccaagctc 120
tggcgcgccg ccaccaagct gactcgag 148
菌株构建补充说明 ：
1. 基因合成
全基因序列合成可由生物公司协助完成， 序列包括构建克隆所需的 BglII、 XhoI 酶切位点、 肠激酶酶切位点， 序列如 “序列表” 所述。
2. 表达载体构建
以购自 Novagen 公司的 pET32a(+) 为表达载体， 以 BglII、 XhoI 酶切位点将目的序 列片段插入表达载体。
3. 表达菌株构建
选用电转法或热激法， 将含有目的片段的表达载体转入 BL21(DE3)plysS 感受态 菌株， 该菌株购自 invitrogen 公司。涂布于 LB/Amp+ 培养基上， 挑选单克隆做鉴定。
4. 筛选与鉴定
可通过菌株 PCR、 提取质粒测序、 提取质粒酶切、 表达蛋白大小分析等手段检测所 挑选的菌株是否与设计的一致。
鉴于此， 本发明涉及的菌株可自行构建完成， 无需生物材料样品保藏。