技术内容：
本发明的目的在于提供一段运用基因重组技术制备的、
不包括CEA基因的I、II功能区，而仅含CEA信号肽编码
区和III区序列的1.1Kb CEA基因片段重组及CEA基因疫苗。
本发明的癌胚抗原基因片段包含CEA信号肽和III区编
码序列的1.1Kb CEA部分基因。
1091 bp CEA基因片段的核苷酸序列和开放读码框架
1 CAGAGGAATT CAGAGCAGAC AGCAGAGACC
ATG GAGTCTC CCTCGGCCCC
TCCCCACAGA
[ORF] M E S P S A P P H R
61 TGGTGCATCC CCTGGCAGAG GCTCCTGCTC ACAGCCTCAC TTCTAACCTT CTGGAACCCG
W C I P W Q R L L L T A S L L T F
W N P
121 CCCACCACTG CCAAGCTCAC TATTGAATCC ACGCCGTTCA ATGTCGCAGA GGGGAAGGAG
P T T A K L T I E S T P F N V A E
G K E
181 GTGCTTCTAC TTGTCCACAA TCTGCCCCAG CATCTTTTTG GCTACAGCTG GTACAAAGGT
V L L L V H N L P Q H L F G Y S W
Y K G
241 GAAAGAGTGG ATGGCAACCG TCAAATTATA GGATATGTAA TAGGAACTCA ACAAGCTACC
E R V D G N R Q I I G Y V I G T Q
Q A T
301 CCAGGGCCCG CATACAGTGG TCGAGAGATA ATATACCCCA ATGCATCCCT GCTGATCCAG
P G P A Y S G R E I I Y P N A S L
L I Q
361 AACATCATCC AGAATGACAC AGGATTCTAC ACCCTACACG TCATAAAGTC AGATCTTGTG
N I I Q N D T G F Y T L H V I K S
D L V
421 AATGAAGAAG CAACTGGCCA GTTCCGGGTA TACTCGAGGC TGCCCAAGCC CTCCATCTCC
N E E A T G Q F R V Y S R L P K P
S I S
481 AGCAACAACT CCAAACCCGT GGAGGACAAG GATGCTGTGG CCTTCACCTG TGAACCTGAG
S N N S K P V E D K D A V A F T C E
P E
541 GCTCAGAACA CAACCTACCT GTGGTGGGTA AATGGTCAGA GCCTCCCAGT CAGTCCCAGG
A Q N T T Y L W W V N G Q S L P V S
P R
601 CTGCAGCTGT CCAATGGCAA CAGGACCCTC ACTCTATTCA ATGTCACAAG AAATGACGCA
L Q L S N G N R T L T L F N V T R N
D A
661 AGAGCCTATG TATGTGGAAT CCAGAACTCA GTGAGTGCAA ACCGCAGTGA CCCAGTCACC
R A Y V C G I Q N S V S A N R S D P
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721 CTGGATGTCC TCTATGGGCC GGACACCCCC ATCATTTCCC CCCCAGACTC GTCTTACCTT
L D V L Y G P D T P I I S P P D S
S
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781 TCGGGAGCGA ACCTCAACCT CTCCTGCCAC TCGGCCTCTA ACCCATCCCC GCAGTATTCT
S G A N L N L S C H S A S N P S
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841 TGGCGTATCA ATGGGATACC GCAGCAACAC ACACAAGTTC TCTTTATCGC CAAAATCACG
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901 CCAAATAATA ACGGGACCTA TGCCTGTTTT GTCTCTAACT TGGCTACTGG CCGCAATAAT
P N N N G
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961 TCCATAGTCA AGAGCATCAC AGTCTCTGCA TCTGGAACTT CTCCTGGTCT CTGAGCTGGG
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1021 GCGACTGTCG GCATCATGAT TGGAGTGCTG GTTGGGGTTG CTCTGATA
TA G CAGCCCTGGG
A T V G I M I G V L V G V A L I
1081 TGTGGACCTT C
癌胚抗原基因片段的生产方法是在CEA信号肽编码区
的5’端和III区序列的3’端PCR引物中加入了XhoI的
酶切位点(CTCGAG)，使RT-PCR扩增出的二种基因片段
经限制性内切酶XhoI作用后，具有相同的粘性末端，而能
够被DNA连接酶连接，合成目的基因片段。
癌胚抗原基因疫苗，将CEA片段插入真核表达载体
pIRES1neo的多克隆位点，构建CEA裸DNA基因疫苗。克
隆入真核质粒pIRES1neo的外源基因是CEA部分基因片
段。
CEA疫苗在表达过程中，能排除重复序列间的干扰，增
强免疫原性，更有效地激活T细胞，诱导出特异性抗肿瘤免
疫应答。同时，由于新制备的基因片段较短，因此易于同其
它免疫增强基因和肿瘤基因重组，制成联合或多价疫苗，进
一步提高基因疫苗的抗肿瘤效果。
具体实施方式：
首先，根据CEA的基因序列分别设计并合成扩增CEA
信号肽编码区的特异性PCR引物(引物1：5’C AGAG
GAATTC AGAGCAGACAGCAGAGACCATGGA 3’，含EcoRI
酶切位点和起始密码子；引物2：5’AGC
CTCGAG
TATACCCGGAACTGGCCAGTTG 3’，含XhoI酶切位点)
和扩增III序列的引物(引物3：5’AGTCTC
CTCGAG
GCTGCCCAAGCCCTCCATC 3’，含XhoI酶切位点；引物
4：5’GAA
GGATCC ACACCAGGGCTGCTATATCAGA 3’，
含
BamHI酶切位点和终止密码子)，再以提自大肠癌组织
的总RNA为模板，应用RT-PCR技术合成相应的基因片段，
将二个PCR产物分别XhoI酶切，产生的粘性末端用DNA
连接酶连接，制备长约1.1Kb的CEA重组基因。然后，用EcoRI
和BamHI分别酶切重组基因和真核表达载体pIRES1neo，
经DNA连接反应，构建pIRES-CEA重组质粒。该质粒即
为CEA裸DNA疫苗，它不仅能够在哺乳动物细胞中表达，
而且具有大肠杆菌的复制子和氨苄青霉素抗性基因，可以在大
肠杆菌中大量复制生产。
本发明的特点和积极效果在于对构成基因疫苗的两大
要素-外源基因和表达载体的优化组合：
1、外源基因的重组
参与机体抗肿瘤免疫反应的主要是T细胞，T细胞识
别的不是整个CEA抗原分子，而是其中的CTL抗原肽表位。
因此，我们从CEAcDNA中优选了能编码产生CEA CTL表位
-YLSGANLNL和TYACFVSNL的III区片段，连接于CEA信号
肽编码区之后，用于CEA基因疫苗的制备，以排除重复序
列间的干扰，改善抗原的递呈，提高基因疫苗的免疫原
性，并使疫苗的作用更加专一、准确和安全。
2.真核表达载体的选择
以往基因治疗应用的表达载体将外源基因和筛选基因
分别置于不同启动子的控制下，因此二者的表达没有必然的
相关性，经筛选获得的阳性克隆中只有5-30％表达目的基
因。而本实验选择的真核表达质粒pIRES1neo含有内部核
糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)，插入
多克隆位点的CEA部分基因与筛选基因Neor分别位于
IRES的上下游，同处于能在真核细胞中高效表达的人巨细
胞病毒主要立即早期启动子/增强子CMV的调控之下，在
转染靶细胞后，能从一条mRNA上转录并翻译CEA蛋白和新
霉素磷酸转移酶II，使转染后经G418筛选获得的抗性克隆
都是高表达CEA基因的细胞株，提高了工作效率。
pIRES1neo中还含有二个拷贝的以CpG为核心、具有回文结
构的(5’AACGTT 3’)的免疫刺激DNA序列
(immunostimulatory DNA quence，ISS)，可以引导免疫反应向
TH1倾斜，并显著增强对外源基因编码抗原的免疫应答。
基因重组疫苗综合了三代疫苗的优点，兼有减毒活疫苗
的有效性、亚单位疫苗的安全性和基因疫苗的准确性。它可
以在体内模拟自然感染过程，持续产生重组抗原蛋白，刺激
机体免疫系统，激发理想的抗肿瘤免疫应答；同时疫苗的质
量易于控制和评价，并方便储存和运输，适于大规模生产，
具有广泛的应用前景和商品化潜力。本发明根据治疗目的重
组了CEA基因片段，疫苗的DNA及氨基酸序列清楚，抗原性
更强，并减少了序列之间的干扰，使基因免疫的效果更加专
一、精确和安全。经过对新建pIRES-CEA质粒的序列分析
证明，重组子中CEA基因片段的开放读码框架结构正确，与
实验设计相一致，能够在真核细胞中获得正确表达及剪切，
并被特异性T细胞识别，
本发明的实施方法如下：
一、CEA基因片段的重组
1、PCR引物设计与合成：二对PCR引物均自行设计并
用末端终止法由DNA合成仪合成。引物序列如下。
CEA信号肽编码区引物：
引物1 5’CAGAG
GAATTC AGAGCAGACAGCAGAGACCATGGA
3’
(含EcoRI酶切位点及起始密码子)
引物2 5’AGCCTCGAGTATACCCGGAACTGGCCAGTTG 3’
(含
XhoI酶切位点)
III区编码序列引物：
引物3 5’AGTCTCCTCGAGGCTGCCCAAGCCCTCCATC 3’
(含
XhoI酶切位点)
引物4 5’GAAGGATCCACACCAGGGCTGCTATATCAGA 3’
(含
BamHI酶切位点及终止密码子)
2、提取大肠癌组织总RNA：
(1)取新鲜大肠癌组织，剪成小块后每0.1克组织加入
1.2ml预冷的变性裂解液(4.0M硫氰酸胍、25mM柠檬酸钠
pH7.0、0.5％十二烷基肌酸钠、0.72％β-巯基乙醇)，在匀浆器
中粉碎，裂解细胞。
(2)加2M乙酸纳(pH4.0)0.12ml，混合。
(3)加酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)1.2ml，用力混合
后，置冰上15min。
(4)4℃、12000rpm离心20min。
(5)小心转移上层水相，加等体积异丙醇，-20℃沉淀30min
以上。
(6)4℃、12000rpm离心20min。
(7)弃掉上清，再加变性液1ml重悬RNA沉淀物。
(8)加等体积异丙醇，-20℃沉淀30min以上。
(9)4℃、12000rpm离心20min。
(10)弃净上清，用预冷的75％乙醇洗涤离心2次。
(11)沉淀晾干后，用50μlDEPC水溶解。
(12)紫外分光光度计定量后，-20℃保存备用。
3、cDNA合成
在反应体系中依次加入RNA模板1-2μg、oligo(dT)121μl
(100μg/ml)、dNTP(各10mmol/L)2μl、RNA酶抑制剂20U、
AMV反转录酶20U、10×AMV反应缓冲液2μl、加DEPC水至
20μl，42℃水浴30min，95℃ 5min。
4、PCR扩增和产物回收：
上述反应体系中再加入特异性引物1+2(或3+4)4μl
(20pmol)、dNTP8μl、Tag(Ex)聚合酶2.5U、10×Tag酶反应
缓冲液10μl、加双蒸水至100μl。循环扩增程序为：预变性
95℃ 5min，然后变性95℃ 1min、复性58℃ 1min、延伸72℃ 1.
5min，共30个循环，充分延伸72℃ 10min。琼脂糖凝胶电泳
鉴定PCR产物后用DNA纯化试剂盒回收。
5、DNA的限制性内切酶消化：
DNA的酶切反应均按照此条件进行，即每μg DNA片段
用5U限制性内切酶消化(此处为XhoI)，加1/10体积的
限制性内切酶反应缓冲液，再加双蒸水至酶体积的10倍。
按照限制性内切酶供应商提供的温度反应2-3小时。
6、DNA连接反应：
反应体系包括CEA信号肽编码区(3’端有XhoI
酶切的粘性末端)和III区编码序列(5’端有XhoI酶
切的粘性末端)各0.5μg、T4DNA连接酶1μl、10×T4
DNA连接酶缓冲液2μl、加双蒸水至20μl。16℃，连接
12-16小时。
二、构建真核表达质粒pIRES-CEA
1、双酶切反应：
用EcoRI和BamH I分别制备有粘性末端的CEA重组
基因和线性载体pIRES1neo。
2、DNA片段的连接：
反应体系中CEA重组基因和线性载体pIRES1neo的体
积比为1∶2-4。16℃，连接12-16小时。
三、重组质粒pIRES-CEA的大量生产
1、制备感受态大肠杆菌(氯化钙法)：
(1)用无菌接种环刮取冻存于液氮中的大肠杆菌菌种，划线接种
于LB琼脂平皿，37℃培养12-16h。
(2)挑取单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，37℃、
200rpm/min振摇培养12h。
(3)取1％培养液，接种于50ml LB液体培养基中，37℃、
250rpm/min振摇培养2-3h，至OD600＝0.4-0.6。
(4)取出后立即冰浴10min。
以下均需无菌操作。
(5)将培养液转移到用冰预冷的50ml离心管中，4℃、4000rpm
离心10min。
(6)弃净上清液，用冰预冷的0.1mol CaCl2 10ml重悬菌体，冰水
浴30min。
(7)4℃、4000rpm离心10min，弃净上清液。
(8)用冰预冷的0.1mol CaCl22ml重悬菌体，4℃放置12-24h，即
成感受态细菌。可分装为200μl/份，加30％甘油，-70℃保存备用。
2、细菌转化
(1)取50ng质粒加入含0.2ml感受态细菌的无菌玻璃试管中，轻
轻混匀，冰水浴30min。
(2)42℃热休克90s。
(3)加0.8μl LB液体培养基，37℃、120rpm/min温和振摇45mi。
(4)用玻璃弯头铺菌器将200μl菌液涂于含氨苄青霉素50μg/ml的
琼脂培养皿中，37℃平放吸附20min后，倒置培养10-14h。
3、重组质粒的快速鉴定
(1)将转化菌落依次转移到含Amp的琼脂培养皿中，编号后，37
℃过夜培养。
(2)挑取适量菌落，加入25μl溶液A，混匀。
(3)加入25μl溶液B，混匀，70℃保温5min后，4℃、12000rpm
离心10min。
(4)取上清，行琼脂糖凝胶电泳(同时用空质粒作对照)，根据分
子量大小确定是否为重组质粒。
4、质粒的大量提取(碱裂解法)：
(1)将1％转化菌接种于100ml LB培养基(含Amp50μg/ml)中，
37℃、250rpm/min振摇培养12-16h，至OD600＝0.6-0.8。
(2)取出后立即冰浴10min，转移到用冰预冷的50ml离心管中，
4℃、4000rpm离心10min。
(3)弃净上清液，加入冰预冷的溶液I(40mmol/L葡萄糖、
2540mmol/L Tris-CI pH8.0、10mmol/L EDTA pH8.0)4ml，剧烈震
荡混匀。
(4)加新鲜配制的溶液II(0.2mol/L NaCI、1％SDS)8ml，缓慢
颠倒混匀，放置5-10min。
(5)加用冰预冷的溶液III(5mol/L乙酸钾3.6ml、3mol/L冰乙酸
0.69ml、双蒸水1.71ml)6ml，颠倒混匀，冰水浴10min。4℃、8000rpm
离心10min。
(6)取上清液，加0.6体积异戊醇，混匀，-20℃沉淀20min。4℃、
12000rpm离心10min。
(7)弃净上清液，用70％乙醇洗沉淀，晾干，溶于1.2mlTE(pH8.0)
溶液中。
(8)加Rnase A 30μl，37℃水浴30min。
(9)加等体积平衡酚，混合。5000rpm离心10min。
(10)小心吸取上层水相，平衡酚抽提及氯仿-异戊醇(24∶1)抽提。
(11)5000rpm离心10min，小心吸取上层水相。
(12)加1/10体积NaAc(pH5.3)，2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-20
℃沉淀20min。
(13)12000rpm离心10min，弃净上清，70％洗2次。
(14)沉淀晾干，溶于200μl TE(pH8.0)溶液中。
(15)取10μl按1∶100稀释后测量OD260，计算质粒DNA浓度。
-20℃保存备用。