一株邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌及其应用.pdf

本发明属于环境污染修复领域，公开了一株邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌，其分类命名为Camelimonas sp.，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年1月9日，保藏编号为CCTCC NO:M2015029。本发明还公开了上述邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌的应用，该菌株可以在高温条件下降解不同侧链长的邻苯二甲酸二酯类增塑剂。本发明采用邻苯二甲酸二酯类增塑剂长期污染的土壤中筛选所得的高效降解菌，可有效去除邻苯二甲酸二酯类增塑剂。上述降解菌株可以用于农产品、食品加工过程中添加的邻苯二甲酸二酯类增塑剂的去除，同时可以用于修复邻苯二甲酸二酯类增塑剂污染的土壤、水体等环境，在实际应用中具有较大的潜力。

权利要求书
1.  一株邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌，其分类命名为Camelimonas sp.，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年1月9日，保藏编号为CCTCC NO:M2015029。

2.  权利要求1所述的邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌在降解邻苯二甲酸二酯类增塑剂中的应用。

3.  根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的邻苯二甲酸二酯类增塑剂选自不同碳链长邻苯二甲酸二酯类塑剂中的一种或多种。

4.  根据权利要求3所述的应用，其特征在于，邻苯二甲酸酯苯环结构侧链含碳数范围为C1～C6。

5.  根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的邻苯二甲酸二酯类增塑剂选自邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二戊酯和邻苯二甲酸二己酯中的一种或多种。

6.  根据权利要求2所述的应用，其特征在于，邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌适宜在20～50℃范围内降解邻苯二甲酸二酯类增塑剂。

说明书一株邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌及其应用
技术领域
本发明属于环境污染生物修复领域，具体涉及一株邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌及其应用。可用于农产品、食品加工过程中的邻苯二甲酸二酯类增塑剂的去除，同时可以用于修复邻苯二甲酸二酯类增塑剂污染的土壤、水体等环境。
背景技术
增塑剂，即塑化剂，是一种高分子材料助剂。广泛应用于国民经济各领域，包括塑料、橡胶、粘合剂、纤维素、树脂、医疗器械、电缆等成千上万种产品中。塑化剂种类多达百余种，但使用得最普遍的即是一群称为邻苯二甲酸二酯类的化合物。中国增塑剂行业协会公布的数据显示，目前全球的增塑剂产能约800万吨，中国为450余万吨，占全球产能的56％；中国增塑剂年消费量约为220万吨，占全球消费量的37％左右，年进口量近11万吨。中国已成为全球最大的增塑剂生产国、消费国和进口国，并且中国的增塑剂市场多年来一直由邻苯类增塑剂主导。邻苯二甲酸二酯类增塑剂的作用机理是将邻苯二甲酸二酯分子插入到聚合物分子链之间，削弱了聚合物分子链间的作用力，结果增加了聚合物分子链的移动性、降低了聚合物分子链的结晶度，从而增加聚合物的可塑性。由于邻苯二甲酸二酯并未与聚合物发生共价结合，所以易于从聚合物中迁移出来，进入环境并累积。邻苯二甲酸二酯类增塑剂对人体具有较大危害，可导致动物存活率降低、体重减轻、肝功能下降、血中红细胞减少，具有致突变性和致癌性等。因此美国环保署已将其列为优先环境污染物，并对其使用量进行了严格控制。但是已经进入环境的邻苯二甲酸二酯类增塑剂仍然存在，目前国际上针对去除进入环境的邻苯二甲酸二酯类增塑剂进行了多方面的研究，提出了利用化学、物理、生物学方法等多种解决途径。其中生物学方法具有无毒、无残留、无二次污染的优势。微生物在污染物消除的生物学解决途径中具有独特的作用。
微生物降解修复技术是近几年才兴起的一种新型的环境污染修复技术。该技术和物理化学方法相比，具有很多无可比拟的优点，如处理效果好，适合有毒有害有机污染物大面积面源污染的降解修复，修复费用较低(仅为传统化学、物理修复经费的10％左右)，不产生二次污染等。在国内外，生物修复技术已经广泛应用于石油、化工和有机污染的 清除。
目前，国内外已经有关微生物降解邻苯二甲酸二酯类增塑剂的报道，但到目前为止还未见能在相对高温条件下同时有效降解不同链长邻苯二甲酸二酯类增塑剂生物修复技术的研究和应用报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题，是提供一株邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌，用于农产品、食品加工过程中添加的邻苯二甲酸二酯类增塑剂的去除，同时可以用于修复邻苯二甲酸二酯类增塑剂污染的土壤、水体等环境。
本发明还要解决的技术问题，是提供上述邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一株邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌，其分类命名为Camelimonas sp.，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏日期为2015年1月9日，保藏编号为CCTCC NO:M2015029。该菌株是发明人于2011年9月从江苏省南京市垃圾填埋场分离得到。
上述菌株Camelimonas sp.的生理特性见表1。
表1

上述邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌，其16SrDNA基因上有效长度约为1377bp的核 苷酸序列，16SrDNA序列如SEQ ID No.：1所示。将该序列输入GenBank，用Blast软件与数据库序列进行比对分析，结果表明与Camelimonas sp.菌的16SrDNA序列相似性较高，为99％。基于16SrDNA基因的系统发育分析结果以及生理生化特性，鉴定为Camelimonas sp.。
上述邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌在降解邻苯二甲酸二酯类增塑剂中的应用。
其中，所述的邻苯二甲酸二酯类增塑剂选自不同碳链长邻苯二甲酸二酯类增塑剂中的一种或多种。邻苯二甲酸酯侧链含碳数范围优选为C1～C6。
所述的邻苯二甲酸二酯类增塑剂优选自邻苯二甲酸二酯类增塑剂选自邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二戊酯和邻苯二甲酸二己酯中的一种或多种。
上述邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌适宜在20～50℃范围内降解邻苯二甲酸二酯类增塑剂，优选在40～50℃范围内降解邻苯二甲酸二酯类增塑剂，最优选在40℃降解邻苯二甲酸二酯类增塑剂。
有益效果：本发明与现有技术相比具有如下优点：
1.本发明采用邻苯二甲酸二酯类增塑剂长期污染土壤中筛选得到高效降解邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌，该菌株能同时降解不同侧链长的邻苯二甲酸二酯类增塑剂：邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二戊酯和邻苯二甲酸二己酯，常温下对0.10mM上述的各类邻苯二甲酸二酯降解效果均在50％以上。
2.本发明所获邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌，在环境温度为40℃时对邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解效果最高，短时期内可100％降解0.10mM的邻苯二甲酸二酯类增塑剂。这相对比其他筛选得到的邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌，最适降解温度较高，降解效果更高。这有利于本发明所获得降解菌生产的菌剂可用于高温环境下污水、堆肥等邻苯二甲酸二酯类增塑剂污染的去除。
附图说明
图1邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌筛选结果图(平板透明水解圈)。
图2邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌的生长曲线及邻苯二甲酸二酯类增塑剂水解酶酶活；(酶活指40℃下每毫克蛋白在每分钟时间里所降解的邻苯二甲酸二酯类增塑剂量/μM)。(图2中的“○”代表邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌生长曲线，“△”代表不同生 长阶段降解菌对应水解酶酶活)。
图3邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌的底物降解范围；其中，DMP：邻苯二甲酸二甲酯；DEP：邻苯二甲酸二乙酯；DPP：邻苯二甲酸二丙酯；DBP：邻苯二甲酸二丁酯；DNPP：邻苯二甲酸二戊酯；DNHP：邻苯二甲酸二己酯。
图4邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌在不同环境温度下的降解邻苯二甲酸二乙酯性能。
图5邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌在不同环境温度下的降解邻苯二甲酸二丙酯性能。
图6邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌在不同环境温度下的降解邻苯二甲酸二丁酯性能。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：高效菌株分离。
从江苏省南京市采集土样，放于灭菌采样瓶中，立即带回实验室。加入无菌水振荡，对浑浊土壤溶液进行梯度稀释。
将上述梯度稀释土壤溶液进行涂布布氏培养基平板，30℃温度条件下培养24-96h。所述布氏培养基配方为，1L蒸馏水中含：胰蛋白胨10.0g，鱼类蛋白胨10.0g，葡萄糖1.0g，酵母提取物2.0g，氯化钠5.0g，亚硫酸氢钠0.1g，琼脂粉15g。溶解后NaOH调节pH为7.0，115℃高压灭菌30min。冷却至45～50℃，加入已过滤除菌的胎牛血清50ml至终浓度为5％。布氏培养基中加入终浓度为0.10mM的邻苯二甲酸二酯类增塑剂。
对上述培养基中产生透明水解圈较大的细菌进行纯培养，得到一株降解能力较强的细菌，命名为：M11。该菌株为Camelimonas sp.，2015年1月9日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，菌种保藏号为CCTCC NO:M2015029，主要生物学特性为G-，菌体为短杆状，菌落白色透明，易挑起。
实施例2：邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌的水解活性。
将上述所得邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌接种至布氏培养基中，30℃、200rpm振荡培养，并定期取样测定培养液OD600及邻苯二甲酸二酯类增塑剂水解酶活性，由此计算相对应的邻苯二甲酸二丁酯降解率。菌液离心，用等体积(10mM，pH7.0)磷酸钠缓冲液重悬菌体，超声破碎20分钟。取200μl粗酶液添加到2ml含0.10mM邻苯二甲酸二丁酯的(10mM，pH7.0)磷酸钠缓冲液中，30℃水浴1h。加入2倍体积甲醇，充分混匀，离心后取上清液用HPLC/MS检测降解效果。检测条件如下：干燥气体的温度，250℃；干燥气体流速(氮气)，8L/min；喷雾器气体压力(氮气)，35psi；毛细管电压，4000伏特；鞘气的温度，300℃；鞘气的流量，10L/min；喷嘴电压，400伏特。高效液相色谱柱为Eclipse XDB-C18柱为4.6毫米×250毫米，5.0微米的颗粒大小(Agilent)。流动相为90％甲醇和10％水，流速为1ml/min。如图2所示，该菌株在培养8h后即进入对数生长期，28h后生物量达到最高。培养36h后邻苯二甲酸二丁酯降解酶活最高，提高近10倍，后来逐渐下降至稳定。
实施例3：邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌的底物降解范围。
将上述得到的邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌采用布氏培养基，30℃、200rpm振荡培养至邻苯二甲酸二酯类水解酶活性最高，即培养36h后，无菌条件下经12000rpm离心5min，灭菌10mM的磷酸钠缓冲液洗涤两次后，5％接种量接至含终浓度为0.10mM不同链长邻苯二甲酸二酯类增塑剂的无机盐液体培养基中，30℃、200rpm振荡培养60h。无机盐液体培养基配方为，1L蒸馏水中含NaCl 1.0g，(NH4)2SO41.0g，K2HPO41.5g，KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O 0.01g。溶解后NaOH调节pH7.0，121℃高压灭菌20min。邻苯二甲酸二酯类增塑剂去除效果如图3所示，所得到的降解菌可以降解转化不同链长邻苯二甲酸二酯类增塑剂，包括C2-C5：邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二丙酯(DPP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二戊酯(DNPP)，并且对邻苯二甲酸二丙酯(DPP)的降解性最强，60h内可被降解约90％，其次为邻苯二甲酸二乙酯(DEP)，60h内被降解约70％，邻苯二甲酸二丁酯(DBP)在60h内被降解约60％，邻苯二甲酸二戊酯(DNPP)60h内被降解约30％。而对短链酯邻苯二甲酸二甲酯(DMP)和较长链酯邻苯二甲酸二己酯(DNHP)均无降解性。
实施例4：邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌在不同环境温度下的降解性能。
将上述得到的邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌采用布氏培养基，30℃、200rpm振荡培养至邻苯二甲酸二酯类水解酶活性最高，即培养36h后，无菌条件下经12000rpm离心5min，灭菌10mM的磷酸钠缓冲液洗涤两次后，5％接种量接种至终浓度各为0.10mM邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丙酯和邻苯二甲酸二丁酯的无机盐液体培养基中，于不同温度20～50℃、200rpm振荡培养72h。加入2倍体积甲醇，充分混匀，离心后取上清液用HPLC/MS检测降解效果。如图4～6所示，筛选所得邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌在20～35℃环境下，均保持50～60％的降解性，当温度升高到40℃时降解性最高，几乎降解100％的邻苯二甲酸二丙酯和邻苯二甲酸二丁酯，对邻苯二甲酸二乙酯也有60％的降解活性。当温度上升到50℃时，邻苯二甲酸二酯类增塑剂降解菌仅残余不到20％的降解活性。