利用产甘油假丝酵母突变株好氧发酵生产甘油的方法 本发明涉及利用产甘油假丝酵母突变株好氧发酵生产甘油的方法。
甘油是重要的轻化工原料，用途极广，目前甘油来源主要为制皂工业的副产物和化学合成。但是用传统的皂化法生产甘油，产量不能满足市场需求，而用合成法生产成本太高。早期也采用过厌氧发酵法工业化生产甘油，但是其成本过高且污染过大，因而未能继续生产。目前现有技术中所采用的发酵生产甘油的方法主要是好氧发酵法，主要应用的菌株有汉逊氏糖酵母、毕赤氏酵母、球拟酵母、曲霉、乳杆菌和芽孢杆菌等。在本发明人的早期工作中选育了一株能产甘油的耐高渗压酵母即产甘油假丝酵母WL2002-5，该菌株在含葡萄糖23-25％的发酵培养基中甘油含量达12％以上，糖转化率50％，甘油产率达30克/升/天。但是该菌株的不足之处是当发酵液中葡萄糖含量低于1-2％时要同化甘油，使继续发酵时甘油含量下降，当用于工业化生产时导致发酵最佳放罐时间难于控制，经济损失较大。本发明人以WL2002-5为出发菌株，经理化诱变终于获得一株不同化发酵液中甘油的变异株，并将其用于工业化发酵生产甘油，终于完成了本发明。
因此，本发明的目的在于提供一种好氧发酵生产甘油的方法，该方法利用产甘油假丝酵母突变株发酵生产甘油。
根据本发明，提供了一种好氧发酵生产甘油的方法，所述方法包括如下步骤：
液化及糖化淀粉质原料如玉米、大米、红薯、木薯等，最终制得糖浓度为20-30％(w/v)的净糖液；
向上述净糖液中加入尿素、玉米浆配制成发酵培养基，调节pH值为3.0-5.0，其中培养基中尿素含量为0.1-0.3％(w/v)，玉米浆含量为0.1-0.3％(w/v)；
向上述发酵培养基中加入2-10％(v/v)经过分级培养的种子培养液，在30-100立方米发酵罐中进行好氧发酵，其中通风比为0.05-0.2∶1(风量V：发酵液V/分钟)，发酵温度为29-33℃，发酵时间为70-120小时，所用菌种为产甘油假丝酵母变种(Candidaglycerolgenesis var.rho)；
离心发酵液除去菌体，加入烧碱，真空浓缩获得粗甘油，其中甘油含量为70-80％(w/v)；
将粗甘油泵入载体罐，加入占总残糖量5-15％的载体于120℃-200℃进行真空蒸馏制得黄甘油，最后经脱臭和脱色处理获得成品甘油，其中所用载体为凹凸棒土或奥土。
根据本发明方法，成熟发酵醪中甘油含量可达8-13.5％(w/v)，糖转化率为45-60％。
根据本发明方法，所用的菌株产甘油假丝酵母变种(Candidaglycerolgenesis var.rho)已于1993年5月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 93018。该菌株的细胞形态为椭圆形，芽殖，形成典型假菌丝。菌落为圆形、隆起、边缘不整齐、粗糙型白色。糖发酵试验及碳源利用试验结果见表1和表2所示。
表1糖发酵试验糖 结果糖 结果发酵试验D-葡萄糖 +*D-半乳糖 -麦芽糖 -蔗糖 -/+**岩藻糖 -蜜二糖 -发酵试验乳糖 -纤维二糖 -棉籽糖 -菊糖 -淀粉 -D-木糖 -*强烈发酵**微发酵
表2碳源利用特征碳源利用试验 结果碳源利用试验 结果D-葡萄糖 +D-半乳糖 -L-山梨糖 -D-木糖 -L-阿拉伯糖 -L-鼠李糖 -蔗糖 +麦芽糖 +/*岩藻糖 +/-纤维二糖 -蜜二糖 -乳糖 -棉籽糖 -菊糖 -淀粉 -甘油 -赤藓醇 -L-阿拉伯醇 -D-甘露醇 -柠檬酸 +**硝酸盐 -甲醇 -乙醇 +肌醇 -糊精 -无维生素培养基生长 +*缓慢生长**弱利用
与目前已有的发酵甘油方法相比，本发明的方法由于采用了不同化甘油的产甘油假丝酵母变种，使得甘油产量有较大提高，工业化生产含葡萄糖23-25％的发酵培养基，甘油产量达110-120g/L。另外，本发明方法所采用的无机粉末载体提取甘油技术能使甘油的蒸馏收率达90％以上，并且蒸馏过程中形成的锅垢很易除去，便于连续进行真空蒸馏操作。
以下以实施例更详细地说明本发明。
实施例1
取工业级淀粉(直购自淀粉厂)9000公斤，制成粉状乳浆，每克淀粉加入8-10单位地α-淀粉酶，在85-100℃下液化30-60分钟，再加入120单位/克淀粉的α-1，4葡萄糖苷酶于55-65℃糖化20小时，过滤后制得糖浓度为26.5％的净糖液28500公斤。向净糖液中加入95公斤玉米浆和60公斤尿素。添加8％分级培养的产甘油假丝酵母变种种子培养液，在40立方米的气升式内循环发酵罐中进行好氧发酵，通风量为300-400立方米/小时，温度30-32℃，发酵100小时，成熟发酵液含甘油11.5％，糖转化甘油率55.15％，残余总糖1.75％。离心发酵液除去菌体，真空浓缩获得粗甘油4100公斤，甘油含量为78％，残留总糖12％。将此粗甘油泵入载体罐，加入奥土25公斤，搅拌均匀。将该混合物吸入载体蒸馏器，在真空度为-0.1--0.09MPa进行水蒸汽真空蒸馏。得到2960公斤黄甘油，其甘油含量为98％。
实施例2
如实施例1所述进行发酵86小时，只是采用的原料为11000公斤木薯粉，采用通风搅拌发酵罐，通风量为250-300立方米/小时，载体为30公斤。最后得黄甘油2706公斤。
实施例3
如实施例2所述进行发酵80小时，只是采用的原料为9000公斤已轻度霉变的玉米淀粉，凹凸棒土35公斤。最后得黄甘油2878公斤。
实施例4
如实施例1所述进行发酵82小时，采用玉米淀粉8500公斤，凹凸棒土25公斤。最后得黄甘油2543公斤。