白菜类蔬菜转育新型甘蓝型油菜细胞质雄性不育系材料及其获得方法 技术领域 本发明涉及白菜类蔬菜转育新型甘蓝型油菜细胞质雄性不育系材料及其获得方法。
背景技术 白菜类蔬菜具有明显的杂种优势。国内已经广泛开展了大白菜的杂种一代利用工作，但普遍采用自交不亲和系或自交亲和系的方法进行杂种一代生产，该方法存在着生产原种成本高、技术复杂、易发生双亲生活力衰退和容易出现假杂种，影响一代杂种质量等问题。利用大白菜雄性不育系生产一代杂种，可以克服上述问题。特别是大白菜细胞质雄性不育系材料的选育和利用是白菜育种及杂种优势利用的有效途径之一。利用胞质雄性不育系制种既可以获得高质量的杂种后代，又可以保护育种者的利益。为此，寻找优良的细胞质雄性不育系，克服利用自交不亲和系育种和制种的缺陷，一直是育种者追求的重要目标。
七十年代初，我国学者发现并首创了利用雄性不育二用系(核单隐性基因雄性不育)育成了品种，并在生产上推广应用(如大白菜156、沈阳快菜等)，但由于制种时需多次拔除50％的可育株，费时费工，而且往往制种产量较低，从而限制了该不育系的应用和发展。沈阳市农业科学研究所张书芳(1989)首次培育出核基因互作雄性不育系并育成了“快菜一号”等杂交种大面积推广应用。该雄性不育系不育度和不育株率均可达到100％，可以配制出高质量杂交种，采种量也较高，其缺点是相当于三交种，杂种纯度受到一定影响；另外雄性不育系的转育较困难。1968年萝卜胞质不育(Ogu CMS)被发现，并在世界范围内广泛传播，但低温黄化及蜜腺退化是其致命弱点。李光池等(1995)回交转育该不育系16代后，只获得了黄化现象相对减弱的134大白菜胞质不育系，却又因植株生长势弱、配合力不强等原因而未能实用。近20年来，国内外研究最多和利用最广泛的是Ogu胞质不育(萝卜细胞质雄性不育)和Pol胞质不育(波里马细胞质雄性不育)。
八十年代初，我国对由美国引进的Ogu萝卜细胞质雄性不育源做了大量的向白菜转育的研究工作。但该不育源存在叶片黄化、生长迟缓、蜜腺退化和配合力差等缺陷，所以至今未能在生产上得到利用。美国康奈尔大学用Ogu萝卜细胞质雄性不育花椰菜与白菜型油菜进行细胞质融合，获得了合成的雄性不育甘蓝型油菜体细胞杂种，表现出低温不黄化的优点，与白菜杂交、多代回交后获得了白菜低温不黄化的Ogu细胞质雄性不育材料。1992年，北京蔬菜研究中心引进了这种经过改良的萝卜胞质大白菜雄性不育系95A12、95A13。在与白菜连续多代回交转育后，发现该不育材料随转育代数的增加虽逐渐整齐，但材料退化较快，部分幼苗表现畸形，同时杂种优势弱、配合力差，应用前景暗淡。中国农科院蔬菜花卉所对所引进的萝卜胞质雄性不育材料Nycms进行了转育和研究，得到了同样的结论。
陕西省农科院蔬菜花卉所利用甘蓝型油菜Polima不育源为材料转育成异源胞质白菜不育系CMS
3411-7(专利号为92104134.9)，其不育株率可达100％，不育度在95％以上，但致命的弱点是在不利的环境条件下会出现微量花粉和轻度蕾败育现象。北京蔬菜研究中心用Polima不育源杂13、杂33与大白菜多代回交转育地研究，发现其育性不稳定，容易出现有粉株，影响整体纯度，很难利用。温度敏感一直是Pol CMS的一个难以彻底解决的重要问题，其存在的微量花粉现象(即不育性不稳定)已成为育种者所关注的问题。因为在杂交制种中，如果遇到不育系开花过早(花期不遇)，且有微粉发生时，就可能出现自交苗从而降低制种杂交率(花期相遇时，由于白菜自交的迟配性，即使出现微粉也不影响杂交率)。Ogu-CMS存在多代转育后植株长势退化、杂交优势差，Pol CMS存在育性受环境条件影响的缺陷等缺点。因此寻找能够克服Ogu白菜胞质不育系和Pol白菜胞质不育系上述缺点的新型大白菜不育系材料是非常必要的。
发明内容 本发明的目的是提供一种不育性稳定、组合力强、转育容易、生长势旺、抗病性强、增产明显的白菜类蔬菜转育新型甘蓝型油菜细胞质雄性不育系材料。
本发明的另一个目的是提供这种白菜类蔬菜转育新型甘蓝型油菜细胞质雄性不育系材料的获得方法。
为实现上述目的，本发明采取以下设计方案：
白菜类蔬菜转育新型甘蓝型油菜细胞质雄性不育系材料的获得方法，该方法包括以下步骤：
(1)将甘蓝型油菜胞质不育系与白菜类蔬菜进行人工蕾期剥蕾或花期套袋杂交，露出柱头后，将白菜的花粉涂于其上，柱头正常膨大，获得转育一代种子；
(2)将转育一代种子采用加代处理的方法，结合田间观察，选择优良不育系单株，并用白菜优良株系进行多代回交转育；
(3)回交五代后获得稳定遗传的白菜细胞质雄性不育系材料。
所述加代处理方法是指每年加代1～2代。具体做法为：将刚收下的种子用清水浸20～40分钟，再放到2～4％的双氧水中浸2～4小时，在23～27℃下催芽，次日将萌动的种子放到1～5℃冰箱春化处理20～30天。取出后播到20～21℃的温室中，夜间采用光照强度为3000lux的光源进行补充光照到16小时日长。25～30天可以抽薹开花，然后进行人工回交授粉。
白菜类蔬菜转育新型甘蓝型油菜细胞质雄性不育系材料的获得方法，该方法为：将小白菜与稳定的大白菜不育系材料进行蕾期剥蕾和花期套袋杂交，获得稳定遗传的小白菜细胞质不育系材料。小白菜不育系材料也可使用前述方法获得，但使用本方法比使用前述方法更省时、高效。
本发明的有益效果：本发明提供的白菜类蔬菜不育系材料具有以下突出优点：(1)所获得的不育系属于细胞质不育，其不育性稳定，多代回交不退化，转育容易，生长势旺，组合力强。
(2)转育早代，不育系比保持系植株生长势强，具有种间杂交优势。
(3)转育早代，不育系的晚抽薹性比保持系强。
(4)用不育系配制F1，种子产量高，制种成本低，省工。
(5)不育系抗病性强，增产明显。
本发明提供的该材料的获得方法简便，成本低廉，便于推广，市场前景广阔。
下面结合附图对本发明作进一步说明。
图1为本发明雄性不育系的花和花药图
图2为转育早代不育系和相应的保持系的抽薹性比较图(左：为不育系，处于现蕾期；右：为保持系，处于抽薹期)
图3-1为转育早代的不育系叶片(左)与保持系叶片(右)比较图
图3-2为转育早代的不育系的结球情况(半抱球)和外叶性状(半裂叶)图
实施例1、大白菜转育新型甘蓝型油菜细胞质雄性不育系材料的获得
一、材料和方法：
1、材料
甘蓝型油菜细胞质雄性不育系材料CMS96来源于法国，其蜜腺正常，叶片不黄化，花瓣大，花药白色退化，柱头正常，植株生长旺盛。
用于转育的白菜材料56份，其中26份大白菜材料，是一些普通类型的需要改良和提高抗病性的材料。余下的30份材料是纯合的、各种类型的大白菜材料。所有材料都来源于北京市蔬菜研究中心。
2、方法
(1)从1996年春季开始，采用人工蕾期剥蕾或花期套袋技术进行甘蓝型油菜细胞质不育系与大白菜杂交和多代回交转育其雄性不育性。方法为：剥开甘蓝型油菜细胞质不育系CMS96的花蕾，露出柱头后，将26份大白菜株系的花粉涂于其上，柱头正常膨大，获得转育1代种子；
(2)将转育1代种子采用加代处理的方法，每年加代1～2次，同时结合秋天选留老株和春季小株授粉进行多代回交转育。对转育的每一世代都调查植株的植物学性状，淘汰叶柄有缺刻、偏向甘蓝型油菜的裂叶型等中间材料，选留叶形与白菜相似的单株，并用白菜优良株系进行多代回交转育。历年春播或秋播不育系的代号为：98-517，98-518，98-519，98-520；99-327，99-329，99-331，99-332；00.3-195，00.3-226，00.3-351；01.3-178，01.3-204，01.3-307；02.3-178，02.3-196，02.3-311。
加代的具体做法是：将刚收下的种子用清水浸泡30分钟，再放到3％的双氧水中浸3小时，在25℃下催芽，次日将萌动的种子放到3℃冰箱春化处理25天。取出后播到20℃～21℃的温室中，夜间采用光照强度为3000lx的光源进行补光。25天～30天可以抽薹开花，然后与大白菜进行人工回交授粉。
(3)获得稳定遗传的大白菜细胞质不育系材料：按上述方法经过5代回交即可获得性状稳定的大白菜CMS96胞质不育系材料。目前已获得了5份不育性稳定、经济性状优良、生长整齐一致的、纯合的大白菜CMS96胞质不育系材料，(02.3-168，02.3-178，02.3-196，02.3-307，02.3-311)。继续用30份各种类型的、纯合的大白菜与2份纯合、稳定的大白菜不育系进行回交转育，进一步扩大该不育系的利用范围。同时利用稳定的大白菜细胞质不育系试配杂种一代。
二、结果与分析
1、用26份大白菜材料与甘蓝型细胞质不育系CMS96进行杂交试验，结果表明，杂交结实率极高，达到100％，其中最大荚结子数为21粒种子/荚，最小荚为5粒/荚，杂交后代100％不育。在显微镜下，观察不到该不育系任何花粉。如图1所示，雄性不育系的花，花瓣鲜艳、正常开放，可以充分吸引蜜蜂等昆虫。雄性不育系的柱头正常，很容易接受外来花粉，花药白色、空瘪退化，同时由于该不育系的蜜腺正常，可以观察到蜜蜂访花和在自然条件下结实良好的枝条。
目前已经获得5份稳定遗传的大白菜细胞质雄性不育材料，这些不育系与保持系或父本杂交结实正常而且种子产量高。用30份普通大白菜与2份稳定的大白菜不育系进行回交转育，已获得了转育2代的种子。
2、CMS96细胞质不育系的特征
(1)CMS96细胞质不育系不育性稳定，多代回交不退化，转育容易，生长势旺，组合力强。
比较了利用CMS96不育系和相应的保持系(该保持系与不育系只是在育性上有区别，其它性状已经完全一致)的植物学性状和营养成分含量，结果见表1、表2，表明：多代回交获得的纯合CMS96不育系生长势不退化，其植株生长旺盛，优势强。如表1所示，在主要植物学性状上，不育系与保持系基本相同。不育系转育早代比保持系植株生长势提高，表现出种间杂交优势的特点。另外，转育早代不育系的晚抽薹性比保持系强。转育早代不育系和相应的保持系在经过相同的低温处理后(“破肚”的种子在4℃冰箱中处理半个月)，不育系比保持系晚抽薹。如图2所示，不育系处在现蕾期，而保持系已抽出了很长的花薹。转育早期，不育系叶片形状为甘蓝型油菜和白菜的中间型(图3-1，图3-2)。由图3-1可见转育早代的不育系叶片(左)为甘蓝型油菜与白菜的中间型，与保持系叶片(右)完全不同，保持系叶片边缘没有裂刻。图3-2为转育早代的不育系植株，表现为半抱球，外叶有又深且大的中度裂刻。经过多代回交转育和选择，很容易淘汰不育系中间类型材料，最终获得与大白菜叶片和抱球性状完全一致的不育系材料。
表1 CMS96不育系与保持系和不育系F1、相应保持系F1的比较研究
项目 代号 株高 开展度 叶数 中心柱 球高 球宽 荒菜重 净菜重
名称 2001- (cm) (cm) (片) 长度 (cm) (cm) (kg) (kg)
(cm)
CMS96-1 3-178 36.6 62.6 9.0 3.4 32.8 18.0 2.7 2.1
保持系 3-176 36.6 62.4 8.4 3.2 32.0 16.4 2.2 1.8
CMS96-2 3-304 53.6 81.2 12.0 5.9 37.6 21.0 5.5 3.6
保持系 3-303 43.4 73.2 10.0 3.7 37.0 18.4 3.5 2.3
CMS96-3 3-307 50.0 72.6 10.8 4.7 35.2 18.6 3.8 2.5
保持系 3-306 47.0 68.6 9.1 4.5 32.8 17.8 3.8 2.6
CMS96-4 205 42.8 66.2 9.4 3.3 28.3 18.3 3.4 2.6
保持系 194 39.8 59.8 10.4 3.0 25.0 13.3 2.7 2.1
CMS96(F1) 3-378 38.0 63.8 9.4 5.6 28.6 23.6 5.1 4.1
保持系(F1) 2-198 45.4 76.2 8.4 5.3 32.4 23.0 4.8 3.7
CMS96(F1) 3-383 41.6 69.4 7.8 5.1 29.6 20.2 4.2 3.2
保持系(F1) 2-366 37.4 65.8 8.2 5.5 27.4 21.2 4.1 3.2
CMS96(F1) 3-395 50.2 82.0 10.2 5.4 36.2 26.8 6.3 4.1
保持系(F1) 2-319 43.8 70.0 7.8 6.9 30.0 23.0 4.7 3.8
CMS96(F1) 3-398 53.2 83.6 11.2 6.1 39.8 18.2 5.5 4.1
保持系(F1) 2-361 54.0 74.8 7.0 5.3 41.6 19.0 5.1 3.7
表2 CMS96与保持系营养成分平均值的比较研究
项目 代号 Vc β胡萝卜 粗纤维 Ca Fe 硫氰酸根
名称 2001- (mg/100g) 素 (％) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg)
(mg/kg)
CMS96-1 3-178 20.0 -- 0.42 412 2.29 13.52
保持系 3-176 25.4 -- 0.50 452 2.51 11.86
CMS96-3 3-307 25.4 2.20 0.49 576 5.71 12.15
保持系 3-306 22.5 1.90 0.48 434 3.15 13.42
CMS96-5 C27 19.6 0.70 0.50 571 5.92 17.44
保持系 P1 16.8 0.30 0.46 626 4.88 17.40
(2)CMS96细胞质不育系材料具有不育性稳定、不育度和不育株率100％、蜜腺正常、花药白色退化、转育速度快、植株整齐一致的优点。
大白菜不育系CMS96，为甘蓝型油菜细胞质不育，不育株率和不育度均为100％，且不育性稳定。已获得的5份纯合的大白菜胞质不育系CMS96也为不育性稳定、不育株率和不育度均为100％、稳定遗传的细胞质雄性不育系，其蜜腺和柱头正常、花药白色退化和具有转育容易等突出优点。其转育速度快和不育性稳定的优点，是以往任何白菜不育系所不能比拟的。用普通大白菜与稳定的大白菜胞质不育系CMS96回交转育5代即可获得稳定遗传的所需类型的大白菜胞质不育系。
(3)该不育系在抗病性上和保持系相一致，但增产明显。
不育系和用不育系试配的F1对病毒病、霜霉病、黑斑和黑腐病等大白菜主要病害的抗病性与相应保持系和用保持系试配的F1相当或有所提高。在产量方面，由表1可见，不育系和其F1无论是荒菜和净菜产量明显高于保持系和其F1。不育系比保持系净菜产量平均提高33％，最高达57％。用不育系试配的F1比保持系试配的F1净菜产量平均提高10％。
(4)CMS96细胞质不育系杂种一代的种子产量高，结籽好。
对3份不育系和相应保持系在室温下催芽，待种子“破肚”后置于4℃冰箱中低温春化25天后，播种在温室中。同时在温室中也有同期盛开的其它白菜的花。花期让昆虫自然辅助授粉，种子成熟后收获并考种、称重，结果如表3所示，表明：不育系F1代种子产量高于保持系的F1种子产量。
表3 三种不育系和对应的保持系结种产量比较
代号 特点 种子产量(克)/株 差值
01-411 保持系 0.22
01-646 不育系 0.48 0.26
01-604 保持系 0.14
01-644 不育系 0.32 0.18
01-462 保持系 0.89
01-709 不育系 1.14 0.25
(5)CMS96胞质不育系是一种新型和优良的大白菜细胞质雄性不育材料，表现出了广阔的应用前景。
CMS96大白菜细胞质雄性不育系克服了Pol-CMS存在育性受环境条件影响的缺陷和Ogu-CMS多代转育后植株长势退化、杂交优势差等缺点。在对CMS96不育系与保持系、不育系F1和相应保持系F1在植物学性状和营养成分进行了综合分析、比较后认为该不育系获得了保持系的性状和营养成分，且生活力不退化。用该不育系试配杂交组合，在白菜产量方面表现出较好的增产潜力，具有配合力高的特点；同时不育系F1代种子产量高，制种容易、成本低。综上所述，CMS96大白菜细胞质雄性不育系是一份很有利用价值、优良的新型大白菜胞质不育系，有很好的应用前景。进一步开展对该不育系的研究和利用将有利于白菜育种方法的改进，在白菜育种途径方面将有所突破和提高。
实施例2、小白菜转育新型甘蓝型油菜细胞质雄性不育系材料的获得
从2000年开始用5份小白菜与1份稳定的大白菜CMS96不育系进行蕾期剥蕾和花期套袋杂交，从杂交后代中选取叶柄无叶翼、叶形偏向小白菜的株系，并用这5份优良的小白菜继续与不育系进行回交转育，已获得了转育2代的种子(2003年代号分别为03.N-3，03.N-81，03.N-118，03.N-147，03.N-168)。结果表明二者杂交容易，可以获得不育度和不育株率为100％的小白菜不育系。该小白菜不育系生长势强，结籽好。目前虽还没有获得稳定遗传的小白菜不育系，但转育2代后该不育系表现出的稳定的不育性和旺盛的生长势等优点已展现出了其在小白菜育种中的应用前景。