重组鱼生长激素基因工程酵母菌Pichia Pastoris 本发明涉及重组鱼生长激素基因工程酵母菌Pichia Pastoris的构建。
在国内外报导的关于鱼生长激素的基因工程菌的工作，大部分是在大肠杆菌E.coli中完成的。虽然大肠杆菌在基因工程领域被广泛地选用，但是由于它属于原核生物，对真核生物蛋白的正确表达存在一定的缺陷并最终影响产物活性。而酵母作为异源蛋白的表达宿主，克服了大肠杆菌的缺点，体现在表达蛋白可以正确折叠、糖基化，具有活性。此外，酵母在食品工业中常用作饲料。因而酵母适合作为鱼生长激素的表达宿主。早期工作大多集中在酿酒酵母(S.cerevisiae)，1989年，Hayami就构建金枪鱼的生长激素酿酒酵母工程菌(Agric.Biol.Chem，Vol53)。但是它易丢失带有外源片断的载体，或启动子不理想，甚至难于进行大规模工业培养，而甲基营养型毕赤酵母Pichia Pastoris能弥补该不足，利用AOX I(乙醇氧化酶基因)的强启动子，以整合形式稳定外源基因，此外，它的培养基成分简单明确，甲醇诱导方便易行，能达到很高的生长密度而大大提高产量，因此，有利于工业上进行大规模生产。利用酵母Pichia Pastoris表达外源蛋白不乏报导和专利，但是用其构建重组鱼生长激素基因工程菌在国内外却是首例。
本发明的目的在于构建一种能够在胞内或胞外高效表达鱼生长激素的酵母工程菌Pichia Pastoris，由于该表达产物可促进各种鱼类、贝类的生长，所以该菌可以作为饵料添加剂，用于鱼类、贝类的人工养殖。
本发明中的鱼生长激素cDNA是由我们实验室从鱼脑下垂体中分离克隆得到的，并测定了其全部cDNA序列。论文于1995年发表在《生物化学与生物物理学报》，Vol27(5)，且该序列被收入国际基因库。将鱼生长激素基因克隆到酵母高效表达穿梭载体中，利用电穿孔技术转入酵母。通过P.CR技术和地高辛(DIG)标记的探针从转化子中筛选出十个高拷贝的含有鱼生长激素(GH)基因的菌株。检测多拷贝转化子的表型后，实验室里用三角锥瓶进行发酵表达，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western杂交确证表达产物为鱼生长激素，表达量约为100mg/l，而工业发酵中有良好的通气条件，并能利用简单确定的培养基，产量至少为1g/l，因此有很好的工业发酵前景。
本发明基于前期的鱼生长激素基因cDNA序列的测定和酵母，尤其是甲基营养型毕赤酵母Pichia Pastoris地优越性，构建了一种高效表达的重组鱼生长激素基因工程酵母菌，为日后工业生产饲料打下基础。附图为鱼生长激素基因在酵母高效表达载体pHIL-D2中的克隆以下对本发明的具体思路及方法做详细描述：一、引物：P105：5’-AAA GAA TTC ATG CAG CCA ATC ACA GAG AAC-3’
EcoRIP103：5’-GGG GAA TTC TAC AG(AG)GTG CAG TT(AG)GC(CT)TC-3’
EcoRIP205：5’-TGG T(GT)G A(AG)T C(GCT)T GGG A-3’P203：5’-CAT G(CT)C(CT)TT(CT)TT(AG)AA(AG)CA-3’p305：5’-GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC-3’p303：5’-GCA AAT GGC ATT CTG ACA TCC-3’二、常用溶液、培养基的配制：1.LB培养基
NaCl 1％
Yeast extract 0.5％
Tryptone 1％
琼脂 1.5％(固体培养基)2.2xYT培养基
NaCl 0.5％
Yeast extract 1.0％
Tryptone 1.6％ 3.YPD培养基
yeast extract 1％
peptone 2％
dextrose 2％4.MGY培养基
YNB 1.34％
glycerol 1％
biotin 4×10-5％5.MD培养基
YNB 1.34％
biotin 4×10-5％
dextrose 1％6.MM培养基
YNB 1.34％
biotin 4×10-5％
methanol 0.5％7.IMD培养基
10×IM1 salt：36.7mM KH2PO4 22.7mM(NH4)2SO4
2.0mM MgSO4.7H2O 6.7mM KCl
0.7mM CaCl2.2H2O
400×trace salt：0.2μM CuSO4 1.25μM KI
4.5μM MnSO4 2.0μM NaMoO4.2H2O
0.75μM H3BO3 17.5μM ZnSO4.7H2O
44.5μM FeCl3.6H2O
biotin 0.4ug/ml
glucose 2％8.BMGY培养基
yeast extract 1％
peptore 2％
potassium phosphate 100mM(pH6.0)
YNB 1.34％
biotin 4×10-5％
glycerol 1％9.BMMY培养基
yeast extract 1％
peptone 2％
potassium phosphate 100mM(pH6.0)
YNB 1.34％
biotin 4×10-5％
methanol 0.5％10.碱法抽提质粒溶液I(GET)
葡萄糖 50mM
EDTA 10mM
Tris-Hcl 25mM pH8.011.碱法抽提质粒溶液II
NaOH 0.2M
SDS 1％12.碱法抽提质粒溶液III
KAc/5M 15ml
冰HAc 7ml
dd Water 3ml13.PCR反应缓冲液(10×)
Tris-Hcl 0.1M/pH8.3
MgCl2 15mM
KCl 0.5M
明胶 0.1％14.连接酶缓冲液(5×)：
Tris-HCl 0.25M/pH7.6
MgCl2 50mM
ATP 5mM
DTT 5mM15.CIP缓冲液
Tris-HCl 100mM pH8.3
MgCl2 10mM
ZnCl2 10mM16.RNase贮液
将RNase溶于10mM Tris-HCl/pH7.5，15mM NaCl，配成浓度为
10mg/ml的溶液，于100℃加热15分钟，分装成小份。17.TAE(50×)
Tris-HAc 2M
EDTA 50mM18.TE缓冲液
Tris-HCl 10mM/pH8.0
EDTA 1mM19.TES缓冲液
Tris-HCl 10mM/pH8.0
EDTA 1mM
NaCl 0.1M20.琼脂糖凝胶电泳上样缓冲液(6×)
溴酚蓝 0.25％
蔗糖 40％21.杂交液
5×SSC
blocking reagent 1％(w/v)
N-lauroylsarcosine Na-Salt 0.1％(w/v)
SDS 0.02％(w/v)22.杂交检测Buffer buffer1：
Tris-HCl 100mM/pH7.5
NaCl 150mM
buffer2：
1％ blocking reagent溶解于bufferl
buffer3：
Tris-HCl 100mM/PH9.5
NaCl 100mM
MgCl2 50mM
buffer4：
Tris-HCl 10mM/PH8.0
EDTA 1mM23.丙烯酰胺水溶液(30.8％)
丙烯酰胺 30％
N，N′-甲叉丙烯酰胺 0.8％24.SDS-PAGE分离胶缓冲液(4×)：
Tris pH8.8 18.2％
SDS 0.4％25.SDS-PAGE浓缩胶缓冲液(4×)：
Tris pH6.8 6.06％
SDS 0.4％26.SDS-PAGE电极缓冲液(5×)
Tris pH8.3 3％
SDS 0.5％
Gly 14.4％27.SDS-PAGE上样缓冲液(2×)
Tris 20mM pH8.2
EDTA 2mM
SDS 2％
β-巯基乙醇 10％
甘油 16％
溴酚蓝 0.05％28.NaI溶液(100ml)
NaI 90.8g
Na2SO3 2g 经0.45um滤膜过滤29.洗脱液
乙醇 50ml
Tris-HCl(20mM/PH7.4)/EDTA(1mM)/NaCl(100mM)50ml30.魔力柱树脂
硅藻土 50mg/ml
盐酸胍 6M31.TE pH7.4
Tris-HCl pH7.4 10mM
EDTA pH8.0 1mM32.TE/LiCl
LiCl 0.1M
Tris-HCl pH7.4 10mM
EDTA 1mM33.PEG溶液
40％PEG-3350于TE/LiCl34.SCE pH5.8
sorbitol 1M
EDTA 1mM
柠檬酸钠 10mM35.2×CTAB抽提缓冲液
CTAB 2％
NaCl 1.4M
Tris-HCl 100mM pH8.0
EDTA 20mM36.转移缓冲液
Tris-HCl 48Mm
甘氨酸 39Mm
SDS 0.037
甲醇 20％37.PBS
NaCl 0.8％
KCl 0.02％
Na2HPO4 0.144％
KH2PO4 0.024％38.封闭试剂 PBS中加入1％ blocking三.方法：(一).鱼生长激素DNA在pBluescript及pHIL-D2中的克隆
1.鱼生长激素DNA的制备
以本实验室已构建的含生长激素片段的质粒为模板，经PCR反应扩增：
10×PCR缓冲液 5μl
dNTP 5μl
P105 1μl
P103 1μl
DNA模板 10μl(20ng)
ddW 28μl
加2滴矿物油，99℃ 15分钟，加入1μlTaq酶(2unit)，
94℃ 30sec；55℃ 30sec；72℃ 30sec；20个循环；
72℃ 10min。
扩增产物用silica纯化。2.pBluescript-fGH的构建
将GH DNA片段PCR产物用EcoR I进行酶切反应，电泳后，用silica纯化。pBluescript用EcoR I酶切，经去磷酸化、silica纯化后，与GH片段进行连接反应，经转化XLl-Blue感受态细胞，挑取6个白色菌落，接种LB培养基，37℃培养过夜，提取质粒，以EcoR I进行酶切反应。经电泳，选酶切片段为GH片段大小的(560bp)，以GH内部引物P205，P203作PCR反应，循环条件：94℃ 30sec；50℃ 1min；72℃ 30sec。扩增30圈。将PCR产物电泳，扩增片段约为250 bp，确证插入的为GH片段。3.pHIL-D2-GH的构建
用EcoR I酶切pBluescript-GH，并用silica纯化。pHIL-D2经EcoRI酶切，去磷酸化，silica纯化后，与GH片段进行连接反应。经转化XL1-Blue，以P105，P303为引物，直接挑取单菌落加入反应体系做菌落PCR，以确证GH在pHIL-D2中的正确克隆方向。循环条件：94℃ 30sec；55℃1min；72℃ 30sec。扩增30圈。经电泳，能扩增出来的为正确的插入方向。接种2×YT培养基培养过夜，进行质粒的大量提取。用NotI酶切，并用硅藻土进行纯化，以备转化用。(二).电转移方法转化酵母细胞
1)挑单菌落酵母细胞于80ml YPD，30℃培养至OD600为1.3-1.5；
2)5,000rpm，4℃离心5分钟。重悬于8ml ddW；
3)加入1ml 10×TE pH7.5，1ml 10×LiCl(1M，pH7.5)，30℃轻摇45分钟；
4)加入0.25ml 1M DTT，30℃轻摇15分钟；
5)用水稀释至50ml，离心，分别以下列溶液重悬：25ml冰冷的ddW；3ml冰冷的1M山梨醇；0.05ml冰冷的1M山梨醇；
6)混合40μl细胞和少于100ng经NotI线性化的pHIL-D2-GH，混匀，转到冰冷的0.2cm电穿孔容器；
7)冰浴5分钟；
8)用Bio-Rad Gene Pulser电击：时间约10ms，场强为7500v/cm.设定参数为：1500v，50μF，200Ω；
9)加入1ml冰浴的1M山梨醇，转移到eppendorf管；
10)取200μl涂布IMD板，30℃培养2-3天。(三).酵母PCR快速检测方法筛选阳性转化子
挑取单菌落转化子于5μl 1％蜗牛酶/SCE溶液，30℃轻摇1小时，酶解破壁，99℃加热15分钟，稀释至20μl，取2μl为模板做PCR反应：
10×缓冲液 2μl
dNTP 2μl
P105 0.25μl
P103 0.25μl
模板 2μl
ddW 12.5μl
Taq酶 1μl95℃加热2分钟；94℃ 30sec；50℃ 1min；72℃ 30sec；扩增2圈；94℃ 30sec；50℃ 30sec；72℃ 30sec；扩增38圈；经电泳，能扩增出560 bp的片段的为阳性转化子。(四).筛选多拷贝转化子1酵母DNA的提取
1)接种单菌落阳性转化子于YPD中，30℃培养3-4天；
2)5,000rpm离心45秒，用50mM TE(pH8.0)洗一次，压干，称重；
3)按2ml/g细胞悬于TE，加入2％β-巯基乙醇，室温摇动15分钟。离心，用SCE洗一次；
4)加入与TE相同体积的1％蜗牛酶/SCE，37℃振荡2-3小时，5.000rpm离心10分钟，SCE洗一次；
5)加入0.5ml 2×CTAB抽取缓冲液，70℃，10分钟；
6)冷至室温，加入0.5ml氯仿/异戊醇(24∶1)，充分混匀，离心；
7)取上清，加入50μl 5％ CTAB/0.5M NaCl，混匀，重复6)；
8)取上清，加入50μl 5％ CTAB/0.5M NaCl，混匀，加入0.5ml ddW；
9)离心，沉淀溶于0.5ml 1M NaCl/TE，加入5μl 10％ SDS，5μl 1MMgCl2，0.25ml异丙醇，回收沉淀，70％乙醇洗两次，溶于TE。2.点杂交
1)点样
酵母染色体DNA样品经测分光定量后，取等量DNA 0.5μg点在膜上，样品干燥后，将膜放于变性液(1.5M NaCl/0.5M NaOH)中变性5min，再用中和液(1.0M Tris-HCl/1.5M NaCl/PH8.0)中和5min，干燥后，紫外(254nm)交联3min。
2)预杂交1-2hr。
3)杂交
DIG标记探针沸水浴5min，迅速冰浴进行变性；
换杂交液，加入探针20ng/ml，65℃杂交8-16hr。
4)洗膜
用2x SSC/0.1％SDS室温洗膜5min，两次；
用0.1x SSC/0.1％SDS 65℃洗膜15min，两次。
5)检测(在室温下进行)
a.bufferl洗膜1min
b.加buffer2 1ml，放置30min
c.将antibody conjugate按1∶5000稀释在buffer2中，继续放置30min
d.用bufferl洗膜15min，两次
e.用buffer3平衡2min，并换一次buffer3
f.将NBT-solution及X-phosphate-solution分别按4.5μl/1ml及3.5μl/lml buffer3加入并进行显色，可在buffer4洗涤，终止显色。
g.也可用化学发光检测：用滤纸吸去多余的buffer3，加约5μl化学发光剂CSPD浸润杂交膜，放入杂交袋中，用X射线胶片压片，曝光5-6小时，然后冲洗胶片。
6)选择杂交信号强的为多拷贝转化子。(五).表型检测：
将等量的多拷贝转化子分别接种MD和MM培养基，30℃培养，在MM中和在MD中生长速度相同的为Mut+(甲醇利用正常型)，在MM中的生长速度明显慢于MD的为Muts(甲醇利用缓慢型)。(六).表达：1.Mut+转化子的诱导表达1)挑取单克隆接种25ml MGY，30℃培养至OD600为2-6；2)5,000rpm离心5分钟，去上清，用MM重悬细胞至OD600为1.0；3)盖两层纱布，30℃培养；4)每24小时加入100％甲醇至终浓度为0.5％；5)培养3-4天，收获1ml培养物，最大速离心1分钟，去上清，存于-20℃；2.Muts转化子的诱导表达1)挑取单克隆接种25ml MGY，30℃培养至OD600为2-6；2)5,000rpm离心5分钟，去上清，用MM将细胞浓缩5-10倍；3)盖两层纱布，30℃培养；4)每24小时加入100％甲醇至终浓度为0.5％；5)培养6-7天，收获1ml培养物，最大速离心1分钟，去上清，存于-20℃3.SDS-PAGE样品的制备
(1).释放内容物的方法：1)将诱导表达的培养物用ddW洗两次；2)加入50μl 1％蜗牛酶/SCE，37℃，轻摇3小时，缓慢离心；3)山梨醇洗两次；4)加入1×上样缓冲液100μl，沸水浴5分钟，离心，取上清。
(2).上清液处理方法：1).用10％TCA沉淀上清液蛋白，-20℃放置30分钟，离心收集沉淀；2).乙醇乙醚(1∶1)洗3次，真空干燥；3).加入1×上样缓冲液，溶解，沸水浴5分钟，取10ul上样。4.SDS-PAGE
(1).依下配方配制分离胶10ml，混匀，灌胶；
凝胶储液(30.8％) 4ml
4×分离胶缓冲液 2.5ml
ddW 3.5ml
10％过硫酸胺 80μl
TEMED 8μl
(2).待分离胶凝固后，依下配方配制浓缩胶5ml，混匀，灌胶于分离胶之上；
凝胶储液(30.8％) 0.65ml
4×浓缩胶缓冲液 12.5ml
ddW 3.1ml
10％过硫酸胺 40μl
TEMED 4μl
(3).取5μl样品及分子量标准上样；
(4).电泳条件：0.5v/cm，20min；1.5v/cm，约1.5hr；
(5).电泳后，剥胶，于25％异丙醇，7％乙酸中固定至指示剂颜色退去(约1小时)；
(6).将凝胶浸没于0.02％考马斯亮兰R250，7％乙酸中染色，约30分钟；
(7).用7％乙酸反复脱色至背景变白；
(8).将凝胶转至大小合适的滤纸上，覆盖以保鲜膜，80℃真空干燥2小时。
(9).电泳后，在分子量为20,000处有一条带，初步确证表达产物为生长激素。5.western杂交
1)蛋白样品及标准生长激素样品按上述条件经SDS-PAGE进行分离；
2)将硝酸纤维素膜用水润湿；
3)在托盘中加入转移缓冲液，将滤纸浸入其中；在上面依次加上：凝胶，硝酸纤维素膜，滤纸，卫生纸，及重物，并经常更换已润湿的卫生纸，转移过夜；
4)硝酸纤维素膜用PBS洗3次，加入封闭试剂，室温下摇动温育2小时；
5)用PBS洗膜2次，各5分钟。在封闭试剂中加入鼠抗鲈鱼生长激素抗体，稀释比为1∶1000。室温下摇动温育至少1小时；
6)用PBS洗膜4次，每次5分钟。在封闭试剂中加入羊抗小鼠IgG-HRP，稀释比为1∶1000。室温下摇动温育1小时；
7)用PBS洗膜4次，每次5分钟。
8)溶解6mg二甲基联苯胺于10ml 50mM Tris(PH 7.6)，过滤，加入10ul 30％ H2O2，将膜在其中摇动1-5分钟，显色。用PBS洗膜终止反应。
9)杂交后，蛋白质样品和标准生长激素对应处有一条杂交带，进一步确证表达产物为生长激素。
以上是以载体pHIL-D2为例。本发明中的方法，其中所说的载体还包括pPIC3，pHIL-S1，pHIC9等酵母胞内及分泌表达载体。