发明内容
本发明的目的在于提供了一种杨树皮类脂作为佐剂的新用途，以及杨树
皮类脂用作佐剂的制备方法和使用方法。
杨树皮类脂用于佐剂是通过如下方法制备得到的：
以下操作均为无菌操作：
(1)粗提类脂液在20-40℃加热，同时按100-1000转/分转速搅拌20-30分
钟；
(2)将上述搅拌获得的物质过80-120目铜网，得到滤液；
(3)将步骤(2)得到的滤液在20-40℃水浴加热均匀，同时按1500-3000
转/分转速搅拌10-20分钟；
(4)将步骤(3)得到的液体在50-70℃水浴加热均匀，并过100-120目铜
网，将此滤液冷却至室温，得到杨树皮类脂佐剂，保存备用。
本发明进一步提供这种杨树皮类脂佐剂的使用方法：
(1)500-1000转/分搅拌一种抗原和/或抗原组合物，同时缓缓加入杨树皮
类脂佐剂，使杨树皮类脂佐剂在混合物中的终浓度达到4-6％(W/V)；
(2)将上述混合物通过乳化压力为10-15MPa，剪切压力为45-60MPa的均
质机内乳化，乳化温度在20-30℃之间，制得含杨树皮类脂佐剂的疫苗。
杨树皮类脂作为免疫佐剂，既可以保持抗原的特性，又能成为良好的免
疫增强剂和刺激剂，这是其他常规的佐剂如羊毛脂、弗氏佐剂等无可比拟的。
以杨树皮类脂为免疫佐剂制备的疫苗具有以下优特点：
(1)产生免疫力时间早：注射鸡体后7-10天即可产生坚强免疫力，
比油佐剂疫苗提前10天左右。
(2)保存运输方便：无需特殊冷藏设备，0-8℃下可保存18个月，常
温下可保存12个月，冷冻保存可达到2年之久。
(3)应激性小，吸收良好：给7-10日龄的鸡注射，在机体内被很好
得吸收，不产生残留，因此不影响肉鸡出口。由于应激性小，因此在产蛋高
峰期注射不会影响产蛋率。
(4)提高产蛋率：本疫苗由于含有大量的维生素E等提高产蛋率的营养
成分，注射后会不同程度地提高产蛋鸡的产蛋率。
以矿物油为佐剂加入鸡新城疫抗原制备的油苗、以蜂胶为佐剂加入鸡新
城疫抗原制备的蜂胶苗与以杨树皮类脂为佐剂加入鸡新城疫抗原制备的类脂
苗三者的比较：
比较项目
新城疫油苗
新城疫蜂胶苗
新城疫类脂苗
外观
正常应为乳白色或白色，
组织苗常呈褐色，由于油苗
一般采用不透明包装，因此
对其是否出现悬浮、沉淀、
破乳无法确认，增加了使用
前的物理检查难度。
正常应为黄褐色或黄色，
由于蜂胶苗的不稳定性，
因此，出现变色、破乳、
颗粒、沉淀严重时禁用，
出现少量沉淀摇匀后4小
时不恢复沉淀，可继续使
用。
正常为浅乳黄色或浅白
色，上部出现少量黄色
附着物属正常现象。采
用透明进口原料，方便
用户进行物理观察。
产生免
疫力时间
注射后20天左右
注射后7-10天左右
注射后7-10天左右
免疫持
续期
100天左右
约30天(病毒苗)、约100
天细菌苗
90-100天左右
免疫程序
一次免疫效果差，两次免疫
效果较好
一次免疫效果差，两次免
疫效果较好
一次免疫效果差，两次
免疫效果较好
免疫抗体
估测(以
ND为例)
免疫后20天约为4-5，30
天6-7，40-80天7-8，
80-90天5-6，90天以后应
加强免疫；
免疫后7天约2-4或无，
20天约4-5或无，30天，
约4-5或无，最高不超过
6-7；
免疫后10天约4-5，20
天6-7，30-70天，7-8，
70-85天，5-6，90天以
后，应加强免疫，
保存方式
避光、4-8℃(保存时间长)，
或常温(保存时间短)，严
禁低温保存
避光、4-8℃(保存时间
长)，或常温(保存时间
短)、可低温保存
避光、4-8℃(保存时间
长)，或常温(保存时间
短)、可低温保存
粘稠度
粘度高，冬季不易注射
粘度低，易堵针头，堵针
头者禁用
粘度低，易注射
应激性
应激性高，副作用大，产蛋
高峰期、受威胁期、疾病期
慎用
应激性较高，麻醉作用大，
应激性较小，可用于产
蛋期
抗原性
抗原性较好
病毒抗原易被蜂胶破坏；
抗原性较好
免疫应答
体液免疫
体液免疫、细胞免疫
体液免疫、细胞免疫
本发明杨树皮类脂用作佐剂的制备方法特点如下：由于粗提的类脂液中
杂质较多，因此，通过搅拌，可将大的粗颗粒沉淀；并且由于类脂在低温下
为半固体，通过热过滤，一方面过滤沉淀物质，另一方面容易过滤；多次过
滤，温度逐步提升，可有效保护生物活性物质不至于突然变性失活。
本发明杨树皮类脂用作佐剂的使用方法中，类脂含量的确定(终浓度为
4-6％(W/V))，一方面可使本产品规程化，另一方面也是因为用于佐剂时免疫
效果的限制，即，使用本含量免疫效果最好；压力的选择，取决于类脂本身
的特性和制备疫苗的要求，高速乳化，可使抗原与佐剂更加充分乳化，分散
系更为均匀，制备的疫苗形状更为稳定。
具体实施方式
实施例1
制备杨树皮类脂佐剂和疫苗：
以下操作均为无菌操作。杨树皮粗提类脂(购自山东莒县林产化工厂)
500克置于25℃水浴锅中，100转/分缓慢搅拌30分钟。过80目铜网，得到
滤液。滤液再经过30℃水浴，1500转/分中速搅拌20分钟。再经过50℃水
浴，过120目铜网，滤液冷却至室温，得到杨树皮类脂佐剂。
制备鸡新城疫病毒抗原：取8日SPF鸡胚(购自济南SPF鸡场)，用碘酒
消毒，无菌操作，按照每枚鸡胚0.2ml剂量将稀释10000倍的新城疫种毒(购
自中国兽药监察所)注射到鸡胚的尿囊腔内，而后将针孔用无菌胶布密封，
将封好的鸡胚置于37-38℃培养箱内继续孵化至13日龄。孵化结束将鸡胚置
于2-10℃冷库内冷却24小时后，取出，碘酒消毒，无菌收集鸡胚尿囊腔内
的含毒液体，将含毒液体按照0.05-0.1％(V/V)比例加入甲醛灭活剂(购自
莱阳化工厂)，37℃灭活12小时，其间振摇6次。灭活完毕，进行无菌检验、
安全检验。合格者的鸡新城疫病毒抗原即可用于制备疫苗。
制备疫苗时，可将上述制得的灭活的鸡新城疫病毒抗原10000ml以500
转/分搅拌，同时缓缓加入上述制得的杨树皮类脂佐剂，使类脂液在混合物中
的终浓度达到5％(W/V)。然后将上述混合物通过乳化压力为15MPa，剪切压
力为45MPa的均质机内乳化，乳化温度要求20℃，乳化时间20秒。乳化完
毕，得到鸡新城疫类脂灭活疫苗。将上述疫苗进行无菌检验(检验方法如下)、
安全检验(检验方法如下)，合格后分装。
无菌检验：取上述方法制备的疫苗1ml，接种于高压灭菌的马丁固体培
养基，置入37℃培养箱内培养24-48小时，无菌生长，则无菌检验合格。
安全检验：取10日龄和30日龄健康易感鸡各5只，分别颈部皮下注射
疫苗0.5ml，1.0ml，连续观察14天，注苗局部无严重反应，鸡全部健活，则
安全检验合格。
实施例2
制备杨树皮类脂佐剂和疫苗：
以下操作均为无菌操作。将杨树皮粗提类脂1200g(购自山东莒县林产
化工厂)置于40℃水浴锅中，800转/分缓慢搅拌20分钟。过120目铜网，
得到滤液。滤液再经过40℃水浴，2500转/分中速搅拌10分钟。再经过70
℃水浴，过100目铜网，滤液冷却至室温，得到杨树皮类脂佐剂。
制备鸡产蛋下降综合症病毒抗原：取10日SPF鸭胚(购自济南SPF鸡场)，
用碘酒消毒，无菌操作，按照每枚鸭胚0.2ml剂量将稀释100倍的产蛋下降
综合症种毒(购自中国兽药监察所)注射到鸭胚的尿囊腔内，而后将针孔用
无菌胶布密封，将封好的鸭胚置入37-38℃培养箱内继续孵化至15日龄。孵
化结束将鸭胚置入2-10℃冷库内冷却24小时后，取出，碘酒消毒，无菌收
集鸭胚尿囊腔内的含毒液体，将含毒液体按照0.05-0.1％(V/V)比例加入甲
醛灭活剂(购自莱阳化工厂)，37℃灭活12小时，其间振摇6次。灭活完毕，
进行无菌检验、安全检验(方法通上)。合格者即可用于制备疫苗。
制备疫苗时，可将灭活的鸡新城疫病毒抗原(制备方法见实施例1)和
灭活的鸡产蛋下降综合症病毒抗原(制备方法如上)混合(各10000ml)后
以1000转/分搅拌，同时缓缓加入上述杨树皮类脂佐剂，使类脂液在混合物
中的终浓度达到6％(W/V)。然后将上述混合物通过乳化压力为15MPa，剪切
压力为45MPa的均质机内乳化，乳化温度要求在25℃之间，乳化时间30秒。
乳化完毕，将上述的乳化液进行检验(检验方法同实施例1)，合格后分装，
得到鸡新城疫与产蛋下降综合症二联类脂灭活疫苗。
实施例3
鸡新城疫类脂灭活疫苗的免疫
使用实施例1制得的鸡新城疫类脂灭活疫苗，免疫程序如下：10日龄雏
鸡颈部皮下注射0.3ml/只，40-60日龄第二次免疫，颈部皮下注射0.5ml/只，
免疫两次，即可保护整个生长期不受鸡新城疫病毒的侵袭。采集第二次免疫
后14天鸡群的血液，分离血清，采用血清学中的微量血凝抑制(HI)方法(参
考农业部畜牧兽医局《兽医生物制品规程》)对血清抗体进行评估，本实施例
的类脂疫苗免疫效果与蜂胶作为佐剂的同种疫苗的免疫效果相比，同期抗体
平均高2-3个滴度，并且应激性小，不影响鸡产蛋率。
测定免疫鸡新城疫(ND)类脂灭活疫苗后鸡血清抗体的方法：
(1)材料：鸡新城疫标准4单位抗原(购自哈尔滨兽医研究所)
待检血清(采集免疫类脂疫苗7天以后的鸡群)
0.01M PH7.2的磷酸盐缓冲溶液(PBS)或0.85％的生理盐水
0.8％的鸡红细胞悬液
96孔V型血凝板、微量加样器、吸头、微量振荡器等
(2)操作：
1)0.8％鸡红细胞悬液的制备：无菌采取健康鸡血4ml于4ml阿氏液中，
2500转/分离心5分钟，弃去析出的血清和白细胞，再加入4ml阿氏液洗涤
红细胞，然后2500转/分离心，重复上述操作3-4次，最后吸取红细胞0.8ml
加到10ml生理盐水中即得0.8％鸡红细胞悬液。
2)在每孔加入PBS或生理盐水0.05ml，然后在第一孔加入待检血清，
混匀，从中吸取0.05ml加入第二孔，混匀从中再吸取0.05ml加入第三孔，
依次稀释到第11孔，吸出0.05ml弃去。第12孔作抗原对照(阳性对照)。
然后每孔都加入稀释好的4单位抗原0.05ml。另取4孔只加PBS或生理盐水
0.05ml(阴性对照)。放入微量振荡器上振荡1分钟，于20-30℃环境中作
用10分钟，然后每孔加上0.8％的鸡红细胞0.05ml。放在37℃温箱中孵育，
15分钟后观察。
结果判定：在阳性对照孔完全凝集、阴性对照孔完全沉集的情况下，以完
全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的(抗体滴度)HI滴度。按照上述
方法对鸡群进行免疫后的待测新城疫抗体滴度平均为8-9log2，(各种佐剂的
新城疫疫苗抗体测定方法及判定标准均相同，按照目前测定标准，当抗体水
平维持在4log2以上时就具有保护力。当抗体在5-6log2以上时具有坚强的
保护力)。
实施例4
使用实施例2中的鸡新城疫与产蛋下降综合症二联类脂灭活疫苗，免疫程序
如下：120日龄雏鸡颈部皮下注射0.5ml/只，230日龄第二次免疫，颈部皮
下注射0.5ml/只，免疫两次，即可保护整个生长期不受新城疫、产蛋下降综
合症病毒的侵袭。采集免疫鸡群的血液，分离血清，采用血清学中的微量血
凝抑制(HI)方法(参考农业部畜牧兽医局《兽医生物制品规程》)对血清抗
体进行评估，本实施例的类脂疫苗的免疫效果与蜂胶作为佐剂的同种疫苗的
免疫效果相比，同期抗体平均高2-3个滴度，并且应激性小，不影响鸡产蛋
率。
具体试验方法及结果：
一、测定ND的抗体方法同实施例3，具体的测定结果为：采集第二次免疫
免14天的鸡群血清测定抗体水平，滴度平均为8-9Log2。
二、测定的减蛋综合症抗体的方法如下：
材料：
1、鸡产蛋下降综合症标准4单位抗原(购自哈尔滨兽医研究所)
2、待检血清(采集免疫类脂疫苗7天以后的鸡群)
3、0.01M PH7.2的磷酸盐缓冲溶液(PBS)或0.85％的生理盐水
4、0.8％的鸡红细胞悬液
5、96孔V型血凝板、微量加样器、吸头、微量振荡器等
(2)操作：
1)0.8％鸡红细胞悬液的制备：无菌采取健康鸡血4ml于4ml阿氏液中，2500
转/分离心5分钟，弃去析出的血清和白细胞，再加入4ml阿氏液洗涤红细胞，
然后2500转/分离心，重复上述操作3-4次，最后吸取红细胞0.8ml加到
10ml生理盐水中即得0.8％的鸡红细胞悬液。
2)在每孔加入PBS或生理盐水0.05ml，然后在第一孔加入待检血清，混匀，
从中吸取0.05ml加入第二孔，混匀从中再吸取0.05ml加入第三孔，依次稀
释到第11孔，吸出0.05ml弃去。第12孔作抗原对照(阳性对照)。然后每
孔都加入稀释好的4单位抗原0.05ml。另取4孔只加PBS或生理盐水0.05ml
(阴性对照)。于微量振荡器上振荡1分钟，于20-30℃环境中作用10分钟，
然后每孔加上0.8％的鸡红细胞0.05ml。放在37℃温箱中孵育，15分钟后观
察。
结果判定：在阳性对照孔完全凝集、阴性对照孔完全沉集的情况下，以
完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的(抗体滴度)HI滴度。按照上
述方法对鸡群进行免疫后的待测产蛋下降综合症抗体滴度平均为8-9log2，
(各种佐剂的产蛋下降综合症疫苗抗体测定方法及判定标准均相同，按照目
前测定标准，当抗体水平维持在4log2以上时就具有保护力。当抗体在
5-6log2以上时具有坚强的保护力)。
实施例5
对产蛋率的影响试验：
将鸡新城疫类脂灭活疫苗制品20001批在某种鸡养鸡场进行了试验，共
免疫罗曼商品蛋鸡雏鸡1000羽，免疫后进行了产蛋量、产蛋率测定和临床观
察，现将试验结果报告如下。
1、材料与方法
1.1材料 鸡新城疫类脂灭活疫苗20001批、新城疫灭活油苗00102批(购
自农业部定点企业齐鲁动物保健品厂)。试验鸡共计2000羽份，分2组，A
组免疫类脂疫苗、B组免疫油苗。
1.2免疫程序与免疫方法：
A组：7日龄雏鸡每只颈部皮下注射鸡新城疫类脂灭活疫苗0.3ml，同时
以LaSota疫苗滴鼻点眼，100日龄、195日龄分别胸肌注射类脂疫苗1.0ml/
只。
B组：7日龄雏鸡每只颈部皮下注射鸡新城疫类脂灭活疫苗0.3ml，同时
以LaSota疫苗滴鼻点眼，100日龄、195日龄分别胸肌注射类脂疫苗1.0ml/
只。
1.3日粮 按照罗曼公司推荐的日粮配方，统一标准，统一配方，同一饲养
标准进行饲喂。
1.4观察产蛋情况，从200日龄收集每天产蛋数量，计算产蛋率。
结果
2批疫苗免疫的鸡群均正常开产见蛋，保持了正常的产蛋高峰期，但
免疫类脂疫苗的鸡群产蛋高峰期比油苗提前10天左右。第3次免疫在195
日龄，到达200日龄时开始统计产蛋量，计算产蛋率，具体产蛋率统计如下：
结果见表
疫苗 鸡数(个) 第一周 第二周 第三周 第四周
产蛋数(个) 产蛋数(个) 产蛋数(个) 产蛋数
(个)
20001类脂疫苗 1000 6279 6188 6132 6167
00102油苗 1000 5978 5817 5614 5719
四周的统计结果表明，免疫类脂疫苗的鸡群产蛋量(24766)比免疫油苗
的鸡群产蛋量(23128)多1638枚，免疫类脂疫苗的鸡群产蛋率(88.45％)
比免疫油苗的鸡群产蛋率(82.6％)高5.85％个百分点。
实施例6
制备杨树皮类脂佐剂和疫苗：
以下操作均为无菌操作。将杨树皮粗提类脂(购自山东莒县林产化工厂)
800克置于20℃水浴锅中，1000转/分缓慢搅拌25分钟。过100目铜网，得
到滤液。滤液经过20℃水浴，3000转/分中速搅拌15分钟；再经过60℃水
浴，过120目铜网，滤液冷却至室温，得到杨树皮类脂佐剂。
制备疫苗时，可将实施例1的方法制备的灭活的鸡新城疫病毒抗原
10000ml以800转/分搅拌，同时缓缓加入上述制得的杨树皮类脂佐剂，使类
脂液在混合物中的终浓度达到4％(W/V)。然后将上述混合物通过乳化压力为
10MPa，剪切压力为60MPa的均质机内乳化，乳化温度为30℃，乳化时间20
秒。乳化完毕，得到鸡新城疫类脂灭活疫苗。将上述疫苗进行无菌检验(检
验方法如下)、安全检验(检验方法如下)，合格后分装。
无菌检验：取上述方法制备的疫苗1ml，接种于高压灭菌的马丁固体培
养基，置入37℃培养箱内培养24-48小时，无菌生长，则无菌检验合格。
安全检验：取10日龄和30日龄健康易感鸡各5只，分别颈部皮下注射
疫苗0.5ml，1.0ml，连续观察14天，注苗局部无严重反应，鸡全部健活，则
安全检验合格。