一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体及其筛选方法和应用.pdf

本发明公开了一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体及其筛选方法和应用，特点是该受体为微管蛋白，其筛选方法如下：将健康梭子蟹冰上解剖取其鳃加入到膜蛋白提取液中匀浆，将离心得到的沉淀用膜蛋白提取液重悬得到三疣梭子蟹鳃膜蛋白提取液；上述膜蛋白用8% SDS-PAGE分离电转移到PVDF膜上，用低脂牛奶4℃孵育过夜，经过洗涤三次和SCRV病毒室温孵育一个小时再洗涤三次和鸡抗SCRV室温孵育两个小时，洗涤三次后和HRP偶联的羊抗鸡二抗继续室温孵育一个小时，洗涤四次后用OPD进行显色，所得到的蛋白条带即为SCRV受体，优点是该受体阻断剂对SCRV感染细胞有抑制活性可以开发防治SCRV感染的药物。

权利要求书
1.  一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体，其特征在于：所述的受体为微管蛋白。

2.  一种根据权利要求1所述的三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体的筛选方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）取健康的三疣梭子蟹冰上解剖取其鳃，按质量体积比1 g：（5 –10）ml加入到预先冰浴过的含有1mM 苯甲基磺酰氟的膜蛋白提取液中匀浆，将匀浆液于4℃，600g离心3min，取上清液于4℃，6000g离心5min后，再取上清液于4℃，35000g离心2 h，将得到的沉淀用膜蛋白提取液重悬，即得到三疣梭子蟹鳃膜蛋白提取液；
（2）将三疣梭子蟹鳃膜蛋白提取液进行8%SDS-PAGE电泳后，在电转液中将凝胶上所有蛋白条带转移至PVDF膜上，300mA，4℃转移3h，转移结束后，将PVDF膜从电转槽中取出，用去离子水与PBST缓冲液稍加漂洗后，浸没于20-25ml封闭液中，40r/min 室温摇动封闭过夜，将封闭过夜的PVDF膜用PBST缓冲液洗3次，每次5min，将洗涤后的PVDF膜放入塑料袋中，加1mL12.9ug/ml 三疣梭子蟹呼肠孤病毒，用封口机封住，室温摇动孵育1h后，用PBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次5min；然后将PVDF膜置于鸡抗三疣梭子蟹呼肠孤病毒一抗稀释液中，在室温下摇动孵育2h，再用PBST缓冲液洗涤3次，每次5min；再将PVDF膜置于HRP-羊抗鸡二抗稀释液中，在室温下缓慢摇动孵育1h，再用PBST缓冲液洗涤3次，每次10min后，将PVDF膜用PBS缓冲液洗5min后，用邻苯二胺在37℃下避光显色15min，PVDF膜上显色的蛋白条带为三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体。

3.  根据权利要求2所述的一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体的筛选方法，其特征在于步骤（1）中所述的膜蛋白提取液的配制方法如下：pH 8.0的1mol/L Tris-HCl 100ml、MgCl2·6H2O 0.4063g、0.1mol/L EDTA 10ml 、TritonX-100 2ml，补足双蒸水至1L，高压灭菌。

4.  根据权利要求2所述的一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体的筛选方法，其特征在于步骤（2）中所述的电转液配制方法为：Tris 3g、甘氨酸 14.4g，甲醇200ml，补足双蒸水至1L；所述的封闭液为含5wt%脱脂牛奶的PBST缓冲液；所述的鸡抗三疣梭子蟹呼肠孤病毒一抗稀释液为鸡抗三疣梭子蟹呼肠孤病毒一抗用含0.5wt% 脱脂牛奶的PBST缓冲液稀释1000倍所得；所述的HRP-羊抗鸡二抗稀释液为HRP-羊抗鸡二抗用含0.5wt% 脱脂牛奶的PBST缓冲液稀释5000倍所得。

5.  根据权利要求4所述的一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体的筛选方法，其特征在于所述的PBST缓冲液配制方法如下：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、 KH2PO4 0.2g，500μL吐温-20，补足双蒸水至1L，调节pH至7.4，高压灭菌；所述的PBS缓冲液配制方法如下：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、 KH2PO4 0.2g，补足双蒸水至1L，调节pH至7.4，高压灭菌。

6.  一种根据权利要求1-5中任一项所述的三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体的用途，其特征在于：权利要求1所述的微管蛋白在制备用于阻断SCRV病毒感染细胞的受体阻断剂方面的用途。

7.  根据权利要求6所述的一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体的用途，其特征在于所述的受体阻断剂为三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体抗体，其具体制备方法如下：将权利要求1所述的微管蛋白用0.9% 氯化钠悬浮，将微管蛋白和弗氏完全佐剂等体积混合，充分乳化后对小鼠皮下注射进行基础免疫，每只小鼠免疫剂量为10-20μg/mL，15天后，将微管蛋白和弗氏不完全佐剂进行等体积混合，充分乳化后对小鼠皮下注射进行加强免疫，每只小鼠免疫剂量为8-15μg/mL，加强免疫重复进行3次，每次间隔时间为7-10天，最后一次免疫后，对小鼠进行摘眼球取血，将血液室温下放置1h，转移至4℃静置3-5h，用针头轻轻将血拨弄后，于4℃，3000g离心10min，取血清，即得到三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体抗体，于-80℃保存备用。

8.  根据权利要求7所述的一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体的用途，其特征在于：所述的三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体抗体用于开发成防治三疣梭子蟹呼肠孤病毒感染方面的应用。

说明书一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体及其筛选方法和应用
技术领域
本发明属于生物学领域，尤其涉及一种新型三疣梭子蟹呼肠孤病毒(SCRV)受体以及利用受体蛋白抗体进行对SCRV病毒感染的防治。
背景技术
三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是一种重要的海洋经济动物，肉味鲜美、营养丰富，深受广大消费者的青睐，也是重要的出口创汇品种。目前三疣梭子蟹是世界上养殖规模最大的海洋经济蟹类。近年来，秋冬季节常出现由梭子蟹呼肠孤病毒引起的疫病使梭子蟹大量死亡的现象，给养殖产业带来重要的经济损失。所述的三疣梭子蟹呼肠孤病毒的毒株为R1015株，保藏号为CGMCC No.5379，于2011年10月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。(类)呼肠孤病毒是中华绒螯蟹(Eriocheir sinensi)、锯缘青蟹(Scylla serrata)和三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的重要病原，哺乳动物呼肠孤病毒受体研究较系统深入而蟹类呼肠孤病毒受体研究尚未被报道。
由于病毒受体及病毒与受体间的互作是病毒感染的关键点而受到广泛的重视从而成为研发热点，已有众多人、畜、禽病毒的细胞受体被阐明，而水生动物病毒受体研究远落后于人、畜、禽病毒。主要的报道有牙鲆淋巴囊肿病毒、WSSV和海洋双RNA病毒Marine birnavirus(MABV)。水生生物呼肠孤病毒与细胞受体互作方面，寥有的几篇报道主要是关于草鱼呼肠孤病毒的。通过对三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体的研究对预防及控制该病毒提供有效策略。
病毒受体的研究方法比较多，如从基因水平上入手的方法有酵母双杂交技术、克隆表达技术、噬菌体展示技术等。从蛋白质水平入手的方法，如病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA)、免疫共沉淀技术等，这些方法的优点是直接、客观。目前，国内外还没有公开任何关于三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体及该受体的阻断抑制剂的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体，同时利用该受体蛋白免疫小鼠所得到的抗体作为受体阻断剂，该阻断剂对三疣梭子蟹呼肠孤病毒感染细胞有抑制活性，可以开发防治三疣梭子蟹呼肠孤病毒感染的药物。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体，所述的受体为微管蛋白。
上述三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体的筛选方法，具体步骤如下：
(1)将健康的三疣梭子蟹冰上解剖取其鳃，按质量体积比1g：(5–10)ml加入到预先冰浴过的含有1mM苯甲基磺酰氟的膜蛋白提取液中匀浆，将匀浆液于4℃，600g离心3min，取上清液于4℃，6000g离心5min后，再取上清液于4℃，35000g离心2h，将得到的沉淀用膜蛋白提取液重悬，即得到三疣梭子蟹鳃膜蛋白提取液；
(2)将三疣梭子蟹鳃膜蛋白提取液进行8％SDS-PAGE电泳后，在电转液中将凝胶上所有蛋白条带转移至PVDF膜上，300mA，4℃转移3h，转移结束后，将PVDF膜从电转槽中取出，用去离子水与PBST缓冲液稍加漂洗后，浸没于20-25ml封闭液中，40r/min室温摇动封闭过夜，将封闭过夜的PVDF膜用PBST缓冲液洗3次，每次5min，将洗涤后的PVDF膜放入塑料袋中，加1mL12.9ug/ml三疣梭子蟹呼肠孤病毒，用封口机封住，室温摇动孵育1h后，用PBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次5min；然后将PVDF膜置于鸡抗三疣梭子蟹呼肠孤病毒一抗稀释液中，在室温下摇动孵育2h，再用PBST缓冲液洗涤3次，每次5min；再将PVDF膜置于HRP-羊抗鸡二抗稀释液中，在室温下缓慢摇动孵育1h，再用PBST缓冲液洗涤3次，每次10min后，将PVDF膜用PBS缓冲液洗5min后，用邻苯二胺在37℃下避光显色15min，PVDF膜上显色的蛋白条带为三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体。
步骤(1)中所述的膜蛋白提取液的配制方法如下：pH 8.0的1mol/L Tris-HCl 100ml、MgCl2·6H2O 0.4063g、0.1mol/L EDTA 10ml、TritonX-100 2ml，补足双蒸水至1L，高压灭菌。
步骤(2)中所述的电转液配制方法为：Tris 3g、甘氨酸14.4g，甲醇200ml，补足双蒸水至1L；所述的封闭液为含5wt％脱脂牛奶的PBST缓冲液；所述的鸡抗三疣梭子蟹呼肠孤病毒一抗稀释液为鸡抗三疣梭子蟹呼肠孤病毒一抗用含0.5wt％脱脂牛奶的PBST缓冲液稀释1000倍所得；所述的HRP-羊抗鸡二抗稀释液为HRP-羊抗鸡二抗用含0.5wt％脱脂牛奶的PBST缓冲液稀释5000倍所得。
所述的PBST缓冲液配制方法如下：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、KH2PO40.2g，500μL吐温-20，补足双蒸水至1L，调节pH至7.4，高压灭菌；所述的PBS缓冲液配制方法如下：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、KH2PO40.2g，补足双蒸水至1L，调节pH至7.4，高压灭菌。
步骤(2)中所述的鸡抗三疣梭子蟹呼肠孤病毒一抗的制备：取健康的初产蛋的母鸡作为免疫对象，将三疣梭子蟹呼肠孤病毒抗原和弗氏完全佐剂等体积混合，充分乳化后对母鸡的双翅、双腿、背部和胸肌部位肌肉注射进行基础免疫，每只母鸡免疫剂量为500-800μ g/mL，15-20天后，将三疣梭子蟹呼肠孤病毒抗原和弗氏不完全佐剂进行等体积混合，充分乳化后对母鸡肌肉注射进行加强免疫，每只母鸡免疫剂量为400-600μg/mL，加强免疫重复进行三次，每次间隔时间为7-10天，进行三次免疫后收集鸡蛋测定效价，当卵黄抗体效价>1：20000时收集鸡蛋，分离卵黄，用饱和硫酸铵沉淀法纯化卵黄抗体。卵黄抗体的纯化的具体方法如下：称取适量卵黄，按1：9加入乙酸-乙酸钠缓冲液(0.05M，pH5.0)，搅拌均匀后4℃静置过夜，8000g离心20min，取上清液加入饱和硫酸铵至饱和度为40％，4℃搅拌6h，10000g离心20min，沉淀用10-20倍卵黄质量的双蒸馏水重悬，加入饱和硫酸钠至饱和度为40％，4℃搅拌过夜，10000g离心20min，取沉淀用少量PBS溶液(0.01M，pH7.4)重悬，在PBS溶液中透析过夜，即得到鸡抗三疣梭子蟹呼肠孤病毒一抗，于-80℃保存备用。
所述的微管蛋白在制备用于阻断SCRV病毒感染细胞的受体阻断剂方面的用途。
所述的受体阻断剂为三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体抗体，其具体制备方法如下：
所述的微管蛋白用0.9％氯化钠悬浮，将微管蛋白和弗氏完全佐剂等体积混合，充分乳化后对小鼠皮下注射进行基础免疫，每只小鼠免疫剂量为10-20μg/mL，15天后，将微管蛋白和弗氏不完全佐剂进行等体积混合，充分乳化后对小鼠皮下注射进行加强免疫，每只小鼠免疫剂量为8-15μg/mL，加强免疫重复进行3次，每次间隔时间为7-10天，最后一次免疫后，对小鼠进行摘眼球取血，将血液室温下放置1h，转移至4℃静置3-5h，用针头轻轻将血拨弄后，于4℃，3000g离心10min，取血清，即得到三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体抗体，于-80℃保存备用。
所述的三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体抗体用于开发成防治三疣梭子蟹呼肠孤病毒感染方面的应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体及其筛选方法和应用，利用该受体蛋白免疫小鼠所得到的抗体作为受体阻断剂，该阻断剂对三疣梭子蟹呼肠孤病毒感染细胞有抑制活性，可以开发防治三疣梭子蟹呼肠孤病毒感染的药物，从而为三疣梭子蟹呼肠孤病毒的研究和防治提供了一个全新的思路，扩大了研究的范围，对于实际生产有着极为重要的意义。
附图说明
图1为用Mascot软件进行三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体蛋白质指纹质谱分析，横坐标表示蛋白质分数，纵坐标表示点击次数；
图2为三疣梭子蟹呼肠孤病毒(SCRV)与SCRV受体的结合的免疫共沉淀结果图；
图3为体外三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体阻断试验中的阴性对照，PBS组；
图4为体外三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体阻断试验中抗受体抗体稀释10倍组；
图5为体外三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体阻断试验中抗受体抗体稀释20倍组；
图6为体外三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体阻断试验中抗受体抗体稀释40倍组。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例一 
用蛋白印迹技术筛选三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体
1、三疣梭子蟹呼肠孤病毒(SCRV)纯化
取攻毒感染死亡的三疣梭子蟹，冰上解剖取其内脏，称量，按质量体积比1g：(5-20)ml加入到预先冰浴过的含有1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的TNE2缓冲溶液中匀浆，将匀浆液于4℃，8000g离心20min，沉淀用含1mM PMSF的TNE2缓冲液重新悬浮匀浆后再次于4℃，8000g离心20min，合并两次离心所得上清液，将上清液于4℃，6000g离心10min后，取上清液于4℃，38000g离心1.5h，用预冷的TM2缓冲液洗去沉淀上层疏松部分，取下层结实白色沉淀部分用含1mM PMSF的预冷的TM2缓冲液重悬后于4℃，3500g离心5min后，取上清液于4℃，38000g离心1.5h，用TM2缓冲液洗去上层疏松部分，下层结实的白色沉淀部分再次用含1mM PMSF的预冷的TM2缓冲液重悬后于4℃，3500g离心5min后，取上清液再次于4℃，38000g离心1.5h，用TM2缓冲液洗去上层疏松部分，最终得到的下层结实的白色沉淀即为三疣梭子蟹呼肠孤病毒抗原。
上述TNE2缓冲液配制方法如下：Tris 6.0578g、NaCl 23.4g、乙二胺四乙酸二钠1.8612g，补足双蒸水至1L，调节pH至8.5，高压灭菌；
上述TM2缓冲液配制方法如下：Tris 6.0578g、MgCl2·6H2O 2.0338g、NaCl 15g，补足双蒸水至1L，调节pH至7.4，高压灭菌。
2、三疣梭子蟹鳃膜蛋白提取
取健康的三疣梭子蟹，冰上解剖取其鳃，称量，按质量体积比1g：(5–10)ml加入到预先冰浴过的含有1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的膜蛋白提取液(Buffer M)中匀浆，将匀浆液于4℃，600g离心3min，取上清液于4℃，6000g离心5min后，再取上清液于4℃，35000g离心2h，将得到的沉淀用膜蛋白提取液重悬，即得到三疣梭子蟹鳃膜蛋白提取液。
上述膜蛋白提取液的配制方法如下：1mol/L Tris-Hcl(pH 8.0)100ml、MgCl2·6H2O 0.4063g、0.1mol/L EDTA 10ml、TritonX-1002ml，补足双蒸水至1L，高压灭菌；上述1mol/L Tris-Hcl(pH 8.0)的配制方法如下：Tris 121.1g、浓HCl 42ml，补足双蒸 水至1L，调节pH至8.0，高压灭菌；上述0.1mol/L EDTA的配制方法如下：EDTA-Na237.22g，补足双蒸水至1L，调节pH至8.0，高压灭菌。
3、蛋白印迹技术筛选
将三疣梭子蟹鳃膜蛋白提取液进行8％SDS-PAGE电泳后，在电转液(电转液配方：Tris3g、甘氨酸14.4g，甲醇200ml，补足双蒸水至1L)中将凝胶上所有蛋白条带转移至PVDF膜上(0.45um)，300mA，4℃转移3h，转移结束后，将PVDF膜从电转槽中取出，用去离子水与PBST缓冲液稍加漂洗后，浸没于封闭液(含5wt％脱脂牛奶的PBST缓冲液)20-25ml中，40r/min室温摇动封闭过夜。将封闭过夜的PVDF膜用PBST缓冲液洗3次，每次5min，将洗涤后的PVDF膜放入塑料袋中，加1mL12.9ug/ml三疣梭子蟹呼肠孤病毒，用封口机封住，室温摇动孵育1h后，用PBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次5min；然后将PVDF膜置于鸡抗三疣梭子蟹呼肠孤病毒一抗稀释液(该稀释液为鸡抗三疣梭子蟹呼肠孤病毒一抗用含0.5wt％脱脂牛奶的PBST缓冲液稀释1000倍所得)中，在室温下摇动孵育2h，再用PBST缓冲液洗涤3次，每次5min；再将PVDF膜置于HRP-羊抗鸡二抗稀释液(该稀释液为HRP-羊抗鸡二抗(康为世纪，CW6162)用含0.5wt％脱脂牛奶的PBST缓冲液稀释5000倍所得)中，在室温下缓慢摇动孵育1h，再用PBST缓冲液洗涤3次，每次10min后，将PVDF膜用PBS缓冲液洗5min后，用邻苯二胺(上海埃彼化学试剂有限公司，AR100G)在37℃下避光显色15min，PVDF膜上显色的蛋白条带即为三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体。
上述PBST缓冲液配制方法如下：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、KH2PO40.2g，500μL吐温-20，补足双蒸水至1L，调节pH至7.4，高压灭菌；上述PBS缓冲液配制方法如下：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、KH2PO40.2g，补足双蒸水至1L，调节pH至7.4，高压灭菌。
4、三疣梭子蟹呼肠孤病毒结合蛋白进行MALDI-TOF-MS-MS分析
将SDS-PAGE电泳得到的凝胶上且与PVDF膜上三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体所对应的蛋白条带切割放入离心管，用封口膜封住，寄到广州辉骏生物科技有限公司进行基质辅助激光解吸电高飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS-MS)分析。质谱结果如图1所示，由Mascot软件分析，当蛋白分数大于41(p<0.05)时结果是有意义的，三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体与拟穴青蟹的微管蛋白匹配分数是48，由此可知上述三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体是微管蛋白(tubulin)。
具体实施例二 
三疣梭子蟹呼肠孤病毒(SCRV)受体抗体的制备
将上述三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体蛋白从8％SDS-PAGE凝胶上割下匀浆，用0.9％氯化钠悬浮，将受体蛋白和弗氏完全佐剂等体积混合，充分乳化后对小鼠皮下注射进行基础免疫，每只小鼠免疫剂量为10-20μg/mL，15天后，将三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体蛋白和弗氏不完全佐剂进行等体积混合，充分乳化后对小鼠皮下注射进行加强免疫，每只小鼠免疫剂量为8-15μg/mL，加强免疫重复进行3次，每次间隔时间为7-10天，最后一次免疫后，对小鼠进行摘眼球取血，将血液室温下放置1h，转移至4℃静置3-5h，用针头轻轻将血拨弄后，于4℃，3000g离心10min，取血清，即得到三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体抗体，于-80℃保存备用。
具体实施例三 
免疫共沉淀技术验证三疣梭子蟹呼肠孤病毒(SCRV)与SCRV受体的结合
将800ul具体实施例一新鲜制备的三疣梭子蟹鳃膜蛋白提取液和30ul三疣梭子蟹呼肠孤病毒抗原加入到离心管中，4℃缓慢振摇8h，再加入10ul鼠抗受体蛋白抗体，抗甲鱼系统性败血症球状病毒卵黄抗体作为阴性对照，4℃孵育过夜。取60ul蛋白A/G琼脂糖(圣克鲁斯生物技术公司，sc-2003)充分颠倒混匀后加入离心管中4℃缓慢振摇3h，加高盐NETN缓冲液1ml，于4℃，3000rpm离心，取沉淀重复离心操作4次进行洗涤，最后加NETN缓冲液1ml，于4℃，3000rpm离心，取沉淀加入30ul蛋白上样缓冲液，沸水煮5min，12000g离心1min，取上清和作为阳性对照的三疣梭子蟹呼肠孤病毒进行12％SDS-PAGE电泳，电泳结束后进行电转膜4℃转移3h，转移结束后，将PVDF膜从电转槽中取出，用去离子水与PBST缓冲液稍加漂洗后，浸没于封闭液(含5wt％脱脂牛奶的PBST缓冲液)20-25ml中，40r/min室温摇动封闭过夜。将封闭过夜的PVDF膜用PBST缓冲液洗3次，每次5min，然后将PVDF膜置于鸡抗三疣梭子蟹呼肠孤病毒一抗稀释液(该稀释液为鸡抗三疣梭子蟹呼肠孤病毒一抗用含0.5wt％脱脂牛奶的PBST缓冲液稀释1000倍所得)中，在室温下摇动孵育2h，再用PBST缓冲液洗涤3次，每次5min；再将PVDF膜置于HRP-羊抗鸡二抗稀释液(该稀释液为HRP-羊抗鸡二抗(康为世纪，CW6162)用含0.5wt％脱脂牛奶的PBST缓冲液稀释5000倍所得)中，在室温下缓慢摇动孵育1h，再用PBST缓冲液洗涤3次，每次10min后，用PBS缓冲液洗PVDF膜1次，5min，用邻苯二胺(上海埃彼化学试剂有限公司，AR100G)在37℃下避光显色15min。结果如图2所示，泳道1为用鼠抗受体蛋白抗体作用下的三疣梭子蟹呼肠孤病毒；泳道2为阳性对照的三疣梭子蟹呼肠孤病毒；泳道3为阴性对照。由图可知，三疣梭子蟹呼肠孤病毒可以和受体蛋白结合。
上述高盐NETN缓冲液配制方法如下：NaCl 29.22g、NP-40 5ml、1.0M Tris-Hcl(pH8.0)20ml、0.1M EDTA 10ml,补足双蒸水至1L，调节pH至7.6，高压灭菌；上述NETN缓冲液配制方法如下：1.0M Tris-Hcl(pH8.0)20ml、0.1M EDTA 10ml、NaCl 5.844g、NP-40 5ml，补足双蒸水至1L，高压灭菌。
上述抗甲鱼系统性败血症球状病毒卵黄抗体的制备：
取健康的初产蛋的母鸡作为免疫对象，将甲鱼系统性败血症球状病毒抗原和弗氏完全佐剂等体积混合，充分乳化后对母鸡的双翅、双腿、背部和胸肌部位肌肉注射进行基础免疫，每只母鸡免疫剂量为500-800μg/mL，15-20天后，将甲鱼系统性败血症球状病毒抗原和弗氏不完全佐剂进行等体积混合，充分乳化后对母鸡肌肉注射进行加强免疫，每只母鸡免疫剂量为400-600μg/mL，加强免疫重复进行三次，每次间隔时间为7-10天，进行三次免疫后收集鸡蛋测定效价，当卵黄抗体效价>1：20000时收集鸡蛋，分离卵黄，用饱和硫酸铵沉淀法纯化卵黄抗体。卵黄抗体的纯化的具体方法如下：称取适量卵黄，按1：9加入乙酸-乙酸钠缓冲液(0.05M，pH5.0)，搅拌均匀后4℃静置过夜，8000g离心20min，取上清液加入饱和硫酸铵至饱和度为40％，4℃搅拌6h，10000g离心20min，沉淀用10-20倍卵黄质量的双蒸馏水重悬，加入饱和硫酸钠至饱和度为40％，4℃搅拌过夜，10000g离心20min，取沉淀用少量PBS溶液(0.01M，pH7.4)重悬，在PBS溶液中透析过夜，即得到抗甲鱼系统性败血症球状病毒卵黄抗体；上述乙酸-乙酸钠缓冲液配方如下：乙酸钠2.604g、冰乙酸1.095g，补足双蒸馏水至1L，调pH至5.0，高压灭菌。
具体实施例四 
体外三疣梭子蟹呼肠孤病毒(SCRV)受体阻断试验
1、异硫氰酸荧光素(FITC)标记三疣梭子蟹呼肠孤病毒制备：将SCRV与FITC按质量比1:100比例混合孵育1h后，10000g离心10min，取沉淀用TM2缓冲液悬浮，再用该缓冲液在10000g离心10min洗涤三次，以除去未结合的FITC，用1ml PBS缓冲液悬浮沉淀；
2、三疣梭子蟹血细胞悬液制备：用一次性注射器对梭子蟹进行心脏取血，血液与抗凝剂的比例为1：1，500g离心3min，1ml PBS缓冲液悬浮沉淀；
所述的抗凝剂配制方法如下：一水合柠檬酸0.547g、二水合柠檬酸钠9.116g、葡萄糖18.7g、NaCl 26g,补足双蒸水至1L，调节pH至5.66,高压灭菌；
3、将上述三疣梭子蟹血细胞悬浮液加到24孔细胞培养板，室温孵育1h，加三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体抗体稀释10倍(图4)，20倍(图5)，40倍(图6)三个梯度，加PBS缓冲液作为阴性对照，室温孵育1h，每个孔加异硫氰酸荧光素标记的三疣梭子蟹呼肠孤病毒继 续室温孵育30min，用PBS缓冲液洗涤两次，每次5min，在显微镜观察结果。结果如图3-6所示，由图3-6可知三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体抗体稀释度为10倍时(图4)，三疣梭子蟹呼肠孤病毒数相对于阴性对照组(图3)明显减少，当三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体抗体稀释度为20、40倍(图5、图6)，三疣梭子蟹呼肠孤病毒数相对于阴性对照组(图3)略有减少。由此可知，加三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体抗体对三疣梭子蟹呼肠孤病毒的抑制感染有明显的作用。
具体实施例五 
体内三疣梭子蟹呼肠孤病毒(SCRV)受体阻断试验
1、实验用蟹及分组
三疣梭子蟹由宁波象山鑫亿养殖场提供，平均20g/只；实验用蟹在实验室充气暂养7d稳定后，选健康活泼者分三个组，A组为PBS为空白对照组，B组为SCRV感染组，作阴性对照组，C组为SCRV受体抗体实验组，20只/组。
2、毒种处理 
取2g呼肠孤病毒感染致死三疣梭子蟹腿部肌肉，加30mlTM2缓冲液在冰上进行匀浆；匀浆液在4℃，6000g离心20min，取上清，加终浓度为1000单位的青霉素、链霉素混合液，4℃静置过夜。
3、实验方法 
A组(空白对照组)：从三疣梭子蟹第二步足处注射PBS，150ul/只；
B组(阴性对照组)：从三疣梭子蟹第二步足处注射攻毒液，150ul/只；
C组(SCRV受体抗体实验组)：从三疣梭子蟹第二步足处注射SCRV受体抗体50ul，半个小时后，每只再注射攻毒液100ul。
4、实验结果检测
感染后每天进行换水，充气养殖，观察梭子蟹发病和死亡情况，对死蟹数量进行记录，并计算相对保护率：
相对保护率(％)＝(1-阳性组死亡尾数/阴性组死亡尾数)×100％。
5、结果
感染实验结果：通过感染实验蟹的存活情况，结果显示SCRV受体抗体注射后再进行毒种感染的实验组梭子蟹较感染对照组存活率得到提高，其相对保护率为50％。注射感染为一种很激烈的感染方式，SCRV采用这种方式感染梭子蟹时，其致死力极强，且攻毒剂量较大，在这种情况下SCRV受体抗体能使病毒感染梭子蟹后的存活率提高，证明该SCRV受体抗体对 三疣梭子蟹呼肠孤病毒的感染活性有明显的抑制作用，可用于开发防治三疣梭子蟹呼肠孤病毒的药物。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。