一种抗体保护剂及其应用 【技术领域】
本发明涉及一种抗体保护剂及其应用， 属于生物检测技术领域。背景技术 离子液体是指在室温范围内 ( 一般为 100℃下 ) 呈现液态的完全由离子构成的物 质体系。 一般由有机阳离子和无机阴离子、 有机阴离子组成， 其性能主要由组成的阳离子和 阴离子共同决定。 离子液体具有很多独特的理化性能， 经测定， 许多咪唑阳离子构成的离子 液体的热分解温度高达 400℃。由于离子液体的熔点一般低于 100℃， 因此其稳定的液态范 围可达 300℃ -400℃， 这是普通溶剂无法比拟的。与传统的有机溶剂不同， 由于离子液体内 部的库仑引力较大， 相当于水的 10 倍， 其蒸汽压几乎察觉不到。离子液体随其阴离子和阳 离子的不同呈现出一定的极性， 对金属络合物具有很强的溶解能力， 对于普通溶剂难以溶 解的氢化物 (NaH、 CaH 2)、 碳化物、 氮化物、 硫化物以及各种氧化物的盐类化合物， 离子液体 也具有良好的溶解能力。
由于离子液体所体现的优良特性， 在诸多领域越来越成为研究的热点， 如离子液 体在萃取分离、 有机合成反应、 环境友好催化体系中的应用， 因此， 被认为是一种具有广阔 应用前景的新型环境友好的绿色溶剂。有关离子液体与酶之间相互作用报道已有很多， 例 如， 酶在室温离子液体里的活性、 稳定性、 选择性等等， 但是， 国内外有关离子液体在抗体稳 定性方面的研究却未见报道。目前， 常用小分子糖类物质、 表面活性剂等作为抗体保护剂， 但效果并不理想。
发明内容
本发明提供了一种抗体保护剂， 可在室温下保持抗体的稳定。
为解决上述技术问题， 含有离子液体 1- 仲丁基 -3- 甲基咪唑 - 六氟磷酸盐、 牛血 清蛋白、 硫柳汞， pH 为 7.4 的 PBS 缓冲液 ； 其中 1- 仲丁基 -3- 甲基咪唑 - 六氟磷酸盐浓度 为 0.05％ -5％、 牛血清蛋白含量为 0.1g/L-3g/L、 硫柳汞含量为 0.05g/L-1g/L。
所述抗体保护剂， 还包括浓度为 10mmol/L-30mmol/L 的 CaCl2， 浓度为 200mmol/ L-600mmol/L 的海藻糖。
所述抗体保护剂， 离子液体 1- 仲丁基 -3- 甲基咪唑 - 六氟磷酸盐 ( 离子液体 1- 仲 丁基 -3- 甲基咪唑六氟磷酸盐的微波辅助合成、 晶体结构及热稳定性， 高等学校化学学报， 2009， 9， 1814-1818) 在抗体保护剂中其浓度为 0.05％ -5％ ( 体积比 )， 其优选浓度为 0.5％； 发明所用离子液体为自主合成 ； 在装有电动搅拌器、 温度计和高纯氮气的四口瓶中， 加入等 摩尔 (0.5mL) 的 3- 甲基咪唑和重蒸过的溴代仲丁烷， 水浴加热， 溶液由透明变为膏状时停 止搅拌， 加水溶解， 弃去上层未反应的原料， 将中间产物转移至 400mL 烧杯中加入 200mL 丙 酮， 搅拌， 分批加入四氟硼酸钾， 加毕， 继续搅拌 3h， 过滤除溴化钾， 滤液减压蒸馏除去丙酮， 紫外、 核磁 (1H-NMR) 和电喷雾质谱对离子液体进行表 得到无色离子液体， 然后， 采用红外、 征。所述的 pH 缓冲液， 采用 PBS 缓冲液， 由磷酸一氢钠、 磷酸二氢钠、 氯化钠组成， 30-40℃水浴溶解后， 冷却至室温， 校正 pH 至 7.4。
所述硫柳汞、 CaCl2、 海藻糖为常用防腐剂的成分。
本发明提供的一种抗体保护剂， 用于提高免疫学检测的稳定性。
为解决上述技术问题， 本发明应用方法为， 抗体保护剂与抗体按照 1 ∶ 1-3 ∶ 1 之 间的比例混合， 混合后的复合物包被于裸金电极表面制作成为工作电极， 工作电极用于免 疫学检测。
所述工作电极的制备方法为， 金电极 ( 直径 2mm) 分别经 0.3、 0.05μm Al2O3 悬浊 液抛光成镜面后， 依次用蒸馏水、 无水乙醇、 蒸馏水超声 5min， 清洗后将电极置于室温下晾 干备用 ； 将一定量的羧基化碳纳米管滴加于电极表面， 于室温下晾干备用 ； 将上述抗体混 合液 10μL 滴于电极表面， 在 37℃下吸附 1h， 蒸馏水洗净晾干， 在 4℃下储存备用。
所述免疫学检测装置工作原理在于， 抗体包被于电极表面产生一定阻抗值， 抗体 与检测物中毒素结合后阻抗值发生变化， 其变化与毒素浓度成正比， 装置采用 CHI760C 型 电化学工作站检测阻抗值。
所述 CHI760C 型电化学工作站， 其本质是用于控制和监测电化学池电流和电位以 及其它电化学参数变化的仪器装置， 本发明用于检测阻抗值的变化。 所述抗体， 为黄曲霉毒素抗体、 金黄色葡萄球菌 B 型肠毒素抗体、 藻毒素抗体或呕 吐毒素抗体中任一一种， 购自 Sigma 公司。
所述毒素， 为黄曲霉毒素、 金黄色葡萄球菌 B 型肠毒素、 藻毒素和呕吐毒素中任 一一种， 购自 Sigma 公司。
所述免疫学检测方法， 采用酶联免疫吸附试验 (enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA)， ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记 ； 结合在固相 载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性， 酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性， 又保留酶的活性 ； 在测定时， 受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
本发明将离子液体用于抗体保护剂的开发， 研制出了一种新型、 绿色、 高效的抗体 保护剂， 可使抗体在室温下保藏依然保持较高的活性， 抗体保护剂可与抗体混合包裹于裸 金电极表面制作成工作电极， 安置于免疫学检测装置中， 明显提高了免疫学检测装置的稳 定性和准确性。
附图说明
图1： 应用抗体保护剂后， 检测黄曲霉毒素的免疫学电化学检测曲线。 -2
( 在 1×10 -2.0μg/L 黄曲霉毒素浓度范围内， 可产生良好线性， 线性回归方程为 2 Y ＝ 1.1649X+0.1141， R ＝ 0.9982)
图2： 应用抗体保护剂后， 检测金黄色葡萄球菌 B 型肠毒素的免疫学电化学检测曲 线。
( 在 5×10-3-1.0μg/L 金黄色葡萄球菌 B 型肠毒素浓度范围内， 可产生良好线性， 2 线性回归方程为 Y ＝ 1.3055X+0.0809， R ＝ 0.9989)
图3： 应用抗体保护剂后， 检测藻毒素的免疫学电化学检测曲线。 -3
( 在 5×10 -1.0μg/L 藻毒素浓度范围内， 可产生良好线性， 线性回归方程为 Y ＝0.9964X+0.1063， R2 ＝ 0.99849)
图4： 应用抗体保护剂后， 检测呕吐毒素的免疫电化学检测曲线。 -3
( 在 5×10 -1.0μg/L 呕吐毒素浓度范围内， 可产生良好线性， 线性回归方程为 Y 2 ＝ 1.1309X+0.1038， R ＝ 0.9965) 具体实施例
实施例 1 ： 抗体效价的测定方法
1) 包 被 ： 用 0.05mol/L， pH 9.6 碳 酸 盐 缓 冲 液 将 包 被 抗 原 稀 释 至 1 ∶ 4000， 100μL/ 孔加到酶标板上， 4℃冰箱过夜。
2) 封闭 ： 取出已包被好的酶标板， 恢复至室温后， 用洗液洗涤 2 次， 每次 2 分钟， 拍 干。加入 3％的 BSA-PBS 溶液封闭， 250μL/ 孔， 37℃恒温培养箱孵育 2h。
3) 加入抗体 ： 将封闭好的酶标板取出， 恢复至室温， 洗涤 3 次， 依次加入用 0.1％ BSA-PBS 抗体稀释液， 适当倍比稀释浓度的抗体以及阴性血清， 横向分别加入 100μl/ 孔， 37℃温育 1h。
4) 加入酶标二抗 ： 取出以上酶标板， 洗涤 4 次， 将酶标羊抗兔抗体稀释至工作浓度 1 ∶ 5000， 每空加入 100μL， 37℃恒温培养箱孵育 30min。
5) 加入显色液 ： 将上述酶标板取出， 恢复到室温后， 洗涤 4 次后加入显色液， 100μL/ 孔， 37℃温育 15min。
6) 终止反应 ： 取出酶标板， 加终止液 (2mol/L 硫酸 )， 50μL/ 孔。
7) 测定 ： 用酶标仪测定终止反应后的各孔的 OD450 值。
阳性血清的 OD450 ≥阴性对照孔的 2.1 倍并且 OD450 大于 0.1， 此时的抗体稀释倍 数即是该抗体的效价。
实施例 2 ： 保护剂中离子液体浓度为 0.5％
实验组中离子液体浓度为 0.5％ ( 体积比 )， 将保护剂与抗体血清 ( 藻毒素抗体 ) 按照 2 ∶ 1 体积比混合， 对照组不添加保护剂， 将两组分分别在室温下储存 12 个月， 其间， 每隔三个月取样， 进行效价测定。
藻毒素保护剂组成为 ： 离子液体 1- 仲丁基 -3- 甲基咪唑 - 六氟磷酸盐 0.5 ％、 CaCl220mmol/L、 海藻糖 500mmol/L、 牛血清蛋白 1g/L、 硫柳汞 0.1g/L。
发现对照组抗体在 3 个月时， 实验组抗体效价未发生明显变化， 而对照组抗体效 价下降 50％， 6 个月时实验组抗体依然保持活力， 对照组抗体已经腐败变质不能使用。 12 个 月后， 实验组依然保持 98％的抗体活力， 具体结果见表 1。
表1： 0.5％离子液体时藻毒素抗体效价变化
实施例 3 ： 保护剂中离子液体浓度为 0.05％
当离子液体浓度为 0.5％ ( 体积比 ) 时， 将抗体保护剂与抗体血清 ( 藻毒素抗体 ) 按照 2 ∶ 1 体积比混合， 在室温下储存 12 个月， 每隔三个月取样， 进行效价测定。
藻毒素保护剂组成为 ： 离子液体 1- 仲丁基 -3- 甲基咪唑 - 六氟磷酸盐 0.05 ％、 CaCl220mmol/L、 海藻糖 500mmol/L、 牛血清蛋白 1g/L、 硫柳汞 0.1g/L。
藻毒素抗体室温下放置 3 个月后， 藻毒素抗体依然保持 100％的抗体活力 ； 6 个月 后， 藻毒素抗体依然保持 94％的抗体活力 ； 9 个月后， 藻毒素抗体依然保持 87.5％的抗体活 力； 12 个月后， 藻毒素抗体依然保持 78％的抗体活力， 具体结果见表 2。
表2： 0.05％离子液体时藻毒素抗体效价变化
实施例 4 ： 保护剂中离子液体浓度为 5％
当离子液体浓度为 5％ ( 体积比 ) 时， 将抗体保护剂与抗体血清 ( 藻毒素抗体 ) 按 照 2 ∶ 1 体积比混合， 室温下储存 12 个月， 其间， 每隔三个月取样， 进行效价测定。
上述藻毒素保护剂组成为 ： 离子液体 1- 仲丁基 -3- 甲基咪唑 - 六氟磷酸盐 5％、 CaCl220mmol/L、 海藻糖 500mmol/L、 牛血清蛋白 3g/L、 硫柳汞 1g/L。
藻毒素抗体室温下放置 3 个月后， 藻毒素抗体依然保持 87.5％的抗体活力 ； 6个 月后， 藻毒素抗体依然保持 78％的抗体活力 ； 9 个月后， 藻毒素抗体依然保持 75％的抗体活 力； 12 个月后， 藻毒素抗体依然保持 62.5％的抗体活力， 具体结果见表 3。
表3： 5％离子液体时藻毒素抗体效价变化
实例 5 ： 保护剂与抗体比例 1 ∶ 1
藻毒素保护剂组成为 ： 离子液体 1- 仲丁基 -3- 甲基咪唑 - 六氟磷酸盐 0.5％ ( 体 积比 )、 CaCl220mmol/L、 海藻糖 500mmol/L、 牛血清蛋白 1g/L、 硫柳汞 0.1g/L。
将藻毒素保护剂与藻毒素抗体按照 1 ∶ 1 体积比进行混合， 孵育在电极上制成修 饰电极， 室温下放置 12 个月， 每个三个月再测定 1ppb 藻毒素含量时， 电极的阻抗响应值。
通过表 4 可见， 室温保存 12 个月， 电极的阻抗响应值下降了 50％。
表 4 保护剂与抗体比例 1 ∶ 1 时修饰电极阻抗响应值的变化
实例 6 ： 保护剂与抗体比例 2 ∶ 1
藻毒素保护剂组成为 ： 离子液体 1- 仲丁基 -3- 甲基咪唑 - 六氟磷酸盐 0.5％ ( 体 积比 )、 CaCl220mmol/L、 海藻糖 500mmol/L、 牛血清蛋白 1g/L、 硫柳汞 0.1g/L。
将藻毒素保护剂与藻毒素抗体按照 2 ∶ 1 体积比进行混合， 孵育在电极上制成修 饰电极， 再测定 1ppb 藻毒素含量时， 电极的阻抗响应值。
通过表 5 可见， 室温保存 12 个月， 电极的阻抗响应值仅下降 17％。
表 5 保护剂与抗体比例 2 ∶ 1 时修饰电极阻抗响应值的变化
实例 7 ： 保护剂与抗体比例 3 ∶ 1藻毒素保护剂组成为 ： 离子液体 1- 仲丁基 -3- 甲基咪唑 - 六氟磷酸盐 0.5％ ( 体 积比 )、 CaCl220mmol/L、 海藻糖 500mmol/L、 牛血清蛋白 1g/L、 硫柳汞 0.1g/L。
将藻毒素保护剂与藻毒素抗体按照 3 ∶ 1 体积比进行混合， 孵育在电极上制成修 饰电极， 再测定 1ppb 藻毒素含量时， 电极的阻抗响应值。
通过表 6 可见， 室温保存 12 个月， 电极的阻抗响应值仅下降 56％。
表 6 保护剂与抗体比例 3 ∶ 1 时修饰电极阻抗响应值的变化
实施例 8 ： 免疫学检测装置的制备
工作电极的制备 ：
金电极 ( 直径 2mm) 分别经 0.3， 0.05μm Al2O3 悬浊液抛光成镜面后， 依次用蒸馏 水、 无水乙醇、 蒸馏水超声 5min， 清洗后将电极置于室温下晾干备用。将一定量的羧基化碳 纳米管滴加于电极表面， 于室温下晾干备用。将上述抗体混合液 10μL 滴于电极表面， 在 37℃下吸附 1h， 蒸馏水洗净晾干， 在 4℃下储存备用。
免疫学检测装置工作原理 ：
采用 CHI760C 型电化学工作站检测阻抗值变化， 三电极体系组成三电极体系组 成： 免疫电极为工作电极， 饱和甘汞标准电极为参比电极， 铂丝电极为对电极。抗体包被在 金电极表面， 其存在一定阻抗值， 抗体与检测物中毒素结合后阻抗值发生变化， 其变化与毒 素浓度成正比。
实施例 9 ： 保护剂在黄曲霉毒素免疫学检测装置中的应用
抗体保护剂组成为 ： 离 子 液 体 1- 仲 丁 基 -3- 甲 基 咪 唑 - 六 氟 磷 酸 盐 0.5 ％、 CaCl220mmol/L、 海藻糖 500mmol/L、 牛血清蛋白 1g/L、 硫柳汞 0.1g/L。
抗体保护剂与抗体按照 2 ∶ 1 体积比混合， 混合后将复合物包被于金电极表面制 作成工作电极， 装置其他部件按照实施例 7 中设计制作。
建 立 黄 曲 霉 毒 素 标 准 品 与 免 疫 学 检 测 阻 抗 值 变 化 的 关 系， 结 果 见 附 图 一， -2 在 1×10 -2.0μg/L 黄 曲 霉 毒 素 浓 度 范 围 内， 可 产 生 良 好 线 性， 线性回归方程为 Y ＝ 2 1.1649X+0.1141， R ＝ 0.9982。
实施例 10 ： 保护剂在金黄色葡萄球菌 B 型肠毒素免疫学检测装置中的应用
抗体保护剂组成为 ： 离 子 液 体 1- 仲 丁 基 -3- 甲 基 咪 唑 - 六 氟 磷 酸 盐 0.5 ％、 CaCl220mmol/L、 海藻糖 500mmol/L、 牛血清蛋白 1g/L、 硫柳汞 0.1g/L。
抗体保护剂与抗体按照 2 ∶ 1 体积比混合， 混合后将复合物包被于金电极表面制 作成工作电极， 装置其他部件按照实施例 7 中设计制作。
金黄色葡萄球菌 B 型肠毒素标准品与免疫学检测阻抗值变化的关系， 结果见附图
二， 在 5×10-3-1.0μg/L 金黄色葡萄球菌 B 型肠毒素浓度范围内， 可产生良好线性， 线性回 2 归方程为 Y ＝ 1.3055X+0.0809， R ＝ 0.9989。
实施例 11 ： 保护剂在藻毒素免疫学检测装置中的应用
抗体保护剂组成为 ： 离 子 液 体 1- 仲 丁 基 -3- 甲 基 咪 唑 - 六 氟 磷 酸 盐 0.5 ％、 CaCl220mmol/L、 海藻糖 500mmol/L、 牛血清蛋白 1g/L、 硫柳汞 0.1g/L。
抗体保护剂与抗体按照 2 ∶ 1 体积比混合， 混合后将复合物包被于金电极表面制 作成工作电极， 装置其他部件按照实施例 7 中设计制作。
藻 毒 素 标 准 品 与 免 疫 学 检 测 阻 抗 值 变 化 的 关 系， 结 果 见 附 图 三， 在 -3 5×10 -1.0μg/L 藻 毒 素 浓 度 范 围 内， 可 产 生 良 好 线 性， 线性回归方程为Y＝ 2 0.9964X+0.1063， R ＝ 0.99849。
实施例 12 ： 保护剂在呕吐毒素免疫学检测装置中的应用
抗体保护剂组成为 ： 离 子 液 体 1- 仲 丁 基 -3- 甲 基 咪 唑 - 六 氟 磷 酸 盐 0.5 ％、 CaCl220mmol/L、 海藻糖 500mmol/L、 牛血清蛋白 1g/L、 硫柳汞 0.1g/L。
抗体保护剂与抗体按照 2 ∶ 1 体积比混合， 混合后将复合物包被于金电极表面制 作成工作电极， 装置其他部件按照实施例 7 中设计制作。
呕 吐 毒 素 标 准 品 与 免 疫 学 检 测 阻 抗 值 变 化 的 关 系， 结 果 见 附 图 四， 在 -3 5×10 -1.0μg/L 呕 吐 毒 素 浓 度 范 围 内， 可 产 生 良 好 线 性， 线性回归方程为 Y ＝ 2 1.1309X+0.1038， R ＝ 0.9965。