猪PDLIM3蛋白三种亚型超表达载体的构建和应用.pdf

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种猪PDLIM3蛋白三种不同亚型超表达载体的构建和应用。所述的猪PDLIM3蛋白三种不同亚型基因编码区的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1、SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示。将猪PDLIM3蛋白三种亚型的基因的完整编码区片段经过双酶切，连接到同样经过双酶切pEGFP-N1载体中，这样可以同时构建三个PDLIM3蛋白三种亚型超表达载体。该真核表达载体构建方法简单可行，可以高效的增强PDLIM3蛋白的表达，并且都包含绿色荧光蛋白，可以检测猪PDLIM3蛋白三种不同亚型在真核细胞中的表达和定位。本发明提供的超表达载体也可以在研究猪PDLIM3蛋白在猪肌肉纤维生长和发育中的作用。

权利要求书
1.  作为猪PDLIM3基因三种转录本，它们的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所述。

2.  猪PDLIM3基因三种转录本真核重组质粒，其特征在于由序列表中SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所述的猪PDLIM3基因三种转录本的核苷酸序列和pEGFP-N1载体构建而成，其中利用带有保护性碱基、末端分别带有EcoR1和BamH1限制性内切酶酶切位点的引物进行PCR扩增，PCR反应的正、反向引物DNA序列如下所示：
正向引物（F1）： 5- CGGAATTCATGCCCCAAAACGTGATC-3
反向引物（R1）：5- CGGGATCCTGAGCTTTGGGATAGAGAGT-3。

3.  制备如权利要求2所述的真核重组质粒的方法，按照以下步骤：
   （1）以猪肌肉的cDNA为模板，PCR扩增猪PDLIM3基因的三种转录本；
（2）用EcoR1和BamH1限制性内切酶分别对纯化后的猪PDLIM3基因的三种转录本和pEGFP-N1质粒进行双酶切，用连接酶T4 DNA Ligase进行酶连接，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布加有Kan抗生素的平板，筛选阳性克隆。

4.  依据权利3所述方法获得的猪PDLIM3基因三种转录本真核表达载体，在猪PDLIM3蛋白三种亚型亚细胞定位分布中的应用。

说明书猪PDLIM3蛋白三种亚型超表达载体的构建和应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种猪PDLIM3蛋白三种不同亚型超表达载体的构建方法和应用。
背景技术
Actinin-associated LIM protein (PDLIM3) 属于PDZ/LIM 蛋白家族，其直接和α-actinin 蛋白在骨骼肌Z线处结合，最近发现其可以调控许多生肌调控因子myogenin 和MyoD。所以其可以作为肌纤维的结构蛋白也可以通过转录调控来促进肌纤维的发育。敲除PDLIM3可以导致心脏的发育不完善，并且带来许多肌肉相关的疾病，所以其在骨骼肌和心肌的发育过程中具有重要的作用。以前在人、小鼠、鸡和鱼类中研究报道PDLIM3基因存在两种不同的转录本。
猪PDLIM3基因是在大白猪和梅山猪中筛选出的骨骼肌差异表达基因，且为横纹肌特异表达基因，在骨骼肌发育不同时期和中外品种间表达量存在差异。研究还发现猪PDLIM3基因存在大量的转录本，除了包括以前发现的两种外，还发现一种缺失了中间ZM结构域的PDLIM3-2。以前的研究结果表明ZASP-like motif(ZM) 结构域对于ALP基因和肌肉Z线的结合起着重要的作用，表明ZM结构域在蛋白与蛋白结合中起着非常重要的作用，那么PDLIM3-2缺失了ZM结构域，可能会在蛋白与蛋白的相互作用中有着新的作用，特别是在肌肉的不同发育时期中可能起着某种重要的作用。另外还发现在3'UTR存在大量的选择性剪切现象，这很可能会改变其RNA二级结构，影响其转录从而改变其功能。
猪肌肉初级肌纤维数量形成终止和二级纤维形成的开始在胚胎期65天，出生后就是肌纤维的肥大增殖阶段。PDLIM3-1和PDLIM3-3在肌纤维数量肥大阶段，表达量呈现上调趋势，而在出生后他们的表达量显著升高，表明猪PDLIM3-1和PDLIM3-3可能对于肌纤维的增长和发育有重要的作用。然而PDLIM3-2在胚胎期65天具有较高的表达，而在出生后则表达量显著下降，说明 PDLIM3-2在猪肌肉纤维数量发育阶段发挥着重要的作用，特别是对二级肌纤维的形成。在体外分离培养的猪骨骼肌卫星细胞中也发现，随着肌卫星细胞的分化猪PDLIM3不同转录本都呈现上调趋势，说明不同的转录本在肌纤维的分化过程中起着重要的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种PDLIM3蛋白三种不同亚型超表达载体构建的方法。
本发明通过以下技术实现：根据pEGFP-N1载体的多克隆位点和猪不同PDLIM3转录本的编码区序列，设计带有保护性碱基、末端分别带有EcoR1和BamH1限制性内切酶酶切位点的引物，扩增产物包含猪不同PDLIM3转录本的编码区序列。将其构建入pEGFP-N1载体的EcoR1和BamH1两个酶切位点之间。得到猪PDLIM3不同绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-N1- PDLIM3。
本发明的效果是：利用一对引物进行PCR扩增可以同时克隆猪PDLIM3蛋白三种亚型的基因的完整编码区，可以同时构建三个PDLIM3蛋白三种亚型超表达载体。该真核表达载体构建方法简单可行，可以高效的增强PDLIM3蛋白的表达，并且都包含绿色荧光蛋白，是研究猪PDLIM3蛋白三种亚型的功能差异的重要技术。
更详细的技术方案请参见《具体实施方式》中的实施例。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的猪PDLIM3基因转录本1的核苷酸序列。
序列表SEQID NO：2是本发明克隆的猪PDLIM3基因转录本2的核苷酸序列。
序列表SEQID NO：3是本发明克隆的猪PDLIM3基因转录本3的核苷酸序列。
图1是猪PDLIM3蛋白三种亚型的绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-N1- PDLIM3构建后的酶切鉴定图谱。图中泳道M：DNA分子量标准（DL2000 ladder）。
图2是猪PDLIM3蛋白三种亚型的绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-N1-PDLIM3通过瞬时转染导入猪PK-15细胞后的蛋白表达图谱。A、B、C分别代表PDLIM3-1、 PDLIM3-2 和PDLIM3-3在细胞中的表达。
具体实施方式
实施例1: 猪PDLIM3蛋白三种不同亚型基因序列的扩增
（1）总RNA的提取
1. 将100mg肌肉组织放入盛有液氮的研钵中，用研杵将组织磨成粉末。
2. 把粉末转移到Eppendorf管中，每100mg组织加1.0mL的Trizol，用匀浆器充分研磨，转入离心管。
3. 于4℃以12000r/min 离心10min，使混合物分为两相。
4. 将上层水相移入另一离心管中，加入200μL氯仿/1mLTrizol，充分混匀，室温静置5分钟，于4℃以12000r/min离心10min。
5. 将上清液小心转移到1.5mL离心管里，加入与上清等体积的异丙醇，室温下放置15min。
6. 12000r/min离心10min，沉淀RNA。
7. 加入75%乙醇1mL，于4℃以7500r/min离心5分钟。
8. 尽可能彻底地吸取上清，放在室温下将酒精风干。然后沉淀用DEPC水溶解，混匀，分装。
9. 取2μL总RNA，加2μL上样缓冲液，混匀后点样于0.8％的琼脂糖凝胶，观察RNA的完整性并拍照做好记录。
10. 测定总RNA的浓度后，样品于-80℃保存备用。
（2）cDNA的合成
取2μg总RNA和1μL Oligo(dT)15于0.5ml DEPC 水处理的无菌Ep管中，加入DEPC处理水至总体积10μL。混匀后离心，于70C温育5 min后迅速转入冰浴2min。然后加入200U的M-MLV, 5μL的5×buffer, 1μL 10mM的dNTP, 100U的RNasin，加入DEPC处理水至15μL。混匀后离心，置于37℃温育1h，然后95℃5min。cDNA于-20℃保存。
（3）RT-PCR扩增目的基因的三种转录本
用Primer Premier 5.0 软件设计1对引物扩增SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3，所述的序列，它们的序列大小分别为1109、844、965bp。所述1对引物的DNA序列如下：
正向引物（F1）： 5- CGGAATTCATGCCCCAAAACGTGATC-3
反向引物（R1）：5- CGGGATCCTGAGCTTTGGGATAGAGAGT-3。
以猪肌肉的cDNA为模板，PCR扩增猪PDLIM3基因的三种转录本。PCR的反应总体积均为25uL，体系如下：2.5μL10×PCR buffer (with NH4+)， 2μL 25mM MgCl2，2.5μL 2mM dNTP，1μL(10μM)正反向引物，1U Taq DNA聚合酶 (MBI) 和50ng DNA。PCR的反应程序为：95℃ 4min；94℃ 40s，59℃ 40s，72℃ 90s，35个循环；72℃延伸6min。扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
实施例2: 不同PDLIM3亚细胞定位载体构建
（1）扩增猪PDLIM3不同转录本扩增产物用琼脂糖凝胶纯化试剂盒进行纯化。 
（2）用质粒小量抽提试剂盒抽提制备pEGFP-N1空载体。
（3） 用EcoR1和BamH1限制性内切酶分别对纯化后的PCR产物和所抽提的质粒进行双酶切，37℃孵育6小时后纯化回收。PCR产物和载体质粒的双酶切体系：总体积为20 μL，包含 pEGFP-N1载体DNA 8 μL，10×Buffer (MBI) 2 μL, EcoR1和BamH1两种限制性内切酶各1 μL, 双蒸水8 μL。
（4） 用连接酶T4 DNA Ligase进行酶连，酶连体系为：质粒双酶切产物2 μL，PDLIM3基因片段双酶切产物6 μL，T4 Ligase 1 μL，10×Buffer 1 μL，混匀后置16℃连接8小时。 
（5） 将连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布加有抗生素（Kan）的平板，筛选阳性克隆，挑单克隆经菌液PCR鉴定为阳性之后，送测序公司进行测序验证，并最终确定载体构建成功。 
实施例3: 猪PDLIM3蛋白三种不同亚型的亚细胞定位
（1）    细胞培养
在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中进行猪肾细胞（Porcine kidney cells，PK15）的培养。培养箱条件为37℃，5％的CO2。当细胞处于对数生长期时，用PBS洗细胞三遍后，加入1.5 mL胰酶，依据细胞密度情况37℃消化4-6 min，倒掉胰酶向培养瓶中加入DMEM细胞生长培养基并用吸管吹打细胞使其形成单个细胞的形式。然后将获得的细胞悬液一部分均匀分到放有盖玻片的六孔板中。
（2）脂质体法转染
当六孔板中的细胞达到40-60％汇合率时进行转染。首先将4 ug质粒DNA与250 μL OPTI培养基混合均匀，然后将10 uL 脂质体与250 μL OPTI培养基中，混匀静置5分钟。再将两种混合物混匀，室温放置20分钟。最后将质粒和脂质体的混合物加入六孔板中轻轻混匀后放入CO2培养箱于37℃温育6小时。然后弃去转染液加入含血清的DMEM培养基继续培养。
（3）转染后的细胞染色和融合蛋白的观察
PK15转染18-24小时后用DMEM冲洗三次，加入500 μL 4％的多聚甲醛于37℃温育15 min以固定细胞。然后用DMEM培养基冲洗三次，加入500 μL的10 ug/mL的DAPI于37℃温育10 min进行细胞核的染色，取出盖玻片并放在载玻片上，用指甲油封片。将载玻片放置在共聚焦荧光显微镜下并在不同的激发光下观察照相。蓝色荧光（DAPI）的激发波长为358nm，绿色荧光（GFP）的激发波长为488nm。
SEQUENCE LISTING
 
<110>  四川农业大学
 
<120>  猪PDLIM3蛋白三种不同亚型超表达载体的构建方法和应用
 
<130>  2013
 
<160>  3    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  1109
<212>  DNA
<213>  Sus scrofa
 
<400>  1
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<212>  DNA
<213>  Sus scrofa
 
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<211>  965
<212>  DNA
<213>  Sus scrofa
 
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