说明书金黄色葡萄球菌肠毒素B的B细胞免疫优势表位肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物制药领域，特别是涉及来自金黄色葡萄球菌肠毒素B的三 个B细胞免疫优势表位、鉴定此B细胞免疫优势表位的方法以及其在医药生物 技术领域的应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)，作为革兰氏阳性菌 的代表，是一类在自然界广泛存在的致病性球菌，也是引起医院感染和社区感 染的一种重要致病菌。调查研究表明，在美国，社区皮肤及软组织感染最常见 的病原菌为S.aureus(约占75％)；在日本，脓疱病中S.aureus引发的大疱性脓 包病占的92％；在非洲，热带脓性肌炎病原体中S.aureus占55％～72％；在中 国，感染性心内膜炎的头号致病菌为S.aureus(占31％～34％)。此外，S.aureus 感染以急性、化脓性为特征，局部可引起皮肤和软组织等的化脓性感染，经久 不愈；全身可导致骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、肺炎、脓毒血症等严重 感染及并发症，死亡率高达20％。同时，金葡菌的外毒素还可引起食物中毒、 烫伤样皮肤综合征和中毒性休克综合征等全身致死性感染。
金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，在含有血液和 葡萄糖的培养基中生长更佳，需氧或兼性厌氧。28℃～38℃均能生长，最适温度 为37℃，pH为4.8～9.4，最适为7.4。耐盐性强，在含10％～15％氯化钠培养基 中均能生长。在血脂平板上形成的菌落较大，菌落周围形成明显的全透明溶血 环(β-溶血)，溶血性菌株具有较强致病性。按照噬菌体分型，金黄色葡萄球菌 可分为5群26个型。噬菌体分型在流行病学调查时追踪传染源及研究菌型与疾 病种类间的关系上均有重要意义。肠毒素型食物中毒由Ⅲ和Ⅳ群金黄色葡萄球 菌引起，Ⅱ群菌对抗生素产生耐药性的速度比Ⅰ和Ⅳ群缓慢很多。造成医院感 染严重流行的是Ⅰ群中的52、52A、80和81型菌株。引起疱疹性和剥脱性皮炎 的菌株经常是Ⅱ群71型。
金黄色葡萄球菌耐热性肠毒素(Staphylococcal enterotoxin，SE)，是引起人 类食物中毒、全身炎症反应和脓毒症休克的主要原因，也是金黄色葡萄球菌疫 苗研究最重要的保护性抗原之一。SE因血清型差异SE分为SEA、SEB及SEC 等多种型，每株临床MRSA分离株可分泌1-2种肠毒素，其中SEB，SEC及TSST-1 最丰富。每株金黄色葡萄球菌能产生一型或两型以上的肠毒素。近年发现，造 成医院感染的耐甲氧西林金葡菌，80％以上产生肠毒素B(Staphylococcal enterotoxin B，SEB)。个别医院分离株几乎100％产SEB。
金葡菌SEB属于超抗原，不需要抗原呈递细胞的加工处理，以完整的蛋白 质分子直接与在MHCⅡ类分子的α1结构域和TCR的β链V区结合，从而刺激 T细胞活化增殖，释放大量细胞因子如IL-2、IFN-γ及TNF-α。由金葡菌SEB引 起的中毒性休克综合征的病死率可达50％，而与流感并发的金葡菌SEB感染其 死亡率可达90％以上，因此，气溶胶中的金葡菌SEB是一种潜在的生化武器。 当SEB进入机体后，其超抗原的结合引起单个核细胞活化，导致广泛的细胞因 子释放，而早期的TCR-αβT细胞释放的TNF-α对死亡的发生起了重要的作用。
经Blast比对证实，SEB在MRSA各菌株中序列保守，结构稳定。在小鼠 模型中的研究证实，SEB具有比其他抗原更好的体液应答优势，合成的人SEB 单克隆抗体可预防MRSA感染常见的毒性休克综合症。但SEB本身为毒素，用 于人体存在安全隐患，因此，失去毒性的突变体SEB是MRSA疫苗较好的保 护性抗原。目前，SEB突变体疫苗用于SEB中毒及抗MRSA感染已在动物模型 中获得成功。
蛋白抗原发挥其功能主要通过表位来体现特异性。用SEB表位中的优势表 位来制备疫苗，有利于去除不利成份，增强免疫效果。因此，SEB抗原中免疫 优势应答的保护性表位的鉴定，是提升和优化基于SEB抗原的S.aureus疫苗设 计的重要前提。筛选SEB的多个免疫优势表位，将各抗原的表位进行串联所得 到多表位多肽疫苗可以激发更有效的免疫应答。目前的已知的SEB的B细胞表 位有5个，所用的筛选方法主要是生物信息学预测和单克隆抗体筛选。用生物 信息学预测抗原的B细胞表位准确率不高，预测出的表位仅局限于特定长度的 肽段，无法预测免疫优势表位。研究也证实，实验所得的B细胞表位与生物信 息学软件预测的结果并不一致。用单克隆抗体筛选抗原的B细胞表位步骤繁琐， 试验周期长，所鉴定的抗原B细胞表位的不全，也无法鉴定免疫优势表位。因 此，建立一种准确有效的筛选及鉴定B细胞免疫优势表位的方法显得尤为重要。
发明内容
本发明提供一种金黄色葡萄球菌肠毒素B的B细胞免疫优势表位肽，其氨 基酸序列如SEQ ID NO：42所示。其对应的核心表位的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：69所示。
本发明提供一种鉴定所述的金黄色葡萄球菌肠毒素B的B细胞免疫优势表 位肽的方法，其主要包含步骤：
1)用金黄色葡萄球菌肠毒素B的突变体免疫小鼠获得抗血清；
2)步移合成覆盖金黄色葡萄球菌肠毒素B全长序列的重叠18肽；
3)用步骤1)所得的抗血清结合步骤2)所得的重叠18肽筛选金黄色葡萄 球菌肠毒素B的B细胞免疫优势表位肽；
4)用步骤3)所筛得的B细胞免疫优势表位肽与钥孔血蓝蛋白偶联，所得 偶联物用于动物免疫，获得免疫优势肽抗血清；所述免疫优势表位抗血清进行 金黄色葡萄球菌肠毒素B的中和能力检测，鉴定所述B细胞免疫优势表位肽为 目标B细胞免疫优势表位肽。
进一步地，上述鉴定方法包含步骤：
5)针对步骤3)所得的B细胞免疫优势表位肽序列，从N-端及C-端分别 依次截断2个氨基酸，合成各B细胞免疫优势表位肽所对应的截断肽；
6)用步骤4)获得的所述免疫优势肽抗血清结合步骤5)所述的截断肽， 来确定所述B细胞免疫优势表位肽的最小表位；
7)用步骤6)所筛得的B细胞免疫优势表位肽的最小表位与钥孔血蓝蛋白 蛋白偶联，所得偶联物用于动物免疫，获得免疫优势表位抗血清；
8)用步骤7)获得的所述免疫优势表位抗血清进行金黄色葡萄球菌肠毒素 B的中和能力检测；
9)用生物信息学方法确定步骤6)所确定的B细胞免疫优势表位肽的最小 表位在金黄色葡萄球菌各个菌株中的保守性，并明确其在金黄色葡萄球菌肠毒 素B蛋白三维结构中的位置。
所述的金黄色葡萄球菌肠毒素B的B细胞免疫优势表位肽具有高免疫原性， 可引发强烈的免疫反应；用所述免疫优势表位免疫动物所获的抗血清均具有特 异性中和SEB毒素的作用。所述免疫优势表位不含有不必要甚至有害的部分， 从而降低由其所制备的疫苗的使用风险，具有较大的疫苗应用价值，可用于制 备金黄色葡萄球菌肠毒素B表位疫苗和/或预防疫苗。
本发明通过用SEB突变体(rSEB)免疫BALB/c小鼠获得预防S.aureus(金 黄色葡萄球菌)感染的抗血清，结合覆盖SEB全长的42条重叠肽逐步筛选出了 SEB的B细胞三个免疫优势表位肽。用免疫优势表位肽—KLH(钥孔血蓝蛋白) 偶联物免疫动物，获得的了可强烈结合SEB毒素的表位肽特异性抗血清。接着 用分别覆盖三个免疫优势表位肽的多个截断重叠肽与该表位肽抗血清进行进一 步筛选，明确了该免疫优势表位肽的核心序列即优势表位。在体外，鉴定的三 个免疫优势表位均可中和天然SEB毒素的超抗原能力。本发明所提供的筛选和 鉴定方法准确率高，可以避免漏筛和误筛现象，可以区别抗原表位的免疫显性 和免疫亚显性，并且所筛选出的抗原表位均能在动物体内诱发高水平优势表位 抗血清，并且该抗血清具有中和SEB毒素超抗原能力的功能，由此使得制备高 效、低毒、高安全性的基于SEB的疫苗成为可能。
本发明用覆盖抗原蛋白全长的多组重叠肽结合ELISA法筛选金黄色葡萄球 菌肠毒素B的免疫优势B细胞表位肽,进一步用覆盖优势表位肽全长的截断重叠 肽结合ELISA法来明确该优势表位肽的核心序列，方法简便快速，表位无遗漏， 获得了金黄色葡萄球菌肠毒素B的B细胞的三个免疫优势表位。该免疫优势表 位均具有较强的免疫原性，用该优势表位免疫动物，免疫制剂无无关成分或有 害成分，可获得高水平的优势表位抗血清，并且，该抗血清可强烈中和SEB毒 素的超抗原能力。以该优势表位为活性成分的疫苗比SEB全蛋白突变体疫苗具 有更好的预防和中和诱发的SEB毒素的作用，由于优势表位SEB97-112及 SEB207-222在多种S.aureus菌株中序列保守，提示其对其他S.aureus感染也具有 良好的应用前景。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳 实施例，并配合附图，作详细说明如下。
附图说明
图1为金黄色葡萄球菌肠毒素B的免疫优势表位肽的筛选。
图2为金黄色葡萄球菌肠毒素B的免疫优势表位肽抗血清与天然SEB的结 合检测。
图3Ai至图3Cii为金黄色葡萄球菌肠毒素B的免疫优势表位的最小表位确 定；其中
图3Ai为SEB97-112的最小表位确定；
图3Bi为SEB207-222的最小表位确定；
图3Ci为SEB247-257的最小表位确定；
图3Aii，图3Bii及图3Cii分别是亚优势表位肽SEB31-48,SEB133-150及 SEB193-210的核心序列。
图4A至图4D为金黄色葡萄球菌肠毒素B的免疫优势最小表位抗血清对该 毒素的中和能力的检测；其中
图4A为免疫优势最小表位抗血清中和了金黄色葡萄球菌肠毒素B诱导的T 细胞增殖；
图4B为免疫优势最小表位抗血清阻断了金黄色葡萄球菌肠毒素B诱导的 IL-2的分泌；
图4C为免疫优势最小表位抗血清阻断了金黄色葡萄球菌肠毒素B诱导的 IFN-γ的分泌；
图4D为免疫优势最小表位抗血清阻断了金黄色葡萄球菌肠毒素B诱导的 TNF-α的分泌。
图5A至图5B为金黄色葡萄球菌肠毒素B的免疫优势表位保守性分析及其 在SEB全蛋白三维结构中的定位；其中
图5A为金黄色葡萄球菌肠毒素B的免疫优势表位保守性分析；
图5B为金黄色葡萄球菌肠毒素B的免疫优势表位保守性分析在SEB全蛋白 三维结构中的定位。
具体实施方式
下面结合具体实例，进一步阐述本发明，应理解的是，这些实例仅用于说 明本发明而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的 简单改进，及对本发明表位肽的利用都属本发明要求保护的范围。
本发明的思路如下：以本教研室已经制备的金黄色葡萄球菌肠毒素B突变 体为基础(突变体制备参考文献：Oral Vaccine Formulations Stimulate Mucosal and Systemic Antibody Responses against Staphylococcal Enterotoxin B in a Piglet Model.Clinical and Vaccine Immunology,2010(17)8：1163-1169)，以BALB/c小 鼠为动物模型，制备了在以BALB/c小鼠动物模型上研究MRSA的嵌合表位疫 苗。本发明用步移合成法，合成了覆盖SEB全长的42条重叠肽。其后，用免疫 优势表位肽-KLH(钥孔血蓝蛋白)偶联物免疫动物，获得优势表位肽特异性抗血 清。针对各个免疫优势表位肽序列，从N-端及C-端分别依次截断2个氨基酸， 合成覆盖各免疫优势表位肽全长的对应的截断肽。用优势表位肽特异性抗血清 结合其对应的截断肽，筛选优势表位肽的核心序列，并用抗血清滴定法进一步 验证该核心表位。用该核心表位-KLH(钥孔血蓝蛋白)偶联物免疫动物，获得优 势表位特异性抗血清。用优势表位特异性抗血清阻断SEB毒素的超抗原活性。 最后，用生物信息学方法确定优势表位在金黄色葡萄球菌各个菌株中的保守性， 并明确其在金黄色葡萄球菌肠毒素B蛋白三维结构中的位置，分析其在预防不 同金黄色葡萄球菌菌株感染所致的SEB中毒的通用性。
材料的准备：
1.金黄色葡萄球菌肠毒素B突变体为申请人制备。
2.实验动物：BALB/c小鼠：6-8周玲，SPF级，雌性，体重18-22g，购自 第三军医大学动物房。
3.合成多肽：由上海强耀公司合成，多肽干粉用二价亚砜(DMSO)溶解 成0.5mg/mL的浓度，-70℃保存。临用时依据使用浓度用磷酸盐缓冲液(PBS) 稀释。
4.弗式佐剂：弗式完全佐剂：石蜡油(1份)+羊毛脂(1份)+灭活卡介苗 1支，弗式不完全佐剂：石蜡油(1份)+羊毛脂(1份)
5.PBS缓冲液(PH7.2)Na2HPO414mmol，NaH2PO46mmol，NaCl 9g， 加蒸馏水到1L
6.ELISA试剂的配制
1)包被稀释液0.05mol/L PH9.6碳酸盐缓冲液：Na2CO31.6g，NaHCO3 2.9g，NaN30.2g，加蒸馏水至1000ml。
2)样本稀释液/抗体稀释液:Tween-20溶解于PBS中体积比为0.5‰3)封闭液: PBS中加入1％BSA(质量体积比)及Tween200.5‰(体积体积比)
3)洗涤液：Tween-20溶解于PBS中体积比为0.5‰
4)TMB底物液：中国天根公司
7.BSA(小牛血清白蛋白)：中国BIOSHARP公司。
8.SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)：中国碧云天公司。
9.预染Marker：中国MBI公司。
10.脱脂奶粉：中国博士德公司。
11.96孔可拆酶标板及96孔平底细胞培养板：美国Corning公司。
12.IPTG：中国鼎国公司。
13.二甲基亚砜(DMSO)：Sigma公司。
14.3H-胸腺嘧啶核苷：第三军医大学西南医院核医学科。
15.IL-2,IFN-γ及TNF-α.细胞因子检测试剂盒(Dakewe公司)
16.小鼠淋巴细胞分离液：中国天津灝洋公司。
17.R-1640细胞培养液及胎牛血清：Hyclone公司。
18.HRP-羊抗小鼠IgG：中国中杉金桥公司。
实施例1步移重叠含18个氨基酸短肽的合成
SEB是金黄色葡萄球菌肠毒素B，在各菌株之间序列是保守的，全长261 个氨基酸，其中，1-27氨基酸为信号肽。重组构建的重叠肽为1-261之间的18 肽，来源于MRSA252国际标准菌株。是在UniProt蛋白数据库中检索金黄色葡 萄球菌MRSA252来源的SEB蛋白序列(编号Q6GFN0)，从第1号氨基酸开始 合成步移重叠18个氨基酸短肽(由上海强耀公司协助合成)，共42条，纯度均 大于90％。合成肽信息见表1。将合成的肽段用DMSO溶解至0.5mg/mL的储存 浓度，分装后-70℃保存。
UniProt蛋白数据库检索网址：http://www.uniprot.org/uniprot/P57839
SEB的1-260位的氨基酸序列如下(共261个氨基酸)：
MKLFAFIFICVKSCSLLFMLNGNPKPEQLNKASEFTGLMDNMRYLYDDKHVS EINIKAQEKFLQHDLLFKINGSKIDGSKILKTEFNNNSLSDKYKNKNIDLFGTN YYYQCYFSADNMELNDGRLIEKTCMYGGVTEHDGNQIDKNNSTDNSHNILI KVFENERNSLSFDIPTNKKNITAQEIDYKVRNYLLKHKNLYEFNSSPYETGYIK FIEGNGHSFWYDMMPESGEKFYPTKYLLIYNDNKTVESKSINVEVHLTKK
表1：覆盖金黄色葡萄球菌肠毒素B全长序列的重叠18肽氨基酸序列信息(依 次对应序列表中的SEQ ID No：1-42)
实施例2抗原优势表位肽的筛选及鉴定
1.铝盐佐剂辅助下，抗原免疫的保护作用分析与抗血清收集
(1)重组突变体SEB制备及鉴定：
根据文献报道，突变SEB中三个氨基酸位点(L45R,Y89A,Y94A)，选择 pGEX6p-2载体，克隆表达重组SEB蛋白(rSEB)，rSEB蛋白用GST柱纯化(蛋 白纯度大于90％)后，经Western Blot鉴定。(突变位点参考文献：Oral Vaccine Formulations Stimulate Mucosal and Systemic Antibody Responses against Staphylococcal Enterotoxin B in a Piglet Model.Clinical and Vaccine Immunology, 2010(17)8：1163-1169)
(2)动物免疫：
铝盐佐剂组动物免疫采用肌注途径，弗氏佐剂组动物免疫采用皮下免疫途 径。分别在不同佐剂辅助下免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠，分组及免疫剂量如 下表所示。分别在0天，第14天，第28天免疫，在末次免疫后第7天，尾静 脉取血，分离血清后,无菌分装保存于-80℃备用。本实验分为以下三组，每组 10只小鼠,蛋白抗原用量为100μg/次/只：①rSEB+AlPO4；②PBS+AlPO4；③PBS
(3)抗血清收集：
BALB/c小鼠疫苗末次免疫后第7天，经摘眼球取血后处死，收集抗血清。 在全身感染模型中观察小鼠的生存状态，存活小鼠经摘眼球取血后处死，收集 存活小鼠的血清，无菌分装保存于-80℃备用。
2.筛选抗原中的免疫优势B细胞表位
(1)重叠肽的ELISA法筛选抗原的线性B细胞表位：
间接ELISA法。肽及重组突变体SEB蛋白包被浓度均为5μg/mL,4℃包被 过夜，SEB抗血清1:500稀释，每孔加入被稀释的SEB抗血清100μL，37℃温 箱孵育1.5h，PBS-T洗涤3次，甩干，每孔各加入含0.5％BSA的PBS-T以1:3000 稀释的HRP-羊抗小鼠IgG100μL，37℃，温箱孵育1h，PBS洗涤3次，甩干， 每孔加入TMB100μL,避光常温孵育15min，每孔加入TMB显色液100μL，避光 15min后加入终止液100μL，测定450nm处的OD值。
结果：筛选出抗原的三个免疫优势表位肽SEB97–114，SEB205-222及SEB247-261， 三个亚优势表位肽SEB31-48，SEB133-150及SEB193-210。
3.鉴定抗原的B细胞线性优势表位肽
(1)动物免疫及抗血清收集：
动物免疫采用皮下免疫途径。分别在不同佐剂辅助下免疫6-8周龄雌性 BALB/c小鼠，分别在0天，第14天，第28天免疫。在末次免疫后第7天， 尾静脉取血，分离血清，无菌分装保存于-80℃备用。本实验分为以下几组，每 组10只小鼠，蛋白抗原用量为100μg/次/只：
①SEB97–114+CFA/IFA；②SEB205-222+CFA/IFA；③SEB247-261+CFA/IFA④ PBS+CFA/IFA；
(2)抗原的B细胞线性优势表位肽免疫原性鉴定：
间接ELISA法。用SEB全蛋白包被，浓度为5μg/mL,4℃包被过夜。表位 肽特异性抗血清分别以1:000、1：2000、1：4000稀释，每孔加入被稀释的抗血 清100μL，37℃温箱孵育1.5h，PBS-T洗涤3次，甩干，每孔各加入含0.5％BSA 的PBS-T以1：3000稀释的HRP-羊抗小鼠IgG100μL，37℃，温箱孵育1h,PBS 洗涤3次，甩干，每孔加入TMB100μL，避光常温孵育15mi n，每孔加入TMB 显色液100μL，避光15min后加入终止液100μL，测定450nm处的OD值。具 体请参照图1。
结果：三个免疫优势表位肽特异性抗血清Anti-SEB97–114、Anti-SEB205-222及 Anti-SEB247-261能强烈结合SEB天然毒素，与正常小鼠血清结合能力相比，具有 显著统计学差异。
实施例3步移重叠免疫优势肽对应截断肽的合成
针对实施例2所筛选的免疫优势表位肽序列，从N-端及C-端分别依次截断 2个氨基酸，合成覆盖各免疫优势表位肽全长的对应的截断肽；重组构建的重叠 肽为三组截断肽，每组对应一个免疫优势表位肽，每组内相邻截断肽相差2个 氨基酸，合成纯度均大于90％(由上海强耀公司协助合成)。合成截断肽信息见 表3。将合成的肽段用DMSO溶解至0.5mg/mL的储存浓度，分装后-70℃保存。
免疫优势肽对应截断肽氨基酸序列信息如下表3，其肽编号分别对应序列表 中的SEQ ID：43-73
肽编号 肽段位置 序列(N→C) 原始纯度(％)
(NO：43)D-1 99-114aa NIDLFGTNYYYQCYFS 0.9464
(NO：44)D-2 101-114aa DLFGTNYYYQCYFS 0.9134
(NO：45)D-3 103-114aa FGTNYYYQCYFS 0.9232
(NO：46)D-4 105-114aa TNYYYQCYFS 0.911
(NO：47)D-5 107-114aa YYYQCYFS 0.9091
(NO：48)D-6 97-112aa NKNIDLFGTNYYYQCY 0.9377
(NO：49)D-7 97-110aa NKNIDLFGTNYYYQ 0.9804
(NO：50)D-8 97-108aa NKNIDLFGTNYY 0.9756
(NO：51)D-9 97-106aa NKNIDLFGTN 0.9715
(NO：52)D-10 97-104aa NKNIDLFG 0.9892
(NO：53)D-11 98-103aa KNKNIDLF 0.9552
(NO：54)D-12 207-222aa TGYIKFIEGNGHSFWY 0.9611
(NO：55)D-13 209-222aa YIKFIEGNGHSFWY 0.9806
(NO：56)D-14 211-222aa KFIEGNGHSFWY 0.9585
(NO：57)D-15 213-222aa IEGNGHSFWY 0.9743
(NO：58)D-16 215-222aa GNGHSFWY 0.9046
(NO：59)D-17 205-220aa YETGYIKFIEGNGHSF 0.9757
(NO：60)D-18 205-218aa YETGYIKFIEGNGH 0.9775
(NO：61)D-19 205-216aa YETGYIKFIEGN 0.9016
(NO：62)D-20 205-214aa YETGYIKFIE 0.9888
(NO：63)D-21 205-212aa YETGYIKF 0.9981
(NO：64)D-22 249-261aa SKSINVEVHLTKK 0.9869
(NO：65)D-23 251-261aa SINVEVHLTKK 0.9416
(NO：66)D-24 253-261aa NVEVHLTKK 0.9981
(NO：67)D-25 255-261aa EVHLTKK 0.9985
(NO：68)D-26 247-259aa VESKSINVEVHLT 0.9243
(NO：69)D-27 247-257aa VESKSINVEVH 0.9891
(NO：70)D-28 247-255aa VESKSINVE 0.9833
(NO：71)D-29 247-253aa VESKSIN 0.9887
(NO：72)D-30 252-261aa INVEVHLTKK 0.9924
(NO：73)D-31 110-119aa QCYFSADNME 0.9117
实施例4抗原优势表位核心序列的筛选及鉴定
1.抗原优势表位核心序列的筛选
间接ELISA法。截断肽及全长优势表位肽包被浓度均为5μg/mL,4℃包被过 夜，SEB抗血清1:500稀释，每孔加入被稀释的SEB抗血清100μL，37℃温箱 孵育2h，PBS-T洗涤3次，甩干，每孔各加入含0.5％BSA的PBS-T以1:3000 稀释的HRP-羊抗小鼠IgG100μL，37℃，温箱孵育1h，PBS洗涤3次，甩干， 每孔加入TMB100μL，避光常温孵育15mi n，每孔加入TMB显色液100μL，避 光15min后加入终止液100μL，测定450nm处的OD值，具体请参照图3。
结果：在SEB97–114组截断肽中，SEB97–112,SEB97–114,SEB97–110,SEB99–114, SEB101–114和SEB97–112相比其他截断肽与SEB97–114抗血清的结合能力更强 (请参照图3Ai)；在SEB205–222组截断肽中，SEB205–222,SEB207–222,SEB209–222, SEB211–222,SEB205–220,SEB205–218和SEB205–216相比其他截断肽与SEB205–222抗血清的结合能力更强(请参照图3Bi)；在SEB247–261组截断肽中，SEB247–261, SEB249–261,SEB252–261,SEB251–261,SEB247–259和SEB247–257相比其他截断肽与 SEB247–261抗血清的结合能力更强(请参照图3Ci)。
2.抗原优势表位核心序列的进一步确定
选取上步每组应答较强的截断肽进行包被，包被浓度均为5μg/mL，进行表 位肽抗血清血清滴定。根据上步的间接ELISA法，设定多个抗血清稀释度，从 1:200,1:400,1:800,1:1600,1:3200,1:6400,1:12800至1:256000，其他实验方 法不变，测定450nm处的OD值。
结果：鉴定出每组应答最强的截断肽：SEB97–112,SEB207-222及SEB247-257。
请参照图3Aii，图3Bii及图3Cii，分别是三个优势表位肽SEB97–114, SEB205-222及SEB247-261的核心序列。
实施例5优势表位抗血清的中和毒素能力分析
1.动物免疫及抗血清收集
动物免疫采用皮下免疫途径。分别在不同佐剂辅助下免疫6-8周龄雌性 BALB/c小鼠，分组及免疫剂量如下表所示。分别在0天，第14天，第28天 免疫。在末次免疫后第7天，尾静脉取血，分离血清,无菌分装保存于-80℃备 用。本实验分为以下几组，每组10只小鼠,蛋白抗原用量为100μg/次/只：
①SEB97–112+CFA/IFA；②SEB207-222+CFA/IFA；③SEB247-257+CFA/IFA；④ PBS+CFA/IFA；
2.优势表位抗血清的中和能力分析
(1)小鼠淋巴细胞分离：无菌取BALB/c小鼠脾脏研磨，红细胞裂解(1 只脾脏+7mL)，15min；重悬，补至15mL离心；500g，离心10min；15mL生 理盐水洗1次；15mL生理盐水重悬，分2管，用Ficoll-Paque法梯度离心分离 (小鼠淋巴细胞分离液说明书，天津灝洋公司)；取白膜层细胞，生理盐水补 至15mL；离心，2000rpm/min，15min；15mL生理盐水洗2次；10mL生理盐水 重悬细胞；取10μl至90μl生理盐水中，计算活的小细胞数目；用生理盐水稀释 小鼠淋巴细胞至终浓度107/mL，备用。
(2)优势表位抗血清中和SEB毒素实验：用0.22uM滤器过滤优势表位抗 血清，并检测抗血清IgG浓度，用完全1640调整抗血清IgG浓度，在96孔平 底细胞培养板上，选择IgG浓度为100μg/ml的抗血清50μl分别与浓度为50ng/mL 的SEB溶液50μl混合，在37度孵育1h；选择同等IgG浓度的正常小鼠血清作 对照，选择未处理孔作空白本底检测，每个条件重复六孔；每孔加100μl分离的 小鼠淋巴细胞(细胞浓度为106/100μl/孔)，细胞在37度细胞培养箱培养48h； 每个条件取三孔用1uCi3H-胸腺嘧啶核苷刺激，再培养12h(3H-胸腺嘧啶核苷掺 入法)；检测CPM值(由西南医院核医学科协助完成，刺激指数Stimulation Index(SI)＝每个实验处理孔平均CPM值/未处理孔平均CPM值)；每个条件下另 外三孔也继续培养12h，收集细胞培养上清，用IL-2，IFN-γ及TNF-α.细胞因子 检测试剂盒检测(按试剂盒操作说明进行)
结果：每组100μg/ml最小表位抗血清IgG(Anti-SEB97-112血清IgG、 Anti-SEB207-222血清IgG及Anti-SEB247-257血清IgG)能够完全中和50ng/ml的 SEB毒素诱导的T细胞增殖及脾细胞细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α的分泌(请 参照图4A至图4D，图4A为免疫优势最小表位抗血清中和了金黄色葡萄球菌肠 毒素B诱导的T细胞增殖；图4B为免疫优势最小表位抗血清阻断了金黄色葡 萄球菌肠毒素B诱导的IL-2的分泌；图4C为免疫优势最小表位抗血清阻断了 金黄色葡萄球菌肠毒素B诱导的IFN-γ的分泌；图4D为免疫优势最小表位抗血 清阻断了金黄色葡萄球菌肠毒素B诱导的TNF-α的分泌：关于图4A至图4D的 图标说明：Medium alone(培养基空白对照)；SEB alone(阳性对照)；SEB+ Anti-SEB97-114(抗血清Anti-SEB97-114IgG对SEB毒素能力的中和)；SEB+ Anti-SEB207-222(抗血清Anti-SEB207-222IgG对SEB毒素能力的中和)；SEB+ Anti-SEB247-257(抗血清Anti-SEB247-257IgG对SEB毒素能力的中和)；SEB+mixed antisera,(等量的抗血清Anti-SEB97-114IgG、Anti-SEB207-222IgG及Anti-SEB247-257IgG 混合抗血清IgG对SEB毒素能力的中和)；SEB+normal sera(正常小鼠血清IgG对 SEB毒素能力的中和)。
实施例6抗原免疫优势表位空间结构的生物信息学分析
1.优势表位序列保守性分析：在UniProt蛋白数据库中检索不同金黄色葡萄 球菌菌株来源的SEB蛋白序列(UniProt蛋白数据库检索网址： http://www.uniprot.org/uniprot/Q6GFN0)，在NCBI网站(网址： http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上输入所查的蛋白序列，进行BLAST序列 比对；选择位于97-112aa、207-222aa和247-257aa位置的序列进行分析。
结果：三个免疫优势表位SEB97–112及SEB207-222在不同金黄色葡萄球菌菌株 中序列保守(保守率大于85％)，而SEB247-257在不同金黄色葡萄球菌菌株中序 列不保守(请参照图5A)。
2.优势表位在SEB抗原三维结构中定位：SEB晶体结构pdb数据由Pubmed protein data base数据库下载，由Papageorgiou，A.C.等人在1998年解析 (Papageorgiou AC,Tranter HS,Acharya KR:Crystal structure of microbial superantigen staphylococcal enterotoxin B at 1.5A resolution:implications for superantigen recognition by MHC class II molecμles and T-cell receptors.J Mol Biol 1998,277(1):61-79.)；用PyMOL 1.1program软件分析并明确抗原优势表位在抗 原三维结构中的位置。
结果：三个免疫优势表位中SEB97–112位于抗原结构内部的Loop区，而 SEB207-222及SEB247-257位于抗原结构外部的β片层(请参照图5B)。
虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技 术领域的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与改 进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。