一种芳环单加氧扩环酶及其在制备氧杂环庚三烯23H酮类化合物中的应用.pdf

本发明涉及一种来自真菌的芳环单加氧扩环酶，其制备方法及用于酚类芳环的氧化以制备氧杂环庚三烯酮类化合物的应用。所述的芳环单加氧扩环酶是将真菌褐盖韧革菌(Boreostereum vibrans)的菌丝匀浆上清液经过凝胶过滤、离心浓缩等步骤制备而得；利用芳环单加氧扩环酶作为生物催化剂，在温和的条件下催化酚类芳环进行单加氧扩环氧化生成氧杂环庚三烯-2(3H)-酮类化合物，为这类稀有化合物的合成提供一种条件温和、对环境友好、只需一步催化反应的新途径。

权利要求书
1.  芳环单加氧扩环酶，其特征在于其由下述方法制备而得：将真菌褐盖韧革菌(Boreostereum vibrans)的菌丝匀浆上清液经过凝胶过滤、离心浓缩步骤制备而得。

2.  芳环单加氧扩环酶，其特征在于其由下述方法制备而得：由发酵培养得到的褐盖韧革菌菌丝在缓冲液中匀浆，匀浆液经离心后得到上清液，将上清液加入Sephadex G‐25凝胶柱进行凝胶过滤，收集第一个洗脱峰并浓缩。

3.  权利要求1或2所述的芳环单加氧扩环酶的制备方法，其特征在于由发酵培养得到的褐盖韧革菌菌丝在缓冲液中匀浆，匀浆液经离心后得到上清液，将上清液加入Sephadex G‐25凝胶柱进行凝胶过滤，收集第一个洗脱峰并浓缩。

4.  氧杂环庚三烯‐2(3H)‐酮类化合物的制备方法，其特征在于应用权利要求1或2所述的芳环单加氧扩环酶作为生物催化剂，在温和的条件下催化酚类芳环进行单加氧扩环氧化生成氧杂环庚三烯‐2(3H)‐酮类化合物。

5.  氧杂环庚三烯‐2(3H)‐酮类化合物的制备方法，其特征在于应用权利要求1或2所述的芳环单加氧扩环酶作为生物催化剂，以酚类芳环化合物为底物，助溶剂为DMSO，在28℃恒温水浴中，经过单加氧扩环氧化生成氧杂环庚三烯‐2(3H)‐酮类化合物，酶制备和酶催化的缓冲液pH值为7.5(Hepes,25mM)。

6.  权利要求1所述的芳环单加氧扩环酶在制备氧杂环庚三烯‐2(3H)‐酮类化合物中的应用，其特征在于应用权利要求1或2所述的芳环单加氧扩环酶作为生物催化剂，在温和的条件下催化酚类芳环进行单加氧扩环氧化生成氧杂环庚三烯‐2(3H)‐酮类化合物。

7.  权利要求1所述的芳环单加氧扩环酶在制备氧杂环庚三烯‐2(3H)‐酮类化合物中的应用，其特征在于应用权利要求1或2所述的芳环单加氧扩环酶作为生物催化剂，以酚类芳环化合物为底物，助溶剂为DMSO，在28℃恒温水浴中，经过单加氧扩环氧化生成氧杂环庚三烯‐2(3H)‐酮类化合物，酶制备和酶催化的缓冲液pH值为7.5(Hepes,25mM)。

说明书一种芳环单加氧扩环酶及其在制备氧杂环庚三烯-2(3H)-酮类化合物中的应用
技术领域：
本发明属于生物有机合成领域，具体涉及一种芳环单加氧扩环酶，其制备方法及其在制备氧杂环庚三烯-2(3H)-酮类化合物中的应用。
背景技术：
氧杂环庚三烯酮结构单元广泛存在于多种天然产物中，这些天然产物往往具有复杂的结构和广谱的生理活性，是新药开发的重要基础。在氧杂环庚三烯酮类化合物的各种结构类型中，氧杂环庚三烯-2(3H)酮结构单元则非常少见，仅出现在1,5-Secovibralactone(1)、RetipolideC,D(2,3)等少数几个天然产物及通过化学修饰获得的天然产物衍生物(4，5)中。由于氧杂环庚三烯-2(3H)酮结构中七元环较大的环张力以及烯醇式的存在，通过化学合成这类化合物仍然是一项很有挑战性的工作，目前有关这类化合物的合成方法报道极少，Enrique Aguilar等人报道了利用过渡金属金催化环丙基炔的环化异构化高产率构建氧杂环庚三烯-2(3H)酮的方法(Fernández-García et al.,Regioselective synthesis of oxepinones and azepinones by gold-catalyzed cycloisomerization of functionalyzed cyclopropyl alkynes.Chem.Commun.2013,11185–11187)，但是由于底物合成路线较长，制备复杂，催化剂昂贵，且操作要求严格等因素使得该方法的应用受到很大的限制。由于氧杂环庚三烯-2(3H)酮化合物来源稀少，对其深入研究和进一步开发利用的工作难以开展。目前制备主要以化学合成为主，而生物酶制备氧杂环庚三烯-2(3H)-酮在国内外均未见报道。
发明内容：
本发明的目的是提供一种芳环单加氧扩环酶，其制备方法及其在制备氧杂环庚三烯-2(3H)-酮类化合物中的应用。本发明用来自褐盖韧革菌的芳环单加氧扩环酶作催化剂，只需一步反应即可由酚类芳环化合物催化制备氧杂环庚三烯-2(3H)-酮类化合物。本发明的方法催化效率高，专一性强、反应条件温和、对环境友好，方法简捷，酶反应操作方便。其芳环单加氧扩环酶活性提高了70倍以上。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
芳环单加氧扩环酶，其由下述方法制备而得：将真菌褐盖韧革菌 (Boreostereum vibrans)的菌丝匀浆上清液经过凝胶过滤、离心浓缩步骤制备而得。
芳环单加氧扩环酶，其由下述方法制备而得：由发酵培养得到的褐盖韧革菌菌丝在缓冲液中匀浆，匀浆液经离心后得到上清液，将上清液加入Sephadex G-25凝胶柱进行凝胶过滤，收集第一个洗脱峰并浓缩。
所述的芳环单加氧扩环酶的制备方法，由发酵培养得到的褐盖韧革菌菌丝在缓冲液中匀浆，匀浆液经离心后得到上清液，将上清液加入Sephadex G-25凝胶柱进行凝胶过滤，收集第一个洗脱峰并浓缩。
氧杂环庚三烯-2(3H)-酮类化合物的制备方法，应用所述的芳环单加氧扩环酶作为生物催化剂，在温和的条件下催化酚类芳环化合物进行单加氧扩环氧化生成氧杂环庚三烯-2(3H)-酮类化合物。
氧杂环庚三烯-2(3H)-酮类化合物的制备方法，应用所述的芳环单加氧扩环酶作为生物催化剂，以酚类芳环化合物为底物，助溶剂为DMSO，在28℃恒温水浴中，经过单加氧扩环氧化生成氧杂环庚三烯-2(3H)-酮类化合物，酶制备和酶催化的缓冲液pH值为7.5(Hepes,25mM)。
所述的芳环单加氧扩环酶在制备氧杂环庚三烯-2(3H)-酮类化合物中的应用，应用所述的芳环单加氧扩环酶作为生物催化剂，在温和的条件下催化酚类芳环化合物进行单加氧扩环氧化生成氧杂环庚三烯-2(3H)-酮类化合物。
所述的芳环单加氧扩环酶在制备氧杂环庚三烯-2(3H)-酮类化合物中的应用，应用所述的芳环单加氧扩环酶作为生物催化剂，以酚类芳环化合物为底物，助溶剂为DMSO，在28℃恒温水浴中，经过单加氧扩环氧化生成氧杂环庚三烯-2(3H)-酮类化合物，酶制备和酶催化的缓冲液pH值为7.5(Hepes,25mM)。
由发酵培养得到的褐盖韧革菌菌丝在缓冲液中匀浆，匀浆液经离心后得到上清液，将上清液加入Sephadex G-25凝胶柱进行凝胶过滤，收集第一个洗脱峰并浓缩制成粗酶。以化合物6或8为底物，助溶剂为DMSO，在28℃恒温水浴中，利用该酶可制得氧杂环庚三烯-2(3H)-酮类化合物。经过优化的酶制备和酶催化的缓冲液pH值为7.5(Hepes,25mM)。
与现有技术相比，本发明具备如下的优益性：
1.与一般的化学催化相比，本发明的反应具有催化效率高，专一性强、反应 条件温和、对环境友好等优点。
2.与上清液粗酶相比，经过Sephadex G-25凝胶过滤处理得到的粗酶，其芳环单加氧扩环酶活性提高了70倍以上。
3.粗酶制备方法简捷，酶反应操作方便。
附图说明：
图1为氧杂环庚烯-2(3H)-酮类化合物的结构；
图2为芳环单加氧扩环酶催化制备氧杂环庚三烯-2(3H)-酮类化合物1和7；
图3为上清液粗酶对化合物6的转化(对照)；
图4为凝胶过滤处理后的粗酶对化合物6的转化；
图5为不同缓冲液对芳环单加氧扩环酶催化6形成7的影响。
具体实施方式：
下面结合附图，用以下具体实施例对本发明的实质性内容作进一步说明，但并不以此来限定本发明。
下述实施例中，无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中，所述百分含量如无特殊说明，均为质量百分含量。
实施例1：
芳环单加氧扩环酶的制备：
在10mL预冷的缓冲液(pH7.5Hepes,25mM)中加入10g褐盖韧革菌菌丝进行匀浆，匀浆液在4℃下9000rpm离心15分钟，取上清液，得到体积约10mL的粗酶，将其中5mL用于实施例2，剩余5mL上样Sephadex G-25凝胶柱，用25mM pH7.5Hepes缓冲液洗脱,紫外检测器280nm检测洗脱液，收集第一个洗脱峰并在4℃下6000rpm超滤离心浓缩到与起始上清液相同的体积5mL，用于实施例3。
实施例2：
上清液粗酶直接用作生物催化剂：
取上述实施例1中的上清液1mL，加入1mM化合物6(助剂为DMSO)和3mM NADPH，三个重复，在28℃恒温水浴中反应4h，每个反应加入0.3μg内标化合物4-羟基二苯甲酮，用乙酸乙酯萃取三次，浓缩至0.1mL，经液相质谱检测准分子离子峰[M+Na]+m/z 203，结果如图3所示，生成的氧杂环庚三烯-2(3H)-酮类化合物7极少，与内标的峰面积之比，三个重复的平均值为0.014。
实施例3：
凝胶过滤处理后得到的粗酶用作生物催化剂：
取上述实施例1中的经凝胶过滤处理后得到的粗酶1mL，加入1mM化合物6(助剂为DMSO)和3mM NADPH，三个重复，对照为煮沸失活的粗酶，在28℃恒温水浴中反应4h，每个反应加入0.3μg内标化合物4-羟基二苯甲酮，用乙酸乙酯萃取三次，浓缩至0.1mL，经液相质谱检测准分子离子峰[M+Na]+m/z 203，结果如图4所示，生成的氧杂环庚三烯-2(3H)-酮类化合物7极为显著，与内标的峰面积之比，三个重复的平均值为1.042，比实施例2中上清液粗酶的酶活性提高了70倍以上。
实施例4：
不同缓冲液对芳环单加氧扩环酶催化6形成7的影响：
采用浓度均为25mM但pH值各不相同的三种缓冲液，分别是pH7.5Hepes(羟乙基吡啶乙磺酸),pH6.4Mes(吗啡啉乙磺酸)和pH 5.3Mes。取上述三种缓冲液2mL分别与2g菌丝按照上述实施例1制备凝胶过滤的粗酶2mL，然后按照上述实施例3进行催化反应，经液相质谱检测准分子离子峰[M+Na]+m/z 203，结果如图5所示，在pH7.5Hepes缓冲液中生成的氧杂环庚三烯-2(3H)-酮类化合物7极为显著，与内标的峰面积之比达到1.15，在pH6.4Mes缓冲液中生成的7与内标的峰面积之比为0.22，在pH5.3Mes缓冲液中没有检测到产物7。因此，优选pH7.5Hepes(25mM)缓冲液用于酶制备和酶催化。
实施例5：
对化合物8的转化：
取上述实施例1中的经凝胶过滤处理后得到的粗酶1mL，加入1mM化合物8(助剂为DMSO)和3mM NADPH，对照为煮沸失活的粗酶，在28℃恒温水浴中反应4h，用乙酸乙酯萃取三次，浓缩至0.1mL，经液相质谱检测准分子离子峰[M+Na]+m/z 231，生成的氧杂环庚三烯-2(3H)-酮类化合物1极为显著。
上述实施例2、3、4和5的检测条件均为：仪器为美国Agilent Technologies公司1290/6530UPLC-Q-TOF液相色谱-质谱联用仪。质谱条件：电离方式为双源ESI；能量3500V；质量范围50-500。液相色谱条件：ZORBAX Eclips Plus C18 Rapid Resolution HD柱(50mm×2.1mm×1.8μm)；柱流量为0.3mL/min；进样量1.0μL；化合物7及标准品采用25％甲醇75％水进行层析洗脱；化合物1及标准品采用43％甲醇57％水进行层析洗脱；样品与标准品同时检测。