固氮斯氏假单胞菌及其菌膜的培养方法 本发明涉及一种耐盐碱、抗干热、极具开发应用价值的联合固氮斯氏假单胞菌株(Pseudomonas stutzeri)A1501，以及采用特定培养介质和培养条件诱发该菌株形成致密菌膜以保持高度抗逆性和高效固氮能力的培养方法。
水稻、小麦和玉米等大多数农作物产量的提高主要依赖于化学氮肥施用量的增加，而以提高产量为唯一目标而无节制的大量施用化肥所带来的恶果是土壤板结，肥力下降，环境特别是水质污染严重等。此外，我国这个全球人口最多的农业大国正在遭受着土壤荒漠化和盐碱化的严重威胁，危害面积约为330多万平方公里，占国土面积的34％。联合固氮菌兼具固氮和促进植物生长的双重功能，能通过固定空气中的氮素(类似一个微型生物氮肥厂)，分泌植物激素(刺激根系和植株的生长发育)，对常见病虫害的广谱抑制或拮抗作用达到节肥增产的目的。在我国，联合固氮菌株资源十分丰富，开发应用潜力巨大。但是，目前对联合固氮菌的生物学研究大多停留于基础理论，新菌株的筛选鉴定工作缺乏后劲，从而大大限制了联合固氮菌在改良土壤，节肥增产方面所应取得的社会和经济效益。
本发明的目地在于针对现有研究的缺陷，发明了一种新的微生物，该微生物具有诸多优良特性，如：对多种极端条件如高盐碱、干热等有极强的抗逆能力，能在氮贫瘠条件下固定空气中的氮素供其生长繁殖所需，并能分泌IAA，刺激植物生长等，采用特定培养介质和培养条件诱发该菌株形成致密菌膜以保持其高度抗逆性和高效固氮能力。培养方法简便易行，有实用价值。在可持续发展农业中应用前景广阔，对于减少化肥用量或提高作物产量，节省能源，减少环境污染和改良土壤等都具有长远的经济和社会意义。
以下叙述本发明的主要内容：
本发明涉及一种新微生物，该菌株已于1998年6月3日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCC No．0351。
图1为固氮斯氏假单胞菌A1501在LB培养基上的菌落形态
图2为固氮斯氏假单胞菌A1501在水稻根表的扫描电镜照片
图3为固氮斯氏假单胞菌A1501的16S rRNA基因的核苷酸序列
图4为固氮斯氏假单胞菌A1501低物利用类型的Biolog测定
图5为固氮斯氏假单胞菌A1501总DNA的southern杂交结果
本发明所涉及的微生物菌株为细菌，在分类上属于原核生物界(KingdomProcaryotae)。根据伯杰氏系统细菌学手册(Bergey’s Manual of SystemicBacteriology，1984年第一版)，属于假单胞菌属(Pseudomonas)，斯氏假单胞菌种(Pseudomonas stutzeri)，菌株号A1501。该菌株A1501分离自水稻根表，革兰氏阴性杆菌，在丰富培养基(LB)上菌落粘着，具有特征性的半透明皱折状(图1)。离心后菌体沉降物呈红褐色。在无氮限制性培养基上为杆状或短杆状，以周生或极生鞭毛运动。在厌氧条件下不生长，但在有硝酸盐的情况下可厌氧生长，具有强烈的反硝化作用。利用乙酸、苯甲酸、琥珀酸等几种酸生长，石蕊牛奶产碱。微好氧固氮，在无氮、含苹果酸固体培养基中生长和固氮良好，在整个培养过程中pH值逐步升高，最终可接近于9左右，其乙炔还原活性达700-900毫微克分子C2H4／毫升／小时，比活性为90-120毫微克分子C2H4／毫克菌体蛋白／分。用微量凯氏法测定培养前后的总氮量，每100ml培养物的总氮增加3-6mg，耗酸0．3-0．4g，固氮效率为10-24mg N／g苹果酸。该菌能在温度25-45℃、pH5．5-9．0、盐浓度0．1-5％范围内生长和固氮。采用15N同位素标记的氮气(N2)在封闭体系中测定A1501的固氮量为36微克15N／小时，田间15N同位素稀释法表明其固氮率(Ndfa％)为10％左右。A1501能紧密地定植于水稻根表(图2)，其联合固氮活性高达1861．2nmol乙烯／克干根．小时。
该菌株的16S rRNA基因的核苷酸全序列已测定(图3)，95底物利用类型的Biolog测定也已完成(图4)。采用nif和gln基因探针经southern总DNA杂交证明，在A1501中存在固氮基因nifHDK，nifA和一般氮代谢调节基因glnB，glnD的同源DNA序列(图5)。经中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所大鼠经口急性毒性测试，该菌株对大鼠无毒，无致病性。本发明所述菌株培养基成分和培养条件如下：
(1)限制性液体培养基(15磅、121℃灭菌15分钟，下同) KH2PO4 0．4g K2HPO4 0．1g NaCl 0．1g MgSO47H2O 0．2g MnSO4．H2O 0．01g Fe2(SO4)3·H2O 0．01g Na2MoO4·2H2O 0．01g 苹果酸 1．0g (NH4)2SO4 0．4g 蒸馏水 1000ml pH 6．8 置于200转／分恒温摇床，30℃培养24小时。(2)LB培养基蛋白胨 10g NaCl 5g-10g酵母膏 5g 蒸馏水 1000mlpH6．8 置于200转／分恒温摇床，30℃培养24小时。
(3)固体培养基
上述液体培养基中加1．2-1．5％琼脂，配制固体斜面或平板，pH6．8，30℃静置24小时。
(4)半固体限制性培养基
从限制性固体培养基斜面种子管中，用接种针挑少许菌体，接种到LB固体平板上，30℃培养48小时，挑单菌落接种到无铵半固体培养基中，培养基成分和培养条件如下： KH2PO4 0．4g K2HPO4 0．1g NaCl 0．1g MgSO4·7H2O 0．2g MnSO4·H2O 0．01g Fe2(SO4)3·H2O 0．01g Na2MoO4·2H2O 0．01g 乳酸 5．0g 谷氨酸钠 0．1g 蒸馏水 1000ml 琼脂 2．0g pH 6．8 30℃静置培养36小时，形成白色致密的菌膜。
97年度在浙江省嘉兴市农科所、江苏省农科院和辽宁省盐碱地研究所等单位的协作下，在浙江海宁、江苏南京、辽宁盘锦等地区布置了应用耐盐固氮菌剂的示范试验点6个，涉及作物包括水稻、小麦、玉米和蔬菜等，大棚蔬菜选用了黄瓜、西红柿和大白菜作为接种示范研究重点。将上述培养物接种水稻和玉米的田间试验结果表明，菌株A1501显示良好的增产节肥效果，增产幅度在7-15％之间。接种上述培养物后，盐碱土壤的含盐量均有不同程度地降低，与对照比较降低幅度在15％-30％之间；而土壤有机质也有所提高，与对照比较提高幅度在14％-20％之间，这显示了该菌在我国盐碱地改良上的应用潜力。上述培养物接种黄瓜、西红柿和大白菜等蔬菜的试验结果显示，该菌对供试蔬菜生长和产量均有明显的促进作用，以日光温室冬春茬黄瓜的接种效益为例：施菌组黄瓜平均每株结瓜22．4，回头瓜为9，未施菌组为14．2，回头瓜为6．2，接种增产效果十分显著。大棚西红柿喷施或根施菌剂的示范试验结果表明，接种比对照产量提高30％左右，品质如口感和外观质量大大提高，并能少施或不施化肥。平均每个大棚的经济收益增加30％-20％左右。因此，该菌在大棚蔬菜应用上具有潜在的推广市场，可望取得良好的经济效益。
本发明的特点是采用一种耐盐碱，抗干热，极具开发应用价值的联合固氮斯氏假单胞菌株A1501，该菌株是施氏假单胞菌种中首次发现的第一株固氮菌。菌株A1501具高度耐盐碱能力，在pH9-10间、在盐浓度6％固体LB培养基及盐浓度8％LB液体培养基中均能生长良好。菌株A1501能分泌胞外多糖，抗干热和强紫外照射，在模拟半干旱或干旱地区气候的人工气候箱中的试验结果表明，该菌株及其高活性菌膜具有固沙、保水和沃土的功能。上述生物学特性是其他联合固氮菌株无法比拟的。
实施例
从限制性固体培养基斜面种子管中，用接种针挑少许菌体，接种到LB固体平板上，30℃培养48小时，挑单菌落接种到无铵半固体培养基中，培养基成分和培养条件如下：
半固体限制性培养基KH2PO4 0．4g K2HPO4 0．1g NaCl 0．1gMgSO4·7H2O 0．2g MnSO4·H2O 0．01g Fe2(SO4)3·H2O 0．01gNa2MoO4·2H2O 0．01g 乳酸 5．0g 谷氨酸钠 0．1g蒸馏水 1000ml 琼脂 2．0gpH 6．830℃静置培养36小时，形成白色致密的菌膜。每毫升菌量达1012-1013，其乙炔还原活性高达250 nmC2H4／分／mg蛋白，编码固氮酶铁蛋白的固氮基因nifH表达活性高达1．2×105miler单位／分／mg蛋白。该法培养的高密度、高活性菌膜还具有高度耐盐碱、抗干热等生物学优良特性。