细菌、 细胞药敏检验方法及药敏检验装置 【技术领域】
本发明涉及一种细菌、 细胞药敏检验方法及药敏检验装置。背景技术 药敏检验是对细菌或细胞耐药性进行检测的重要试验。现有的药敏检验方法， 其 用的培养基一般分为液体培养基和固体培养基两种， 其检验方法一般有纸片检验法和浓度 检验法， 纸片检验法采用的是固体培养基， 浓度检验法采用的是液体培养基。 纸片检验法是 通过观察由于贴在固体培养基表面上药物纸片形成的药物抑菌圈来确定结核杆菌对药物 的敏感性 ； 浓度检验法是通过观察检测不同药物和不同药物浓度试验容器中细菌或细胞的 生长情况来确定细菌或细胞对药物的敏感性。不管是纸片检验法还是浓度检验法， 其整个 药敏检验过程一般可分为浓集细菌或细胞、 增殖或分离培养和药敏检验三个阶段。例如利 用现有的技术对结核杆菌进行药敏试验， 一般有纸片检验法和浓度检验法， 其整个检验过 程一般都可以分为浓集结核杆菌、 增殖或分离培养和药敏检验三个阶段。现有的纸片检验
法， 浓集结核杆菌阶段的步骤为 ： ①用吸管吸取患者提供的标本置于试验容器中 ； ②向试 验容器中加入消化液， 对标本粘液进行消化， 使标本中粘液和杂质中包裹的细菌充分暴露 ； ③离心分离， 倒掉上清液， 获得结核杆菌标本。 在获得结核杆菌标本后再进行增殖或分离培 养培养。增殖或分离培养培养阶段的步骤为 ： ④取已经浓集的结核杆菌标本少部分制成浓 菌液 ； ⑤将浓菌液接种于固体培养基例如罗氏培养基上进行增殖或分离培养培养， 一般需 在 37℃培养箱中培养 1 月左右， 把单个细菌培养成细菌菌落 ； 在获得细菌菌落后再进入药 敏检验阶段。 药敏检验阶段的步骤为 ： ⑥取少量的细菌菌落， 一般是取 1——3 个细菌菌落， 将其溶解分散成浓菌液 ； ⑦将浓菌液接种于固体培养基例如琼脂培养基表面上 ； ⑧在固体 培养基表面上贴上药物纸片 ； ⑨放入 37℃培养箱中培养 1 个月左右， 观察药物抑菌圈， 确定 结核杆菌对药物的敏感性。现有的纸片检验法的优点是操作方便、 设备简单， 投资小 ； 但其 存在以下缺点 ： (1) 整个检验所需的时间太长。增殖或分离培养培养阶段需要 1 个月左右， 药敏检验阶段大约需要 1 个月左右， 整个检验过程大约需要 2 个月左右。如果在药敏检验 得到结果后再使用药物治疗， 就会严重影响治疗时机。而临床上在没有药敏检验的情况下 使用药物治疗往往会造结核杆菌耐药的严重后果。(2) 不安全。整个检验需要两次人工接 种， 由于结核杆菌具有传染性， 这样对操作人员形成安全隐患， 对环境形成污染隐患。
现有的浓度检验法， 有两种方法， 一种浓度检验法是在增殖培养阶段采用固体培 养基， 其浓集结核杆菌和增殖或分离培养培养二个阶段的步骤与现有的纸片检验法相同， 但药敏检验阶段的步骤与现有的纸片检验法不同， 具体为 ： 从固体培养基上取增殖或分离 培养培养获得的细菌菌落， 一般是取 1 或数个细菌菌落， →→将其溶解分散成菌悬液→→ 将菌悬液倒入按不同的药物和不同的浓度配制成的多个试验容器中， 制成对比试验标本 →→观察检测试验容器中细菌生长情况， 确定结核杆菌对药物的敏感性。这种检验方法的 优点是设备简单， 投资小 ； 但其存在以下缺点 ： (1) 所需的时间长。增殖或分离培养培养阶 段的方法和步骤与现有的纸片检验法的方法和步骤相同， 因此， 仅增殖或分离培养培养阶段所需的时间就需要 1 个月左右 ； (2) 操作麻烦、 不安全且容易造成错误的检验结果。由于 需要配制多个试验容器， 配制过程很麻烦且不安全， 对操作人员形成安全隐患， 对环境形成 污染隐患 ； 在配制多个试验容器过程中比较容易被其他细菌污染， 这样就可能造成错误的 检验结果。另一种浓度检验法是在增殖或分离培养培养阶段采用液体培养基。这种检验方 法一般采用专用仪器检验， 例如 BD 公司推出的 BACTEC 9000MB 及 BACTEC MGIT 960 全自 动快速分枝杆菌培养鉴定药敏系统， 其优点是操作简单， 检验过程时间短， 平均检出时间为 14.4 天， 最快 10 天左右。但其存在的主要缺点是仪器设备的价位高， 投资大 ； 使用成本高， 一是仪器设备的使用成本高， 二是需要多个对比试验标本， 试剂的成本较高， 其费用较大， 一般医院难以承受， 难以推广普及。
对体外细胞进行药敏试验的方法较多， 常用的方法有 MTT 比色法、 放射线同位素 掺入法等， 但其都存在操作麻烦、 容易造成错误的检验结果等缺点。 原因是需要配制不同药 物和不同浓度的多个试验容器， 并且要向每个试验容器中加细胞悬液， 配制和加细胞悬液 的过程很麻烦， 在配制多个试验容器过程中比较容易被污染， 这样就可能造成错误的检验 结果。
从上面详细分析结核杆菌药敏检验中可以看出， 现有的细菌、 细胞药敏检验方法 尤其是结核杆菌检验方法存在以下缺点 ： (1) 整个检验过程所需的时间长。(2) 操作麻烦。 (3) 不安全。(4) 容易出现误检。(5) 投资大， 难以推广普及。 发明内容
本发明的目的是提供一种检验过程时间短的细菌、 细胞药敏检验方法及药敏检验 装置 ； 另一个目的是投资少、 使用成本低 ； 再一个目的是使用安全方便。
为实现上述目的， 本发明细菌、 细胞药敏检验方法， 包括 ：
(1) 从患者提供的标本中浓集待检细菌标本或细胞标本 ；
(2) 向待检细菌标本或细胞标本中加入培养液， 制作成液态检验标本， 所述的培养 液包括有营养物质、 胶体原料 ；
(3) 液态检验标本中加入可与胶体原料反应形成凝胶状的助凝剂， 制成凝胶检验 标本 ；
(4) 在凝胶检验标本的表面上贴药物纸片 ；
(5) 将其放入培养箱中培养 ；
(6) 观测药物抑菌圈， 确定对药物的敏感性。
上述细菌、 细胞药敏检验方法， 所述培养液包括有细菌细胞生长指示剂。
上述细菌、 细胞药敏检验方法， 将液态检验标本放入培养箱中增殖培养 2-4 天。
上述细菌、 细胞药敏检验方法， 所述培养液中包括有抑菌剂。
上述细菌、 细胞药敏检验方法， 所述培养液中的营养物质、 胶体原料之间的配比 为： 每 100ml 营养物质中加胶体原料 0.8g---2g ； 每 100ml 营养物质配助凝剂 0.1g---0.2g。
上述细菌、 细胞药敏检验方法， 所述培养液中的营养物质、 胶体原料、 细菌细胞生 长指示剂之间的配比为 ： 每 100ml 营养物质中加胶体原料 0.8g---2g ； 加细菌细胞生长指示 剂 2mg---20mg ； 每 100ml 营养物质配助凝剂 0.1g---0.2g。
上述细菌、 细胞药敏检验方法， 所述培养液中的营养物质、 胶体原料、 细菌细胞生长指示剂、 抑菌剂之间的配比为 ： 每 100ml 营养物质中加胶体原料 0.8g---2g ； 加细菌细胞 生长指示剂 2mg---20mg ； 加抑菌剂适量 ； 每 100ml 营养物质配助凝剂 0.1g---0.2g。
上述细菌、 细胞药敏检验方法， 其培养液按一次使用的数量分装并密封保存。
上述细菌、 细胞药敏检验方法的药敏检验装置， 包括有周壁和底部封闭、 上端敞开 结构形式的盒体， 在盒体内腔中放置有助凝剂。
上述药敏检验装置， 在盒体内腔的底部设有助凝层， 助凝层由缓释体和附着在缓 释体中的助凝剂组成。
述的药敏检验装置， 在盒体内腔的底部设有助凝层， 助凝层为由粘合剂与助凝剂 混合后涂在盒体底部的结构形式。
上述药敏检验装置， 在盒体的底部设有标尺。
上述药敏检验装置， 在盒体的敞开端设有与其配套的盒盖。
本发明细菌、 细胞药敏检验方法， 其培养液中的营养物质包括有营养组份和缓冲 剂， 作用是为细菌或细胞生长提供营养和控制培养液的 PH 值。对不同的细菌或细胞， 可以 选用不同的营养物质配方。例如， 结核杆菌可以选用 7H9 配方， 普通细菌或真菌可以选用 营养肉汤配方， 肿瘤细胞可以选用细胞培养基配方。培养液中的胶体原料的作用是在培 养液中加入助凝剂前， 胶体原料溶解在其中， 使培养液呈液态， 在培养液中加入助凝剂后， 胶体原料与助凝剂反应， 使培养液在一定时间内形成稳定的凝胶， 可以选用 0.5-1.5 ％海 藻酸钠或者 0.5-2.0 ％果胶、 0.5-1.5 ％卡拉胶等。培养液中的细菌细胞生长指示剂的作 用是细菌或细胞在生长繁殖过程中会分解 MTT 形成蓝色点状色团， 从而在短时间内每一 个细菌或细胞形成一个蓝色的肉眼可见的颗粒状点， 可以根据肉眼或低倍显微镜准确观 察点的性质和数量来确定细胞或细菌的生长状况， 可以选用 3-(4， 5- 二甲基噻唑 -2)-2， 5- 二苯 基四氮唑溴盐 ( 其商品名为噻唑蓝， 英文名 3-(4， 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2， 5-diphenyltetrazolium bromide)。在培养液中加抑菌剂主要用于结核分枝杆菌药敏试 验， 其作用是抑制抗酸杆菌以外的其它杂菌生长。
本发明细菌、 细胞药敏检验方法使用的助凝剂， 其作用是助凝剂与培养液中的胶 体原料反应， 使培养液在一定时间内形成稳定的凝胶。可以选用钙离子或镁离子， 硼砂， 枸 橼酸钾等。
由于本发明细菌、 细胞药敏检验方法， 其药敏检验装置包括有周壁和底部封闭、 上 端敞开结构形式的盒体， 在盒体中放置有助凝剂， 在培养液中加入有胶体原料， 液态检验标 本是利用培养液制成的， 因此， 在液态检验标本中有胶体原料， 液态检验标本在倒入药敏检 验装置内以前是呈液态的， 在倒入药敏检验装置后， 检验标本中的胶体原料与药敏检验装 置中的助凝剂反应， 可以在常温下快速形成稳定的凝胶状， 形成凝胶检验标本， 这样， 药物 纸片可以贴在凝胶检验标本的表面上， 因此， 可以用药物纸片检验细菌或细胞对药物的敏 感性。
本发明与现有的细菌、 细胞药敏检验方法相比， 整个检验过程时间短的原因是 ： ① 充分利用了患者提供的标本中的待检细菌或细胞。 患者提供的标本中的细菌或细胞绝大部 分被浓集用于制作检验标本， 而检验标本又全部被用于做药敏试验， 因此， 患者提供的标本 中的待检细菌或细胞得到了充分的利用。②可以省略掉增殖或分离培养培养阶段或减少 增殖或分离培养培养时间。对一般的细菌或细胞进行药敏检验， 同时做 6 个药物纸片试验就能满足要求， 因此， 药敏检验装置内腔的面积可以设计为同时做 6 个药物纸片的药敏试 验。 由于药敏检验是对细菌或细胞的耐药性进行检测， 在进行药敏检验以前， 对患者都进行 了确定诊断。 对已经确诊的一般患者而言， 由于本发明细菌、 细胞药敏检验方法充分利用了 其提供的标本中的细菌或细胞， 这样在进行药敏试验时， 药敏检验装置内腔中单位面积的 细菌或细胞数量较大， 足以满足药敏试验对细菌或细胞的数量要求， 不再需要通过增殖培 养增加细菌或细胞数量。对在确定诊断时确认患者提供的标本含待检细菌量较少， 则应该 将制作成的液态检验标本置于培养箱中进行增殖培养， 之后再将液态检验标本倒入药敏检 验装置中进行药敏试验。 由于本发明的增殖培养是在液态培养基中进行， 相对而言， 细菌在 液态培养基中的增殖速度比在固体培养基上的增殖速度快， 再加上充分利用了患者提供的 标本中的待检细， 使增殖培养前的初始数量较大， 因此， 增殖培养的时间很短。例如对结核 杆菌， 按照中国疾病预防中心编写的， 由中国协和医科大学出版社 2004 年 7 月 1 日出版的 《中国结核病防治规划痰涂片镜检质量保证手册》 中规定的， 采用萋 - 尼氏染色法， 如果镜 检结果为抗酸杆菌阳性 (4+) ： ≥ 10 条 / 每视野， 可以不进行增殖培养而直接进入到药敏检 验阶段， 这样， 本发明就省略掉了增殖培养阶段， 因此， 节省了整个试验时间 ； 如果镜检结果 为抗酸杆菌阳性 (3+) ： 1-9 条 / 每视野及以下， 则应该进行增殖培养， 由于在液态培养基中 增殖速度快， 加上初绐菌量大， 相对现有的增殖培养所需的时间而言， 所需的时间短， 因而 节约了整个试验的时间 ； ③药敏检验阶段时间短。 由于起始数量大， 比较容易形成药物抑菌 圈， 与现有的纸片检验法相比所需的时间短， 因而节约了整个试验的时间。 再加上细菌细胞 生长指示剂的显示作用， 能更好地显示细菌或细胞的繁殖生长情况和药物抑菌圈， 更便于 观察检测， 可以进一步减少试验时间。经发明人反复试验证明， 利用本发明细菌、 细胞药敏 检验方法进行结核杆菌药敏试验， 可以省略增殖培养阶段， 即使需要增殖培养， 也只需 2-4 天， 药敏检验阶段只需 5-7 天， 增整个检验过程不到 14 天。综上所述， 本发明实现了检验过 程时间短的目的。
本发明细菌、 细胞药敏检验方法投资少、 使用成本低的原因是 ： 实施本发明所需的 设备与现有的纸片检验法基本相同， 只需配套离心装置、 药敏检验装置等。上述的离心装 置、 药敏检验装置等制造简单， 生产成本低， 因此， 整套设备的投资少 ； 实施本发明需要配套 使用一次性试验容器以及包括营养物质、 缓冲剂、 胶体原料、 指示剂等试剂， 这些一次性试 验容器和试剂的成本低且使用的数量少， 加上本发明仪器设备的投资少使用成本低， 进一 步减少了本发明的使用成本。因此， 本发明能有效地实现投资少、 使用成本低的目的。
本发明细菌、 细胞药敏检验方法使用安全方便的原因是 ： 本发明浓集待检标本、 结 果伴读均可以在一次性密闭容器内进行， 不会污染其他器材， 操作完成后进行统一消毒处 理， 并且整个检验过程手工操作的程序很少且简单， 因此， 能最大程度的减少了细菌对工作 人员和环境的影响， 大大提高了试验的生物安全性。本发明由于将一次使用的培养液灌装 在密封瓶中， 使用时， 只需打开密封瓶， 将培养液与浓集的细菌或细胞混均， 之后将其倒入 药敏检验装置中即可， 操作简单方便， 因此， 本发明能有效地实现使用安全方便的目的。 附图说明
下面结合附图和实施例对本发明细菌、 细胞药敏检验方法及药敏检验装置作进一 步说明。图 1 所示为本发明中的药敏检验装置的主视图剖视示意图。 图 2 为图 1 所示的仰视图示意图。 1、 盒体， 2、 助凝层， 3、 盒盖， 4、 标尺。具体实施方式
如图所示， 盒体 (1) 为周壁和底部封闭、 上端敞开的结构形式， 在盒体 (1) 内设有 助凝层 (2)， 助凝层 (2) 由缓释体和附着在缓释体中的助凝剂组成， 在盒体 (1) 的底部设有 标尺 (4)， 在盒体 (1) 的敞开端配套有盒盖 (3)。
本发明的药敏检验装置， 其助凝层 (2) 中的缓释体可以是缓释膜， 当将培养液倒 入盒体 (1) 中后， 该缓释膜可以溶解于培养液中， 助凝剂附着在缓释体中 ； 也可以采用糖与 助凝剂混合， 利用喷涂的方法在盒体 (1) 中形成助凝层。
下面给出本发明细菌、 细胞药敏检验方法及药敏检验装置用于结核杆菌药敏试验 的实施例 ：
对采用萋 - 尼氏染色法进行确定诊断， 镜检结果为抗酸杆菌阳性 (4+) ： ≥ 10 条 / 每视野的进行药敏试验 ： 1、 将患者晨痰标本留取 5ml 用 4％氢氧化钠消化 ；
2、 置于离心机中， 4500 转 10 分钟离心分离， 将标本中结核杆菌充分沉淀 ；
3、 去掉上清液 ；
4、 用 20ml 培养液将沉淀物洗脱制成液体菌悬液形式的液态检验标本 ；
5、 将液态检验标本均匀倒在药敏检验装置的盒体中， 培养液中的胶体原料与盒体 中的助凝剂反应， 在 3 小时内凝固成稳定的凝胶， 形成凝胶检验标本 ；
6、 在凝胶检验标本表面设定的位置贴上欲测药物纸片 ；
7、 盖上盒盖， 将其置于 37℃培养箱中培养 5-7 天， 结核杆菌在生长繁殖过程中会 分解 MTT 形成蓝色点状色团， 如果药物对结核杆菌有抑制作用则贴有药物纸片的凝胶检验 标本周围不能形成蓝色团， 因而形成抑菌圈 ；
8、 根据抑菌圈大小判断药物对细菌的作用效果。
本实施例中的 20ml 培养液采用的配方为 ： 营养物质为 7H9 配方 20ml、 细菌细 胞生长指示剂为 3-(4， 5- 二甲基噻唑 -2)-2， 5- 二苯基四氮唑溴盐 0.4mg、 胶体原料为 0.5-1.5％海藻酸钠 0.17g、 抑制剂为 0.4mg 孔雀绿 ； 本实施例中的助凝剂为钙离子 0.02g。
本实施例中的 20ml 培养液采用的配方还可以是 ： 营养物质为 7H9 配方 20ml、 细 菌细胞生长指示剂为 3-(4， 5- 二甲基噻唑 -2)-2， 5- 二苯基四氮唑溴盐 0.5mg、 胶体原料 为 0.5-1.5％海藻酸钠 0.3g、 抑制剂为 0.4mg 孔雀绿 0.8ml ； 本实施例中的助凝剂为钙离子 0.03g。
本实施例中的 30ml 培养液采用的配方还可以是 ： 营养物质为 7H9 配方 20ml、 细菌 细胞生长指示剂为 3-(4， 5- 二甲基噻唑 -2)-2， 5- 二苯基四氮唑溴盐 4mg、 胶体原料 0.4g、 抑制剂为 0.4mg 孔雀绿。本实施例中的助凝剂为钙离子 0.04g。
对采用萋 - 尼氏染色法进行确定诊断， 镜检结果为抗酸杆菌阳性 (3+) ： 1--9 条 / 每视野及以下的进行药敏试验 ：
1、 将患者晨痰标本留取 5ml 用 4％氢氧化钠消化 ；
2、 置于离心机中， 4500 转 10 分钟离心分离， 将标本中结核杆菌充分沉淀 ；
3、 去掉上清液 ；
4、 用 20ml 培养液将沉淀物洗脱制成液体菌悬液形式的液态检验标本 ；
5、 将液态检验标本置于 37℃培养箱中增菌培养 2-4 天， 观察到液态检验标本呈现 淡蓝色改变 ；
6、 将增菌后的液态检验标本均匀倒在药敏检验装置的盒体中， 培养液中的胶体原 料与盒体中的助凝剂反应， 在 3 小时内凝固成稳定的凝胶， 形成凝胶检验标本 ；
7、 在凝胶检验标本表面设定的位置贴上欲测药物纸片 ；
8、 盖上盒盖， 将其置于 37℃培养箱中培养 5-7 天， 结核杆菌在生长繁殖过程中会 分解 MTT 形成蓝色点状色团， 如果药物对结核分枝杆菌有抑制作用， 则结核分枝杆菌不能 正常繁殖， 在贴有药物纸片的凝胶检验标本周围不能形成蓝色团， 因而形成抑菌圈 ；
9、 根据抑菌圈大小判断药物对细菌的作用效果。
本实施例中的 20ml 培养液采用的配方还可以是 ： 营养物质为 7H9 配方 20ml、 细 菌细胞生长指示剂为 3-(4， 5- 二甲基噻唑 -2)-2， 5- 二苯基四氮唑溴盐 0.5mg、 胶体原料为 0.5-1.5％海藻酸钠 0.3g、 抑制剂为 0.4mg 孔雀绿。本实施例中的助凝剂为钙离子 0.03g。
下面给出本发明细菌、 细胞药敏检验方法及药敏检验装置用于普通细菌或真菌药 敏试验的实施例 ：
1、 将分离培养后的目标菌落用 20ml 培养液制成液体菌悬液形式的液态检验标 本；
2、 将液态检验标本均匀倒在药敏检验装置的盒体中， 培养液中的胶体原料与盒体 中的助凝剂反应， 在 3 小时内凝固成稳定的凝胶， 形成凝胶检验标本 ；
3、 在凝胶检验标本表面设定的位置贴上欲测药物纸片 ；
4、 盖上盒盖， 将其置于 37℃培养箱中培养 12-24h， 普通细菌或真菌在生长繁殖过 程中会分解 MTT 形成蓝色点状色团， 如果药物对细菌有抑制作用， 则细菌不能正常繁殖， 在 贴有药物纸片的凝胶检验标本周围不能形成色团， 因而形成抑菌圈 ；
5、 根据抑菌圈大小判断药物对细菌作用效果。
本实施例中的 20ml 培养液采用的配方为 ： 营养物质为营养肉汤配方 20ml、 细 菌细胞生长指示剂为 3-(4， 5- 二甲基噻唑 -2)-2， 5- 二苯基四氮唑溴盐 4mg、 胶体原料为 0.5-1.5％海藻酸钠 0.4g ； 本实施例中的助凝剂为钙离子 0.04g。
下面给出本细菌、 细胞药敏检验方法及药敏检验装置用于肿瘤细胞药敏试验的实 施例 ：
1、 将已经确诊的肿瘤患者手术切除物细胞进行分离和培养， 待一定数量后置专用 容器中进行保存备用。
2、 取 1ml 含肿瘤细胞的上述溶液加入 20ml 含有本发明的培养液中， 混匀， 制成细 胞悬液形式的液态检验标本 ；
3、 将液态检验标本均匀倒在药敏检验装置的盒体中， 培养液中的胶体原料与盒体 中放置的助凝剂结合， 在 3 小时内凝固成稳定的凝胶， 形成凝胶检验标本 ；
4、 在凝胶检验标本表面设定的位置贴上欲测药物纸片 ；
5、 盖上盒盖， 将其置于 37℃培养箱中培养 2-7 天， 肿瘤细胞在生长繁殖过程中会分解 MTT 形成蓝色点状色团， 如果药物对肿瘤细胞有抑制作用， 则细胞不能正常繁殖， 在贴 有药物纸片的凝胶检验标本周围不能形成色团， 因而形成抑菌圈 ；
6、 根据抑菌圈大小判断药物对肿瘤细胞作用效果。
本实施例中的 20ml 培养液采用的配方为 ： 营养物质为细胞培养基配方 20ml、 细 菌细胞生长指示剂为 3-(4， 5- 二甲基噻唑 -2)-2， 5- 二苯基四氮唑溴盐 5mg、 胶体原料为 0.5-1.5％海藻酸钠 0.4mg。本实施例中的助凝剂为钙离子 0.04mg。