高剂量重组人α-干扰素口含片及其制造方法 【技术领域】
本发明涉及一种医药生物技术领域，特别是一种高剂量重组人α-干扰素口含片及其制造方法。
背景技术
干扰素是一组天然存在的蛋白质，共分为三类：α-干扰素、β-干扰素和γ-干扰素。α-干扰素又有十几个亚型，其中临床上常用的有干扰素α1a、α2a、α1b和α2b等数个亚型。干扰素是最早发现的细胞因子，它们在同种细胞上具有抗病毒、抗增殖和免疫调节等多种功能，自1956年发现干扰素以来，人们一直渴望这种化合物能控制多种疾病。经历二十几年的技术开发，八十年代初终于研制成了重组人干扰素商品。如今，有40多个国家使用干扰素制剂，治疗大约30多种疾病，如各种病毒性感染，肿瘤及免疫功能紊乱引起的疾病。
重组人α-干扰素是开发较早和应用最广的干扰素，通常都采用注射应用，其剂量都在数百万单位/支。由于重组人α-干扰素都是采用基因重组技术生产，进口的设备、高技术的人才和应用高新技术使得干扰素生产成本较高，追求高利润使得注射用干扰素价格居高不下，高剂量、高价格和长治疗周期使得注射用干扰素变成了富人的药品、毒副作用大、患者耐受性差等因素更限制了干扰素的应用。因此，人们需要一种疗效高、服用方便、价格适宜、毒副作用小和患者耐受性好的新剂型。
因为口腔和舌下含有较丰富的淋巴组织，舌下含服小剂量干扰素可被口粘膜吸收，激活淋巴系统，产生生物效应达到治病目的，基于这一考虑，有澳大利亚的Namalwa细胞干扰素口含片(Immulin，肝灵素)面市，每片含干扰素活性为200IU，在我国已临床应用数年，对疾病的疗效不甚理想(姚光弼、计焱焱：口含干扰素-a治疗慢性乙型肝炎双盲随机对照临床试验，中国新药与临床杂志，18：351-353，1999)。我国成都生物制品研究所申请了人白细胞干扰素口含片专利(CN1140088A)，每片含干扰素活性100～10000IU，但未见有产品面市，其临床效果究竟如何未见报道。上海华辰研制了一种重组α-干扰素含片(申请号98105384.X)，每片含干扰素100-500IU，也属低剂量范畴。
α-干扰素口粘膜服用能直接作用于口粘膜细胞的表面受体，诱导口粘膜淋巴细胞类似的Th1反应，包括上调INF-γ的表达和下调IL-4，而且α-干扰素是放大CD8+应答和阻止病毒感染的主要细胞因子(Tompkins WA.，J.Interferon Cytokine Res，19：817-828，1999)。口粘膜服用重组鼠α-干扰素在B16肉瘤荷瘤鼠上表现了显著抗癌作用(Fleischmann WR etal，J.Interferon Cytokine Res；18：17-29，1998)；小鼠口粘膜服用鼠α/β-干扰素对致死性病毒(EMCV、VSV和VZV)感染表现显著的抗病毒作用，并观察到其抗病毒效应与干扰素地剂量成依赖关系，同时对接种肿瘤(红白血病或L1210白血病、EL4癌和B16肉瘤)小鼠也表现有非常显著的抗癌作用(Tovey MG et al，J.Interferon Cytokine Res；19：145-55，911-921，1999..)。还有报告小鼠口粘膜服用重组鼠INF-α能有效地防护致死剂量的EMCV病毒感染，小鼠腹腔注射44LD50的EMCV，1小时口粘膜服用20,000IU的rMuIFN-a，一天一次，连用四天，到21天有40％动物存活，其平均存活天数为12.0±2.46天，与对照组(6.11±0.38天)相比有显著差异(P小于0.05)(Schellekews H et al：J.Interferon CytokineRes，21：575-581，2001)；其机理与非肠道服用α-干扰素是不相同的。但口粘膜服用α-干扰素在慢性病毒感染中是非常有效的，是对非肠道服用α-干扰素临床有效而耐受性差的患者的新选择。我们的研究也证实口粘膜服用重组人α-干扰素其抗病毒效应与α-干扰素的剂量成依赖关系，大剂量干扰素优于低剂量的治疗作用。
鉴于低剂量干扰素口含服用对乙型肝炎等病毒性感染的治疗效果不够理想，对HIV感染和肿瘤完全无效和近几年大剂量鼠α-干扰素口粘膜服用(o.m)在小鼠上显示了非常显著的抗病毒活性和抗肿瘤作用；虽然大剂量α-干扰素口粘膜服用不能进入血液循环，其抗病毒和抗肿瘤作用机理还不太清楚(Eid P.，et al：J.Interferon Cytokine Res，19：157-169，1999)，但其抗病毒活性和抗肿瘤作用是明确的。
因此，本发明的目的之一在于提供一种高剂量重组人α-干扰素口含片，填补无高剂量重组人α-干扰素口含片这一空白，具体的说，在保持高剂量重组人α-干扰素独特疗效的同时，克服重组人α-干扰素注射应用毒副作用大、患者耐受性差和价格高等缺点，为患者提供一种服用方便、疗效显著、耐受性好和价格适宜的新剂型。
本发明的另一目的在于提供以上所述高剂量重组人α-干扰素口含片的制备方法，使高剂量重组人α-干扰素在制备过程中活性损失小，片剂稳定性好，并且使片剂在口粘膜服用时溶散后形成较粘的液体，有利于延长主药与粘膜的接触时间，增大重组人α-干扰素的吸收和对口腔粘膜上皮及淋巴细胞的作用。
为了实现上述的目的，本发明提供了一种高剂量重组人α-干扰素口含片，它包含重组人α-干扰素和药学上认可的辅料，重组人α-干扰素的含量为每片100万IU至1000万IU。
上述含片中重组人α-干扰素的含量尤以每片100万IU至600万IU更好。
上述含片中每片还可包含有含量为20～500万IU的白细胞介素-2和中药提取的多糖20～100毫克，从而可以提高抗病毒作用。用于本发明的白细胞介素-2是一种由T淋巴细胞分泌的在机体免疫应答中起关键作用的细胞因子，其主要生理功能是促进T淋巴细胞的增殖，临床上主要用于多种肿瘤的治疗。中药提取的多糖能增强机体免疫功能，对病毒性感染、肿瘤有治疗作用。与重组人α-干扰素三者共用有较好的协同作用。白细胞介素-2可以是任何天然或重组人白细胞介素-2或重组人白细胞介素-2的融合蛋白，其白细胞介素-2的含量每片为20万IU至500万IU，尤以40万IU至200万IU更好。中药提取的多糖可以是黄芪多糖、猪苓多糖、灵芝多糖、木耳多糖、虫草多糖、板蓝根多糖等。每片多糖含量为20～100毫克，尤以30～80毫克为佳。
上述含片中的辅料可选用人血白蛋白、聚乙二醇、甘露醇、羧甲基纤维素钠、蔗糖、硬脂酸镁、糊精或可溶性淀粉和泊洛沙姆。作为本发明药学上认可的辅料，人血清白蛋白、聚乙二醇、糊精、冷水可溶性淀粉、羧甲基纤维素钠、蔗糖、泊洛沙姆和硬脂酸镁等对干扰素活性均无负面影响，人血清白蛋白是干扰素活性的保护剂；聚乙二醇、糊精为干扰素的吸附剂，也是口含片主要的赋形剂和稳定剂，糊精也可用冷水可溶性淀粉替代；蔗糖为矫味剂，可以改善口感；羧甲基纤维素钠、泊洛沙姆有粘合和增稠作用，可促进干扰素的吸收和延长干扰素对口粘膜上皮及淋巴细胞的作用时间；硬脂酸镁可改进打片性能。
上述各辅料在每片含片中的重量百分含量为：人血白蛋白0.1～1.0、聚乙二醇5～20、羧甲基纤维纳5～15、蔗糖10～60、硬脂酸镁0.2～2.0、糊精或可溶性淀粉15～60和泊洛沙姆0.2～2.0。
上述含片中重组人α-干扰素可以是α-干扰素的一种亚型或两个以上亚型的组合，即本发明的有效成分的重组人α-干扰素是指任何天然的或重组人α-干扰素，可以是重组人α-干扰素的任何一种亚型，如人α1a-干扰素、人α2a-干扰素、人α1b-干扰素、人α2b-干扰素、人αAD-干扰素、也可以是重组人α-干扰素的融合蛋白或商业上可提供的干扰素商品；
上述含片中的白细胞介素-2可以是天然的或重组的或白细胞介素-2融合蛋白。
本发明提供的一种高剂量重组人α-干扰素口含片的制作方法，包括粉碎辅料、制软料、制空白粒、干燥和打片等工序，其特征是：空白粒在氮气的保护下，均匀地喷入含有处方量的重组人α-干扰素的人血清白蛋白溶液，然后于干燥洁净的环境中晾干，使颗粒中水份含量小于3％。
本发明提供的第二种高剂量重组人α-干扰素口含片的制作方法，包括粉碎辅料、制软料、制空白粒、干燥和打片等工序，其特征是：将重组人α-干扰素和人血清白蛋白溶液冷冻干燥，制成粉剂，最后将空白粒加入处方量的干扰素粉剂和硬脂酸镁混匀，打片。
本发明提供的第三种高剂量重组人α-干扰素口含片的制作方法，包括将各处方量辅料粉碎、制粒、打片等工序，其特征是：将辅料粉粹后过80～100目，然后和重组人α-干扰素原液及乙醇水溶液拌合，在氮气保护下于自动制粒机中制粒，加入处方量的硬脂酸镁混匀，打片。
由于用于本发明的主药重组人α-干扰素、人白细胞介素-2等属于生物制品，是一种高纯度高比活性的蛋白质，在片剂中所占的重量百分比小于万分之一，如何使其均匀分散在片剂中和保护其活性成为设计制备口含片方法的关键，本发明提供的制备重组人α-干扰素口含片的三个方法及其采取的新工艺有效地保护了干扰素的活性和片剂中干扰素活性的均匀性。尤其采用氮气保护下制粒可有效地防止空气对生物制品的氧化，是保护活性蛋白质的有效方法。其次将干扰素与人血清白蛋白一起混合使用，也有利于干扰素活性的稳定。
本发明的积极效果：本发明以高剂量重组人α-干扰素为主要成分的口含片，在口腔内溶散后直接作用于粘膜上皮细胞和淋巴细胞，并通过它激活局部免疫系统，进一步放大此免疫激活效应，产生全身的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节的作用；此外，由于重组人α-干扰素和人白细胞介素-2各有独特的作用，合用时具有显著的协同作用，大大地增强了疗效。所以本发明的含有白细胞介素-2的重组人α-干扰素复合细胞因子口含片具有疗效更显著、毒性低、病人耐受性好、口服方便和价格适宜等优点。
由于本发明选用的辅料人血清白蛋白、聚乙二醇、糊精等都具有稳定干扰素蛋白活性的作用，再加上口含片制备中的独特工艺，使得本发明的重组人α-干扰素口含片和复合细胞因子口含片具有稳定性好、在口腔溶散形成较粘的液体，延长了主药在口粘膜的滞留时间，增加了主药的吸收和作用。
【具体实施方式】
实施例1
处方：(按1000片用量计算)
重组人α-干扰素 2.6×109IU
人血清白蛋白 0.5克
糊精 49.0克
蔗糖 56.0克
聚乙二醇-6000 12.0克
羧甲基纤维素钠 10.0克
泊洛沙姆 0.8克
硬脂酸镁 1.2克
操作步骤：取处方量泊洛沙姆配成4％水溶液20ml备用。蔗糖粉、糊精过100目，聚乙二醇-6000过80目，羧甲基纤维素钠过60目，并以处方的比例混匀备用。用4％泊洛沙姆水溶液作润湿剂制成软料，用20目制粒，然后置50℃烘箱中干燥6小时，再用18目筛整粒。取干燥颗粒125.0g置糖衣锅中，转速40-60转/分，在氮气保护下均匀地喷入含有处方量的重组人a-干扰素的人血清白蛋白溶液，然后于干燥洁净的氮气环境中晾干3小时，并不断翻动，使颗粒中水份含量小于3％。加入处方量的硬脂酸镁混匀，打片。
经检测，片硬度5.0±0.2公斤，溶散时间26±2分钟，片重126±3毫克，干扰素活性每片206±18万IU。
实施例2
处方(按1000片用量计算)
重组人α-干扰素 3.6×109IU
人血清白蛋白 0.4克
糊精 56.0克
蔗糖 49.0克
聚乙二醇-6000 14.0克
羧甲基纤维素钠 8.0克
泊洛沙姆 0.8克
硬脂酸镁 1.2克
操作步骤：
取处方量泊洛沙姆配成4％水溶液20ml备用。蔗糖粉、糊精过100目，聚乙二醇-6000过80目，羧甲基纤维素钠过60目，并以处方的比例混匀备用。用4％泊洛沙姆水溶液作润湿剂制成软料，用20目制粒，然后置50℃烘箱中干燥6小时，再用18目筛整粒。将处方量的重组人α-干扰素和人血清白蛋白溶液冷冻干燥，制成粉剂。空白粒加入处方量的重组人α-干扰素人血清白蛋白粉剂及硬脂酸镁混匀，打片。
经检测，片硬度4.5±0.3公斤，溶散时间20±2分钟，片重124±4毫克，干扰素活性每片290±25万IU。
实施例3
处方(按1000片用量计算)
重组人α-干扰素 3.2×109IU
人血清白蛋白 0.6克
糊精 56.0克
蔗糖 46.0克
聚乙二醇-6000 12.0克
羧甲基纤维素钠 8.0克
泊洛沙姆 1.0克
硬脂酸镁 1.5克
操作步骤：
将各处方量辅料粉碎过80～100目和重组人α-干扰素人血清白蛋白液及适量乙醇水溶液拌合在氮气保护下于自动制粒机上制粒。加入处方量的硬脂酸镁混匀，打片。经检测，片硬度4.8±0.2公斤，溶散时间24±2分钟，片重124±3毫克，干扰素活性每片276±16万IU。
实施例4处方(按1000片用量计算)
重组人α-干扰素 2.6×109IU
人血清白蛋白 0.5克
冷水可溶性淀粉 48.0克
蔗糖 56.0克
聚乙二醇-6000 12.0克
羧甲基纤维素钠 10.0克
泊洛沙姆 0.7克
硬脂酸镁 1.0克
操作步骤：
按实施例1的操作方法制粒打片，所得片剂经检测，片硬度4.5±0.3公斤，溶散时间21±3分钟，片重125±3毫克，干扰素活性每片218±16万IU。
实施例5
处方(按1000片用量计算)
重组人α-干扰素 3.0×109IU
人血清白蛋白质 0.8克
冷水可溶性淀粉 56.0克
蔗糖 48.0克
聚乙二醇-6000 16.0克
羧甲基纤维素钠 7.0克
泊洛沙姆 0.8克
硬脂酸镁 1.2克
操作步骤：
按实施例2的操作方法制粒打片，所得片剂经检测，片硬度4.6±0.3公斤，溶散时间23±2分钟，片重124±3毫克，干扰素活性每片248±18万IU。
实施例6
处方(按1000片用量计算)
重组人α-干扰素 2.6×109IU
人血清白蛋白 0.6克
冷水可溶性淀粉 54.0克
蔗糖 48.0克
聚乙二醇-6000 14.0克
羧甲基纤维素钠 7.0克
泊洛沙姆 1.0克
硬脂酸镁 1.0克
操作步骤：
按实施例3的操作方法制粒打片，所得片剂经检测，片硬度4.7±0.3公斤，溶散时间24±2分钟，片重124±3毫克，干扰素活性每片219±17万IU。
实施例7
处方(按1000片用量计算)
重组人α-干扰素 2.2×109IU
白细胞介素-2 6.0×108IU
黄芪多糖 50.0克
人血清白蛋白 0.8克
糊精 30.0克
蔗糖 25.0克
聚乙二醇-6000 12.0克
羧甲基纤维素钠 10.0克
泊洛沙姆 1.0克
硬脂酸镁 1.0克
操作步骤：
实施例1的操作方法制粒打片，所得片剂经检测，片硬度4.9±0.3公斤，溶散时间24±3分钟，片重123±3毫克，干扰素活性每片202±19万IU，白细胞介素-2活性为52±3万IU。
实施例8
处方(按1000片用量计算)
重组人α-干扰素 2.4×109IU
白细胞介素-2 5.0×108IU
猪苓多糖 50.0克
人血清白蛋白 1.0克
糊精 28.0克
蔗糖 25.0克
聚乙二醇-6000 12.0克
羧甲基纤维素钠 10.0克
泊洛沙姆 0.8克
硬脂酸镁 1.0克
操作步骤：
按实施例2的操作方法制粒打片，所得片剂经检测，片硬度4.2±0.2公斤，溶散时间20±3分钟，片重124±3毫克，干扰素活性每片207±18万IU，白细胞介素-2活性为46±2万IU。
实施例9
处方(按1000片用量计算)
重组人α-干扰素 2.4×109IU
白细胞介素-2 5.8×108IU
人参多糖 50.0克
人血清白蛋白 0.8克
糊精 25.0克
蔗糖 25.0克
聚乙二醇-6000 15.0克
羧甲基纤维素钠 10.0克
泊洛沙姆 1.3克
硬脂酸镁 1.0克
操作步骤：
按实施例3的操作方法制粒打片，所得片剂经检测，片硬度4.9±0.2公斤，溶散时间24±3分钟，片重123±3毫克，干扰素活性每片215±17万IU，白细胞介素-2活性48±2万IU。
测试实例1
以健康昆明种小鼠，体重20±2克，雌雄各半，随机分为三组，每组10只。取实施例1制备的重组人α-干扰素口含片适量，称量，加注射用水溶散，并配成合适浓度的悬液。给药方法采用灌胃法，隔夜禁食后给药。给药容积0.2ml/10g体重。观察给药后的反应及7天的存活率。试验结果见表1。所有存活动物均增重正常，未见异常体症。口服给药高剂量组每公斤体重4克，相当人常用量的1920倍，可以认为高剂量重组人α-干扰素口含片对人是无毒的。
表1 小白鼠口服急性毒性试验结果
给药浓度 给药剂量 动物数 死亡数 存活数 存活率
(g/10ml) (g/kg) (只) (只) (只) (％)
0.5 1.0 10 0 10 100
1.0 2.0 10 0 10 100
2.0 4.0 10 0 10 100
测试实例2
取本发明的高剂量重组人α-干扰素口含片置于-18℃或4～8℃存放不同时间，取出用注射用水溶解，离心取上清，用细胞病变抑制法测干扰素活性，两种温度下放置12个月，其生物活性下降率分别不超过5％和10％。这表明重组人α-干扰素口含片是稳定的。
临床试用情况
大三阳慢性乙型肝炎患者15例，年龄16～45岁，其中男11例，女4例，口粘膜服用本发明的高剂量重组人α-干扰素口含片，每片含干扰素活性200万IU，每日1片含服，服用前后半小时禁饮水或进食，连服120天，结果HBsAg转阴3例(20％)，HBeAg转阴9例(60.0％)，HBVDAN转阴10例(66.7％)，ALT复常13例(86.7％)。这一结果与文献报告的注射应用重组干扰素治疗慢性乙型肝炎的结果是一致的。