动物乳腺组织特异性高效表达载体 本发明涉及一种使外源基因在动物乳腺组织中特异表达的载体，具体地说是一种可以驱动外源基因在动物乳腺组织而不是其它组织合成该基因编码的蛋白质的生物元件。它包括控制外源基因在乳腺组织特异表达的羊BLG基因的调控序列，驱动外源基因高效合成蛋白质的小鼠STAT序列，便于将外源基因装入载体的合成DNA片段，以及供载体连同插入其上的外源基因在大肠杆菌中复制的PBluescriptSK序列。
乳腺组织是一群专门化的动物细胞，主要功能是合成乳蛋白。其合成蛋白质的能力非常强，超过动物体任何其它组织。一头优良奶牛一年可以生产乳蛋白300公斤，一只绵羊一年可以生产乳蛋白30公斤，即使一只家免一年也可以生产1.2-1.5公斤蛋白质。因此，如果采用转基因技术将外源基因，特别是编码有医疗价值的基因，如人干扰素基因，人胰岛素基因，人生长激素基因或人促红细胞生成素基因等转入动物体内，就有可能创造一种生产这些医用蛋白质的生产体系。其优点是产量高、成本低和产品质量接近天然提取物(Andrew S.et.al.1993，Biotechnology，Vol.11 1263-1269)。但是外源基因转入动物之后，它的插入地点和表达地点有随意性，如果外源基因产物有强烈生理功能，如促红细胞生成素可以刺激造血细胞增殖，外源基因随意表达会杀死动物，也不能方便地提取出来，达到利用的目的。
本发明的目的是构建一种具有乳腺组织特异性和有高效表达外源基因能力的载体，使外源基因装在本发明的载体之上并转入动物时，能在动物乳腺中大量生产该外源基因所编码的蛋白质。
本发明所构建地载体的独特之处主要是：第一，它包括了绵羊乳球蛋白基因(BLG)的全部调控元件，保证外源基因只在乳腺组织表达，不会在其它任何组织表达；第二，在绵羊乳球蛋白基因的两侧，组装了小鼠的DNA序列(STAT序列)，此序列的功能是保证外源基因高效率地表达；第三，在绵羊乳球蛋白基因第一个遗传密码之前，插入了一段人工合成的DNA，其具体序列为5’AAGTCGACAACCCGGGAAATCGATAA3’，这一段序列中含有Sal I，Sma I和Cla I三个限制性内切酶的位点，保证外源基因插入上述三个酶切位点之中的任何一个之后，可以先于绵羊乳球蛋白基因在乳腺中表达。本载体各种组分的共同作用，是保证装在它上边的外源基因在转入动物或离体培养的乳腺细胞之后，都能得到乳腺组织特异性的和高效率的表达。不论它们插入到动物的哪一条染色体，也不管它插到一条染色体上哪一个具体的位点，其表达的组织特异性和表达高效率的特点均不会消失。载体的其它部分是供载体及其所载的外源基因在大肠杆菌中扩增时所必要，不是本发明特有的。
一.用于鼠和羊乳腺表达的BLG启动子表达载体(pBCD)参见附图1：
图1是本发明pBCD乳腺组织特异性高效表达载体的结构，载体pBluescript sk的克隆位点为NotI，图中灰色区域是polylinker接头(含有SalI，SmaI和CLaI位点)，插入于BLG的PvuII位点。可于此处插入所需表达的外源基因。图中黑色区域是5’鼠染色体片段(含可使染色体解链的STAT序列)，4.6kb。紧挨黑色区域的左斜划线区是羊BLG5’区域，4.5kb。图中右斜划线区域为羊BLG3’区域，8.3kb。图中的白色区域为3’鼠染色体片段(含可使染色体解链的STAT序列)，5.0kb。
本发明pBCD(CGMCC NO 0312)于1997年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
二.pBCD的制备
1.各部分来源
a.多接头
人工合成寡核苷酸5’AAGTCGACAACCCGGGAAATCGATAA3’序列，其中含有Sall，Smal和Clal酶切位点。
b.羊BLG5’和3’区域(分别为4.5kb，8.3kb)
常规方法构建染色体组基因文库(Lambda EMBL3载体)，以一段PCR法合成的BLG启动子区域的探针进行筛选，分别挑选出含有BLG5’、3’序列的阳性克隆，连接成完整的BLG基因。
以Sall(位于BLG5’末端)和Pvull(位于第一外显子，部分消化)释放出BLG5’区域4.5kb片段，克隆于pSP72载体的Sall和Pvull位点，构建成含有BLG5’序列的P5质粒。
以Pvull 位于第一个显子，部分消化)和Xbal释放出BLG3’区域6.5kb片段，克隆于pSP72载体的Pvull和Xbal位点，构建成含有BLG3’序列的P3质粒(具体操作参见附图2)。
c.鼠染色体片段的克隆
由一乳腺高效表达人胰蛋白酶基因(AAT)的转基因鼠系(表达量与整合位点无关，与整合拷贝数成正比且遗传稳定)，构建其染色体组基因文库(在Super-cos-1 cosmid载体中)。筛选出含有整合的外源基因的重组子，基因两侧比邻鼠染色体序列。以NotI和Sall释放出5’鼠染然体区域(4.6kb)，以NotI和Hindlll释放出鼠染色体3’区域(5.0kb)，分别进行克隆，命名为SK4.5和SK5.0。(具体操作参见附图3)
2.pBCD的构建(参见附图4)，图4中Δ表示此位点处缺失了SK载体的Sall，Clal，HindIII，EcoRI，Pstl和Smal位点。
三.pBCD乳腺表达元件的酶切图谱：(参见附图5)
四.pBCD中polylinker接头及其附近的DNA序列：
---TATAA---进入外显子1---AAGCGACCCCAGGTCGACAA
—— ——
BLG的 Sall
TATA盒
CCCGGGAAATCGATCTGCAGCCATGAAGTGC---
—— —— ——
Smal Clal
注：使用外源基因本身的翻译起始密码子。
五、pBCD载体各部分的功能及使用方法
附图1描述了乳腺特异性高效表达载体的整体结构，附图2、3、4说明了各功能部分的来源和取得它们的方法，附图5给出pBCD载体核心部分的限制性内切酶图谱，表示使用所列举的限制性内切酶可以将各元件在不同位点切断。酶切图谱是描述一段DNA特征，区别它与其它DNA片断不同之点的手段之一。因此，附图5中的酶切图谱是载体pBCD所特有的，世界上不含有任何一段DNA给出相同的酶谱。
pBCD载体有三个功能元件。图5中划斜线的部分是羊乳球蛋白基因及其表达调控序列，包含该基因全部外显子和内含子，详细的核苷酸组成见附图6，附图6中大写英文字母代表羊乳球蛋白基因的氨基酸编码序列(外显子)，小写英文字母代表非编码的内含子和转录区以外的部分，pBCD载体中乳球蛋白基因DNA片段长于图6中所给出的序列，主要是在克隆该基因时连带着克隆了乳球蛋白基因上游和下游的一段序列，这一部分的功能是保证插pBCD载体上的外源基因在乳腺组织特异性表达，因为外源基因是插到乳球蛋白基因启动子的下游，而乳球蛋白基因是一个乳腺组织特异性表达的基因。在乳球蛋白基因DNA序列两翼各装上一段来自小鼠的DNA(STAT序列)，其5’端片段长4.5kb，3’端片段长5.0kb。这两个片段的来源是乳腺表AAT基因的转基因小鼠。该小鼠能高效表达AAT基因，从它的组织中提取的AAT基因连同这两个片段转移到许多小鼠中，都得到高效表达，不受插入位点影响，根据基因表达原理，该片段属于解链蛋白粘附的DNA片段，只要有了这个片段，DNA解链酶就使染色体由非工作状态变到工作状态，在其附近的基因就可以高效表达。这部分DNA序列的内切酶图谱参见附图5。处于乳球蛋白基因两个DNA片段之间的，是一个人工合成的多接头DNA片段，其核苷酸顺序，见图2所示。这一段DNA的功能主要是含有三个内切酶位点Sal I，Sma I和Cla I，便于任何外源基因在此处插入，这一人工合成片段在载体上的确切位置，是在乳球蛋白基因在此处插入，这一人工合成片段在载体上的确切位置，是在乳球蛋白基因启动子中的TATA盒下游到乳球蛋白基因第一个遗传密码ATG的上游(图7)，附图7是转基因小鼠奶的PAGE电泳图，图中箭头所指是外源基因表达的蛋白质。任何完整的外源基因(去掉其本身的启动子后的基因)，只要插入此处后，都能在乳球蛋白基因启动子驱动之下，先于乳球蛋白基因表达。内切酶位点Sal I和Cla I将含在酶切后产生粘性末端，Sma I将来生钝端，使用这三个位点的一个或两个，可以将任何外源基因经末端修饰后插入此处。都能在乳球蛋白基因启动子驱动之下，先于乳球蛋白基因表达。内切酶位点Sal I和Cla I将含在酶切后产生粘性末端，Sma I将来生钝端，使用这三个位点的一个或两个，可以将任何外源基因经末端修饰后插入此处。关于外源基因插入的操作程序，完全可以参照现有工作手册中所载的方法进行(分子克隆手册，曼尼安蒂斯等编著金冬雁等翻译，科学出版社1996年出版)。
下面用实施例对本发明作进一步说明，本发明的精神和保护范围在所附的权利要求书中。
实施例1
pBCD载体在转基因小鼠中表达羊乳球蛋白基因
本实验的目的是检测pBCD乳腺组织特异性高效表达载体有无乳腺组织特异性表达功能，载体转入动物之后有无不良影响。
表达载体和基因构建：
实验使用的表达结构如图1所示，换句话说就是pBCD载体本身。pBCD的核心部分是羊乳球蛋白基因，其本身就编码完整的绵羊乳球蛋白。
转基因小鼠的生产：
一实验材料
1.实验动物昆明小白鼠和昆明小鼠与C57 BL的杂交鼠，购自计划生育研究所动物部
2.仪器 倒置相差显微镜(日本尼康)
显微操作仪(德国Leitz)
拉针仪(日本Narishige PD-5型)
解剖显微镜(东分公司)
二氧化碳培养箱(pharmacia)
3.药品三溴乙醇，60％乳酸钠，氯化钙，透明质酸酶、丙酮酸钠均购自美国Sigma公司，牛血清白蛋白(组分V)购自华美公司，PMSG，HCG购自天津实验动物研究所，其余药品为国产。
4.地高辛DNA标记和检测试剂盒，Boehringer公司。SephaglasesBandprep kit Phamacia公司。人生长激素放免试剂盒购自301医院内分泌室。
5.尼龙膜 购自Boehrnger公司。
6.质粒pBCD。
二、方法
(一)主要试剂的配制：
1、20×SSC，在800毫升水中溶解175.3克NaCl和88.2克柠檬酸钠，NaOH调PH至7.0，加水定容至1升，高压灭菌。2、变性液 1.5M NaCl，0.5M NaOH。3、中和液 1M Tris，Cl(pH7.4)，1.5M NaCl。4、鼠尾DNA抽提缓冲液 50mM Tris，Cl(pH8.0)，100mM EDTA(pH8.0)， 100mM NaCl 1％SDS。5、显微注射用DNA稀释液：
7mM Tris.Cl(pH7.4)0.16mM EDTA，三蒸水配制，过滤除菌。(二)M2与M16培养液的配制1.贮存液的配制配制M2与M16培养液的贮存液贮存液 成 分 体积 克数与浓度 (ml)A 10× 100
NaCl 5.534
KCl 0.356
KH2PO4 0.162
MgSO47H2O 0.293
乳酸钠 2.610
或4.349克60％的浆
葡萄糖 1.000
青霉素 0.060
链霉素 0.050B 10× 100
NaHCO3 2.101
酚红 0.010C 100× 10
丙酮酸钠 0.036D 100× 10
CaCl2.2H2O 0.352E 10× 100
HEPES 5.958
酚红 0.010上述贮存液均过滤除菌，A液-20℃保存二周，其余4℃保存一周。2.M2与M16的配制。由贮存液配制M2贮存液 M2工作液 (单位ml)
10 50 100A(10×) 1.0 5.0 10.0B(10×) 0.16 0.8 1.6C(100×) 0.10 0.5 1.0D(100×) 0.10 0.5 1.0E(10×) 0.84 4.2 8.4BSA 40.0mg 200mg 400mg双蒸水 7.80 39.0 78.0由贮存液配制M16贮存液 M16工作液 (单位ml)
10 50 100A(10×) 1.0 5.0 10B(10×) 1.0 5.0 10C(100×) 0.1 0.5 1D(100×) 0.1 0.5 1BSA 40.0mg 200mg 400mg双蒸水 7.80 39.0 78.0 M2和M16均现用现配
(三)转基因用DNA的制备
质粒pBCD转化大肠杆菌DH52后，用液体培养法培养含pBCD质粒的大肠杆菌DH52。培养量根据需要可为100ml-1000ml。培养完成后用离心法(300转/分)离心10分钟收集细菌，用快速抽提法或大规模抽提法制备pBCDDNA(详细操作参考曼尼安蒂斯主编的分子克隆手册，或任何一本关于分子克隆的手册均可)。提取的pBCD DNA用内切酶Notl酶切，TAE琼脂糖凝胶电泳将得到一个分子量为22.4kb的大片段和一个3.0kb的小片段。22.4kb的片段是pBCD完整序列，将其切下后，再用Sephaglass Babndprep试剂盒纯化备注射用。
2.用显微注射用DNA稀释液将纯化后的DNA稀释至2μg/ml，离心(12,000rpm，30分钟)，取1/2体积，分装，即可用作显微注射。
(四)转基因实验方法
1.小鼠的准备：
转基因实验用的小鼠分为四种类型，即供体母鼠、受体母鼠、种公鼠和结扎公鼠。
①供体母鼠，8-10周龄的雌性昆明白鼠和杂交鼠。人工诱导发情后与种公鼠交配，作为超排卵供体母鼠。
②受体母鼠，8-10周龄的雌性昆明白鼠和杂交鼠。人工诱导发情后与结扎公鼠交配，获得假孕母鼠，可作为显微注射后受精卵的受体。
③种公鼠，8-10周龄雄性昆明白鼠，购回后单笼饲养，并标号。1-2周后与供体母鼠交配。
④结扎公鼠8-10周龄的雄性昆明白鼠，实验前三周作双侧输精管结扎。
2.公鼠的输精管结扎：麻醉：2.5％三溴乙醇，(0.017毫升/克体重)，腹腔注射。结扎：将小鼠仰卧定于手术板上，下腹部剪毛消毒，打开腹腔，分别找出并结扎左右侧输精管，还纳后闭合手术通路，关腹前切口处上少许磺胺粉以防感染。
3.超排卵
供体母鼠在明暗循环的动物房中饲养一周，即可作超排卵用。用生理盐水将PMSG及hCG稀释为100in/ml，每只鼠腹腔注射0.1ml，注射时间为14：00PMSG，48小时后hCG，注射hCG后分别将每只供体母鼠放入一种公鼠笼内。排卵时间一般为注射hCG后10-13小时。
4.取卵
将有阴栓的供体母鼠挑出，引颈处死，0.2％新结尔灭浸泡全身，在下腹部打开腹腔，暴露两侧输卵管及卵巢，分别取出两侧输卵管，将之转移到盛有M2的培养皿中，将培养皿置解剖镜下，用尖镊子将输卵管壶腹部撕开，将卵轻轻拨出，加入少许透明质酸酶(0.3mg/ml)。用移卵管轻轻的吹打，待卵分散后，将卵转入M16液滴中，M16洗4次后，放入二氧化碳孵箱中。
5.受精卵的显微注射
①持卵器的制备，取直径1mm的硬玻璃管，在微火上烤软，将其拉成80-150μm直径的细管，在距颈部2cm处折断，用烧针仪烤平断口。
②注射针的制备，用拉针仪直径1mm的玻璃管拉成针尖约1μm直径的注射针。
③显微注射，在凹玻片上各滴上M2培养液和DNA注射液(两者不同混合)，无菌石腊油覆盖后置显微镜的载物台上。低倍镜下将注射针吸入适量的DNA注射液。取约10个受精卵注入M2液滴中。用持卵器吸住一枚卵后转至高倍镜下。将注射针调至合适的角度，针尖刺入受精卵雄原核中，将DNA注射液注入约1p1，可见雄原核膨胀，迅速抽出注射针，待凹玻片上所有的卵注射完毕后，立即将卵转移至M16培养基中，CO2孵箱培养30分钟后即行移卵。
6.受精卵的输卵管移植
①移植用移卵管的制备：将细玻璃管在酒精喷灯上烧软，拉成150μm直径左右，折断后将断端烤平。
②受精卵的准备：将受精卵从M16培养液移至M2培养液中，再吸入移卵管中备用。
③受精卵的输卵管移植
选择有阴栓的假孕母鼠，麻醉，方法同公鼠的输精管结扎术。将鼠背侧酒精消毒，在最后肋骨后约1cm处，沿脊柱作一长1.5cm的纵长切口，打开腹腔，用镊子夹住卵巢上的脂肪垫，将卵巢和输卵管轻轻拉出。在解剖镜下找到输卵管伞开口，用虹膜剪剪开外层被膜，将移卵管插入伞部后将卵吹入。两侧输入卵部的移植同法，手术完毕后用小夹子夹住切口，一周后除去夹子。
(五)鼠尾DNA的提取：
2周龄以上的小鼠，即可用于提取鼠尾DNA
1、剪下2cm长的鼠尾，先用70％乙醇洗净。晾干后放入Ependorff管中。
2、加鼠尾DNA抽提液0.7ml，将鼠尾剪碎，再加70μl浓度为10mg/ml的蛋白酶K，混匀。
3、55℃水溶18小时，不时颠倒混匀。
4、冷却至室温后加RNAmax使终浓度为20μg/ml，37℃水溶1小时。
5、加等体积苯酚，轻轻颠倒混合20分钟，离心。(4℃，5000rpm，10分钟)取上清，重复苯酚抽提两遍，酚/氯仿抽提一遍，24∶1的氯仿∶异戊醇抽提一遍。
6、转移水相至一新管中，加2倍体积的冷无水乙醇，混匀，沉淀立即出现。
7、将沉淀吸出，70％乙醇洗两次，晾干。
8、加500μl TE，室温溶解48小时，待DNA溶解后4℃保存。
(六)PCR法筛选转基因阳性鼠
模板DNA为1μg鼠尾DNA，引物II为重新设计，其余条件同实验第二部分。
(七)Southern杂交鉴定转基因阳性鼠。
1、鼠尾DNA的酶切：
取鼠尾DNA 20μg，BamHl酶切，酶切体系为
鼠尾DNA20μg
10×bufer E 20μl
BamHl酶50ul
加双蒸水至200μl
37℃酶切过夜
2、电泳：酶切后的DNA取小量电泳检查，酶切完全后，将样品用苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后溶于20μl TE中，0.8％琼脂糖凝胶电泳，3-4v/cm，8小时。
3、转膜
①将转移槽用清水洗净，蒸馏水冲洗，铺上带窗口的塑料膜。
②剪一块比窗口大尼龙膜，重蒸水浸泡2分钟后，盖于窗口上。
③把凝胶装置在尼龙膜上，放好后不再移动。
④装好真空装置，启动真空泵。调真空压强为40mbar保持2分钟。
⑤吸去胶上盐酸加变性液，使之覆盖胶面，保持30-60分钟。
⑥吸去胶上变性液，加中和液，使之覆盖胶面，保持20分钟。
⑦吸去中和液，加20×SSC，调压至90mbar，保持60分钟。
⑧转膜完毕，关闭真空泵，吸去SSC溶液，除去凝胶，取下尼龙膜，整理好真空转移器及塑料膜。
⑨将尼龙膜用6×SSC漂洗后置滤纸上晾干，80℃干烤2小时，DNA即固定在尼龙膜上。
4、探针的标记，杂交均按Dig DNA标高和检测试剂盒说明书进行。
(八)鼠奶中表达产物的检测
1.小鼠奶样的制备：
产后第8天的母鼠先与仔鼠隔离3小时以上，腹腔注射0.3IU的催产素，10分钟后腹腔注射三溴乙醇。麻醉后，轻轻按摩乳腺，用缠胶布的镊子轻轻挤奶，用微量加样器将乳汁吸出。乳汁加无菌双蒸水5倍稀释，离心去乳脂。每200μl加4-5μl1N HCl，混匀后离心。上清液即为乳清，可供检测用。
2.乳清蛋白的SDCpAGE电泳：5％三氯乙酸沉淀去脂乳蛋白，离心，去上清，丙酮洗沉淀一次，溶于电泳上样缓冲液中。6％的浓缩胶，1.5％的分离胶。15v/cm电泳3小时。考马斯亮蓝染色。
电泳结果见图7表示：图中1、2是部分提纯的牛奶，其中出现的谱带是酪蛋白。3号样品是牛的全奶，4-6号是转基因小鼠的奶，7号是牛乳球蛋白标样品，8号是非转基因小鼠的奶。从图中可以看出，4号样中出现了羊乳球蛋白谱带，说明绵羊乳球蛋白基因已在小鼠中表达。而5号和6号样品中无绵羊乳球蛋谱带，与8号样品(非转基因鼠)相同，证明外源基因未在奶中表达出蛋白。
实施例2：用pBCD在乳腺培养细胞中表达人的生长激素基因
人生长激素基因是一种组织特异性表达的基因，在人和其它哺乳动物，生长激素基因只在脑垂体前叶细胞中表达，不在其它任何组织中表达。为了证实pBCD载体的乳腺组织特异性，将人的生长激素基因组装到pBCD载体上，用以转化培养的山羊乳腺细胞。实验证明，pBCD载体可以驱动人的生长激素基因在乳腺细胞中高效表达。具体实验程序如下：
1、用于羊乳腺中表达的人生长激素(hGH)基因的结构与序列：
----TATAA----(插入BLG外显子1)----AAGCACGACCCCAGGTCGACAACCC以下进入hGH基因序列： GATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACGCTCAC CTAGCTGCA ATG GCT ACA G GTAAGCGCCCCTAAAATCCCTTTGGGC ACAATGTGTCCTGAGGGGAGAGGCAGCGACCTGTAGATGGGACGGGGGCA CTAACCCTCAGGTTTGGGGCTTCTGAATGAGTATCGCCATGTAAGCCCAGT ATGGCCAATCTCAGAAAGCTCCTGGTCCCTGGAGGGATGGAGAGAGAAAA ACAAACAGCTCCTGGAGCAGGGAGAGTGCTGGCCTCTTGCTCTCCGGCTCC CTCTGTTGCCCTCTGGTTTCTCCCCAG GC TCC CGG ACG TCC CTG CTC CTG GCT TTT GGC CTG CTC TGC CTG CCC TGG CTT CAA GAG GGC AGT GCC TTC CCA ACC ATT CCC TTA TCC AGG CTT TTT GAC AAC GCT AGT CTC CGC GCC CAT CGT CTG CAC CAG CTG GCC TTT GAC ACC TAC CAG GAG TTT GTAAGCTCTTGGGGAATGGGTGCGCATCAGGGGTGGCAGGAAGGGGTGAC TTTCCCCCGCTGGGAAATAAGAGGAGGAGACTAAGGAGCTCAGGGTTTTTC CCGAAGCGAAAATGCAGGCAGATGAGCACACGCTGAGTGAGGTTCCCAGA AAAGTAACAATGGGAGCTGGTCTCCAGCGTAGACCTTGGTGGGCGGTCCTT CTCCTAG GAA GAA GCC TAT ATC CCA AAG GAA CAG AAG TAT TCA TTC CTG CAG AAC CCC CAG ACC TCC CTC TGT TTC TCA GAG TCT ATT CCG ACA CCC TCC AAC AGG GAG GAA ACA CAA CAG AAA TCC GTGAGTGGATGCCTTGACCCCAGGCGGGGATGGGGGAGACCTGTAGTCAG AGCCCCCGGGCAGCACAGGCCAATGCCCGTCCTTCCCCTGCAG AAC CTA GAG CTG CTC CGC ATC TCC CTG CTG CTC ATC CAG TCG TGG CTG GAG CCC GTG CAG TTC CTC AGG AGT GTC TTC GCC AAC AGC CTG GTG TAC GGC GCC TCT GAC AGC AAC GTC TAT GAC CTC CTA AAG GAC CTA GAG GAA GGC ATC CAA ACG CTG ATG GGG GTGGGGGT GGCGCTAGGGGTCCCCAATCTTGGAGCCCCACTGACTTTGAGAGCTGTGTTA GAGAAACACTGCTGCCCTCTTTTTAGCAGTCCAGGCCCTGACCCAAGAGAAC TCACCTTATTCTTCATTTCCCCTCGTGAATCCTCTAGCCTTTCTCTACACCCTG AAGGGGAGGGAGGAAAATGAATGAATGAGAAAGGGAGGGAGCAGTACCCA AGCGCTTGGCCTCTCCTTCTCTTCCTTCACTTTGCAG AGG CTG GAA GAT GGC AGC CCC CGG ACT GGG CAG ATC TTC AAG CAG ACC TAC AGC AAG TTC GAC ACA AAC TCA CAC AAC GAT GAC GCA CTA CTC AAG AAC TAC GGG CTG CTC TAC TGC TTC AGG AAG GAC ATG GAC AAG GTC GAG ACA TTC CTG CGC ATC GTG CAG TGC CGC TCT GTG GAG GGC AGC TGT GGC TTC TAG CTGCCC(以下进入pBCD)GGGAAATCGATCTGCAGCCATGAAGTGC------注：序列中黑体字母表示外显子序列。2、表达结构的构想：构建人染色体组基因文库(在Lamda FIX II载体中)，筛选含有人生长激素基因的重组子。以BamH I和Smal(部分消化)释放出hGH基因片段，补平末端，将其与pBCD的Smal位点连接。得到含有hGH编码基因的融合结构(pBCD-hGH)，参见附图8。
3、pBCD-hGH融合基因在山羊乳腺细胞中表达：
(一)实验材料实验动物用产羔24天的泌乳期母山羊。
1.质粒pBCD-hGH
2.LipofectinTMReagent，培养基MEM，199，胎牛血清购自BRL公司。
3.胶原酶II型，牛胰岛素，Cortisol，催乳素购自Sigma公司。
4.细胞培养瓶购自Corning公司。
(二)主要试剂的配制
1.PBS缓冲液(升，PH7.4)
Na2HPO4·H2O2.9克，KH2PO40.2克
NaCl 18.0克，KCL 0.2克
2.MEM，199培养液。重蒸水配制，过滤除菌。
3.双抗贮存液(100×)
结晶青霉素钠盐 100万单位
链霉素 100万单位
灭菌水 100毫升
小瓶分装，每瓶3-4ml，-20℃保存。
4.胰蛋白酶贮存液(10×)
NaCl 2.0克，KCL 0.4克，葡萄糖1.0克
NaHCO3 0.58dqb，EDTA0.2dqb，酚红0.02克。
胰蛋白酶0.5-0.6克，重蒸水100毫升，过滤除菌。
小瓶分装，-20℃保存。
5.8％NaHCO3溶液。重蒸水配制，过滤除菌。
6.胶原酶液。10mg/ml，PBS配制，过滤除菌。
7.牛胰岛素，用199培养液配成1mg/ml，过滤除菌。
8.催乳素，用199培养液配成1mg/ml，过滤除菌。
9.皮质醇，用乙醇配成2mg/ml，过滤除菌。
10.细胞生长液
MEM 45ml 199 45ml
双抗1ml谷氨酰胺1ml
NaHCO3(8％)调至粉红色(PH7.1-7.3)
胎牛血清10ml
(三)山羊原代乳腺上皮细胞的培养
1.杀羊，先用75％酒精擦洗乳腺，切下乳腺后用双层无菌纱布包好，立即置超净工作台内操作。
2.用无菌手术器械剪去脂肪组织，将乳腺组织切成小块(1cm3/块)。
3.MEM培养基漂洗3遍。
4.将组织块剪碎(约1mm3/块)，加MEM培养基漂洗。
5.离心(室温，1000rpm7分钟)，去上清。
6.重复洗三次。
7.向组织沉淀内加入MEM和胶原酶溶液，胶原酶终浓度为1mg/ml。
8.37℃水浴摇床2小时。
9.离心(室温1000rpm7分钟)去上清。
10.MEM洗五次。
11.加细胞生长液20ml。
12.得到的混合物分装至培养瓶，每个培养瓶内接种2-3ml(以铺盖瓶底为限)。
13. 37℃，5％CO2培养箱内培养约1小时。
14.加细胞生长液至5ml。
15. 37℃，5％CO2培养箱内培养。
(四)质粒的转染
1.将各培养瓶口之培养液倾出，199洗两遍，加3ml无血清加谷氨酰胺的MEM/199培养基。
2.取200ul lipofectin与200ul pBCD-hGH质粒混合，室温静置15分钟。
3.每培养瓶加入lipofectin-DNA复合物200ul，逐滴加入，轻摇混合。
4.37℃，5％CO2培养箱培养18小时后取样检测。
(五)人生长激素的放射免疫测定
培养细胞中人生长激素含量的测定采用放射免疫法，测定所用试剂盒由Clonetech(上海)公司购得，采用的操作方法按厂家的说明书中所描述的方法进行，表达结果见下表所示。
表2-1原代山羊乳腺上皮细胞表达人生长激素放免测定结果(ug/106细胞)
激素诱导后小时数 乳腺细胞培养液
0 ND
12 48.4
24 37.56
36 41.6
48 29.56
60 36.64
72 171.8
84 666.0
98 579.2
18 496.4
ND：未测出乳腺细胞裂解液的hGH含量为1.5ng/ml，未经质粒转染的乳腺细胞的培养液未测出人生长激素。
在无激素诱导的情况下，原代山羊乳腺上皮细胞pBCD-hGH转染后18小时pBCD-hGH基因不表达(结果未列出)。由表2-1可以看出，激素诱导12小时后，BLG/hGH基因开始表达，72小时表达量突然升高，84小时至最高，其后稍有降低。而且由于测定的是培养液，说明这是产生后分泌到细胞外的人生长激素。从乳腺细胞裂解液的检测结果可以看出，乳腺细胞内人生长激素含量极低，说明表达产物合成后立即分泌至培养液中，证明乳腺细胞可以将带有本身引导肽的人生长激素有效地分泌出细胞外。
原代山羊细胞经pBCD-hGH转化后生长正常，表明外源基因对细胞没有发生毒害。山羊乳腺细胞在培养状态下生长情况如图9所示。
附图说明：
图1：是本发明pBCD乳腺组织特异性高效表达载体的结构图。
图2：是pBCD的制备操作图。
图3：是鼠染色体片段的克隆操作图。
图4：是pBCD的构建图。
图5：是pBCD乳腺表达元件的酶切图谱。
图6：是羊乳球蛋白基因的详细核苷酸组成。
图7：是转基因小鼠奶的PAGE电泳图。
图8：是pBCD-hGH融合表达结构图。
图9：是山羊乳细胞在培养状态下生长情况。