细胞周期关卡基因 本发明涉及一类在真核细胞中控制细胞周期进程的关卡基因及其多肽产物。
【发明背景】
控制细胞周期是从酵母到哺乳动物的真核生物存在和生长的基础。真核生物已进化出控制途径，称为“关卡”，它能确保细胞周期的每一步在下一步发生前完成。作为DNA损伤的反应，细胞可以通过直接的DNA修复机制和细胞周期进程的减缓来增加细胞存活。依据细胞受辐射时在细胞周期中所处的位置，哺乳动物细胞中的损伤能阻止(a)由G1期进入S期，(b)整个S期进行或(c)从G2期进入有丝分裂期。认为这样的关卡能够阻止有丝分裂过程中的有害事件，如损伤DNA的复制和成为片段的染色体的分离(Hartwell和Kastan，1994)。
粟酒裂殖酵母rad3基因是作为DNA损伤和复制受阻反应的关卡所必需，Rad3是激酶的脂激酶亚类中一员，所述激酶含有与酶磷脂酰肌醇-3激酶(PI-3激酶)的P110亚单位的脂激酶区序列同源的区域。这一亚类也包括共济失调-毛细血管扩张症的病人中ATM蛋白缺陷。来自共济失调-毛细血管扩张症的病人的细胞(AT细胞)失去了辐射后地S期延迟，据说显示了抗辐射的DNA合成(Painter and Young，1989)。S期受辐射的AT细胞由于致命损伤在G2期积聚，可能是试图复制受损DNA的结果。G2期受辐射的AT细胞显示不同的表现型：DNA受损后其有丝分裂并不受阻，以损伤DNA完成整个有丝分裂进程(Beamishand Lavin 1994)。ATM基因已被定位其中的A-T基因座的突变导致了对离子化辐射做出适当反应所需的几个关卡的破坏。这一脂激酶亚类的其它成员包括：Tel1p(Greenwell等1985)，涉及啤酒酵母中维持端粒长度的一个基因；ESr1p；Mec1p和黑胃果蝇mei-41关卡基因的产物(Heri等1995)。
【发明内容】
我们分析了sS rad3基因并发现它有2386个氨基酸的全长氨基酸序列，而不是Seaton等1992所描述的1070个氨基酸。我们已肯定这是啤酒酵母Esr1p的直接同源物，并和ATM基因具有同样的大致结构。rad3蛋白的羧基末端含有脂激酶区，是Rad3的功能所必需。我们已显示Rad3能自我结合。我们已发现了一种与Rad3相关的蛋白激酶活性。
进一步我们找到了rad3的人类同源物。这个我们称为ATR(共济失调和辐射相关)的基因和rad3的同源性显著高于和ATM基因的同源性。
人类ATR cDNA序列如序列号No.1列出。从核苷酸80和8011的ORF氨基酸序列如序列号No.2列出。
rad3de 开放读码框架的DNA序列如序列号No.3所示。基因(序列号No.3的核苷酸585到7742)所翻译的2386个氨基酸如序列号No.4所示。
因此，一方面本发明提供了序列号2的ATR蛋白及其同源物，及其多肽片段，及其能结合ATR蛋白或多肽片段的抗体。本发明下文的多肽表示ATR蛋白，同源物及其片段。
另一方面，本发明提供了能选择性地与序列号1或其互补链(即，相反链)杂交的完全分离状态的寡核苷酸。还提供了编码本发明多肽的寡核苷酸。这些寡核苷酸将被称为本发明的寡核苷酸。
本发明的一种寡核苷酸包括能和该基因选择性杂交的序列号1的DNA及其片段。
进一步的方面，本发明提供了携带本发明寡核苷酸的重组载体，包括表达载体，此载体在合适的宿主细胞中生长的方法，例如本发明的序列编码的蛋白或多肽能够表达的条件。另一方面，本发明提供包括本发明的寡核苷酸，多肽和抗体的试剂盒及用这种试剂盒诊断ATR和其同源物，或其变体包括有害的ATR突变存在与否的方法。
本发明进一步提供了筛选用作抑制或激活ATR活性，或关卡活性缺陷的ATR突变形式活性化合物的候选物试验方法。本发明也提供了筛选作为抑制ATR和其它与ATR相互作用的化合物，包括ATR本身，间相互作用的化合物的试验方法。
相关方面，本发明还提供了基本分离形式的序列号3的寡核苷酸序列，和基本分离形式的序列号4的蛋白，和新片段及其变种。发明详述A. 多核苷酸
本发明的多核苷酸可包括DNA或RNA。还可包括其中有合成或修饰核苷酸的多核苷酸。本领域已知许多不同类型修饰的寡核苷酸。包括甲基磷酸酯和硫代磷酸酯骨架，分子的3‘和/或5’末端加入吖啶或聚赖氨酸。考虑到本发明的目的，可以理解本文所述的寡核苷酸可通过本领域现有的任何方法进行修饰。实施这些修饰旨在改善本发明的寡核苷酸的体内活性或寿限。
能选择性的与序列号1的DNA杂交的本发明的寡核苷酸通常至少有70％，优选至少80％或90％，更优选至少95％与相应的序列号1的DNA同源，在至少20个核苷酸，优选至少25或30个，例如至少40，60或100或更多个的连续核苷酸的区域。
可以理解技术人员用常规技术构建核苷酸替代物而不影响本发明核苷酸编码的多肽序列，反映在其中本发明的多肽可表达的任何特异生物中的编码作用。
任何具有上面提到的同源性程度和最小大小的组合可用来定义本发明的寡核苷酸，优选更严格的组合(即具更长长度的更高的同源性)。例如具有至少25个核苷酸，优选30，80％同源的一条寡核苷酸构成本发明的一个方面，具有至少超过40个核苷酸的90％同源性的寡核苷酸也同样。
本发明的寡核苷酸可用于产生引物，例如PCR引物，用于选择性放大反应的引物，如用放射性或非放射性标记物通过适当方法标记的探针，或该寡核苷酸可克隆入载体。这些引物，探针和其他片段至少15个核苷酸，优选至少20，例如至少25，30或40核苷酸长，并被此处所用的本发明的所称寡核苷酸围绕。
按照本发明如DNA寡核苷酸核的寡核苷酸和引物可重组，合成或其他本领域技术熟练人员可用的任何方法产生。它们可用标准技术克隆。
引物一般用合成方法产生，涉及一步每次用一个核苷酸得到目的核苷酸序列的明智制法。这种利用自动化完成的技术在本领域已可实现。
较长的寡核苷酸一般可用重组方法产生，如用PCR(聚合酶链反应)克隆技术。这将涉及制造一对和要克隆的ATR基因对应的引物(如15-30个核苷酸)，将引物和从人类细胞(例如象外周血白细胞一类的分裂细胞)获得的mRNA或cDNA接触，在能扩增目的区域的条件下进行聚合酶链反应，分离扩增片段(例如在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)并回收扩增片段。引物可设计为含有适当的限制性内切酶识别位点以便将扩增的DNA克隆进合适的克隆载体。
此技术可用于获得所述的ATR序列的全部或部分。包括ATR基因和其内含子及启动子区的基因组克隆也可用类似方法获得，从人类细胞如肝细胞来源的基因组DNA开始。
尽管此处提到的技术在本领域一般广为人知，可具体参考Sambrook等(分子克隆：试验室手册，1989)。
和本发明的序列并不100％同源但在本发明范围内的寡核苷酸可用多种方法得到。
其他所述的ATR序列的人类等位变异体可用筛选来自广泛个体，如来自不同人群的个体，的基因组文库获得。
此外，其他动物，特别是哺乳动物(如小鼠，大鼠和兔)，更特别是灵长类，可获得ATR的同源物，并且所述的同源物和片段一般能和序列号No.1选择性杂交。此序列可用筛选来自其他动物种类的基因组DNA文库或来自分离细胞和组织的cDNA文库获得，用包括序列号1的全部或部分的探针在中高度严格的条件下(例如0.03M氯化钠和0.03M柠檬酸钠50℃到60℃)筛选。
等位基因变异体和物种同源物可用简并PCR获得，该法利用设计定靶于变异体和同源物中编码保守氨基酸序列的引物。保守序列可根据ATR氨基酸序列和rad3序列的排列预测。引物含有一个或多个简并位点并在比针对已知序列用单一引物克隆序列低的严格条件使用。
另外，此寡核苷酸可通过ATR序列或等位基因突变体的定点突变获得。这种技术在例如需要对序列进行沉默密码子改变，以优化多核苷酸序列在其中表达的具体宿主细胞的密码子偏好时是有用的。其他序列改变可期望用于引入限制性内切酶切点，或改变寡核苷酸编码的多肽的功能和特性。可期望进一步改变以体现ATR中特殊的编码改变，这种改变产生失去关卡功能的突变的ATR基因。基于这些改变的探针可用作检查此类ATR突变体的诊断探针。
本发明更提供包含本发明的寡核苷酸及其互补链的双链寡核苷酸。
本发明的寡核苷酸和引物携带显露标记物。合适的标记物包括放射性同位素如32P和35S，酶标记或其他的蛋白标记如生物素。这些标记物可加在本发明的寡核苷酸和引物上并可用已知的技术检测。
标记或未标记的本发明的寡核苷酸或引物或其片段可由本领域的熟练人员用于基于核苷酸的试验以在人类或动物体内检测或测序ATR。
此检测试验一般包括将人或动物体含有DNA或RNA的样品和包含本发明的寡核苷酸或引物的探针在杂交条件下接触，并检测样品中探针和核苷酸之间的任何双螺旋形成。此检测可用一些技术获得，这些技术有例如PCR或将探针固定于固相支持物上，除去样品中不和探针杂交的核苷酸，然后检测和探针杂交的核苷酸。或者是样品核苷酸可固定于固相支持物上，结合于此支持物上的探针数量可以检测。其他形式的适合的试验方法可在如WO 89/03891和WO 90/13667中找到。
测序ATR的试验包括使包含DNA或RNA的人或动物体的样品和本发明包含寡核苷酸或引物的探针在杂交条件下接触，并用例如Sanger双脱氧链终止法(参见Sambrook等)测定序列。
此方法一般包括，存在适合试剂情况下，通过合成和靶DNA或RNA互补链而延伸引物，并选择性在A，C，G，T/U残基的一个或多个处终止延伸反应；允许链延伸和终止反应发生；按照大小分离延伸产物确定选择性终止发生处的核苷酸的序列。适合的试剂包括DNA聚合酶，脱氧核苷酸dATP，dCTP，dGTP和dTTP，缓冲液和ATP。双脱氧核苷酸用于选择性终止。
检测或测序人或动物体内的ATR试验可用于测定含有或怀疑含有突变ATR基因个体细胞中的ATR序列，例如肿瘤细胞包括白血病细胞和实体瘤如乳腺，卵巢，肺，结肠，胰腺，睾丸，肝，脑，肌肉和骨骼肿瘤。
此外ATR的发现使用类似ATM基因的方式研究此基因在遗传疾病中的作用可以实现。这一般涉及ATR(如用PCR序列分析)在细胞中的地位的确定，此细胞来自有细胞复制受损相关疾病的病人，例如家族肿瘤素质，染色体断裂或不稳定表现型或损伤修复敏感表现型。
本发明的探针可以用适当容器方便地以试验试剂盒包装。在此试剂盒中探针结合于固相支持物，其中试剂盒设计用于的试验要求这样的结合。试剂盒还可包括适当的试剂用于待查样品的处理，使探针和样品中的核苷酸杂交，对照，说明书，诸如此类。
本发明也提供编码下文描述的本发明多肽的寡核苷酸。由于该寡核苷酸将用作重组产生本发明多肽的序列，所以它不需要和序列号No.1的序列选择性杂交，尽管一般期望如此。另一方面若需要该寡核苷酸可按上文描述制造，标记和使用。本发明的多肽下文描述。
本发明的寡核苷酸特别优选来自ATR的脂激酶区，其等位基因变异体和物种同源体。脂激酶区由序列号1的核苷酸7054到8011代表。特别优选包括此区的本发明的寡核苷酸。所称“脂激酶区”指由序列排列决定和其他已知脂激酶同源的区域，特别和PI-3激酶的P110亚单位同源。
其他本发明优选的寡核苷酸是编码包括据信为一公认的蛋白-蛋白作用点亮氨酸拉链的序列号No.2的181到302氨基酸序列(序列号No.1的核苷酸620到985)的寡核苷酸，和另一保守区氨基酸序列1358到1366(核苷酸4151到4177)。
另一方面，本发明的寡核苷酸包括序列号No.3和能和此序列选择性杂交的片段而不是包含核苷酸2482到6599的片段，其中发生如下改变：缺失2499，2501，2507和2509残基；5818/5819间插入C。
特别优选包括残基6826到7334(脂激酶区)和亮氨酸拉链区1476到1625和2310到2357的片段。此外优选包括保守区3891到3917的片段。此多肽和片段可按上文描述制造和使用。B. 多肽.
本发明的多肽包括包含序列号NO.2列出序列的基本上分离形式的多肽。
多肽还包括该序列的变异体，包括基本上与所述多肽同源的自然发生的等位基因变异体和合成变异体。在本文中，基本同源是指序列超过30个氨基酸有至少70％，例如80％或90％的氨基酸和脂激酶区和羧基端部分(残基2326到2644)除外的序列号No.2序列同源(一致)，除外部分中基本上同源是指超过50个氨基酸有至少80％，优选90％同源(一致)。
多肽也包括其他编码其他物种的ATR的同源物和其上文定义的变异体，其他物种包括动物如哺乳动物(例如小鼠，大鼠或兔)，特别是灵长类。
本发明的多肽还包括上文提到的全长多肽和其变异体的片段，包括序列号No.2列出序列的片段。
优选片段包括含有抗原决定簇的片段，特别是抗原决定簇。合适的片段至少约5个氨基酸，例如10，12，15或20个氨基酸大小。ATR蛋白及其等位基因和物种变异体的多肽片段可含有1个或多个(例如2，3，5，或10)取代，缺失或插入，包括保守取代。
保守取代可按照下表所列保守取代获得，其中第二列同一区的氨基酸和优选第三列同一行的氨基酸可互相取代。 脂肪族的 非极性 GAP ILV 极性不带电 CSTM NQ 极性带电 DE KR 芳香族的 HFWY1 其他 NQDE
本发明的多肽的变异体还可以包括一个或多个特异的(即，天然编码的)氨基酸缺失或被取代的多肽，或一个或多个非特异的氨基酸加入的多肽：(1)不丢失本发明多肽特异的激酶活性；或(2)失去本发明多肽特异的激酶活性；或(3)丧失与细胞周期关卡通路的成员或调节剂相互作用的能力。
抗原决定簇可以通过如Geysen等，分子免疫学，23；709-715(1986)描述的多肽扫描技术之类的技术来决定。
本发明的多肽可处于基本上分离的形式。可以理解，可将多肽与不干扰其目的的载体或稀释剂混合而仍被认为是基本上游离的。本发明的多肽也可处于基本上纯化的形式，在此情况下通常包括其中多于90％，如95％，98％或99％的多肽是本发明的多肽的多肽制剂。本发明的多肽可以修饰，例如加入组氨酸残基以利于纯化或加入信号序列来增加其从细胞中分泌。
本发明的多肽可用可见的标记物标记。可见的标记物可为任何允许多肽被检测的适当标记物。适当的标记物包括放射性同位素，如125I，酶，抗体，多肽和连接物如生物素。本发明标记的多肽可用于诊断过程中如免疫试验来确定样品中本发明的多肽的量。本发明的多肽或标记的多肽还可用于血清学或细胞介导的免疫试验，用标准的方法检测动物和人类对所述多肽的免疫反应性。
本发明的多肽或标记的多肽或其片段也可固定于一固相，例如免疫试验孔的表面或量尺上。
这些标记的和/或固定化的多肽可于适当的容器中和适当的试剂，对照，说明书等一道包装成试剂盒。
这些多肽和试剂盒可用于通过免疫试验检测ATR蛋白或等位基因或其物种变异体的抗体方法中。
本领域熟知免疫学试验方法，通常包括：
(a)提供包括可被所述蛋白质的抗体结合的抗原决定簇的多肽；
(b)在允许形成抗原抗体复合物的条件下将生物样品与所述多肽
孵育；及
(c)测定是否形成了包含所述多肽的抗原抗体复合物。
本发明的多肽可通过如下所述的合成方法(如Geysen等所述)或重组获得。
本发明特别优选的多肽包括跨越或包含于脂激酶区的多肽，脂激酶区即序列号2中从2326到2644的氨基酸或基本上和其同源的序列。特别优选上文定义的源于此区的片段。这些多肽和片段可包含上文定义的氨基酸变更，包括和下文举例描述的rad3取代位置对应的位置2475，2480和2494中一个或多个取代。优选取代包括D2475A，N2480K和D2494E。
本发明的多肽可用于体内或体外细胞培养系统来研究ATR作为关卡基因的表现。例如，截短或修饰(如修饰脂激酶区)的ATRs可引入细胞以破坏细胞中发生的正常关卡功能。
本发明的多肽可通过重组表达载体(见下)原位表达多肽来引入细胞。表达载体带有一任选的可诱导的启动子来控制多肽的表达。
期望应用哺乳动物宿主细胞株提供翻译后修饰(例如，十四烷基化，糖基化，截断，Lapidation及酪氨酸，丝氨酸或苏氨酸的磷酸化)，这可能是本发明的重组表达产物获得最适的生物活性所需要的。
表达本发明多肽的细胞培养系统可用于识别细胞中干扰或增强关卡功能的候选物质的试验系统中(见下)。
另一方面，本发明的多肽包括序列号4的蛋白及其来自除包括氨基酸713至1778片段外其它区的片段。尤其优选包括残基2082至2386(脂激酶区)和亮氨酸拉链区298至347及576至591的片段。另外，优选包括保守区1103至1111的片段。这些多肽和片段可通过上述方法制备和使用。
本发明还提供了与序列号4的蛋白及其片段基本上同源的多肽。在此，基本上同源代表多于30个氨基酸的，除脂激酶区和C-末端部分(残基2082至2386)外，至少70％，如80％或90％的氨基酸与序列号4蛋白序列同源(相同)的序列，而在脂激酶区和C-末端部分基本上同源表示多于50个氨基酸的，至少80％，优选至少90％同源(相同)。C. 载体
本发明的多肽可插入重组的可复制的载体中。可用载体在相容的宿主细胞中复制核酸。因此，在更进一步的方案中，本发明提供了通过将本发明的多肽引入可复制的载体，将载体引入相容的宿主细胞，使宿主细胞在能使载体复制的条件下生长来制备本发明的多肽的方法。载体可由宿主细胞回收。以下描述了适当的宿主细胞其表达载体。D. 表达载体
载体中本发明的多肽优选可行地连于控制区，宿主细胞能提供其编码区的表达，即，载体为一表达载体。
术语“可行地连接”是指一个邻近位置，其中所述组分处于能行使其预期功能的关系。“可行地连接”于编码序列的控制序列的这种连接使编码序列在与控制序列相容的条件下得以表达。
这些载体可如上述转入合适的宿主细胞来提供本发明多肽的表达。因此，本发明进一步提供了一种按照本发明制备多肽的方法，包括在提供编码多肽的编码序列的载体表达的条件下，培育如上述以表达载体转染或转化的宿主细胞及回收表达多肽。
载体可以是，例如，具有复制起点的质粒，病毒或噬菌体载体，任选地表达所述多肽所需启动子，或启动子的调节子。载体可包括一个或多个可选择的标记基因，如细菌质粒的抗氨苄青霉素基因或哺乳动物载体的抗新霉素基因。载体可体外使用，例如用来产生RNA或用于转化或转染宿主细胞。载体也可适用于体内，例如在基因治疗的方法中。
本发明进一步的方案提供了以载体转化或转染的用于复制和表达本发明多肽的宿主细胞。选择与所述载体相容的细胞，可以是如细菌的，酵母，昆虫，或哺乳动物的。
本发明的多肽也可以反义的方式插入载体中，以提供产生反义RNA。反义RNA或其它反义寡核苷酸还可以合成方法获得。这些反义寡核苷酸可用于控制ATR或其变种或种同系物水平的方法中。
选择启动子和其它表达调控信号与宿主细胞相容，表达载体为宿主细胞设计。例如，酵母启动子包括啤酒酵母GAL4及ADH启动子，粟酒裂殖酵母和adh启动子。哺乳启动子包括metallothionein启动子，后者涉及对重金属如，镉的应答。病毒启动子如SV40大T抗原启动子或腺病毒启动子也可使用。所有这些启动子在本领域均易得。E. 抗体
本发明亦提供本发明多肽或其片段的单克隆或多克隆抗体。本发明进一步提供产生本发明多肽的单克隆或多克隆抗体的方法。单克隆抗体可用本发明的多肽或其肽片段作为免疫原通过传统的杂交瘤技术制备。多克隆抗体也可通过传统的方法制备，包括以本发明的多肽或其肽片段接种一个宿主动物，例如大鼠或兔，回收免疫血清。
为了制备这些抗体，本发明还提供了将本发明的多肽或其片段半抗原化于另一个多肽，在动物或人体中用作免疫原。
本发明优选的抗体能够选择性地结合于人ATR蛋白，即具有至少10倍，优选至少100倍于rad3蛋白亲合力。该抗体可通过常规方法获得，如，选择与rad3蛋白相应区序列不同的ATR蛋白区，制备包含这些序列的肽，以这些肽为免疫原。抗体产生后，测定所述抗体的结合。本发明优选能够选择性结合于人类ATR蛋白脂激酶区(如上定义)的抗体。另外，能够以相似地亲合力结合于人和酵母(粟酒裂殖酵母)脂激酶区，而不与ATM家族蛋白区结合的抗体形成本发明的另一方面。这些抗体可由来自脂激酶区的肽获得，这些区在酵母和人类基因中发现完全相同或基本上相同。
鉴于本发明的目的，术语“抗体”，除非特殊声明，包括保留了与肿瘤靶抗原结合活性的整个抗体片段。这些片段包括，Fv，F(ab′)和F(ab′)2片段，及单链抗体。而且，抗体及其片段可为人源化的抗体，如，EP-A-239400所述。
抗体可用于检测生物样品中本发明的多肽的存在，所用方法包括：
(a)提供本发明的抗体；
(b)将所述抗体和生物样品在能形成抗原-抗体复合物的条件下
孵育；并
(c)检测是否形成包含所述抗体的抗原-抗体复合物。
适合样品包括分离细胞的提取物，例如淋巴细胞或包括白血病细胞和成形肿瘤如乳腺，卵巢，肺，结肠，胰腺，睾丸，肝，脑，肌肉和骨骼肿瘤的肿瘤细胞。
本发明的抗体可结合于固相支持物并/或和适合的试剂，对照，说明书等在适当的容器中包装成试剂盒。F. 试验。
取消细胞周期关卡是可用于发展和设计抗肿瘤治疗的药物的潜在策略，可以做为新的治疗方法或联合治疗的一部分以提高现有化疗药物的特异毒性。例如如氮芥的烷化剂可用作化疗药物破坏快速分裂细胞中的DNA，引起细胞死亡。这类药物的毒性可被DNA修复和关卡机制减弱。取消此类机制增强设计用于破坏DNA的治疗化合物的效果。由于其他基因可在非肿瘤细胞中弥补ATR功能的缺失，取消ATR关卡将对失去其他关卡或破坏反应基因的肿瘤细胞特别有用，导致化疗药物效果大更大增强。
ATR的脂激酶活性是抗肿瘤化合物的靶点，因为下面例子中的结果提示ATR功能需要激酶区。本发明提供的筛选用于抗肿瘤治疗的候选化合物的试验方法包括：
(a)提供具有激酶活性的本发明的多肽和所述激酶的底物，在试
剂存在和某种条件下激酶活性可作用于底物；
(b)将所述底物和多肽于候选物质接触；
(c)测量多肽激酶活性的降低程度；并
(d)选择能使活性降低的活性物质。
试验可在体外进行，例如在微量盘的孔中。这样的形式适合自动化、允许筛选大量的候选物质。
底物可以是蛋白或天然脂底物或本发明的多肽可作用的合成的起点。通常本发明的多肽将磷酸化底物。
本领域技术熟练人员可通过任何合适的试验形式完成试验。通常，具有脂激酶活性的本发明的多肽在底物及活性所需的细胞和其它组分的存在下结合于固体物上。标记的磷酸酯和候选底物同时或以任一顺序依次加入混合物中。适当的反应时间后(通常几分钟，但无候选底物的任何情况下，应足够底物发生磷酸化)，通过如沉淀磷酸酯，测定游离的磷酸酯的量。抑制激酶活性的候选底物将抑制游离的磷酸酯插入底物，因此，发现游离磷酸酯的地方表明有抑制。
本领域技术熟练人员还可用其它试验方式。
候选底物可用于每个反应10个化合物的批量初筛，然后将这些批中显示抑制的化合物单独测试。
合适的候选底物包括基于激酶区序列的肽，尤其5到20个氨基酸大小，或其中一个或多个残基被如上所述取代的这些肽的变种。也可使用来自包括任意序列的肽或序列发生了一致改变以产生最大不同的肽。进一步的候选底物包括小分子的激酶抑制剂如cyclosporin样和staurosporin样化合物，或其它可买到的小分子抑制剂。
如上所述体外筛选有活性的候选底物可再在体内系统中测试，如酵母或哺乳细胞，将其暴露于抑制剂，测定关卡活性。
我们还显示了Rad3具有蛋白激酶活性。Rad3蛋白激酶活性的靶底物可通过将测试化合物插入激酶活性试验中确定。Rad3蛋白再悬浮于激酶缓冲液中，在测试化合物(如酪蛋白，组蛋白H1，或适当的底物蛋白)在或不存在下培育。激酶转化给测试化合物的磷酸酯的摩尔数通过放射自显影或闪烁计数测得。磷酸酯转化酯测试化合物表明所测试的化合物为激酶底物。
调节Rad3/ATR脂激酶活性或Rad3蛋白激酶活性的试剂可以确认如下，将待测化合物和天然表达Rad3/ATR的细胞免疫纯化得到的Rad3/ATR一起孵育，和表达该酶的重组原核或真核细胞重获得的Rad3/ATR一起孵育，或和纯化的Rad3/ATR一起孵育，然后决定所测化合物对Rad3/ATR活性的效果。Rad3/ATR脂激酶活性或Rad3蛋白激酶活性区可以通过测定激酶从γ-32P-ATP到其自身(自身磷酸化)或到如脂或蛋白之类的外源底物转移的32P-磷酸摩尔数来测量。掺入底物的磷酸量可用放射自显影或闪烁计数来测量。有测试化合物存在情况下转移到底物的磷酸摩尔数比无测试化合物存在情况下转移到底物的磷酸摩尔数增加表明测试化合物是所述激酶活性的激活剂。相反，有测试化合物存在情况下转移到底物的磷酸摩尔数比无测试化合物存在情况下转移到底物的磷酸摩尔数减少表明调节物是所述激酶活性的抑制剂。
在现在的优选试验中，连于琼脂珠的Rad3/ATR抗体和来自表达Rad3/ATR的宿主细胞的细胞裂解液一起孵育。从琼脂珠洗去非特异结合到珠上的蛋白并将珠重悬于激酶缓冲液(如25mM K-HEPES pH 7.7，50mM氯化钾，10mM氯化镁，0.1％NP-40，20％甘油，1mMDTT)。加入100μM γ-32P-ATP(4Ci/mM)和如脂或肽的外源底物开始反应，反应在30℃进行10分钟。通过测量转移到激酶自身或外加底物的32P-磷酸摩尔数来测定激酶的活性。在优选方案中宿主细胞缺乏内源的Rad3/ATR激酶活性。化合物调节Rad3/ATR脂激酶活性的选择性可通过比较其对Rad3/ATR活性和对，例如，其他已知磷脂酰肌醇-3(PI-3)-相关激酶的活性来评价。本发明的重组Rad3/ATR产物合其他重组PI-3-相关激酶产物在一系列独立试验中的结合提供了发展Rad3/ATR激酶活性选择性调节剂的系统。类似的，化合物调节Rad3的蛋白激酶活性的选择性可通过参考其他蛋白激酶，例如DNA依赖的蛋白激酶或ATM来决定。
另外，rad突变rad.D2249E(见实施例)可作为显性负性突变的显示提示一个或多个都能复合物的介入，此复合物本身可为治疗性介入所定靶。我们已显示，例如，Rad3可自我配对或和ATR配对。因此可能rad/ATR作为多聚分子起作用。突变酵母rad或人类ATR基因，或其也缺乏rad/ATR活性的衍生物可导入细胞作为显性负性突变。例如如果在肿瘤细胞内表达显性负性突变(例如ATR D2475A，N2480K或D2494E)导致辐射敏感性增加，这表明自身ATR仍起作用并可作为治疗药物的靶点。
包括涉及Rad3或ATR的多聚蛋白复合物的组分的相互作用蛋白可用以下试验分辨。
本发明第一个考虑的试验是双杂交筛选。双杂交系统源自酵母(Chien等(1991))基于激活报告基因的转录因子在体外的功能重构建。特别是，编码与Rad3/ATR相互作用蛋白的寡核苷酸可通过以下分离：用包含报告基因的DNA构建物转化或转染适合宿主细胞，该报告基因在受含一DNA结合区和一激活区的转录因子调节的启动子控制下；在宿主细胞中表达编码部分或全部Rad3/ATR和转录因子的激活区或结合区第一融合物的第一DNA杂交序列；在宿主细胞中表达编码部分或全部假定的Rad3/ATR结合蛋白和未包含在第一融合物的转录因子的结合区或激活区的第二融合物的第二杂交DNA序列文库；通过检测宿主细胞中报告基因产物的产生来检测Rad3/ATR作用蛋白和Rad3/ATR在特殊宿主细胞中的结合。目前优选用于试验的是lexA启动子来使报告基因表达，lacZ报告基因，包含lexA DNA结合区合GAL4激活区的转录因子，酵母宿主细胞。
确认和Rad3或ATR相互作用蛋白的其他方法可涉及固定Rad3/ATR或受试蛋白，可检测地标记非固定的结合配偶体，一起孵育结合配偶体并检测标记结合的量。结合标记表明受试蛋白和Rad3/ATR相互作用。
另一种确认和Rad3或ATR相互作用蛋白的方法涉及固定Rad3/ATR或其片段于一包被(或充满)荧光试剂的固体支持物上，用能激活荧光试剂的化合物标记受试蛋白，使固定的Rad3/ATR和受试蛋白接触，检测荧光试剂的发光，将导致荧光试剂发光的受试蛋白确定为相互作用蛋白。或者试验中可固定假定相互作用的蛋白而标记Rad3/ATR。
调节Rad3/ATR和其它细胞组分相互作用的化合物可用于治疗癌症的方法中。例如，若由非ATR基因，如P53突变导致的特异形式的肿瘤，可用抑制转录或ATR酶活性，并因而抑制G2细胞周期关卡的试剂使癌症细胞对放疗或化疗更敏感。这种试剂治疗的价值在于以下事实，多数情况下现有的放疗或化疗不能克服p53突变癌细胞的觉察并纠正治疗所导致的DNA损伤的能力。结果，肿瘤细胞能轻易地修复DNA损伤。因此本发明的调节试剂可作为放疗和化疗的辅助或本身直接作为化疗药物。
确认调节Rad3/ATR和其他蛋白相互作用的化合物的试验可涉及：用包含报告基因的DNA构建物转化或转染适合宿主细胞，该报告基因在受含一DNA结合区和一激活区的转录因子调节的启动子控制下；在宿主细胞中表达编码部分或全部Rad3/ATR和转录因子的激活区或结合区第一融合物的第一DNA杂交序列；在宿主细胞中表达编码部分或全部和Rad3/ATR相互作用的蛋白和未包含在第一融合物的转录因子的结合区或激活区的第二融合物的第二杂交DNA序列文库；通过检测宿主细胞中报告基因产物在受试化合物存在或不存在时的产生来检测相互作用蛋白和Rad3/ATR在特殊宿主细胞中的结合，以此评价受试化合物对Rad3/ATR和相互作用蛋白间相互作用的效果；并通过比较在无调节化合物存在时报告基因产物的产量和受试化合物对报告基因产物的产量的改变来辨别调节化合物。目前优选用于试验的是促使报告基因表达的lexA启动子，lacZ报告基因，包含lexA DNA结合区和GAL4激活区的转录因子，及酵母宿主细胞。
确认调节Rad3/ATR和涉及固定Rad3/ATR或天然Rad3/ATR相互作用蛋白间的相互作用的化合物的另一类试验，可检测地标记非固定结合配偶体，一起孵育结合配偶体并测定受试化合物对标记结合量的影响，其中有受试化合物存在时标记结合比无受试化合物存在标记结合量少提示受试试剂是Rad3/ATR和蛋白相互作用的抑制剂。相反，有受试化合物存在时标记结合比无受试化合物存在标记结合量多提示候选调节剂是Rad3/ATR和蛋白相互作用的激活剂。
本发明考虑的确认调节Rad3/ATR和相互作用蛋白结合的化合物的另一方法涉及将Rad3/ATR或其片段固定于包被(或充满)荧光剂的固相支持物上，用能够激活荧光剂的化合物标记相互作用蛋白，通过比较无受试化合物存在时荧光剂发出的荧光确认调节化合物为影响荧光剂发光的受试化合物。或者，试验中固定Rad3/ATR相互作用蛋白并标记Rad3/ATR。
我们已显示Rad3和ATR相互作用。因此以上提到的试验也可用于确认调节Rad3和ATR相互作用的化合物，其中试验方法中描述的相互作用蛋白可以是Rad3或ATR。
我们也已显示了Rad3可结合自身，强烈提示ATR也可结合自身。因此以上提到的试验也可用于确认调节Rad3-Rad3相互作用和ATR-ATR相互作用的化合物。
此化合物可治疗性用于扰乱ATR-ATR相互作用并增加肿瘤细胞对化疗和/或放疗的敏感性。本发明提供筛选抗肿瘤候选物的试验方法包括：
(a)(1)将本发明的多肽和与第一多肽相同或不同的本发明另一
多肽在允许第一多肽结合第二多肽形成复合物的条件下
一起孵育；
(2)将形成的复合物和候选物接触；或
(a)将本发明的多肽和与第一多肽相同或不同的本发明另一多肽
在允许第一多肽结合第二多肽形成复合物并存在候选物的条
件下一起孵育；并
(b)测定是否候选物抑制第一多肽和第二多肽的结合并
(c)选择抑制第一多肽和第二多肽的结合的候选物。
优选第一和第二多肽能彼此分辨。例如第一多肽和第二多肽都是ATR，或都是Rad3，或一个是ATR且一个是Rad3或有结合活性的ATR或Rad3的衍生物。当两个多肽都是ATR或Rad3时，优选两个可分辨的ATR/Rad3形式用于这些试验。它们可以通过，例如，标记任一多肽来分辨。标记物的例子包括放射性标记物，抗原决定簇标记，或其它多肽标记物如谷氨酸-S-转移酶。例如，一种形式的Rad3有一种形式的抗原决定簇，另一种形式有不同的抗原决定簇，使其能被免疫学分辨，如一个结合到另一个可被定性或定量的确定。在优选的方法中第一多肽可被固定到例如琼脂珠或固相支持物上，第二多肽可在游离溶液中。结合即可用上文描述的熟练人员熟知的方法测定。
本发明也考虑抗体产物(例如，单克隆和多克隆抗体，单链抗体，融合抗体，CDR-移植抗体等等)和对Rad3蛋白激酶区或Rad3/ATR脂激酶区特异的其它结合蛋白(如以上试验确认的)。结合蛋白可用分离得到的天然或重组酶发展。结合蛋白，反过来，用于纯化重组和天然产生的酶并确认产生这些酶的细胞。细胞或液体中蛋白的检测和定量试验涉及单一的抗体或以“三文治”试验形式的多个抗体物质。结合蛋白也可明显用于调节(即，阻断，抑制，刺激)酶/底物或酶/调节剂的相互作用。
Rad3/ATR的调节剂可影响其激酶活性，其细胞内定位，和/或其与细胞周期关卡途径中成员相互作用。选择性调节剂可包括，例如，多肽或特异结合Rad3/ATR或Rad3/ATR核酸的肽，和/或其它特异作用于Rad3/ATR或Rad3/ATR核酸的非肽化合物(例如，分离或合成的有机分子)。本发明也考虑影响酶活性或野生型Rad3/ATR细胞内定位的Rad3/ATR突变形式。
进一步，重组库，肽和肽类似物，精选的化学物质，寡核苷酸，和天然产物库可用上文描述的试验用来筛选Rad3/ATR激酶活性和Rad3/ATR相互作用的调节剂。F. 治疗应用
Rad3/ATR活性调节剂，包括其脂激酶和蛋白激酶活性抑制剂，可用于抗癌治疗。特别是，它们可以通过扰乱Rad3/ATR的细胞周期调节功能增加癌细胞对化疗和/或放疗的敏感性。
本发明提供通过上文描述的筛选试验分离得到调节Rad3/ATR活性的化合物可用于癌症治疗的方法。在一个实施方案中，所述化合物能抑制Rad3/ATR脂激酶和/或Rad3蛋白激酶活性。在另一实施方案中，所述化合物能抑制ATR与其自身间和/或与，例如，其它可正常形成多聚蛋白复合物的相互作用蛋白间的相互作用。
应当理解本文所称“化合物”也指以上描述试验中所选的候选物。
化合物一般通过将其与可药用的载体或稀释剂混合配制成临床制剂。例如，它们可被配制成局部的，胃肠道外的，静脉内的，肌肉内的，皮下的，眼内的或透皮的制剂。优选，化合物以可注射形式应用。由于使治疗效果能集中于受累组织水平，直接注射入病人肿瘤是更有利的。因此它可合任何注射剂可药用的载体混合，优选直接注射于待治疗部位。药用载体或稀释剂可以是，例如，无菌或等渗溶液。
化合物使用的剂量可根据不同参数调整，特别根据所用化合物，年龄，体重和受治病人情况，所用给药形式，肿瘤病理和所需临床安排。推荐，注射给药的化合物量从0.01mg/kg到30mg/kg是适合的，优选从0.1mg/kg到10mg/kg。
所描述的给药途径和剂量仅作为推荐考虑，因为熟练的操作者能依据任何特异的病人和情况决定最优给药途径和剂量。
给药化合物可包括多肽和核酸。核酸可编码多肽或可编码抑制细胞基因表达的反义构建物。核酸可通过，例如，脂质体转染或病毒载体给药。例如核酸可形成病毒载体如腺病毒的一部分。用病毒载体时，通常给药剂量在104-1014 pfu/ml间，优选106-10104 pfu/ml。术语pfu(“空斑形成单位”)对应于病毒溶液的感染力，通过感染适当的细胞培养液测得，通常在感染48小时后测定感染细胞的空斑数目得到。文献中详细阐明了测定病毒溶液的pfu滴度的技术。
任何癌症形式都可用这些方法治疗，例如白血病，和成体瘤如乳腺，卵巢，肺，结肠，胰腺，睾丸，肝，脑，肌肉和骨骼肿瘤。优选，肿瘤具有正常的ATR功能。
附图简述图1
ATR，rad3，mei-41，MEC1，TEL1及ATM间的关系
A.ATR，rad3，mei-41，Mec1p，Tel1p及ATM的全结构
标志：开放区-Rad3区；划出的框-激酶区
B.基于用DNA星软件通过Clustal方法(PAM250)产生的序列排列图。rad3/ESR1/mei-41/ATR彼此间比与ATR和TEL1更近地关联。在EMBL数据库中有rad3和ATM序列。
以下实施例论证了本发明。
实施例1
粟酒裂殖酵母的rad3基因是粟酒裂殖酵母中DNA结构关卡绝对必须的六个基因之一(Al-Khodairy和Carr，1992；；Al-Khodairy等，1994)。Seaton等(1992)报导了代表部分rad3基因的一个序列。为试图阐明这个基因的内含子/外显子结构，我们确认了5′和3′末端的序列反常。我们曾对整个基因测序(见试验步骤)发现rad3能编码一个2386个氨基酸的产物。C末端区包括激酶的亚类，称做脂激酶的典型的一致序列，其构建成员为PI3激酶的p110催化亚单位(Hiles等，1992)。
已有关于缺少氨基末端和激酶区的截断的rad3克隆报导补充了rad3∷pR3H1.0基因损害的rad3突变体(Jmenez等，1992)。这一损害的突变体并未除去激酶区。为阐明该区的作用，通过基因取代，我们制备了一个缺失突变体。该突变体具有rad3的1477-2271氨基酸，包括激酶区为ura4+取代。这一菌株，rad3.d.与rad3.136突变体(Nasim和Smith，1975)及原始的rad3∷pR3H1.0损害突变体(Jmenez等，1992；Seaton等1992)具有相同的关卡缺陷和射线/羟基脲敏感性(未显示数据)。我们在假定的rad3激酶区制造了三个独立的点突变，用于基因取代试验中来构建具有确定激酶缺失突变的菌株。所有三个菌株，rad3.D2230A，rad3.N2235K或rad3.D2249E均具有与rad3.d缺失突变体相同的基因型(未显示数据)，提示激酶活性为Rad3功能所必须。鉴于我们的发现，Seaton等(1992)和Jmenez等(1992)的结果的一个解释为部分克隆可显示质粒产生的截枝基因和保留激酶功能的基因组的部分缺失间的基因内的互补作用。这样的解释与rad3作为二聚体或多聚体作用一致。
当激酶缺失的变异株rad3.D2249E在野生型细胞中，在修饰的nmtI启动子的控制下中等程度过度表达时(Maundrell，1990)，通过紫外研磨(UV strip)测试试验表明，造成对射线的极度敏感性，成为显性等位基因阴性的突变体(未显示数据)。同一激酶缺失的构建物高水平表达时，抑制生长(未显示数据)。检查细胞表明分化很慢地继续，更小的细胞中，野生型细胞和含空载体以约15微粒的速率分化，而rad3和rad3.D2249E过度表达细胞约12微粒分化(未显示数据)。粟酒裂殖酵母中，这确实表明有丝分裂的推进。人类rad3同源物，ATR
为确认人类rad3的形式，结合应用了一系列方法。通过这些方法，我们克隆了人类整个基因的编码区(见材料与方法)，将其定义为ATR()。ATR能够编码一个2644个氨基酸的蛋白，后者与粟酒裂殖酵母的产物rad3，酿酒酵母菌ESR1(Kato和Ogawa，1994)及D. melanogastermei-41基因(Hari等，1995)的相关比与人类ATM和酿酒酵母菌Tell蛋白(Savitsky等，1995；Greenwell等1995)更近，似乎是rad3真正的同源物。ESR1与mec1/sad3关卡突变体等位(Allen等1994；Weinert等1994)，后者具有与rad3价的基因型。ATR与包含C末端假定的脂激酶活性区和具有类似的全结构的人类关卡基因ATM相关较少。序列排列明显表明rad3/ESR1(mec1/sad3)/mei-41/ATR基因间彼此相关比对ATM或TEL1更近，ATM与TEL1更同源(图1)。
ATM基因在许多组织中表达(Savitsky等，1995)。酿酒酵母中，ESR1在有丝分裂细胞中低水平表达，但在减数分裂I期迅速诱导(Kato和Ogawa，1994)。利用Northern印迹分析，我们论证了ATR在多数组织中亦微弱表达，但在睾丸中高度表达(未显示数据)。考虑到ATR，Rad3和Esr1p蛋白彼此间比与ATM间更相关，在睾丸中ATR较高水平的表达与观察到的Esr1p对减数分裂重组有作用一致(Kato和Ogawa，1994)。利用FISH及PCR分析，我们定位ATR于染色体3q22-3q25(未显示数据)。这一区与已知的肿瘤预兆症状无关。
为进一步研究Rad3作为多聚体的可能性，我们建造了存在于基于pREP的可诱导载体中的两个独立全长rad3的标记构建物。其中一个中，Rad3的N末端转译入两个myc抗原决定簇，而另一个中，以三链的HA抗原决定簇标签取代之。在野生型细胞中同时表达两个构建物时，有可能将HA标记的Rad3与myc特异的抗体同时沉淀，及将myc标记的Rad3与HA特异的抗体同时沉淀(未显示数据)。这表明体内Rad3蛋白能够自身相连，与Jimenez等(1992)的补充数据完全一致。
尽管ATR基因不能与rad3突变体的基因型互补，我们通过在同样的酵母细胞中表达ATR和myc-标记的粟酒裂殖酵母Rad3以研究ATR与粟酒裂殖酵母Rad3形成蛋白复合物的可能性。利用抗ATR抗体(它不沉淀粟酒裂殖酵母Rad3，见材料与方法)我们能够共沉淀酵母蛋白。我们还能用识别粟酒裂殖酵母Rad3的myc特异抗体沉淀人类ATR蛋白(未显示数据)。这些数据表明人和酵母的蛋白可形成异体复合物，后者支持基于序列相似性，这些同源物间相近的功能关系之论点。Rad3蛋白具有相关的激酶活性
既然致突变试验表明体内Rad3蛋白的激酶活性对其功能似乎是必须的，我们进一步研究了这一活性。用表达HA标记的粟酒裂殖酵母Rad3的粟酒裂殖酵母Rad3∷ura4细胞，我们能够检测到显著的蛋白激酶活性，后者仅在Rad3被诱导时与HA特异的抗体沉淀，而照射后不改变(未显示数据)。这种Rad3或共沉淀激酶特异的活性，似乎反映了rad3本身的磷酸化，因为磷酸化的大于200kD的主要带可用抗HA抗体通过Western分析检测到(未显示数据)。目前试图体外确认如髓磷脂基蛋白，RP-A和一些纯化的粟酒裂殖酵母关卡蛋白等方便底物还未成功。用过度表达“激酶缺失”的Rad3 D2249E的细胞进行体外IP的激酶试验时，被HA特异抗体沉淀的相关激酶活性显著降低(未显示数据)。对此有许多可能的解释。测出的激酶活性可直接反映rad3活性。在此情况下死性Rad3激酶残存活性能反映以下事实，已知在其它蛋白激酶中等价的D到E的突变可产生有体外残存生化活性的生物学惰性蛋白。另外磷酸化Rad3的激酶活性可能取决于相关蛋白，这些蛋白可能与D2249E突变蛋白相互作用不太有效。讨论
DNA损伤或组成周期的某个事件被干扰后，调控细胞周期进程的关卡通路在维持基因稳定性中具有相当的重要性，可认为是抑制肿瘤发生的途径。许多肿瘤抑制剂基因最初参与了关卡通路分支(Hartwell和Kastan综述，1994)，尤其是G1向S期的转化，调控细胞周期。两个关卡酵母模型系统的会聚明显提示参与这些通路的基因是保守的。我们的工作将该保守性扩展至后生动物细胞，阐明了rad3/ESR1(mec1/sad3)/mei-41和ATR基因间的关系。
本发明证明rad3基因的正确序列将其产物跻身于ATM蛋白质/脂激酶的家族中。在S.pombe中激酶缺陷型rad3突变体的过量表达造成占优势的阴性表型，这一事实提示Rad3作为其完整性为关卡功能所必需的蛋白质复合物的成员。这与rad1 rad3，rad9，rad17，rad26和husl缺失突变体均有不同于rad3：d的表型的观察结果相一致(Sheldrick和Carr，1993)，出乎意料的是，不同于其他关卡rad基因，野生型或突变体rad3等位基因的高水平过量表达抑制细胞生长，引起有丝分裂在减小的细胞尺寸下发生，表明早熟进入有丝分裂。在无表面标志突变体中未观察到这种“semi wee”表型，可能提示在其功能与Rad3重叠的第二途径中的干扰并且起到抑制有丝分裂的作用。这一途径中的一个候选者是ATM/TEL 1途径，其表明与ESR1(MEC1/SAP1)途径具有某些重叠功能(Morrow等1995)。
ATM结构最密切地与Tellp相关，后者参予了保持端粒长度(Greenwell等，1995)。然而，ATM功能看来与Rad3/Esr1p/mei-41产物相关。在最初发现ATM基因和其序列与rad3/Esr1基因和与TEL1基因的关系之后，并不清楚基因在酵母中是重复的和多样化的，还是这两种酵母蛋白质局限于密切相关基因的保守的亚群，正如酵母中的许多情形。本工作的有意义的发现是鉴定了一种人基因ATR，其与rad3/ESR1/mei-41更密切相关。这一工作定义了在整个真核生物进化中保守的蛋白/脂激酶的两个结构不同的关卡相关亚群。虽然这两个亚群的蛋白质可能具有重叠的功能，它们可能控制不同的进程。例如，在酵母中，rad3亚群控制所有应答紫外和离子化放射损伤的G1和G2 DNA损伤关卡，和阻断复制抑制之后有丝分裂的S期关卡(AL-Khodairy和Carr，1992；Allen等，1994；Weinert等，1994)。相反，A-T细胞对于少数几个DNA损伤剂有不正常应答，包括离子化辐射，博莱霉素和neocarzinostatin，其产生了作为基团攻击的结果的DNA链损伤对于紫外线和多数化学致癌剂的应答是正常的，正如对DNA合成抑制的应答。很可能一些或所有余留的DNA损伤关卡或S期关卡为ATR所控制。试验步骤菌株，质粒及介质
Gutz等(1974)描述了对于粟酒裂殖酵母标准的基因技术，生长条件及介质。粟酒裂殖酵母菌株sp011(ura4.D18，leu.32 ade6.704h)亦已被描述(Murray等1992)。质粒pSUB41由S.Subtamani(Seaton等1992)赠送。粟酒裂殖酵母rad3的克隆
从pSUB41中切出4.0kb的Kpn1片段，双向测序得到5′rad3序列。利用从公开的rad3序列得到的1kb的3′探针进行克隆杂交将3’克隆由基因文库(Barbet等1992)中确认，并双向测序。通过这种方法，组装起了整个rad3基因的序列。无及“激酶死性”rad3突变体
用Barbet等所述方法(1992)制备了氨基酸1477至2271间的794个氨基酸(包括激酶区)为ura4+基因取代的rad3的构建物。用其线性片段将sp011转化成尿嘧啶原养型，并以Southern印迹检查rad3位置上的单拷贝整合。为产生这样位点特异的激酶缺失突变，用任一序列(A：GTTTTCGCCATGGCGCGCTCCCAAACCCAA，B：TTCATCAAACAATATCTTTTCGCCATGGCG，或C：CAAAAAGACAGTTGAATTCGACATGGATAG)突变rad3的3.01kbBamHI-alI片段从而将D2230A，N2235K或D2249E引入激酶区。过去曾将类似的改变用于酿酒菌的PI3激酶VPS34分析中(chu等，1993)。再用这些片段转化rad3缺失突变体，根据在含FOA介质上的生长能力选择基因取代(Grimm等1988)。所有菌株以Southern印迹检查。rad3D2230A，构建物的全长表达在pREP1和pREP41(Maundrell，1990)中ATG上引入NdeI位点和三个内在的NdeI位点缺失后通过标准的亚克隆产生。UV照射敏感strip试验
在pREP1(高)和pREP41(中等)中的表达由平板接种前硫胺缺乏18小时诱导。根据Stratagene Stratalinker之方法，以梯度的紫外剂量，从0到300jm-2自平皿下照射平皿。ATR的克隆和表达
为分离用于确认相应于人类rad3同系物的cDNA的探针，设计针对Rad3/Esr1p的氨基酸LGLGDRH(5′寡核苷酸；oDH18)及HVDF[D/N](3′寡核苷酸；oDH-16)的简并寡核苷酸。次黄嘌呤插入在4倍简并的位置，引物加以BamHI(oDH18)和EcoRI(oDH16)的尾以便于克隆。得自外周血白细胞cDNA扩增的约100kbPCR产物DNA序列分析证明与MECI/rad3显著类似。该序列用于合成PCR的未简并引物(oDH-23；GACGCAGAATTCACCAGTCAAAGAATCAAAGAG)，另一个简并引物针对Rad3/Esr1p的氨基酸序列KFPP[I/V][L/F]Y[Q/E]WF设计。这一反应的174bp产物直接用于筛选巨嗜细胞的qDNA文库。分离到了四个阳性克隆(最大的约3kb)。
平行的，如果233bp的序列中允许单一的移码，用来自人cDNA克隆EMBL数据的全长粟酒裂殖酵母rad3查找数据HSAAADPDG作为潜在的rad3同源物。此233bp的序列包含在一个1.6kb的克隆内，该克隆获自Dr.N.Affara，人类分子遗传研究组，剑桥大学，英国。整个克隆(1.6kb)已被测序并位于通过简并PCR和筛选文库获得的cDNA克隆内。为鉴别整个基因，对来自胎盘和胸腺mRNA的cDNA按照ClontechMarathon试剂盒的说明书进行RACE PCR实验。基因特异引物源自cDNA克隆。通过这些实验，具有内部2644氨基酸开放读码框架的8239bpcDNA序列得以组建，79bp 5′非编码区，194bp 3′非编码区和一聚腺苷酸尾。部分序列仅通过PCR确认。为避免错误，至少3个PCR反应来源的克隆进行了双向测序。
除去6942位的单个碱基缺失，233bp序列对应于序列号No.1的6809到7042(共234核苷酸)核苷酸序列。此序列编码序列号No.2的2244到2320氨基酸。
“1.6kb”插入序列对应于序列号No.1的5725到7104(1353核苷酸)苷酸，并编码序列号No.2的1892到2340氨基酸。
Northern印迹杂交：一个1.3kb的PCR产物用引物279-3(TGGATGATGACAGCTGTGTC)和279-6(TGTAGTCGCTGCTCAATGTC)在32P-dCTP存在时被扩增。用探针杂交含有2μg不同人类组织来源片段聚A+RNA(Clontech实验室)的尼龙膜，除最终清洗时为最小化与相关序列的杂交交连采用55℃而非50℃外均按生产者推荐实施。ATR定位
通过荧光原位杂位和基于聚合酶链式反应(PCR)测试的组合将ATR基因定于染色体3上。使用cDNA FISH分析将ATR基因定位于染色体3，大约q22-23位置。PCR分析亦将ATR定位于染色体3。能够扩增ATR基因的257bp片段的两个引物(oATR23：GACGCAGAATTCACCAGTCAAAGAATCAAAGAG和oATR26：TGGTTTCTGAGAACATTCCCTGA)被用于衍生自可从NIGMS人类遗传突变体细胞保藏中心得到的、含有不同人类染色体组的人/啮齿类杂种体细胞。用同样引物进行的PCR被用于将ATR亚定位于染色体3上具体的区域。用于这些扩增的模板由来自具有沿染色体3截断的病人的DNA样品组成。(Leach等，1994)。用Rad3进行免疫沉淀和激酶测试
S. pombe rad3和人ATR基因被克隆到pREP41表达载体以用于互补作用实验。为了标记蛋白质，这些含有阅读框内N末端标记序列的这些载体的版本，无论是双重mgc或三重HA标记均被采用(Griffiths等1995)。标记的蛋白通过在不含硫胺素的培养基中生长而表达(Maundrell，1990)酵母细胞在溶胞缓冲液(25mM Tris. Cl pH7.5，60mM B-磷酸甘油酯，0.1mM Na3VO4，1％Triton X-100，50mM NaCl，2mM EDTA，50mM NaF，1mM苯甲磺酰氯〔PMSF〕，5μg/ml leupeptin，5μg/ml aprotinin，1mM DTT)中溶胞，其步骤是加入玻璃珠后在破膜仪处理2分钟。为进行IP，300μg总蛋白提取物与适量抗体冰浴30分钟，通过与蛋白G玻璃珠混合，于4℃保温30分钟，沉淀免疫复合物。为进行激酶试验，将免疫复合物用溶胞缓冲液洗涤4次，用激酶缓冲液(25mM Hepes pH7.7；50mMKCl；10mM MgCl2；0.1％NP-40；2％甘油；1mM DTT)，并在激酶缓冲液中与10μM ATP〔50Ci/mmol〕于30℃温孵15分钟。在用6％聚丙烯酰胺凝胶分离之前，用20μl 2X SDS样品缓冲液中止反应。Rad3 IP含有几种磷酸化产物，包括一种在Western分析中与Rad3共迁移的产物。
参考文献
Al-Khodairy，F，.和Carr，A.M.(1992)，粟酒裂殖酵母中限定G2关卡途径的DNA修复突变体。EMBO杂志11，1343-1350。
Al-Khodairy，F，.Fotou，E.，Sheldrick，K. S.，Griffiths，D. J.F.，Lehmann，A. R.和Carr，A. M.(1994)，分裂酵母中参与关卡及反馈调控的新元件的识别和确认。分子生物学细胞5，147-160。
Allen，J. B.，Zhou，Z.，Siede，W.，Friedberg，E. C.和Elledge，S. J.(1994)SAD1/RAD53蛋白激酶调控多个关卡及酵母中DNA损伤诱导的转录。基因学方法8，2416-2428。
Barbet，N.C.，Muriel，W.J.，和Carr，A.M.(1992)用于粟酒裂殖酵母基因的通用的穿梭载体及基因组文库。基因114，59-66。
Beamish，H.和Lavin，M. F.(1994)共济失调-毛细管扩张中的放射敏感性：射线诱导的细胞周期延迟中的异常点。国际放射生物学杂志65，175-184。
Carr，A.M.和Hoeksura，M.F.(1995)，DNA损伤的细胞反应。细胞生物学趋势5，32-40。
Chien等(1991)美国国家科学院院刊88，9578-9582。
Deng，C.，Zhang，P.，Harper，J. W.，Elledge，S. J.和Leder，P. J.(1995)缺乏p21CIP1/WAF1的鼠正常发展，但缺乏G1关卡调控细胞(印刷中)。
Drwinga，H. L.，Tojia，L. H.，Kim，C. H.，Greene，A. E.，和Mulovor，R.A.(1993)。NIGMS人/啮齿动物体细胞杂交制图组1及2。基因学16：311-314。
El-Deiry，W. S.，Tokino，T.，Velculescu，V. E.，Levy，D.B.，Parson，R.，Trent，J. M.，Lin. D.，Mercer，W. E.，Kinzler，K. W.和Vogelstein，B.(1993)WFE1，p53肿瘤抑制作用的潜在媒介。细胞75，817-825。
Enoch，T.，Carr，A. M.和Nurse，P.(1992)，参与偶联有丝分裂与DNA复制完成的分裂酵母基因。基因学方法6，2035-2046。
Greenwell，P. W.，Kronmal，S. L.，Porter，S. E.，Gassenhuber，J.，Obermaier，B.和Petes，T. D.(1995)TEL1，参与调控酿酒酵母端粒长度的一个基因，与人ATM基因同源。细胞(已接受)。
Grimm，C.，Kholi，J. Murray，J. M.和Maundrell，K.(1988)粟酒裂殖酵母的基因工程：以ura4基因作为可选择性标记物进行基因破坏和取代的系统。分子基因遗传学215，81-86。
Gutz，H.，Heslot，H. Leupold，U.和Loprieno，N.(1974)。基因学手册，King，R. C.，编，Plenum出版社，纽约，Vol. 1，395-446。
Hari，K.L.，Santerre，A.，Sekelsky，J.J.，McKim，K.S.，Boyd，J.B.和Hawley，R.S.(1995)黑腹果蝇的mei-41基因与人类共济失调-毛细血管扩张功能上同源。
Harper，J.W.，Adami，G.，Wei，N.，Keyomarsi，K.和Elledge，S.J.(1993)与Cip1蛋白相互作用的21KD的Cdk是G1细胞素依赖的激酶的潜在抑制剂。细胞75，805-816。
Hartwell，L.H.，和Kastan，M.B.(1994)。细胞周期调控与肿瘤。科学266，1821-1828。
HILEs，I. D.，Otsu，M.，Volinia，S.，Fry，M. J.，Gout，L.，Dhand，R.，Panayotou，G.，Ruiz-Larrea，F.，Thompson，A.，Totty，N. F.，Hsuan，J. J.，Courtneidge，S. A.，Parker，P. J.和Waterfield M. D. (1992)磷脂酰肌醇3-激酶：结构及110Kd催化亚单位的表达。细胞70，419-429。
Jimenez，G.，Yucel，J.，Rowley，R.和Subramani S.(1992)rad3+基因参与多个关卡的功能及DNA修复。美国国家科学院院刊87，4952-4956。
Kato，R.和Ogawa，H.(1994)ESR1，一种必需基因，有丝分裂细胞生长，DNA修复及减数重组所必需。核酸研究22，3104-3112。
Lamb，J. R.，Petit-Frere，C.，Broughton，B. C.，Lehmann，A.R.和Green，M.H.L.(1989)离子射线对DNA复制的抑制由一反向作用因素介导。国际放射生物学杂志56，125-130。
Leach，R. J.，Chinn，R.，Reus，B. E.，Hayes，S.，Schantz，L.，Dubois，B.，Overhauser，J.，Ballabio，A.，Drabkin，H.，Lewis，B. T.，Mendgen，G.，和Naylor，S.L.(1994)188序列标记位点在人类染色体3的体细胞杂交制图簿上的区域定位。基因学24，549-556。
Maundrell，K.(1990)。分裂酵母的nmt1，一高度转录基因被硫胺完全抑制。生物化学杂志265，10857-10864。
Morrow，D. M.，Tagle，D. A.，Shiloh，Y.，Collins F. S.和Hieter，P.(1995)HAT1/TEL1，一酿酒酵母的人类突变基因同源物，功能上与酵母关卡基因MEC1/ESR1相关。细胞(已接受)。
Murray，J. M.，Doe，C. Schenk，P. Carr，A. M.，Lehmann，A.R.和Watts，F.Z.(1992)粟酒裂殖酵母rad15基因的克隆和确认，酿酒酵母RAD3和人ERCC2基因的一个同源物。核酸研究20，2673-2678。
Nasim，A.和Smith，B.P.(1975)粟酒裂殖酵母中射线敏感性的基因调控。基因学79，573-582。
Painter，R.B.和Young，B.R.(1980)共济失调-毛细血管扩张症中的放射敏感性：一种新解释。美国国家科学院院刊77，7315-7317。
Rowley，R.，Subramani，S.和Young，P. G.(1992)。rad1，粟酒裂殖酵母中的关卡调控。EMBO杂志11，1335-1342。
Savitsky，K.，Bar-Shira，A.，Gilad，S.，Rotman，G.，Ziv，Y.，Vanagaite L.，Tagle，D. A.，Smith，S.，Uziel，T.，Sfez，S.，Ashkenazi，M.，Pecker，I.，Frydman，M.，Harnik，R.，Patanjali，S. R.，Simmons，A.，Clines，G. A.，Sartiel，A.，Gatti，R. A.，Chessa，L.，Sanal，O.，Lavine，M. F.，Jaspers，N. G.J. Taylor，M. R.，Arlett，C. F.，Miki，T.，Weissman，S. M.，Lovett，M.，Collins，F. S.和Shiloh，Y.(1995)。具有与PI-3激酶相似产物的单个共济失调-毛细血管扩张症基因。科学286，1749-1753。
Seaton，B. L.，Yucel，J.，Sunnerhagen P.和Subramani，S.(1992)。参与DNA损伤和DNA合成关卡的粟酒裂殖酵母rad3基因的分离和确认。基因119，83-89。
Schu，P. V.，Takegawa，K.，Fry，M. J.，Stack，J. H.，Waterfield，M. D.和Emr，S. D.(1993)蛋白分类所必需的由酵母VPS34基因编码的磷脂酰肌醇3-激酶。科学260，88-91。
Sheldrick，K. S.和Carr，A. M.(1993)。反馈调控和G2关卡分裂酵母作为模型系统。生物试验15，775-782。
Walworth，N.，Davey，S.和Beach，D.(1993)。分裂酵母chk1激酶将rad关卡途径与cdc2相连。自然363，368-371。
Weinert，T. A.，和Hatwell，L. H.(1988)。RAD组基因调控酿酒酵母中细胞周期对DNA损伤的应答。科学241，317-322。
Weinert，T. A.，Kiser，G. L.Harwell，L. H.(1994)。芽生酵母中有丝分裂关卡基因及有丝分裂对DNA复制和修复的依赖。基因学方法8，652-665。
序列序列号1：ATR序列 1 GCGCTCTTCCGGCAGCGGTACGTTTGGAGACGCCGGGAACCCGCGTTGGCGTGGTTGACTAGTGCCTCGCAGCCT 75 76 CAGCATGGGGGAACATGGCCTGGAGCTGGCTTCCATGATCCCCGCCCTGCGGGAGCTGGGCAGTGCCACACCAGA 150 151 GGAATATAATACAGTTGTACAGAAGCCAAGACAAATTCTGTGTCAATTCATTGACCGGATACTTACAGATGTAAA 225 226 TGTTGTTGCTGTAGAACTTGTAAAGAAAACTGACTCTCAGCCAACCTCCGTGATGTTGCTTGATTTCATCCAGCA 300 301 TATCATGAAATCCTCCCCACTTATGTTTGTAAATGTGAGTGGAAGCCATGAGCGCAAAGGCAGTTGTATTGAATT 375 376 CAGTAATTGGATCATAACGAGACTTCTGCGGATTGCAGCAACTCCCTCCTGTCATTTGTTACACAAGAAAATCTG 450 451 TGAAGTCATCTGTTCATTATTATTTCTTTTTAAAAGCAAGAGTCCTGCTATTTTTGGGGTACTCACAAAAGAATT 525 526 ATTACAACTTTTTGAAGACTTGGTTTACCTCCATAGAAGAAATGTGATGGGTCATGCTGTGGAATGGCCAGTGGT 600 601 CATGAGCCGATTTTTAAGTCAATTAGATGAACACATGGGATATTTACAATCAGCTCCTTTGCAGTTGATGAGTAT 675 676 GCAAAATTTAGAATTTATTGAAGTCACTTTATTAATGGTTCTTACTCGTATTATTGCAATTGTGTTTTTTAGAAG 750 751 GCAAGAACTCTTACTTTGGCAGATAGGTTGTGTTCTGCTAGAGTATGGTAGTCCAAAAATTAAATCCCTAGCAAT 825 826 TAGCTTTTTAACAGAACTTTTTCAGCTTGGAGGACTACCAGCACAACCAGCTAGCACTTTTTTCAGCTCATTTTT 900 901 GGAATTATTAAAACACCTTGTAGAAATGGATACTGACCAATTGAAACTCTATGAAGAGCCATTATCAAAGCTGAT 975 976 AAAGACACTATTTCCCTTTGAAGCAGAAGCTTATAGAAATATTGAACCTGTCTATTTAAATATGCTGCTGGAAAA 10501051 ACTCTGTGTCATGTTTGAAGACGGTGTGCTCATGCGGCTTAAGTCTGATTTGCTAAAAGCAGCTTTGTGCCATTT 11251126 ACTGCAGTATTTCCTTAAATTTGTGCCAGCTGGGTATGAATCTGCTTTACAAGTCAGGAAGGTCTATGTGAGAAA 12001201 TATTTGTAAAGCTCTTTTGGATGTGCTTGGAATTGAGGTAGATGCAGAGTACTTGTTGGGCCCACTTTATGCAGC 12751276 TTTGAAAATGGAAAGTATGGAAATCATTGAGGAGATTCAATGCCAAACTCAACAGGAAAACCTCAGCAGTAATAG 13501351 TGATGGAATATCACCCAAAAGGCGTCGTCTCAGCTCGTCTCTAAACCCTTCTAAAAGAGCACCAAAACAGACTGA 14251426 GGAAATTAAACATGTGGACATGAACCAAAAGAGCATATTATGGAGTGCACTGAAACAGAAAGCTGAATCCCTTCA 15001501 GATTTCCCTTGAATACAGTGGCCTAAAGAATCCTGTTATTGAGATGTTAGAAGGAATTGCTGTTGTCTTACAACT 15751576 GACTGCTCTGTGTACTGTTCATTGTTCTCATCAAAACATGAACTGCCGTACTTTCAAGGACTGTCAACATAAATC 16501651 CAAGAAGAAACCTTCTGTAGTGATAACTTGGATGTCATTGGATTTTTACACAAAAGTGCTTAAGAGCTGTAGAAG 17251726 TTTGTTAGAATCTGTTCAGAAACTGGACCTGGAGGCAACCATTGATAAGGTGGTGAAAATTTATGATGCTTTGAT 18001801 TTATATGCAAGTAAACAGTTCATTTGAAGATCATATCCTGGAAGATTTATGTGGTATGCTCTCACTTCCATGGAT 18751876 TTATTCCCATTCTGATGATGGCTGTTTAAAGTTGACCACATTTGCCGCTAATCTTCTAACATTAAGCTGTAGGAT 19501951 TTCAGATAGCTATTCACCACAGGCACAATCACGATGTGTGTTTCTTCTGACTCTGTTTCCAAGAAGAATATTCCT 20252026 TGAGTGGAGAACAGCAGTTTACAACTGGGCCCTGCAGAGCTCCCATGAAGTAATCCGGGCTAGTTGTGTTAGTGG 21002101 ATTTTTTATCTTATTGCAGCAGCAGAATTCTTGTAACAGAGTTCCCAAGATTCTTATAGATAAAGTCAAAGATGA 21752176 TTCTGACATTGTCAAGAAAGAATTTGCTTCTATACTTGGTCAACTTGTCTGTACTCTTCACGGCATGTTTTATCT 22502251 GACAAGTTCTTTAACAGAACCTTTCTCTGAACACGGACATGTGGACCTCTTCTGTAGGAACTTGAAAGCCACTTC 23252326 TCAACATGAATGTTCATCTTCTCAACTAAAAGCTTCTGTCTGCAAGCCATTCCTTTTCCTACTGAAAAAAAAAAT 24002401 ACCTAGTCCAGTAAAACTTGCTTTCATAGATAATCTACATCATCTTTGTAAGCATCTTGATTTTAGAGAAGATGA 24752476 AACAGATGTAAAAGCAGTTCTTGGAACTTTATTAAATTTAATGGAAGATCCAGACAAAGATGTTAGAGTGGCTTT 25502551 TAGTGGAAATATCAAGCACATATTGGAATCCTTGGACTCTGAAGATGGATTTATAAAGGAGCTTTTTGTCTTAAG 26252626 AATGAAGGAAGCATATACACATGCCCAAATATCAAGAAATAATGAGCTGAAGGATACCTTGATTCTTACAACAGG 27002701 GGATATTGGAAGGGCCGCAAAAGGAGATTTGGTACCATTTGCACTCTTACACTTATTGCATTGTTTGTTATCCAA 27752776 GTCAGCATCTGTCTCTGGAGCAGCATACACAGAAATTAGAGCTCTGGTTGCAGCTAAAAGTGTTAAACTGCAAAG 28502851 TTTTTTCAGCCAGTATAAGAAACCCATCTGTCAGTTTTTGGTAGAATCCCTTCACTCTAGTCAGATGACAGCACT 29252926 TCCGAATACTCCATGCCAGAATGCTGACGTGCGAAAACAAGATGTGGCTCACCAGAGAGAAATGGCTTTAAATAC 30003001 GTTGTCTGAAATTGCCAACGTTTTCGACTTTCCTGATCTTAATCGTTTTCTTACTAGGACATTACAAGTTCTACT 30753076 ACCTGATCTTGCTGCCAAAGCAAGCCCTGCAGCTTCTGCTCTCATTCGAACTTTAGGAAAACAATTAAATGTCAA 31503151 TCGTAGAGAGATTTTAATAAACAACTTCAAATATATTTTTTCTCATTTGGTCTGTTCTTGTTCCAAAGATGAATT 32253226 AGAACGTGCCCTTCATTATCTGAAGAATGAAACAGAAATTGAACTGGGGAGCCTGTTGAGACAAGATTTCCAAGG 33003301 ATTGCATAATGAATTATTGCTGCGTATTGGAGAACACTATCAACAGGTTTTTAATGGTTTGTCAATACTTGCCTC 33753376 ATTTGCATCCAGTGATGATCCATATCAGGGCCCGAGAGATATCATATCACCTGAACTGATGGCTGATTATTTACA 34503451 ACCCAAATTGTTGGGCATTTTGGCTTTTTTTAACATGCAGTTACTGAGCTCTAGTGTTGGCATTGAAGATAAGAA 35253526 AATGGCCTTGAACAGTTTGATGTCTTTGATGAAGTTAATGGGACCCAAACATGTCAGTTCTGTGAGGGTGAAGAT 36003601 GATGACCACACTGAGAACTGGCCTTCGATTCAAGGATGATTTTCCTGAATTGTGTTGCAGAGCTTGGGACTGCTT 36753676 TGTTCGCTGCCTGGATCATGCTTGTCTGGGCTCCCTTCTCAGTCATGTAATAGTAGCTTTGTTACCTCTTATACA 37503751 CATCCAGCCTAAAGAAACTGCAGCTATCTTCCACTACCTCATAATTGAAAACAGGGATGCTGTGCAAGATTTTCT 38253826 TCATGAAATATATTTTTTACCTGATCATCCAGAATTAAAAAAGATAAAAGCCGTTCTCCAGGAATACAGAAAGGA 39003901 GACCTCTGAGAGCACTGATCTTCAGACAACTCTTCAGCTCTCTATGAAGGCCATTCAACATGAAAATGTCGATGT 39753976 TCGTATTCATGCTCTTACAAGCTTGAAGGAAACCTTGTATAAAAATCAGGAAAAACTGATAAAGTATGCAACAGA 40504051 CAGTGAAACAGTAGAACCTATTATCTCACAGTTGGTGACAGTGCTTTTGAAAGGTTGCCAAGATGCAAACTCTCA 41254126 AGCTCGGTTGCTCTGTGGGGAATGTTTAGGGGAATTGGGGGCGATAGATCCAGGTCGATTAGATTTCTCAACAAC 42004201 TGAAACTCAAGGAAAAGATTTTACATTTGTGACTGGAGTAGAAGATTCAAGCTTTGCCTATGGATTATTGATGGA 42754276 GCTAACAAGAGCTTACCTTGCGTATGCTGATAATAGCCGAGCTCAAGATTCAGCTGCCTATGCCATTCAGGAGTT 43504351 GCTTTCTATTTATGACTGTAGAGAGATGGAGACCAACGGCCCAGGTCACCAATTGTGGAGGAGATTTCCTGAGCA 44254426 TGTTCGGGAAATACTAGAACCTCATCTAAATACCAGATACAAGAGTTCTCAGAAGTCAACCGATTGGTCTGGAGT 45004501 AAAGAAGCCAATTTACTTAAGTAAATTGGGTAGTAACTTTGCAGAATGGTCAGCATCTTGGGCAGGTTATCTTAT 45754576 TACAAAGGTTCGACATGATCTTGCCAGTAAAATTTTCACCTGCTGTAGCATTATGATGAAGCATGATTTCAAAGT 46504651 GACCATCTATCTTCTTCCACATATTCTGGTGTATGTCTTACTGGGTTGTAATCAAGAAGATCAGCAGGAGGTTTA 47254726 TGCAGAAATTATGGCAGTTCTAAAGCATGACGATCAGCATACCATAAATACCCAAGACATTGCATCTGATCTGTG 48004801 TCAACTCAGTACACAGACTGTGTTCTCCATGCTTGACCATCTCACACAGTGGGCAAGGCACAAATTTCAGGCACT 48754876 GAAAGCTGAGAAATGTCCACACAGCAAATCAAACAGAAATAAGGTAGACTCAATGGTATCTACTGTGGATTATGA 49504951 AGACTATCAGAGTGTAACCCGTTTTCTAGACCTCATACCCCAGGATACTCTGGCAGTAGCTTCCTTTCGCTCCAA 50255026 AGCATACACACGAGCTGTAATGCACTTTGAATCATTTATTACAGAAAAGAAGCAAAATATTCAGGAACATCTTGG 51005101 ATTTTTACAGAAATTGTATGCTGCTATGCATGAACCTGATGGAGTGGCCGGAGTCAGTGCAATTAGAAAGGCAGA 51755176 ACCATCTCTAAAAGAACAGATCCTTGAACATGAAAGCCTTGGCTTGCTGAGGGATGCCACTGCTTGTTATGACAG 52505251 GGCTATTCAGCTAGAACCAGACCAGATCATTCATTATCATGGTGTAGTAAAGTCCATGTTAGGTCTTGGTCAGCT 53255326 GTCTACTGTTATCACTCAGGTGAATGGAGTGCATGCTAACAGGTCCGAGTGGACAGATGAATTAAACACGTACAG 54005401 AGTGGAAGCAGCTTGGAAATTGTCACAGTGGGATTTGGTGGAAAACTATTTGGCAGCAGATGGAAAATCTACAAC 54755476 ATGGAGTGTCAGACTGGGACAGCTATTATTATCAGCCAAAAAAAGAGATATCACAGCTTTTTATGACTCACTGAA 55505551 ACTAGTGAGAGCAGAACAAATTGTACCTCTTTCAGCTGCAAGCTTTGAAAGAGGCTCCTACCAACGAGGATATGA 56255626 ATATATTGTGAGATTGCACATGTTATGTGAGTTGGAGCATAGCATCAAACCACTTTTCCAGCATTCTCCAGGTGA 57005701 CAGTTCTCAAGAAGATTCTCTAAACTGGGTAGCTCGACTAGAAATGACCCAGAATTCCTACAGAGCCAAGGAGCC 57755776 TATCCTGGCTCTCCGGAGGGCTTTACTAAGCCTCAACAAAAGACCAGATTACAATGAAATGGTTGGAGAATGCTG 58505851 GCTGCAGAGTGCCAGGGTAGCTAGAAAGGCTGGTCACCACCAGACAGCCTACAATGCTCTCCTTAATGCAGGGGA 59255926 ATCACGACTCGCTGAACTGTACGTGGAAAGGGCAAAGTGGCTCTGGTCCAAGGGTGATGTTCACCAGGCACTAAT 60006001 TGTTCTTCAAAAAGGTGTTGAATTATGTTTTCCTGAAAATGAAACCCCACCTGAGGGTAAGAACATGTTAATCCA 60756076 TGGTCGAGCTATGCTACTAGTGGGCCGATTTATGGAAGAAACAGCTAACTTTGAAAGCAATGCAATTATGAAAAA 61506151 ATATAAGGATGTGACCGCGTGCCTGCCAGAATGGGAGGATGGGCATTTTTACCTTGCCAAGTACTATGACAAATT 62256226 GATGCCCATGGTCACAGACAACAAAATGGAAAAGCAAGGTGATCTCATCCGGTATATAGTTCTTCATTTTGGCAG 63006301 ATCTCTACAATATGGAAATCAGTTCATATATCAGTCAATGCCACGAATGTTAACTCTATGGCTTGATTATGGTAC 63756376 AAAGGCATATGAATGGGAAAAAGCTGGCCGCTCCGATCGTGTACAAATGAGGAATGATTTGGGTAAAATAAACAA 64506451 GGTTATCACAGAGCATACAAACTATTTAGCTCCATATCAATTTTTGACTGCTTTTTCACAATTGATCTCTCGAAT 65256526 TTGTCATTCTCACGATGAAGTTTTTGTTGTCTTGATGGAAATAATAGCCAAAGTATTTCTAGCCTATCCTCAACA 66006601 AGCAATGTGGATGATGACAGCTGTGTCAAAGTCATCTTATCCCATGCGTGTGAACAGATGCAAGGAAATCCTCAA 66756676 TAAAGCTATTCATATGAAAAAATCCTTAGAGAAGTTTGTTGGAGATGCAACTCGCCTAACAGATAAGCTTCTAGA 67506751 ATTGTGCAATAAACCGGTTGATGGAAGTAGTTCCACATTAAGCATGAGCACTCATTTTAAAATGCTTAAAAAGCT 68256826 GGTAGAAGAAGCAACATTTAGTGAAATCCTCATTCCTCTACAATCAGTCATGATACCTACACTTCCATCAATTCT 69006901 GGGTACCCATGCTAACCATGCTAGCCATGAACCATTTCCTGGACATTGGGCCTATATTGCAGGGTTTGATGATAT 69756976 GGTGGAAATTCTTGCTTCTCTTCAGAAACCAAAGAAGATTTCTTTAAAAGGCTCAGATGGAAAGTTCTACATCAT 70507051 GATGTGTAAGCCAAAAGATGACCTGAGAAAGGATTGTAGACTAATGGAATTCAATTCCTTGATTAATAAGTGCTT 71257126 AAGAAAAGATGCAGAGTCTCGTAGAAGAGAACTTCATATTCGAACATATGCAGTTATTCCACTAAATGATGAATG 72007201 TGGGATTATTGAATGGGTGAACAACACTGCTGGTTTGAGACCTATTCTGACCAAACTATATAAAGAAAAGGGAGT 72757276 GTATATGACAGGAAAAGAACTTCGCCAGTGTATGCTACCAAAGTCAGCAGCTTTATCTGAAAAACTCAAAGTATT 73507351 CCGAGAATTTCTCCTGCCCAGGCATCCTCCTATTTTTCATGAGTGGTTTCTGAGAACATTCCCTGATCCTACATC 74257426 ATGGTACAGTAGTAGATCAGCTTACTGCCGTTCCACTGCAGTAATGTCAATGGTTGGTTATATTCTGGGGCTTGG 75007501 AGACCGTCATGGTGAAAATATTCTCTTTGATTCTTTGACTGGTGAATGCGTACATGTAGATTTCAATTGTCTTTT 75757576 CAATAAGGGAGAAACCTTTGAAGTTCCAGAAATTGTGCCATTTCGCCTGACTCATAATATGGTTAATGGAATGGG 76507651 TCCTATGGGAACAGAGGGTCTTTTTCGAAGAGCATGTGAAGTTACAATGAGGCTGATGCGTGATCAGCGAGAGCC 77257726 TTTAATGAGTGTCTTAAAGACTTTTCTACATGATCCTCTTGTGGAATGGAGTAAACCAGTGAAAGGGCATTCCAA 78007801 AGCGCCACTGAATGAAACTGGAGAAGTTGTCAATGAAAAGGCCAAGACCCATGTTCTTGACATTGAGCAGCGACT 78757876 ACAAGGTGTAATCAAGACTCGAAATAGAGTGACAGGACTGCCGTTATCTATTGAAGGACATGTGCATTACCTTAT 79507951 ACAAGAAGCTACTGATGAAAACTTACTATGCCAGATGTATCTTGGTTGGACTCCATATATGTGAAATGAAATTAT 80258026 GTAAAAGAATATGTTAATAATCTAAAAGTAATGCATTTGGTATGAATCTGTGGTTGTATCTGTTCAATTCTAAAG 81008101 TACAACATAAATTTACGTTCTCAGCAACTGTTATTTCTCTCTGATCATTAATTATATGTAAAATAATATACATTC 81758176 AGTTATTAAGAAATAAACTGCTTTCTTAATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 8239序列号2：ATR蛋白 1 MGEHGLELASMIPALRELGSATPEEYNTVVOKPRQILCQFIDRILTDVNVVAVELVKKTDSQPTSV 66 67 MLLDFIQHIMKSSPLMFVNVSGSHERKGSCIEFSNWIITRLLRIAATPSCHLLHKKICEVICSLLFLFKSKSPAI 141142 FGVLTKELLQLFEDLVYLHRRNVMGHAVEWPVVMSRFLSQLDEHMGYLQSAPLQLMSMQNLEFIEVTLLMVLTRI 216217 IAIVFFRRQELLLWQIGCVLLEYGSPKIKSLAISFLTELFQLGGLPAQPASTFFSSFLELLKHLVEMDTDQLKLY 291292 EEPLSKLIKTLFPFEAEAYRNIEPVYLNMLLEKLCVMFEDGVLMRLKSDLLKAALCHLLQYFLKFVPAGYESALQ 366367 VRKVYVRNICKALLDVLGIEVDAEYLLGPLYAALKMESMEIIEEIQCQTQQENLSSNSDGISPKRRRLSSSLNPS 441442 KRAPKQTEEIKHVDMNQKSILWSALKQKAESLQISLEYSGLKNPVIEMLEGIAVVLQLTALCTVHCSHQNMNCRT 516517 FKDCQHKSKKKPSVVITWMSLDFYTKVLKSCRSLLESVQKLDLEATIDKVVKIYDALIYMQVNSSFEDHILEDLC 591592 GMLSLPWIYSHSDDGCLKLTTFAANLLTLSCRISDSYSPOAQSRCVFLLTLFPRRIFLEWRTAVYNWALQSSHEV 666667 IRASCVSGFFILLQQQNSCNRVPKILIDKVKDDSDIVKKEFASILGQLVCTLHGMFYLTSSLTEPFSEHGHVDLF 741742 CRNLKATSQHECSSSQLKASVCKPFLFLLKKKIPSPVKLAFIDNLHHLCKHLDFREDETDVKAVLGTLLNLMEDP 816817 OKDVRVAFSGNIKHILESLDSEDGFIKELFVLRMKEAYTHAQISRNNELKDTLILTTGDIGRAAKGDLVPFALLH 891892 LLHCLLSKSASVSGAAYTEIRALVAAKSVKLQSFFSQYKKPICQFLVESLHSSQMTALPNTPCQNADVRKQDVAH 966967 QREMALNTLSEIANVFDFPDLNRFLTRTLQVLLPDLAAKASPAASALIRTLGKQLNVNRREILINNFKYIFSHLV 10411042 CSCSKDELERALHYLKNETEIELGSLLRQDFQGLHNELLLRIGEHYQQVFNGLSILASFASSDDPYDGPRDIISP 11161117 ELMADYLQPKLLGILAFFNMQLLSSSVGIEDKKMALNSLMSLMKLMGPKHVSSVRVKMMTTLRTGLRFKDDFPEL 11911192 CCRAWDCFVRCLDHACLGSLLSHVIVALLPLIHIQPKETAAIFHYLIIENRDAVQOFLHEIYFLPDHPELKKIKA 12661267 VLQEYRKETSESTDLQTTLQLSMKAIQHENVDVRIHALTSLKETLYKNQEKLIKYATDSETVEPIISQLVTVLLK 13411342 GCQDANSQARLLCGECLGELGAIDPGRLDFSTTETQGKDFTFVTGVEDSSFAYGLLMELTRAYLAYADNSRAQDS 14161417 AAYAIQELLSIYDCREMETNGPGHQLWRRFPEHVREILEPHLNTRYKSSOKSTDWSGVKKPIYLSKLGSNFAEWS 14911492 ASWAGYLITKVRHDLASKIFTCCSIMMKHDFKVTIYLLPHILVYVLLGCNDEDOQEVYAEIMAVLKHODQHTINT 15661567 QDIASDLCQLSTQTVFSMLDHLTQWARHKFQALKAEKCPHSKSNRNKVDSMVSTVDYEDYQSVTRFLDLIPODTL 16411642 AVASFRSKAYTRAVMHFESFITEKKQNIQEHLGFLQKLYAAMHEPDGVAGVSAIRKAEPSLKEQILEHESLGLLR 17161717 DATACYDRAIQLEPDQIIHYHGVVKSMLGLGQLSTVITQVNGVHANRSEWTDELNTYRVEAAWKLSQWDLYENYL 17911792 AADGKSTTWSVRLGQLLLSAKKRDITAFYDSLKLVRAEOIVPLSAASFERGSYORGYEYIVRLHMLCELEHSIKP 18661867 LFQHSPGDSSQEDSLNWVARLEMTQNSYRAKEPILALRRALLSLNKRPDYNEMVGECWLQSARVARKAGHHQTAY 19411942 NALLNAGESRLAELYVERAKWLWSKGDVHQALIVLQKGVELCFPENETPPEGKNMLIHGRAMLLVGRFMEETANF 10162017 ESNAIMKKYKDVTACLPEWEDGHFYLAKYYDKLMPMVTDNKMEKQGDLIRYIVLHFGRSLQYGNQFIYQSMPRML 20912092 TLWLDYGTKAYEWEKAGRSDRVQMRNDLGKINKVITEHTNYLAPYQFLTAFSQLISRICHSHOEVFVVLMEIIAK 21662167 VFLAYPQQAMWMMTAVSKSSYPMRVNRCKEILNKAIHMKKSLEKFVGDATRLTDKLLELCNKPVDGSSSTLSMST 22412242 HFKMLKKLVEEATFSEILIPLQSVMIPTLPSILGTHANHASHEPFPGHWAYIAGFDDMVEILASLQKPKKISLKG 23162317 SDGKFYIMMCKPKDDLRKDCRLMEFNSLINKCLRKDAESRRRELHIRTYAVIPLNDECGIIEWVNNTAGLRPILT 23912392 KLYKEKGVYMTGKELRQCMLPKSAALSEKLKVFREFLLPRHPPIFHEWFLRTFPDPTSWYSSRSAYCRSTAVMSM 24662467 VGYILGLGDRHGENILFDSLTGECVHVDFNCLFNKGETFEVPEIVPFRLTHNMVNGMGPMGTEGLFRRACEVTMR 25412542 LMRDQREPLMSVLKTFLHDPLVEWSKPVKGHSKAPLNETGEVVNEKAKTHVLDIEQRLQGVIKTRNRVTGLPLSI 26162617 EGHVHYLIQEATDENLLCQMYLGWTPYM 2664序列号3：rad3序列 1 GGTACCAAGTAAAAACTGCTTAGTAAGTATAAAACACAGAAGAATCCGCGATCTAGTGAACCAATGCCCTGCGTA 75 76 TGACGCTCCACTGACGCTATAGTCAATGAGAACTAGGATGTGCGATTATAACTTATCTTTTCAATATTTTCTTAT 150 151 TATTTATTTAAGAAATAATTGAATTAAAACTCATTTCTTCTTTTATTAGCCGTAAAATAGCTTATTTTCTCTCCT 225 226 ACTACCTTTCAACAATAACTTTTTTTTTTGTTTATTGACCATTATAATCACATCAAAAGTCAAAAAATTCAATCA 300 301 TTATCAGAAACATCCAGCCTAATATTACTTAAAAGTTAGTTTCCTCTGAAAATTCAGTATCACAAAAGCTCGTTA 375 376 ATTAGCATCGCTCGATACTTAGTGCACCATGCATCTTCCTTTACCTCGTGAGTGGAAATCGATTTGATAATCGAT 450 451 TGCCACTTTTCGCATAATTCTATTGAGATATTTTATTACTTACAATCGTCTTTTATAAATGCTCAAGACTTTGAA 525 526 CGCGCGTGTTGCGTTTTAAAAAGGCCTTTTTTTGAATTGAATCAATGGTTTGATATAGTATGAGCCAACACGCAA 600 601 AAAGGAAAGCTGGGTCACTCGATCTTTCACCCAGAGGCTTAGATGACAGACAGGCTTTCGGACAGCTTTTGAAAG 675 676 AAGTATTAGCATTAGACAAAGAACATGAGTTAGGTAGAAGTAATTCTTTACCATCTATGACCTCCGAGCTTGTTG 750 751 AAGTTTTAATTGAAGTTGGTCTTCTAGCTTTTAAACATGATGATTCAAAATCTGAATTTATCTCTCCTAAGATGC 825 826 TAAAAGAAGCCCATCTCTCTCTACAAGCGTTAATGCTAATCTTAAAAAGGTCTCCGACAGTTTTGCGGGAGATTA 900 901 AATCATCTGTTACTCTTTTGGATTGGATTTTACCCAGGACTATATCATTGTTTGCTGATATTCGTTTTATTAAGT 975 976 TATTTGACTCATTAAAAGAGTTTCATAAGCTAATTTATCAGCTAATCAGTGAAAAGTCATTCCTATGGGACTTAT 10501051 ATGCTTCGTTTATGCGTTATTGGAAATATTATATTACAAACGTTTCTTCTATAGTTCTCCAAATCACTAATGCTA 11251126 CATTCCCTTACAAGATGCCCTCACCCAATTCTCAACCATTGCAGAGTATCTCCCCAAATTATCCAACCCATCGAG 12001201 AGGACAAATTTGATTTACTTATCATTAATATAGAGGAGGCTTGTACATTTTTCTTTGAAAGTGCCCATTTTTTTG 12751276 CACAATGCTCATATTTAAAGAAATCCAATTTTCCTAGTCCACCTCTCTTTACAGCGTGGACTTGGATCAAGCCAT 13501351 GTTTTTTTAATTTTGTTATTTTATTAAAACGAATCAGCATCGGAGACTCACAGCTCTTTCTACATTTGCATTCAC 14251426 GTATAGTCCAAACTTTATGCTGTTTTTCCTTGAATTTTATATATCATGGCCTTCCCATTTGTGAAAAATCTAAAC 15001501 ATATTTTAATGTCCTCCATCAACTTAACATTGGGATCATTGAAGAAAACTTATACAGTTGCTAATACTGCTATAT 15751576 CTCTTTTTTTTCTCTCTTTATTTGTTTTACCCAAAACTGTAGCTGGTCTATTCTATCCTTTTGGGGTTTCCTTAC 16501651 TTTCTGACTTCAAGGTATTAGAGCAACTTGAACCAGATTCTGATCTCAAAAAGGCAATAATATTATTTAAGTGCA 17251726 GATACCAAAGTTCAGAAATAGATCAAACAACTCTCCGTGCTTTTGGCGAAATTTGTACTGGTAAACTTGAAAACA 18001801 CGTTGTTTTCTAACTCTGAATTAAACCTTTTTCTTTTACATTATCTTTCCTTGGACAATGACTTGTCAAATATTC 18751876 TTAAAGTGGATTTCCAGAATGGTCATAACATATGTACATTTGCAAAATGGTGTATAAACAACAACTTAGATGAAC 19501951 CGTCTAATTTAAAGCACTTTCGTGAAATGTTAGATTATTATAGCTCTCATAATGTTACAATAAGTGAGGACGACC 20252026 TGAAGAACTTCTCTTTAGTTTTGTGTACTCATGTTGCAAAGGTGAATGAGAAAACAAATAGTATTTTCCGCACAT 21002101 ATGAAGTACATGGTTGTGAAGTTTGTAACTCATTTTGTTTACTATTTGATGAGCGGTCGCCTTTTAAAATTCCTT 21752176 ATCACGAATTGTTTTGTGCATTGCTAAAAAATCCCGACATAATTTCCTCTTCTGTTAAACAATCATTGTTGCTTG 22502251 ATGGCTTTTTTCGGTGGAGCCAGCATTGCTCAAACTTTAATAAAGAATCAATGTTAAGTTTAAGAGAATTTATTA 23252326 TGAAAGCATTAGCCAGTACTTCAAGATGTTTACGTGTTGTTGCTGCAAAAGTTTTGCCCATTTTCATTAAGGGAC 24002401 CTAATAATCTTGATATAGTTGAATTTCACAAGGAAAGTAAAGCCTTGATTTTTAATACGTTGAAAATATTGGCGG 24752476 TGGAAAATACAGCTATTTTAGAAACGGTCATTCTTTCCTGGATCTCCTTATCTAGAGTGGTAGAAGAAGAAGAAT 25502551 TACATTTTGTACTATTGGAAGTTATATCTTCTGTGATAAACAGCGGAATATTTTATCAAGGCATTGGTCTCAGCG 26252626 CTCTGCAACAAATTGCCTCGACGCGTCATATATCCGTTTGGCAATTACTTTCTCCATATTGGCCAACAGTGTCCG 27002701 TTGCGATTGTCCAAGGTATGGGTAAAAAACCGAACATAGCCAGTTTATTTGCTCAGCTTATGAATATTTCCGAGG 27752776 GCGATTTTCTTATTCGAACACAGGCGTACACTTTACCATTCCTTGTACTTACTAAAAACAAAGCGTTAATAGTAC 28502851 GTATAGCTGAACTTTCACAAAGTGATGTTGCTACTTTGTGCCTTACCAATATGCATAAAATCCTTGCTTCGCTAC 29252926 TTACTACGGATCATCCTAATTTGGAAGAGAGTGTGATGCTTCTTCTTTCACTGGCCACTTCTGATTTTGAAAAAG 30003001 TTGATTTAACGTCTTTGTTACGCTCTGATCCTATTTCTATTACTGTGGAGTTGTTACAGCTTTATCAGAATGATG 30753076 TTCCTCATGAAAAAATTGAAAATGCTTTAAGAAAGGTAGCAATGATTGTCTCTCAAGTGGTTAATGACGAAGACT 31503151 TGAGCAATAAGGAATTACTTTATGATTTTTTTAATAATCACATTTTGGGTATCTTAGCAGAATTTTCTAATATCC 32253226 TTAACGACCTGAAAGGAAAGACTTCAATTAATGAAAAGATTAAGACAATTGTCGGCATTGAAAAAATGTTATCTT 33003301 TATGTGGAGGTGCAGTCAAACTTGGATTACCACAGATACTTTCTAATTTACAAAGTGCTTTTCAAAATGAGCACT 33753376 TAAGGTTTTATGCAATCAAAGCTTGGTTCAGTTTGATATTAGCAACCAAGGAGCCCGAGTATAGTTCAATTGCTG 34503451 GTTTAAGTCTTGTAATTTTACCTCCTTTATTCCCTTATTTAGAACCACAAGAAGCAGAGCTAGTAATTCAAATAT 35253526 TTGATTTTATTTCTTCTGACACACACAAGTGCCTACAAGGATTAAAGTGGGCTATCCCCACCAGTCTGGATTCAG 36003601 CGTGCTTTAGCCTTAAGGCTAAAGAAATATTCTGTTCGCTTCAAAATGAAGATTTTTACTCTGAGCTTCAAAGTA 36753676 TAATTAAGTGTTTAACTAACGAAAATGAGCCAGTTTGTTATTTAGGTTTACAAAAATTAGAACTTTTTTTTCAAG 37503751 CCAAGGTGGACGAGTTACATGACACACTAAATTTGGACATATCCAACGAAGTTCTGGACCAATTACTAAGATGCC 38253826 TTTTAGATTGTTGTGTAAAATATGCTTCAACAAATATGCAAATATCATATCTTGCTGCAAAAAATCTTGGTGAAT 39003901 TGGGTGCGATAGATCCCAGCCGCGCCAAGGCTCAACATATTATTAAAGAAACAGTTGTTCTTGATAACTTTGAAA 39753976 ACGGAGAAGAAAGTTTGAAGTTTATTCTAGATTTTATGCAATCGCAGTTAATTCCAGCTTTCCTTGTTACTACTG 40504051 ATACTAAAGCACAAGGTTTTCTTGCCTATGCTCTGCAAGAGTTTCTAAAGCTTGGTGGATTCAAGTCCGCAGTGA 41254126 TTAATAAAAAAAAGGGACTAACTGTGGTAACAGAACATTGGATGTCTTTGCCTGATTTATCCAAACGTGTGCTTA 42004201 TACCATTTTTAACTTCCAAGTATCATTTAACACCAATCCCCAAAATTGACATTCGGTACCCTATTTATAAAGAAA 42754276 ATGTTACTATTCATACTTGGATGCAGTTGTTTTCTCTTAAATTGATGGAGTACGCCCATTCGCAAAACGCTGAAA 43504351 AAATATTTGGTATTTGTTCGAAAGTAGTGAAAGACCAAGAGGTTAACATTCCCTGTTTTCTTCTTCCCTTTCTTG 44254426 TTTTAAATGTTATTTTAACCGAGTCAGAACTGGAAGTTAATAAAGTCATTGAAGAATTCCAGCTTGTTATTAATC 45004501 AACCGGGACCTGATGGATTAAATTCCGTGGGGCAACAAAGATACACCTCATTTGTAGATGTATTTTTTAAGATTG 45754576 TGGATTACCTTAACAAATGGCTTCGCATGCGAAAGAAGAGGAATTGGGATAGACGTTCTGCCATTGCAAGGAAAG 46504651 AGAACCGTTATATGTCGGTGGAAGATGCTACCTCTCGAGAATCATCGATCTCAAAAGTTGAGTCATTTCTTTCTC 47254726 GATTTCCTTCAAAAACATTAGGTATTGTCTCTTTAAATTGTGGATTTCATGCTCGTGCATTGTTTTATTGGGAGC 48004801 AACACATACGTAATGCTACAGCTCCATATGCAGCTTTAGAGTCCGATTATAGAGTTTTGCAGGAAATATATGCTG 48754876 GAATTGATGATCCAGATGAAATCGAAGCAGTGTCTTTAAATTTCCATGATTACTCGTTTGATCAACAACTCCTTT 49504951 TACATGAAAATTCAGGAACATGGGACTCGGCTTTGAGTTGTTACGAAATTATTATTCAAAAGGATCCTGAAAATA 50255026 AAAAGGCGAAAATCGGTTTGCTTAACAGCATGCTGCAATCGGGGCATTATGAATCTCTTGTTTTGAGTTTAGATT 51005101 CTTTTATAATCAATGACAACCACGAGTATTCGAAGATGTTAAATTTGGGTATTGAAGCTTCATGGCGTTCGCTAT 51755176 CTATTGATTCGTTAAAAAAGTGTCTTTCAAAAAGCAACTTGGAATCTTTCGAAGCTAAATTGGGTAGCATATTTT 52505251 ACCAATACCTACGGAAGGATTCTTTTGCTGAATTGACGGAGCGGCTGCAACCCTTGTACGTTGATGCTGCTACAG 53255326 CAATTGCAAACACAGGCGCCCATTCAGCCTATGATTGTTATGATATTTTATCTAAGCTGCACGCAATTAATGACT 54005401 TTAGTAGGATTGCTGAAACTGACGGAATTGTTTCCGACAATCTTGATATTGTTCTTCGCCGTCGGCTTAGCCAAG 54755476 TAGCTCCGTACGGTAAATTCAAGCACCAAATCCTGTCCACTCACTTAGTTGGCTATGAAAAATTTGAAAACACGA 55505551 AGAAAACTGCTGAAATATATCTCGAGATTGCAAGAATATCTCGAAAAAATGGTCAATTTCAAAGAGCCTTCAATG 56255626 CCATCCTCAAAGCAATGGATTTAGATAAACCGCTAGCAACAATAGAGCACGCACAATGGTGGTGGCATCAAGGGC 57005701 AACATCGTAAAGCTATTTCTGAATTGAATTTTTCGCTTAATAACAACATGTTTGATTTGGTTGATGAGCATGAAG 57755776 AAAGACCTAAAAATCGTAAAGAAACTTTAGGAAATCCACTTAAAGGAAAAGTGTTCTTGAAACTTACAAAATGGC 58505851 TCGGAAAAGCTGGCCAACTGGGATTGAAGGATTTGGAGACGTATTATCATAAAGCGGTAGAGATTTACTCAGAAT 59255926 GTGAGAATACGCATTATTATCTTGGCCATCATCGAGTTTTAATGTATGAAGAAGAACAAAAGCTCCCAGTTAATG 60006001 AACAGAGCGAACGATTTTTAAGTGGTGAGTTAGTAACTCGCATAATTAACGAATTTGGTCGATCTTTGTACTATG 60756076 GTACAAATCATATATATGAAAGTATGCCAAAATTGCTCACACTGTGGCTTGATTTTGGGGCCGAAGAACTTCGCT 61506151 TATCTAAAGATGACGGCGAAAAGTACTTTCGTGAACACATTATCTCTTCGAGAAAAAAATCTTTGGAACTTATGA 62256226 ATTCGAATGTTTGTCGCCTTTCTATGAAAATTCCTCAATACTTTTTTCTGGTTGCATTATCCCAAATGATATCCA 63006301 GAGTATGCCATCCAAATAATAAAGTTTATAAAATTTTGGAACATATAATTGCAAACGTTGTAGCATCTTATCCTG 63756376 GGGAGACGCTATGGCAATTAATGGCAACAATAAAATCGACTTCTCAAAAGCGCTCGCTTCGTGGAAAAAGCATTT 64506451 TAAATGTTTTACATTCTAGGAAGCTTTCTATGTCTTCCAAAGTTGATATAAAAGCACTCAGTCAATCTGCAATTC 65256526 TCATTACTGAAAAGTTAATCAATTTGTGCAATACAAGGATTAACAGTAAATCTGTAAAAATGAGCTTAAAGGATC 66006601 ATTTTCGGCTTTCTTTTGATGATCCGGTAGATTTAGTCATTCCTGCTAAATCATTTTTAGACATTACTTTACCAG 66756676 CTAAAGATGCTAACAGAGCTAGTCATTATCCATTTCCAAAAACTCAGCCTACTCTGTTGAAATTTGAGGATGAGG 67506751 TGGATATAATGAACTCTCTTCAAAAACCAAGAAAAGTGTACGTTAGAGGTACGGATGGCAACTTATACCCATTCT 68256826 TGTGCAAACCCAAAGATGATCTTCGTAAGGATGCTAGATTGATGGAATTTAATAATCTTATTTGTAAAATATTGA 69006901 GGAAAGATCAAGAAGCGAACAGAAGGAACTTGTGTATTAGAACTTATGTTGTTATTCCTTTAAATGAAGAATGCG 69756976 GATTTATCGAATGGGTAAATCATACTCGTCCATTTAGAGAAATTTTGTTAAAAAGCTATAGACAGAAAAACATTC 70507051 CCATATCATATCAAGAAATCAAAGTTGATTTAGACTTTGCACTGCGAAGTCCTAACCCTGGTGATATATTTGAAA 71257126 AGAAAATCTTACCGAAATTTCCTCCAGTTTTTTATGAGTGGTTTGTTGAATCTTTCCCAGAACCAAATAATTGGG 72007201 TTACTAGTAGACAAAACTATTGCCGAACTTTAGCAGTAATGTCAATAGTTGGCTACGTTTTGGGTTTGGGAGATC 72757276 GCCATGGCGAAAACATATTGTTTGATGAATTTACAGGTGAAGCTATCCATGTCGATTTCAACTGTCTTTTTGATA 73507351 AAGGTCTTACTTTTGAAAAACCTGAAAAGGTGCCGTTCAGATTAACTCATAATATGGTAGATGCAATGGGTCCGA 74257426 CAGGTTATGAAGGGGGTTTCAGGAAAGCTAGCGAAATAACGATGCGGCTTCTTCGCTCAAACCAAGATACATTGA 75007501 TGAGCGTACTAGAGTCTTTCCTACATGATCCTTTAGTCGAGTGGAATAGAAAGAAGTCGTCAAGCAAGTACCCGA 75757576 ATAATGAAGCAAATGAAGTTTTGGATATAATTCGCAAAAAATTTCAAGGCTTTATGCCAGGGGAGACGATACCTT 76507651 TATCTATTGAAGGGCAAATTCAAGAATTGATCAAATCTGCTGTCAACCCAAAAAACCTGGTAGAAATGTACATTG 77257726 GTTGGGCTGCTTATTTCTAGCATTTTACTAACAAAAATTTCAATGAACAAGCTACCCATTATTAAACTTATGATT 78007801 TGAATCGAAGATATTTTATTTATTAATCCGATGAAGAATTCTCGCTGAGTTGTTCAATTTCTTGTAATTTTCCTT 78757876 CCATTTCTAAATCGTCGATTCGCTTAAATAGGGCACTGGCTTTTTGTGCATTTTTCTCTCGTAAAGCAGCTTCTG 79507951 ATTGAAAAAAAGCTATATCTGTTTCTGAGTCATCATCCGAATCAACAATATATTTTGCAGATCGACCTGCAG 8022斜体字由Seaton等测序。粗笔的为Seaton等删除的碱基(2499，22501，2507，2509)下划线的为单个的C插入物任一侧的两个碱基(5918/5919)，Seaton等。(即未显示错误碱基，但显示了两边的残基)。序列号4：rad3蛋白 1 MSQHAKRKAGSLDLSPRGLDDRQAFGQLLKEVLALDKEHELGRSNSLPSMTSELVEVLIEVGLLAFKHDDSKSEF 75 76 ISPKMLKEAHLSLQALMLILKRSPTVLREIKSSVTLLDWILPRTISLFADIRFIKLFDSLKEFHKLIYQLISEKS 150151 FLWDLYASFMRYWKYYITNVSSIVLQITNATFPYKMPSPNSQPLQSISPNYPTHREDKFDLLIINIEEACTFFFE 225226 SAHFFAQCSYLKKSNFPSPPLFTAWTWIKPCFFNFVILLKRISIGDSQLFLHLHSRIVQTLCCFSLNFIYHGLPI 300301 CEKSKHILMSSINLTLGSLKKTYTVANTAISLFFLSLFVLPKTVAGLFYPFGVSLLSDFKVLEQLEPDSDLKKAI 375376 ILFKCRYQSSEIDQTTLRAFGEICTGKLENTLFSNSELNLFLLHYLSLDNDLSNILKVDFQNGHNICTFAKWCIN 450451 NNLDEPSNLKHFREMLDYYSSHNVTISEDDLKNFSLVLCTHVAKVNEKTNSIFRTYEVHGCEVCNSFCLLFDERS 525526 PFKIPYHELFCALLKNPDIISSSVKQSLLLDGFFRWSQHCSNFNKESMLSLREFIMKALASTSRCLRVVAAKVLP 600 601 IFIKGPNNLDIVEFHKESKALIFNTLKILAVENTAILETVILSWISLSRVVEEEELHFVLLEVISSVINSGIFYQ 675 676 GIGLSALQQIASTRHISVWQLLSPYWPTVSVAIVQGMGKKPNIASLFAQLMNISEGDFLIRTQAYTLPFLVLTKN 750 751 KALIVRIAELSQSDVATLCLTNMHKILASLLTTDHPNLEESVMLLLSLATSDFEKVDLTSLLRSDPISITVELLQ 825 826 LYQNDVPHEKIENALRKVAMIVSQVVNDEDLSNKELLYDFFNNHILGILAEFSNILNDLKGKTSINEKIKTIVGI 900 901 EKMLSLCGGAVKLGLPQILSNLQSAFQNEHLRFYAIKAWFSLILATKEPEYSSIAGLSLVILPPLFPYLEPQEAE 975 976 LVIQIFDFISSDTHKCLQGLKWAIPTSLDSACFSLKAKEIFCSLQNEDFYSELQSIIKCLTNENEPVCYLGLQKL 10501051 ELFFQAKVDELHDTLNLDISNEVLDQLLRCLLDCCVKYASTNMQISYLAAKNLGELGAIDPSRAKAQHIIKETVV 11251126 LDNFENGEESLKFILDFMQSQLIPAFLVTTDTKAQGFLAYALQEFLKLGGFKSAVINKKKGLTVVTEHWMSLPDL 12001201 SKRVLIPFLTSKYHLTPIPKIDIRYPIYKENVTIHTWMQLFSLKLMEYAHSQNAEKIFGICSKVVKDQEVNIPCF 12751276 LLPFLVLNVILTESELEVNKVIEEFQLVINQPGPDGLNSVGQQRYTSFVDVFFKIVDYLNKWLRMRKKRNWDRRS 13501351 AIARKENRYMSVEDATSRESSISKVESFLSRFPSKTLGIVSLNCGFHARALFYWEQHIRNATAPYAALESDYRVL 14251426 QEIYAGIDDPDEIEAVSLNFHDYSFDQQLLLHENSGTWDSALSCYEIIIQKDPENKKAKIGLLNSMLQSGHYESL 15001501 VLSLDSFIINDNHEYSKMLNLGIEASWRSLSIDSLKKCLSKSNLESFEAKLGSIFYQYLRKDSFAELTERLQPLY 15751576 VDAATAIANTGAHSAYDCYDILSKLHAINDFSRIAETDGIVSDNLDIVLRRRLSQVAPYGKFKHOILSTHLVGYE 16501651 KFENTKKTAEIYLEIARISRKNGQFQRAFNAILKAMDLDKPLATIEHAQWWWHQGQHRKAISELNFSLNNNMFDL 17251726 VDEHEERPKNRKETLGNPLKGKVFLKLTKWLGKAGQLGLKDLETYYHKAVEIYSECENTHYYLGHHRVLMYEEEQ 18001801 KLPVNEQSERFLSGELVTRIINEFGRSLYYGTNHIYESMPKLLTLWLDFGAEELRLSKDDGEKYFREHIISSRKK 18751876 SLELMNSNVCRLSMKIPQYFFLVALSQMISRVCHPNNKVYKILEHIIANVVASYPGETLWQLMATIKSTSQKRSL 19501951 RGKSILNVLHSRKLSMSSKVDIKALSQSAILITEKLINLCNTRINSKSVKMSLKDHFRLSFDDPVDLVIPAKSFL 20252026 DITLPAKDANRASHYPFPKTQPTLLKFEDEVDIMNSLQKPRKVYVRGTDGNLYPFLCKPKDDLRKDARLMEFNNL 21002101 ICKILRKDQEANRRNLCIRTYVVIPLNEECGFIEWVNHTRPFREILLKSYRQKNIPISYQEIKVDLDFALRSPNP 21752176 GDIFEKKILPKFPPVFYEWFVESFPEPNNWVTSRQNYCRTLAVMSIVGYVLGLGDRHGENILFDEFTGEAIHVDF 22502251 NCLFDKGLTFEKPEKVPFRLTHNMVDAMGPTGYEGGFRKASEITMRLLRSNQDTLMSVLESFLHDPLVEWNRKKS 23252326 SSKYPNNEANEVLDIIRKKFQGFMPGETIPLSIEGQIQELIKSAVNPKNLVEMYIGWAAYF 2386