头孢菌素发酵生产的改进方法 发明领域和背景
本发明涉及了发酵生产的头孢菌素类化合物的回收。
制备头孢菌素类的半合成路线大都起始于发酵产物，如：青霉素G、青霉素V和头孢菌素C，它们被转化成相应的β-内酰胺母核，例如：K.Matsumoto，生物方法技术(Bioprocess Techn.),16,1993:67-88,J.G.Shewale和H.Sivaraman，生物化学方法(Process Biochemistry),8,1989:146-154,T.A.Savidge，工业抗生素生物技术(Biotechnologyof Industrial Antibiotics)(E.J.Vandamme编)Marcel Dekker，纽约，1984或J.G.Shewale等人，国际生物化学方法(Process BiochemistryInternational),6,1990:97-103等文献中所公开的一种方法。随后获得的β-内酰胺母核通过偶联一个合适的侧链转化成期望的抗生素，如在除了其它之外的EP0 339 751,JP-A-53005185和CH-A-640 240中所述。通过侧链和β-内酰胺母核地不同组合可以获得各种青霉素类和头孢菌素类抗生素。
已知7-氨基去乙酸基头孢烷酸(cephalosporanic acid)(7-ADCA)和7-氨基头孢烷酸(7-ACA)是药物工业中用于抗生素生产最重要的中间体。
例如：通过将苯乙酰基-7-ADCA进行化学或酶裂解(去酰基化)成7-ADCA和苯乙酸而可以获得7-ADCA。将形成自青霉素G的青霉素G亚砜进行化学处理通常可产生苯乙酰基-7-ADCA。在这个生产过程中，需要大量化学物质来保证发生期望的反应。这不但昂贵而且废物处理的负担很重。此外，此方法的总产量没有期望的那样高。
为克服化学方法的一些缺点，已公开了一些用于制备7-ADCA和7-ACA的发酵方法，包括N-取代的β-内酰胺类(如己二酰基-7-ADCA或己二酰基-7-ACA)的发酵生产，其可由能表达一种去乙酸基头孢烷酸合成酶(DAOCS)(也称扩环酶)的转基因重组产黄青霉菌株进行(EP0 532341,EP0 540 210,WO93/08287,WO95/04148,WO95/04149)。该扩环酶可使特定的N-酰基化青霉烷酸(penicillanic acid)的五元环扩张而由此产生相应的N-酰基化去乙酸基头孢烷酸。
已知回收化学或酶方法制备的青霉烷酸和头孢烷酸的方法对回收N-取代的β-内酰胺中间体和去酰基化氨基-β-内酰胺无效。上述发酵生产的N-取代的头孢菌素化合物回收的主要问题在于发酵培养基或培养基滤液的复杂性。培养基中通常含有各种青霉烷酸，如α-氨基己二酰基-6-青霉烷酸、α-羟基己二酰基-6-青霉烷酸、6-氨基青霉烷酸(6-APA)，各种头孢烷酸，包括α-氨基己二酰基-和α-羟基己二酰基-7-ADCA和很多蛋白类物质。已知的回收方法就纯度而言都不能获得质量可接受的头孢烷酸产物。
在酶促去酰基化反应中，这可导致一些问题，如酶半衰期的缩短，较低的生物转化率和生物转化后较高的回收费用和/或无法接受的污染物水平。而且，在去酰基化后，这种杂质阻止或至少妨碍回收具有期望的特异性的去酰基化头孢菌素化合物的回收。
因此，已知青霉素类和头孢菌素类的生产方法无法得到质量可以接受的终产物：终产物(如：7-ADCA或7-ACA)含有无法接受的数量的青霉素成分(杂质)。
发明详述
本发明涉及了一种改进的从产头孢菌素微生物的发酵培养基中制备去酰基化β-内酰胺(如7-ADCA或7-ACA)的方法。
特别的，本发明公开了一种改进的用于制备7-氨基去酰基化的如分子式(Ⅰ)的头孢菌素类的方法，
其中：R0是H或C1-3烷氧基；
Y是CH2、O、S、或S的氧化形式；且
R1是下述任何一个基团：H，羟基，卤素，C1-3烷氧基，选择性地取代的、选择性地含有一个或多个杂原子、饱和或不饱和、直链或支链的C1-5烷基，优选地为甲基，选择性地取代的、选择性地含有一个或多个杂原子的C5-8环烷基，选择性地取代的芳基或芳杂环，或选择性地取代的苄基，
在一种侧链前体物质存在下对一种产头孢菌素的微生物进行发酵，将存在于发酵液或培养基中的N-取代的头孢菌素化合物萃取到一种有机溶剂中，反萃取该N-取代的头孢菌素化合物到水中，用一种二羧酸酰基转移酶处理该水相，并从水相分离如分子式(Ⅰ)所示的头孢菌素化合物的结晶，其特征在于在用一种有机溶剂萃取发酵液或培养基之前或在进一步反萃取处理之前，对发酵液或培养基或反萃取物在酸性和升温的条件下进行培养。
本方法的进一步改进在于：对含有N-取代的头孢菌素化合物的第一次有机溶剂萃取物用酸化水进行洗涤，和/或用二氧化碳处理在本发明方法的一个或多个阶段中产生的头孢菌素水溶液，和/或在去酰基化头孢菌素结晶之前将酶解释放的侧链物质萃取到一种有机溶剂中。
本发明方法将产生比目前已知方法更好的总产量和产物质量。
在本新颖的回收方法中，可从去酰基化头孢菌素化合物的N-酰基化对应物获得去酰基化头孢菌素化合物，例如：从己二酰基-7-ADCA获得7-ADCA，或从己二酰基-7-ACA获得7-ACA，下述步骤将作进一步详细描述。
可以从任何合适的发酵方法获得发酵培养基，例如：如上所述在一种合适的侧链前体物质存在时对产黄青霉菌株的发酵。
应用任何合适的技术(如离心或过滤)从发酵培养基分离生物质，产生含头孢菌素的发酵液。优选地应用过滤步骤以获得该分离物。选择性地洗涤残余固体物质。
产生N-取代的头孢烷酸的障碍之一是存在一些非预期的杂质性β-内酰胺成分，特别是6-氨基头孢烷酸(6-APA)、N-取代的6-APA或α-氨基己二酰基-7-ADCA。
在本发明的一个优选实施方案中，可以通过下述方法显著减少污染性杂质：在酸性和升温条件下对在本发明方法的任何阶段产生的含N-取代的头孢菌素化合物的水溶液进行培养。应用一种或多种已知酸(如硫酸、盐酸或硝酸或它们的组合)对含N-取代的头孢菌素化合物的水溶液进行酸化处理，将其pH调至低于4，优选地低于3。操作温度范围是20-140℃，优选为60-80℃。在这些条件下停留时间的范围从数天至数分钟，优选地少于60分钟，更优选地在1-30分钟。
根据本发明上述培养步骤可应用于发酵液或培养基或含N-取代的头孢菌素的水反萃取物。优选地，培养步骤应用于发酵液或培养基。在对生物质进行分离之前或之后都可进一步采用该培养步骤。优选地，在过滤之前进行培养以有利于过滤。
通过酸化发酵液或培养基且随后萃取N-取代的头孢菌素化合物到一种有机溶剂中的方法，就可从水相，即：发酵液或培养基中，分离出N-取代的头孢菌素化合物。如果发酵液或培养基没有在上述酸化和升温条件下进行培养，则典型地酸化在pH低于4，优选地低于3下进行。为显著地改善萃取效果，可往发酵液或培养基中加入一种合适的破乳化剂。
优选地，有机溶剂选自乙酸戊酯、乙酸丁酯、乙酸乙酯、甲基异丁基酮、环己酮、异丁醇或正丁醇。
如上所述用一种有机溶剂进行萃取时对非预期的β-内酰胺产物如：α-氨基己二酰基-7-ADCA和6-APA没有令人满意的选择性。因此，在本发明一个优选的实施方案中，应用一种洗涤方法来特异性除去这些化合物。洗涤方法的特征在于将有机溶剂萃取液和少量酸化水混合，随后分相。酸化水典型地pH值低于4，优选地低于3，更优选地低于2。另外，两相比例典型地在1∶1至1∶20之间(水∶有机溶剂)，优选地为1∶2(水∶有机溶剂)。
在常规方法中，可以用一种碱性溶液对有机相进行萃取而将N-取代的头孢菌素化合物反萃取到水中，获得的水性反萃取物，其pH范围为6-9之内。典型地，所用两相比例为1∶10(水∶有机溶剂)。该碱性溶液是一种含一种常规矿物碱，如：NaOH或NH3的水溶液。
优选地在一系列连续强力接触萃取器中进行萃取、洗涤和反萃取，例如该萃取器可以为一个强力混合器(如高剪切混合器)与一个离心分离仪的组合，优选地，可以是2-8个，更优选地是3-6个，最优选地是4-5个。
在分相后，水相被选择性地分开以除去有机溶剂。
随后，一种合适的二羧酸酰基转移酶与水溶液接触以使其中的N-取代的头孢菌素化合物去酰基化。例如，可以从相应的N-己二酰基衍生物形成7-ADCA或7-ACA。
已经发现可产生二羧酸酰基转移酶的微生物菌株为：产碱菌属(Alcaligenes)，节杆菌属(Arthrobacter)，无色杆菌属(Achromobacter)，曲霉属(Aspergillus)，不动杆菌属(Acinetobacter)，芽孢杆菌属(Bacillus)和假单胞菌属(Pseudomonas)。更特别地，下述种类的菌株可产生更合适的二羧酸酰基转移酶：木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosooxidans)，粘节杆菌(Arthrobacter viscosis)，节杆菌CA128，芽孢杆菌CA78，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)ATCC53667，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)J1，拟青霉(Paecilomyces)C2106，缺陷假单胞菌(Pseudomonas diminuta sp)N176，缺陷假单胞菌V22，少动假单胞菌(Pseudomonas paucimobilis)，缺陷假单胞菌BL072，假单胞菌菌株C427，假单胞菌SE83，假单胞菌SE495，卵状假单胞菌(Pseudomonasovalis)ATCC950，丛毛单胞菌属(Comamonas sp)SY77，假单胞菌GK16，假单胞菌SY-77-1，假单胞菌A14，泡囊假单胞菌(Pseudomonasvesicularis)B965，丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)，恶臭假单胞菌(Ps putida)ATCC17390，铜绿假单胞菌(Ps aeroginosa)NCTC10701，普通变形菌(Proteus vulgaris)ATCC9634，脆弱假单胞菌(Ps fragi)DSM3881和枯草芽孢杆菌(B.Subtilus)IFO3025。
二羧酸酰基转移酶可以任何合适的方法从产生其的微生物中获得，例如在US4,774,179中对假单胞菌SE83菌株的描述。同样，如SE83或SY77的二羧酸酰基转移酶的基因可在不同的合适宿主中表达，如大肠杆菌(E.coli),Matsuda等人在细菌学杂志(J.Bacteriology),1987,169:5818-5820中已对SE83菌株和在US5,457,032中已对SY77菌株作了报道。
分离自上述来源的酶通常被称作戊二酰基酰基转移酶。但是该酶的侧链特异性并不局限于戊二酰基侧链，它还同时适用于较短和较长的二羧基侧链。一些二羧酸酰基转移酶也表达出γ-谷氨酰基转肽酶活性，所以有时这些酶被归为γ-谷氨酰基转肽酶。
二羧酸酰基转移酶可以游离酶形式应用，并且也可以任何合适的固定化形式应用，如在EP0 222 462中所述。
在本发明的一个实施方案中，通过在酸性条件下结晶从该转化液中分离得到去酰基化头孢菌素化合物，如7-ADCA或7-ACA。典型地，通过调整水溶液的pH值从水溶液中获得去酰基化头孢菌素化合物结晶，水溶液pH值的调节是通过加入一种滴定剂使得水溶液的pH值达到范围2.5-4.5之内，优选地pH值为3-4。
在本发明的一个优选的实施方案中，从一种水溶液中结晶去酰基化头孢菌素化合物是通过将该水溶液加入到一个结晶容器中，应用一种合适的滴定剂使该结晶容器的pH值维持在固定的2.5-4.5的范围之内来实现。
在本发明的一个更优选地实施方案中，该结晶化可通过将水溶液加入到一系列互相连接的结晶容器中而逐步调整水溶液的pH值使终值在范围2.5-4.5之内来实现，即将水溶液加入到第一个结晶容器中，同时把第一个容器中的成分加入到第二个容器中，同时将第二个容器中的加入到第三个容器中，如此类推，其中应用一种合适的滴定剂来控制互相连接的容器中pH值范围，始于第一个器皿中的pH值与含去酰基化头孢菌素的水溶液的pH值相差约0.5-2个pH单位，而最后一个结晶容器的pH值终止在2.5-4.5范围之内。方便地，可应用一系列2-6个互相连接的结晶容器来调整含去酰基化头孢菌素的水溶液的pH值到期望的终值。
例如，为了从转化液中获得去酰基化头孢菌素的结晶，可用一种滴定剂(其是一种如硫酸、盐酸和/或硝酸的酸)应用一系列3-4个互相连接的结晶容器来使其pH值范围从8下降到3。
上述两个优选实施方案优选地以一种连续的方式来进行。
在本发明的另一个优选的实施方案中，可在如下述步骤进行的结晶化之前将转化液中的侧链、有色产物和痕量未转化的化合物除去。
将转化液酸化并与一种有机溶剂接触，例如乙酸戊酯、乙酸丁酯、乙酸乙酯、甲基异丁基酮、环己酮、异丁醇或正丁醇，以在结晶化之前除去侧链。可用一种酸，如硫酸，盐酸或硝酸或其组合来进行酸化处理，优选地为硫酸，以调整pH值低于3，优选地低于2。出人意料地，除了高效除去侧链物质之外，对有色杂质也获得了高效清除。
根据本发明的另一个优选的实施方案，污染性青霉素成分，如两性离子6-APA，其存在于本发明方法的一个或多个阶段产生的含头孢菌素的水溶液中(如发酵液或培养基、反萃取物、转化液或含有如分子式(Ⅰ)所示溶于水的去酰基化头孢菌素的溶液)，通过用CO2接触含青霉素杂质的液体，典型地为pH5-7，可大大减少该污染成分。二氧化碳可以任何合适的形式通入到该溶液中，例如：固体或气体形式或碳酸离子溶液的形式。含头孢菌素的水溶液在温度为10-60℃时通入二氧化碳，优选地为20-40℃时，其中用二氧化碳分子饱和该溶液4-10小时。在减少青霉素成分后，可实现如分子式(Ⅰ)所示的头孢菌素化合物的纯化。
在侧链萃取到一种有机溶剂之后，去酰基化头孢菌素化合物可以数种方式从水相结晶析出，如从上述提到的从水溶液中结晶去酰基化头孢菌素化合物。
在一个优选的操作方式中，水相的pH值被增加到2.5-5范围之内，优选地为3.5-4.5范围之内，这可通过将含去酰基化头孢菌素化合物的溶液一步加入到一个维持在期望pH值的结晶容器中或加入到一系列2-6个互相连接的结晶容器中(pH范围逐渐增加)来实现。这些方法可方便地以连续方式进行。
通过过滤或离心分离结晶，并在常规的连续或分批式干燥器中干燥。
所有上述步骤，即萃取、洗涤、反萃取和结晶均可以分批模式或分批补料模式进行，但因稳定性原因，优选的方法是连续模式。
下述实施例仅仅意在举例，且无论如何也不能把它们看作是一种限制。
实施例
1升己二酰基-7-ADCA培养基样品经过过滤除去生物质。用自来水洗涤菌丝体获得终体积约为2升的滤液。
约2升滤液在40℃用250ml6N硫酸酸化至pH为1.5。加入酸化滤液体积2/3的正丁醇，在强力混合后分离。水相应用正丁醇再这样处理两次。随后用0.25升pH为2的酸化水洗涤合并的有机相。所得有机相再用245ml2N NaOH溶液在20℃进行反萃取，待相分层后真空下将水相中痕量正丁醇除去。
135克水相在30℃时用去离子水稀释到总体积为650ml，且和4NNaOH混合直至pH为8.5。加入50克固定化去酰基化酶，在30℃,pH8.5条件下，加入了13.5ml4N NaOH两个小时后，收集水相。滤液用3份125mlpH0.4的水饱和正丁醇进行萃取。萃取过程中总共加入50.6ml37％的盐酸。残余水相用56.5ml8N NaOH中和，且用6N硫酸使pH降为5.3，便可从水相中获得没有正丁醇的结晶产物。5分钟后，溶液pH进一步降低到终值3.5。总共使用了15ml酸。过滤浆液且用50ml水洗涤结晶饼，干燥饼而获得纯度为96％的4.1克7-ADCA。