抗G3BP蛋白的单克隆抗体及应用 本发明涉及抗G3BP蛋白的单克隆抗体以及产生它们的细胞系。本发明还涉及这些抗体或其衍生物在制备药物和诊断试剂中的应用。
Ras基因的产物，一般称为p21Ras蛋白，在所有研究过的真核生物中对细胞分裂的调控起关键作用。对这些蛋白的一些特定修饰使其丧失正常的调控作用，并导致其具有致癌性。因此，许多人类肿瘤与修饰的ras基因的存在有关。另外，p21Ras蛋白的过量表达可导致细胞增殖的失调。总体来看，p21Ras蛋白参与30％的人类肿瘤。
因此，对这些p21Ras蛋白的确切理解成为肿瘤学领域的目标。
用于解释p21Ras蛋白功能的现有模型系基于这些蛋白与转导的G蛋白间的类似性。细胞中存在与GTP结合的活性p21蛋白和与GDP结合的无活性形式之间的平衡。在Ras蛋白没有激活的静息细胞中，大部分是GDP形式。当细胞被刺激时，核苷酸交换因子GEF变得更活泼，有助于GDP的离去和被GTP替代。该蛋白采取活性构型，使它可以识别和刺激其效应物-GAP蛋白，“GTP酶活化蛋白”。Ras-GTP-GAP复合物看来又与其他蛋白相作用，从而得以传导信号，导致细胞的生物学反应。Ras-GTP与GAP的结合同时起动GTP的水解和Ras蛋白向无活性形式(GDP)地回归。
在癌基因p21Ras蛋白中，其携带的突变阻止其返回无活性状态。此时平衡向Ras的活性形式移动。
p21Ras的活性和无活性形式间的这种复杂平衡同时受Ras蛋白生化特性固有的因素(对GDP和GTP的相对亲和力，核苷酸的交换速度等)和调节其活性的外部因子-特别是GAP蛋白-的控制。
GAP蛋白是一种存在于所有真核生物中的胞质蛋白，具有大大加速与正常p21蛋白相连的GTP水解的性能(Trahey和Mc Cormick1987)。它具有两个结构域，确定不同的功能。其羧基端具有催化活性，结合Ras蛋白并提高其GTP酶活性。在其另一端，氨基末端部分的上游，存在两个相邻的结构域SH2和SH3，它们可以参与与其他蛋白的相互作用。
本申请人已鉴定出Ras依赖性信号转导级联中的又一种蛋白。例如WO96/16169中描述了一种能与GAP的SH3结构域结合的蛋白(称为G3BP，即GAP-SH3结合蛋白)的识别、克隆、测序和特征鉴定。该申请特别证明G3BP是GAP的效应物，即干预Ras依赖性信号转导途径中上游的一种配体。Parker等的文章(分子细胞生物学，16(1996),2561)描述了该蛋白的序列、与GAP结合的能力等。该蛋白构成寻找抗癌治疗方法中的一个新的重要靶点。
G3BP蛋白是一种以遍在方式表达的68kD的胞质蛋白。G3BP蛋白和相应基因的序列示于SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中。该466个氨基酸的蛋白属于hnRNP家族(不均一核核糖核蛋白)，含有多个RNA结合蛋白的特征性结构域：
-RRM结构域(aa 342-385)，包括RNP2结构域(aa 342-347)和RNP1(aa 378-385)
-富含精氨酸、甘氨酸的结构域(aa 429-461)
-酸性辅助结构域(aa 144-221)。
申请人对G3BP蛋白的作用机制一直保持兴趣。因此，申请人已获得了针对G3BP蛋白不同结构域的不同抗体，以拮抗G3BP的活性或作为G3BP的效应物。
本发明一方面基于证明了G3BP蛋白在肿瘤细胞和在人类肿瘤(结肠腺癌和乳腺癌)中的过量表达，另一方面基于这样的惊人发现：某些抗G3BP蛋白的抗体能够在人肿瘤细胞中诱导细胞凋亡。现出人意料地证明，这些抗体在G3BP蛋白过量表达的肿瘤细胞中诱导凋亡而在G3BP表达低的正常人细胞中显示没有毒性。
本发明的第一个目标是抗G3BP蛋白并能在不同类型的肿瘤细胞中诱导凋亡的单克隆抗体。
更具体地讲，本发明的目标是能够识别位于G3BP蛋白N-末端部分的表位的单克隆抗体。有利地，所述表位含于G3BP蛋白的1和144位氨基酸之间，优选含于G3BP蛋白的1到72位氨基酸之间的表位。更优选，含于G3BP蛋白的22到55位氨基酸之间的表位，更优选由22-34位氨基酸组成的表位。
在一个特别有利的方案中，本发明涉及称为Mab 1F1并由杂交瘤细胞系G3B 1F1 1D1分泌的抗体，所述细胞系已于1998年6月9日以保藏号I-2038保藏在C.N.C.M.。
本发明还包括从以上定义的单克隆抗体衍生的抗体。在本发明中，所谓衍生抗体是指包含本发明单克隆抗体的独特型的任何分子，特别是嵌合抗体、单链抗体和Fab片段。嵌合抗体可以按照Morrison等，细菌学杂志(J.Bacteriol.),159:870(1984)；Neberger等，自然(Nature)312:604-608(1984)；Takeda等，自然，314:452-454(1985)(这些文献均引入本文)所述的技术获得。含有本发明抗体独特型的Fab片段可通过本领域技术人员已知的任何技术产生。例如，这些片段包括但不限于：F(ab’)2片段，可通过胃蛋白酶消化抗体而产生的片段；可通过还原F(ab)2片段的二硫键获得的Fab’片段，以及可通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体获得的Fab片段。
本发明的目标还在于从上述单克隆抗体衍生的单链抗体ScFv。这种单链抗体可通过专利US4,946,778,US5,132,405和US5,476,786中所述技术获得。
本发明还涉及含有上述单克隆抗体所衍生单链抗体的编码基因的核酸序列。这种序列的制备方法和体内表达抗体的应用在专利申请WO94/29446(引入本文)中有述。
本发明的目标还在于含有编码上述单克隆抗体所衍生单链抗体的核酸序列的病毒或质粒载体。更优选，本发明的载体源自病毒，例如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、HSV病毒等。
本发明还涉及编码这些ScFv的核酸序列或含有它们的载体在制备治疗或外科处理人或动物体的药物组合物中的应用。本发明还涉及含有如上所定义的载体(特别是病毒载体)或核酸序列的药物组合物。
本发明的目标还在于能分泌本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
本发明更具体地涉及于1998年6月9日以保藏号I-2038保藏于国家微生物培养物保藏中心(Collection Nationale des Cultures deMicroorganismes)(C.N.C.M.)的分泌抗体Mab 1F1的杂交瘤细胞系G3B 1F1 1D1。
本发明还涉及能在不同肿瘤细胞系中诱导细胞凋亡的单克隆抗体的制备方法，其包括(1)将用G3BP蛋白或至少含有N-末端结构域(aa1-144)一部分的片段所免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞在形成杂交瘤的条件下融合；(2)检测并分离所述分泌能在不同肿瘤细胞系中诱导细胞凋亡的单克隆抗体的杂交瘤。
本发明还涉及如上所定义的抗体在制备药物中的应用。本发明更具体地涉及所述抗体在制备治疗或预防过度增殖性疾病的药物中的应用。
本发明还涉及含有治疗有效量的本发明抗体和任选与之混合的药物可接受的载体的药物组合物，所述量对在肿瘤细胞中诱导细胞凋亡是治疗有效的。
本发明的抗体还可以作为诊断试剂用于鉴定或定量测定G3BP蛋白。实际上，已证明G3BP蛋白在肿瘤细胞中过量表达，并且该过量表达构成细胞增殖现象中的标志。因此这些抗体可特别用于诊断引起G3BP蛋白过度表达的过度增殖性疾病。
本发明因而还涉及如上所定义的抗体作为诊断试剂的应用以及含有所述单克隆抗体的免疫诊断试剂盒。
这些抗体可以与生色的、荧光的、生物素化的、放射性的或其他标记偶联。这些抗体可以用于免疫组织化学、流式细胞记数中的免疫标记方法，用于放射免疫测定(RIA)或免疫酶测定(ELISA)，和任何类型的已知诊断试剂盒中。
本发明的抗体还可用于实现G3BP蛋白的功能研究。具体讲，这种功能研究导致鉴定出衍生自G3BP蛋白并具有促凋亡活性的新肽。因此，本发明还涉及衍生自G3BP蛋白并能够诱导凋亡的新肽。优选，本发明的肽含有N-末端片段，更优选这些肽含有至少G3BP蛋白前14个氨基酸的结构域。
除以上所述外，本发明还包括来自以下实施例的其他特征和优点，这些实施例应视为对本发明的说明而不是对其范围的限制。
【附图说明】
图1：通过Western印迹鉴定抗体Mab 1F1所识别的不同G3BP结构域。
图2：不同细胞系的G3BP蛋白表达水平的比较。
图3：HCT116细胞中微注射抗体Mab 1F1的效果。
图4：人蛋白G3BP和G3BP2间的序列比较。N-末端序列的比较显示出多个差异，用分音符表示。
材料和方法
所用细胞系
HCT116：来自具有突变Ki-ras基因和DCC肿瘤抑制基因的突变的人结肠癌的上皮细胞。要求的培养基：DMEM,10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素，1％谷氨酰胺。
Hke-3和HK2-6：通过缺失Ki-ras基因修饰从而丧失致肿瘤能力的HCT116细胞。(参见：Shirasawam,..Sasazuki.(1993)，科学260,85-88)。要求的培养基：DMEM,10％胎牛血清，400ug/ml遗传霉素，1％青霉素/链霉素，1％谷氨酰胺。
H460：来自具有突变Ki-ras的人非小细胞肺癌的上皮细胞。要求的培养基：DMEM,10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素，1％谷氨酰胺。
H1299：来自ATCC。来自具有突变N-ras基因和p53基因缺失的人肺癌的上皮细胞。要求的培养基：DMEM,10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素，1％谷氨酰胺。
HeLa：来自没有ras基因突变的人宫颈癌的上皮细胞。要求的培养基：DMEM,10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素，1％谷氨酰胺。
HT-29：来自ATCC。来自具有p53基因突变但没有ras基因突变的人结肠癌的上皮细胞。要求的培养基：DMEM,10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素，1％谷氨酰胺。
DLD-1：来自ATCC。来自具有Ki-ras基因突变和p53基因突变的人结肠癌的上皮细胞。要求的培养基：DMEM,10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素，1％谷氨酰胺。
T47：来自ATCC。分离自乳腺癌患者胸膜流出液的细胞。要求的培养基：RPMI,10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素，1％谷氨酰胺。
BT20：来自人乳腺癌的细胞。要求的培养基：RPMI,10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素，1％谷氨酰胺。
MCF-7：来自人乳腺癌的细胞。要求的培养基：RPMI,10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素，1％谷氨酰胺。
T24：来自ATCC。来自人膀胱癌的细胞，具有Ha-ras基因的突变。要求的培养基：RPMI,10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素，1％谷氨酰胺。
NHDF：来自Boerhinger Ingelheim。没有突变基因的正常人皮肤成纤维细胞(成年人)的初级培养物。供应商的培养基。
实施例
实施例1：单克隆抗体的制备
1.1-G3BP蛋白的产生
按Parker等(分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol)16(1996)2561)中所述方法进行SF9细胞的培养。这些细胞在HNTG缓冲液(50mMHEPES,pH7.5,150mM NaCl,1％Triton X100,10％甘油,1mM MgCl21mM EGTA；存在磷酸酶抑制剂(1mM Na3VO4,10mM Na4P2O7,10mM NaF)及蛋白酶抑制剂(1μg/ml亮抑蛋白酶肽，1μg/ml胰蛋白酶抑制剂，1μg/ml胃蛋白酶抑制剂A,2μg/ml抑蛋白酶肽，10μg/ml苄脒，1mM苯基甲磺酰氟，1μg/ml抗蛋白酶，1μg/ml胰凝乳蛋白酶抑制剂))存在下溶解。离心溶胞产物并在HG洗涤缓冲液(50mMHepes pH7.5,10％甘油，1mM EGTA，存在磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂)中稀释5倍。然后将溶胞产物与Heparin-Sepharose Fast Flow凝胶(Pharmacia LKB)以每毫升凝胶15mg蛋白的比例保温12小时，所述凝胶在相同缓冲液(50mM Hepes,0.030M NaCl,0.2％TritonX100,10％甘油，1mM MgCl2,1mM EGTA)中平衔。将该复合物转移到K26 Pharmacia柱中。用10体积的平衡缓冲液洗柱(50ml/小时)，然后用100mM NaCl再用600mM NaCl洗脱蛋白。合并含GAP-SH3结合活性的流份，在HG缓冲液中稀释10倍，并以每毫升凝胶1.3mg蛋白的比例上样于琼脂糖-聚尿苷酸AGPOLYCU柱(6型柱，19cm2×1cm,Pharmacia)。柱在相同缓冲液中以5ml/cm2/h的流速预平衡。用HNG缓冲液(60mM NaCl)洗涤后，用229ml缓冲液以0.06-0.32MNaCl线性梯度洗脱杂质蛋白，在0.7M NaCl存在下洗脱G3BP蛋白。POLY(U)层析后，合并含有G3BP蛋白的流份，在磷酸盐缓冲液pH7.5+蛋白酶抑制剂中稀释12倍，上样于用含60mM NaCl的相同缓冲液以30ml/h的流速预平衡的MonoS HR5/51ml(Pharmacia)柱上。洗柱后，用40ml缓冲液以0.06-1M NaCl的线性梯度洗脱蛋白质。G3BP蛋白在0.15M-0.2M NaCl之间被洗脱。
1.2-小鼠的免疫接种方法
在免疫的D0天给6周龄雌性BALB/c小鼠腹膜内注射25μgG3BP。在免疫的D14天进行第二次腹膜内注射，在D45和D80天进行第三和第四次注射。在D165天通过静脉途径进行第五次注射(10μgG3BP蛋白)，三天后取脾细胞并融合。将脾细胞一方面与SP2/O-Ag14小鼠骨髓瘤细胞融合另一方面与X63Ag8/653细胞融合。脾细胞/骨髓瘤细胞的比例为5∶1。在聚乙二醇PEG pm1500(终浓度40％)存在下进行淋巴细胞杂交。在每孔10,000个Balb/c小鼠腹膜巨噬细胞存在下准备16个96孔平板。所用脾细胞的量在每孔2.5×104-105细胞之间。所用培养基含有RPMI 1640(Bionhittaker和Gibco)，2mM谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，HAT:100mM次黄嘌呤、0.4μM氨基蝶呤、16μM胸苷，220％去补体胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素。
融合后3天出现第一批克隆，融合后7天更换培养基，最后在融合后10天每孔加入5000个巨噬细胞。鉴别出只有一个杂交瘤生长的孔，取上清液用于筛选。
融合杂交瘤的上清液用Western印迹筛选。对ER22细胞和HCT116细胞的细胞提取物(50ug)、重组G3BP蛋白以及SAM68对照蛋白在7.5％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上进行电泳，转移到聚偏二氟乙烯膜上(PVDF,Millipore Corpo.)。用ECL缓冲液(20mM Tris,pH7.4,150mM NaCl,0.05％Tween 20)中的2％脱脂牛奶室温下封闭非特异性结合2小时。
将在封闭缓冲液中稀释至1/50的各种上清液与这些膜在4℃保温过夜。用ECL缓冲液-0.05％ Tween20洗涤后，通过与偶联有过氧化物酶的抗小鼠抗体及化学发光试剂ECL(NEN Life Science Product)保温检测结合的蛋白质。
由该筛选获得了三个杂交瘤，它们是杂交瘤G3B 1E1、G3B 1F11D1和G3B 11H7。
实施例2-鉴定抗体MaB 1F1识别的表位。
按Parker等(分子细胞生物学，16(1996)2561)中描述的技术在重组杆状病毒感染的昆虫细胞(SF9)表达系统中产生了G3BP蛋白的不同片段。这些片段是片段“1”(aa72-350),“2”(aa72-235),“3”(aa144-341),“4”(aa236-350)和“5”(aa299-466)。用这些由杆状病毒系统产生的片段进行了Western印迹试验。
2.1-Western印迹检测蛋白
除去培养基后，4℃下用磷酸盐缓冲液洗涤这些增殖细胞2次。在1ml HNTG缓冲液(50mM HEPES pH7.5,150mM NaCl,1％Triton X-100,10％甘油，1mM MgCl2)+磷酸酶抑制剂(1mM Na3VO4,10mMNa4P2O7,10mM NaF)+蛋白酶抑制剂(1μg/ml亮抑蛋白酶肽，1μg/ml胰蛋白酶抑制剂，1μg/ml胃蛋白酶抑制剂，10μg/ml苄脒，1mM苯基甲磺酰氟，1μg/ml抗蛋白酶，1μg/ml胰凝乳蛋白酶抑制剂)存在下在培养板上直接进行细胞溶解。在7.5％十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺(PAGE)电泳凝胶上分离蛋白(16小时，60伏)，然后用半液体转移法将蛋白转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore Corp.)上。在转移缓冲液25mM Tris Base,192甘氨酸，0.15％SDS,20％甲醇中在60伏电压下4℃转移3小时。用PBS洗膜，然后在加有0.05％Tween20和2％脱脂牛奶的PBS中室温饱和2小时。该膜在含第一抗体的ECL缓冲液(20mM TRIS,pH7.4,150mM NaCl)+0.05％Tween 20+2％脱脂牛奶中4℃保温12小时。将抗体MAB 1F1稀释至1/10000。然后在ECL缓冲液+0.05％Tween20中室温下洗涤4或5次，每次10分钟。然后室温下45分钟内在ECL+0.05％Tween20存在下加入第二抗体(抗小鼠抗体)。这些抗体与过氧化物酶偶联，使得可以通过增强化学发光技术(ECL)显示蛋白质。在FBS缓冲液+0.05％Tween20中洗膜4或5次，在ECL试剂中保温1分钟。按供应商(NEN Life Science Product)推荐的方法进行显示。
结果示于图1中，其表明抗体Mab 1F1可以检测到片段“1”(aa72-350)和“2”(aa72-235)。含有一个与片段“2”的共享区的中央片段“3”(aa144-341)不被识别。片段“4”(aa236-350)和“5”(aa299-466)也不被识别。
这些结果表明，抗体Mab1F1识别的表位位于G3BP蛋白N-末端区域中，相应于G3BP蛋白酸性结构域(aa144-221)上游144个氨基酸(特别是含100个氨基酸)的区域中。
实施例3：不同细胞系中的G3BP蛋白的表达水平
在人结肠直肠肿瘤和不同的肿瘤细胞中研究了G3BP蛋白的表达水平。
3.1-G3BP在不同的人细胞系中的表达水平
在该实验中，通过刮擦并以2000转/分离心5分钟收集沉淀来收获得培养细胞。然后在100mM Hepes缓冲液pH7.2,140mM KCl,5mM MgCl2,0.2％NP40和蛋白酶抑制剂中4℃溶解细胞45分钟。以14000转/分离心溶胞产物10分钟，取上溶液。测定蛋白质量,上清液在4×Laemmli缓冲液中变性并于95℃处理10分钟。
将相当于50μg蛋白的不同溶胞产物置于SPS-PAGE Novex 10％丙烯酰胺微凝胶孔中，共10个孔，1.5mm厚。
迁移、电转移至PVDF膜上并将膜在含3％BSA的TTBS缓冲液[20mM TRIS pH7.5,150mM NaCl,0.1％Tween 20,0.02％叠氮化钠]中钝化后，将样品进行Western印迹：
将膜与在含3％BSA的TTBS缓冲液中稀释至0.2μg/ml的抗体Mab 1F1保温2小时，然后用TTBS洗4次，每次10分钟，然后与用过氧化物酶标记的抗鼠抗体保温1小时，再用TTBS洗4次，每次10分钟。然后这些膜用NEN-Dupont的ECL(化学发光)试剂盒在ECLAmersham膜上显示。
结果示于图2a中。所得的膜显示与正常成纤维细胞系NHDF相比，所测的所有肿瘤细胞系中G3BP蛋白均过量表达。这种过量表达的水平依不同的细胞系而不同，但不取决于这些细胞系中ras基因的激活状态；具有突变Ki-ras基因的细胞系如HCT116、H460或DLD-1强弱不同地表达G3BP蛋白，而不具有ras基因突交的细胞系如HeLa或HT29具有同样强的G3BP表达水平并且是可变的。
但可以证实其中缺失了Ki-ras基因的Hke-3和HK2-6细胞与其来源细胞HCT116相比G3BP表达水平降低，但不是这种表达消失。
在人活检中G3BP的表达水平
将健康或肿瘤组织的样品固定在薄板上。在每个薄板的组织上加40μl HNTG缓冲液进行样品的溶解。将提取物以14000转/分离心10分钟，取上清液。测定蛋白质，并用4X Laemmli缓冲液于95℃处理10分钟进行变性。
将20-30μg蛋白质的样品在7.5％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶上进行电泳，然后转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF,Millpore Corpo.)上。非特异性结合通过用ECL缓冲液(20mM Tris,pH7.4,150mM NaCl,0.05％Tween 20)中2％脱脂牛奶室温处理2小时来封闭。
然后将膜与在封闭缓冲液中稀释至0.2μg/ml的抗体Mab 1F1于4℃保温过夜。用ECL缓冲液-0.05 Tween20洗涤后，与偶联有过氧化物酶的抗鼠抗体和ECL化学发光试剂(NEN Life Science Product)保温检测结合的蛋白质。
图2b中所示结果表明G3BP蛋白在中等分化和分化良好的腺癌中过量表达。
实施例4：抗体Mab 1F1的微注射对人肿瘤细胞存活性的影响
本实施例证明本发明抗体在不同类型肿瘤细胞中诱导细胞凋亡的特性。
按如下方法注射单克隆抗体Mab 1F1。将待注射的溶液对PBS透析，通过0.45μm UltraFree Millipore滤膜并离心(14000rpm,5分钟)，然后用一细长针“微量载样品”(Roucaire)引入到微管中。注射时间调节在0.1-0.3秒，注射压力根据细胞大小在50hPa至150hPa之间。每个条件下注射约200个细胞。
给HCT116、H460、H1299、HeLa或Hke-3细胞微注射10mg/ml的单克隆抗体Mab 1F1，然后通过录像显微镜(以每分钟2个画面)在注射后3天中拍摄并记录。通过观看录像，可以观察(分裂，细胞死亡，形态变化)并定量(每小时分裂或死亡的细胞数)被注射细胞的变化。只计算在浓缩和片断化(在凋亡细胞中可观察到的现象)后与支持物分离的细胞。
HCT 116细胞中注射抗体Mab 1F1获得的结果报告在图3中。可以看出，在注射抗体Mab 1F1后12小时开始诱导出高细胞死亡百分率，峰值出现在24-48小时之间。
在HCT 116细胞中测试了抗体Mab 1F1的不同剂量。从10mg/ml到3mg/ml，诱导细胞死亡的效果是相同的，即抗体Mab 1F1诱导至少50％的注射细胞死亡。在1mg/ml抗体时，效果大大降低。
如果对HCT 116细胞注射10mg/ml浓度的小鼠免疫球蛋白作为对照，没有观察到任何细胞死亡，注射细胞继续正常分裂。
抗体Mab 1F1在HCT 116细胞中的这种毒性作用已用荧光“TUNEL”法证实，后者可以特异性地检测进入凋亡程序细胞的DNA断裂：
将细胞接种在方格载玻片(cellocates-Roucaire)上并置于4孔板中。接种后2天，在这些玻片上给细胞注射抗体Mab 1F1或作为对照的小鼠免疫球蛋白，浓度为10mg/ml。注射后，将细胞放在恒温箱中40小时。然后用4％甲醛固定15分钟，用0.2％Triton×100通透化5分钟，用磷酸盐缓冲液冲洗数次。然后用如下物质37℃下进行双标记1小时：
-稀释至1/400的Texas红标记的抗小鼠抗体，其将显示注射的细胞，
-Boerhinger“原位细胞死亡检测”试剂盒，其将特异性地将凋亡细胞的DNA断裂标记为绿色。
然后将小载玻片安装在安装介质中的玻璃片上(Vectashield-Biosys)。
利用选择不同颜色的滤光片进行荧光发光观察，分别计算注射的细胞和凋亡的细胞。
在3个独立的试验中也得出，在40小时中9-18％的HCT116细因凋亡而死亡。在相同的条件下，没有观察到任何注射对照免疫球蛋白的HCT 116细胞的死亡。
微注射抗体Mab 1F1后的录像试验用H460、H1299、HeLa和Hke-3细胞重现了图3所示相似的结果，即显示在注射后12-60小时至少50％的注射细胞死亡。
用HCT 116和H460细胞进行了“TUNEL”标记试验，并给出了相似的结果(注射抗体后40小时9-18％的细胞进入凋亡)。
实施例5：微注射抗体Mab 1F1对人正常成纤维细胞NHDF的存活性和增殖的影响
5.1-微注射抗体Mab 1F1对人正常成纤维细胞NHDF存活力的影响
微注射抗体Mab 1F1的增殖性NHDF细胞的录像试验表明，在注射后60小时中没有观察到任何细胞死亡，细胞继续正常分裂。
5.2-微注射抗体Mab 1F1对人正常成纤维细胞NHDF增殖的影响
正常的培养细胞需要提供生长因子。如果除去这些因子，细胞就进入所谓“静止”的“非增殖”期，在此期间它们不再复制其DNA，因而不再吸收溴代脱氧尿苷(加入培养基中的胸甘类似物)，只有增殖的细胞才能吸收该物质进入其DNA。
当在静止NHDF细胞中微注射10mg/ml浓度的抗体Mab 1F1并将这些细胞放回含有生长因子和溴代脱氧脲苷(BrdU)的培养基中时，接触24小时然后固定并用抗-BrdU抗体显色后，观察到细胞增殖33％的抑制。
通过将注射抗体Mab 1F1并含有BrdU的细胞百分比与注射小鼠免疫球蛋白并含有BrdU的细胞(对照)百分比相联系来计算这种抑制。
在相同条件下给NHDF细胞注射另一种单克隆抗-G3BP(11H7)。
表1：注射G3BP的特异抗体 对NHDF细胞的细胞生长的影响 注射的抗体 含BrdU的百分比小鼠免疫球蛋白(IgG) 44.7 Mab 1F1 29.7 11H7 30.3
可以看出，免疫球蛋白不妨碍细胞增殖，而抗体11H7有与抗体Mab 1F1相似的作用，即它们引起32-33％的增殖抑制。
可将这种抑制归因于抗体Mab 1F1或11H7对内源性G3BP蛋白的封闭。对此，有趣的是注意到这种增殖停止在正常细胞NHDF中只是暂时的并不引起任何细胞死亡。事实上，当抗体在胞浆中被自然降解时(细注射后40小时)细胞恢复了其正常周期。
实施例4和5的结果表明抗体Mab 1F1在至少50％的过量表达G3BP的受试人肿瘤细胞中诱导凋亡，但注射到正常人细胞(G3BP低表达)中时显示无毒性。这种在肿瘤细胞中的效果看来与ras基因的活化状态无关。另外，当注射到静止细胞中时，抗体Mab 1F1引起正常细胞NHDF增殖的暂时停止或延迟。
实施例6-从杂交瘤G3B 1F1 1D1克隆和表达抗-G3BP细胞内抗体的编码DNA序列。
本实施例描述可再现单克隆抗体Mab 1F1特性的细胞内抗体的编码核酸序列的克隆和表达。
6.1-DNA序列的制备
按照专利US4,946,778中描述的技术制备编码细胞内抗体(ScFv片段)的DNA序列。然后将该序列置于哺乳动物细胞中有功能的启动子控制下。
按照Chirguin S.H.等(Biochemistry 18,5294(1979))描述的技术从杂交瘤G3B 1F1 1D1的细胞培养物分离RNA polyA。利用由随机六核苷酸形成的鼠引物，将这些RNA用于逆转录反应。所得的cDNA用作两个PCR反应的模板：
-一个用于以特异的VH引物扩增重链可变片段(VH)，
-另一个PCR利用源自鼠序列的10个引物的混合物用于获取VL片段。
这样获得了340bp和325bp的两个片段，并借助于一个接头组装，后者可允许VH cDNA的5′端与VL的cDNA正确定位。PCR(重组噬菌体抗体系统小鼠ScFv模型，Pharmacia,27-9400-01)。
将融合的核酸序列VH-接头-VL然后插入在能表达细胞内抗体的噬菌粒中。通过这种表达可易容地鉴定和筛选正确识别抗原的细胞内抗体。利用ELISA试验筛选能识别G3BP的抗体从而实现该步骤(重组噬菌体抗体系统表达模型，Pharmacia,27-9401-01)。
6.2-修饰的细胞内抗体的功能评价
通过限制酶从噬菌粒分离编码抗G3BP的修饰的细胞内抗体的序列，然后插入在SV2载体中(Schweighoffer等，科学，256,825-827(1992))或pCDNA3载体中(InVitrogen,V790-20)。如此获得的质粒称为pSV-ScFvG3BP或pCDNA3ScFvG3BP。利用如下所述试验进行功能评价。
a)按照上文所述技术在非永生化哺乳动物细胞NHDF和转化的细胞系(HCT116、H460、HKe-3、H1299、Hela)中微注射，检查转化细胞系中的细胞凋亡，并通过与抗体Mab 1F1的活性相比较测量细胞内抗体对细胞存活性的影响。
b)对转化细胞和肿瘤细胞的neo-抗性试验。将质粒pCDNA3G3BP转染至转化细胞系(HCT116、Hke-3、H460、H1299、HeLa)以及非转化的人细胞中。转染后3天，在遗传霉素存在下筛选转化的细胞。在此试验中，单链抗体与G3BP的片段(其相应的核酸序列包含在相同的表达载体中)相似，都抑制肿瘤细胞的生长。
c)抑制病性形成。按WO94/29446中描述的技术测定单链抗体抑制病性形成的能力。对于抑制肿瘤能力的试验，还可以在用Ras以外的癌基因转化的情形下研究其效果。
d)研究ScFv的表达对G3BP1与DNA的结合活性和/或RNA的内切核酸酶酶解断裂的影响。事实上，微注射单克隆抗体Mab 1F1所诱导的凋亡可通过两种方式解释，即与特异性蛋白配偶体相互作用的解离，或与RNA结合的活性和/或内切核酸切割活性的改变。还可以对所获的ScFv抗体通过其改变这些相互作用的能力来表征。
实施例7：鉴定G3BP1蛋白上抗体Mab 1F1的另一识别域。人蛋白G3BP和G3BP2(或G3BPh)间的序列比较。
G3BP蛋白属于一个蛋白家族的一部分，该家族中有短的G3BP2蛋白，其与G3BP在核苷酸水平有60.9％的相同性，在蛋白水平有58.9％的相同性，还有长的G3BP2蛋白(AB 014560,Genbank)。长型的G3BP2蛋白相当于在G3BP2(短型)序列的790位有99个核苷酸的插入片段。
蛋白G3BP和G3BP2间蛋白序列的比较显示蛋白的主要结构域保守，即：
1．N-末端区(代表与NTF2蛋白(核转运因子2)的同源性)，为单克隆抗体Mab 1F1的耙点，
2．酸性区，
3．参与蛋白-蛋白相互作用的富含PXXP基元的区域，
4．含有RNA识别的RRM结构域和辅助基元“RGG”盒(精氨酸，甘氨酸，甘氨酸)的区域。
令人注意的是，单克隆抗体Mab 1F1在Western印迹实验中不能识别重组G3BP2蛋白(短型)。N-末端序列对比显示出如图4中用分音符标出的多处不同。
利用覆盖不同分散区域的肽得以精确确定G3BP蛋白上的抗体识别域。
首先，通过上述蛋白序列的比较合成了不同的肽(A-F)：
肽A：LLNQAPDMLHRFY
G3BP蛋白的22-34位氨基酸
肽B：LLNKAPEYLHRFY
G3BP2蛋白的22-34位氨基酸：
肽C：HGGLDSNGKPADAV
G3BP蛋白的42-55位氨基酸
肽D：HGGVDASGKPQEAV
G3BP2蛋白的42-55位氨基酸
肽E：LLSNNNQALRRFMQ
G3BP蛋白的97-111位氨基酸
肽F：HNDIFRYQDEVFG
G3BP蛋白的127-139位氨基酸。
然后测试这些肽：
(ⅰ)在ELISA试验中测其识别抗体Mab1F1的能力，
(ⅱ)在Western印迹试验中测其抑制抗体Mab 1F1对G3BP蛋白识别的能力。
(ⅰ)在ELISA试验中测抗体A-F
通过4℃吸附过夜将碳酸盐缓冲液(0.1M,pH7.6)中10mg/ml的肽溶液固定在96孔板上。用PBS洗涤后，各孔在室温下用PBS/BSA 1％缓冲液饱和4小时。用PBS/0.05％Tween洗三次后，将各孔与纯化抗体Mab 1F1在PBS/0.2％BSA中的稀释液(10ng/ml-1pg/ml)室温接触1小时。用PBS缓冲液/0.05％Tween洗三次后，各孔与偶联有过氧化物酶的抗小鼠抗体稀释液(PBS/0.2％BSA中稀释至1/1000)(Pharmacia)于室温保温1小时。用PBS缓冲液/0.05％Tween洗三次后，混合下列成分进行比色反应：10ml水，一片OPD,100ml甲醇和25ml H2O2。用50ml 4N H2SO4终止反应，在492nm进行分光光度计读数(参考滤光片620nm)。
所得结果显示肽A在该试验中是反应活性最高的，在ELISA试验中能够识别抗体Mab 1F1。这些结果提示，被抗体Mab 1F1识别的表位位于G3BP的22-34位氨基酸确定的区域中。用抗体1E1进行的相同试验得出了相同的结果。
(ⅱ)测定肽A-F抑制Western印迹试验中抗体Mab 1F1识别G3BP蛋白的能力的试验
按实施例2中所述技术(2.1:Western印迹检测蛋白)进行蛋白的Western印迹检测。为了进行竞争试验，将抗体与膜接触之前与肽稀释液37℃下预保温2小时。每种肽测定了2种浓度：相对于抗体10和100倍摩尔过量。然后如实施例2.1中所述进行显示。
所得结果显示，肽A和C能够动摇G3BP蛋白与抗体Mab 1F1间的相互作用(主要是100X摩尔过量时)。
这些结果总体显示肽A(G3BP的22-34位氨基酸)和肽C(G3BP的42-55位氨基酸)相应于G3BP的参与抗体Mab 1F1识别的结构域。
从G3BP和短型G3BP2间的序列对比得以鉴定出不同的肽并证明它们在G3BP对细胞凋亡的调控中的作用，以这些结果得以设想各种应用，特别是这些肽在分子模型建立中的应用，以获得模拟这些肽或含有它们的多肽的效果的小分子。另外，这些肽还可用于消除G3BP蛋白与细胞配偶体间的相互作用；这种细胞配偶体可以是G3BP本身，因为已证明该蛋白能够二聚化，这种配偶体还可以是已知的配偶体(Ras GAP)或新鉴定的配偶体。对此，与树脂偶联的这些肽可用于G3BP分子配偶体的研究。最后，在对蛋白-蛋白相互作用的抑制基础上可建立筛选治疗有用分子的模型。
实施例8：G3BP1片段的构建和这些片段的促凋亡活性
鉴于实施例7中所得的结果，构建了用于表达G3BP N-末端片段的质粒，以测定这些片段的促凋亡活性。为此，用下列引物通过PCR扩增了这些片段：
A-G3BP中5′寡核苷酸(核苷酸1)
cccgtcgacatggtgatggagaagcctagtcccctg
B-G3BP中5′寡核苷酸(核苷酸42)
cccgggtcgactttgtgagacagtattacaca
C-G3BP中3′寡核苷酸(核苷酸150)
cccgggtgcggccgcctttccatttgaatccaatcc
通过PCR扩增了片段(1-150)和(42-150)(50℃下30个循环)，用限制酶Sal1和Not1水解，然后插入商业载体pCMV/cyto中(Invitrogen,pShooter Vecotr手册Ⅱ,C版)。
所得片段的序列如下所述：来自载体并将被翻译的序列用大写字母表示，G3BP cDNA的序列用小写字母表示。下划线区相应于编码myc标签的载体序列。(片段1-150)5’ATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGTCatggtgatggagaagcctagtcccctgctggtcgggcgggaatttgtgagacagtattacacactgctgaaccaggccccagacatgctgcatagattttatggaaagaactcttcttatgtccatgggggattggattcaaatggaaagGCGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGGGCCGCATAG 3’
相应的多肽如下所示。该多肽含有相应于G3BP蛋白(其序列示于SEQ ID No.1中)的1-50位氨基酸的片段，该片段用黑体字母表示如下。MAQVQLQVMVMEKPSPLLVGREFVRQYYTLLNQAPDMLHRFYGKNSSYVHGGLDSNGKAAAEQKLISEEDLNGAA(片段42-150)5’ATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGTCtttgtgagacagtattacacactgctgaaccaggccccagacatgctgcatagattttatggaaagaactcttcttatgtccatgggggattggattcaaatggaaagGCGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGGGCCGCATAG 3’
相应的多肽如下所示。该多肽含有相应于G3BP蛋白(其序列示于SEQ ID No.1中)的15-50位氨基酸的片段，该片段用黑体字母表示如下。MAQVQLQVFVRQYYTLLNQAPDMLHRFYGKNSSYVHGGLDSNGKAAAEQKLISEEDLNGAA
将含有G3BP核苷酸序列的1-150和42-150片段的构建物转染到转化细胞系NIH3T3Ras和NIH3T3 Raf中。这些细胞系是用癌基因Ki-Ras Val 12或病毒形式的癌基因v-Raf转化NIH3T3细胞后获得的。
为了检测细胞凋亡，2mg质粒通过脂转染胺(Gibco-BRL)转染，转染后48小时通过FACS分析测定凋亡。凋亡中的细胞相应于亚G1期的细胞。
在这些条件下，表达G3BP序列1-150片段的构建物(编码含1-50位氨基酸的G3BP片段)能够诱导凋亡(4倍)，而表达G3BP序列42-150片段的构建物(编码含15-50位氨基酸的G3BP片段)不具有该特性。
这些结果显示相应于G3BP 1-14位氨基酸的结构域是参与凋亡诱导的结构域。鉴定该G3BP结构域并证明含G3BP 1-14位氨基酸相应结构域的多肽在凋亡控制中的作用，得以开发这些多肽在预防、改善和/或治疗涉及细胞过度增殖的疾病的应有。
实施例9与huG3BP1片段之融合蛋白的构建
制备了用于表达实施例7中所示肽的构建物。相应于这些肽的序列与GST蛋白(谷胱甘肽S-转移酶)融合以使其稳定。
寡核苷酸序列如下：
每个有义寡核苷酸的5′末端连有4个核苷酸以构成一个NcoⅠ位点，在3′末端连有终止密码子(TAA)和一个用于形成BamHⅠ位点的核苷酸。sq22s: tatgctgctgaaccaggccccagacatgctgcatagattttattaagsq22as:gatccttaataaaatctatgcagcatgtctggggcctggttcagcagca(序列66-105)sq44g1s: tatgggattggattcaaatggaaagccagcagatgcagtctaagsq44g1as:gatccttagactgcatctgctggctttccatttgaatccaatccca(序列130-166)sq44g2s: tatgggagtagatgctagtggaaagccccaggaagctgtttaagsq44g2as:gatccttaaacagcttcctggggctttccactagcatctactccca(序列130-166)sq64s: tatgcagaaagaaatccacaggaaagtgatgtcacaaaacttctaagsq64as:gatccttagaagttttgtgacatcactttcctgtggatttctttctgca(序列172-211)sq65s: tatgaaagtgatgtcacaaaacttcaccaactgctaagsq65as:gatccttagcagttggtgaagttttgtgacatcactttca(序列190-220)
通过从80℃冷却到室温将这些寡核苷酸成对杂交，用T4多核苷酸激酶(Boehringer)磷酸化，插入在载体“pBCcollGSTfusion”的NcoⅠ和BamHⅠ位点上。该载体可用于在真核细胞中从SV40启动子(Genbank,X78316)表达GST融合蛋白。将这些质粒转染到人细胞系Hela和H1299中(如材料和方法部分所述)；如实施例8所述用FACS测定所诱导的细胞凋亡。
序列表(1)一般信息： (ⅰ)申请人：
(A)名称：RHONE-POULENC RORER S.A.
(B)街道：Raymond ARON大街20号
(C)城市：ANTONY
(D)国家：法国
(F)邮编：92165 (ⅱ)发明名称：能与GAP蛋白SH3结构域结合的肽 (ⅲ)序列数：2 (ⅳ)计算机可读形式：
(A)载体类型：磁带
(B)计算机：IBM PC兼容
(C)操作系统：PC-DOS./MS-DOS
(D)软件：Patent In Release #1.0,#1.25版(EPO)(2)SEQED No.1的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：466个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链数：单链
(D)构型：线性 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID No.1:Met Val Met Glu Lys Pro Ser Pro Leu Leu Val Gly Arg Glu Phe Val1 5 10 15Arg Gln Tyr Tyr Thr Leu Leu Asn Gln Ala Pro Asp Met Leu His Arg
20 25 30Phe Tyr Gly Lys Asn Ser Ser Tyr Val His Gly Gly Leu Asp Ser Asn
35 40 45Gly Lys Pro Ala Asp Ala Val Tyr Gly Gln Lys Glu Ile His Arg Lys
50 55 60Val Met Ser Gln Asn Phe Thr Asn Cys His Thr Lys Ile Arg His Val65 70 75 80Asp Ala His Ala Thr Leu Asn Asp Gly Val Val Val Gln Val Met Gly
85 90 95Leu Leu Ser Asn Asn Asn Gln Ala Leu Arg Arg Phe Met Gln Thr Phe
100 105 110Val Leu Ala Pro Glu Gly Ser Val Ala Asn Lys Phe Tyr Val His Asn
115 120 125Asp Ile Arg Tyr Gln Asp Glu Val Phe Gly Gly Phe Val Thr Glu Pro
130 135 140Gln Glu Glu Ser Glu Glu Glu Val Glu Glu Pro Glu Glu Arg Gln Gln145 150 155 160Thr Pro Glu Val Val Pro Asp Asp Ser Gly Thr Phe Tyr Asp Gln Ala
165 170 175Val Val Ser Asn Asp Met Glu Glu His Leu Glu Glu Pro Val Ala Glu
180 185 190Pro Glu Pro Asp Pro Glu Pro Glu Pro Glu Gln Glu Pro Val Ser Glu
195 200 205Ile Gln Glu Glu Lys Pro Glu Pro Val Leu Glu Glu Thr Ala Pro Glu
210 215 220Asp Ala Gln Lys Ser Ser Ser Pro Ala Pro Ala Asp Ile Ala Gln Thr225 230 235 240Val Gln Glu Asp Leu Arg Thr Phe Ser Trp Ala Ser Val Thr Ser Lys
245 250 255Asn Leu Pro Pro Ser Gly Ala Val Pro Val Thr Gly Ile Pro Pro His
260 265 270Val Val Lys Val Pro Ala Ser Gln Pro Arg Pro Glu Ser Lys Pro Glu
275 280 285Ser Gln Ile Pro Pro Gln Arg Pro Gln Arg Asp Gln Arg Val Arg Glu
290 295 300Gln Arg Ile Asn Ile Pro Pro Gln Arg Gly Pro Arg Pro Ile Arg Glu305 310 315 320Ala Gly Glu Gln Gly Asp Ile Glu Pro Arg Arg Met Val Arg His Pro
325 330 335Asp Ser His Gln Leu Phe Ile Gly Asn Leu Pro His Glu Val Asp Lys
340 345 350Ser Glu Leu Lys Asp Phe Phe Gln Ser Tyr Gly Asn Val Val Glu Leu
355 360 365Arg Ile Asn Ser Gly Gly Lys Leu Pro Asn Phe Gly Phe Val Val Phe
370 375 380Asp Asp Ser Glu Pro Val Gln Lys Val Leu Ser Asn Arg Pro Ile Met385 390 395 400Phe Arg Gly Glu Val Arg Leu Asn Val Glu Glu Lys Lys Thr Arg Ala
405 410 415Ala Arg Glu Gly Asp Arg Arg Asp Asn Arg Leu Arg Gly Pro Gly Gly
420 425 430Pro Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gly Met Arg Gly Pro Pro Arg Gly Gly
435 440 445Met Val Gln Lys Pro Gly Phe Gly Val Gly Arg Gly Leu Ala Pro Arg
450 455 460Gln Glx465(2)SEQ ID No.2的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：2129个碱基对
(B)类型：核苷酸
(C)链数：单链
(D)构型：线性 (ⅱ)分子类型：cDNA (ⅲ)假拟：否 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID No.2:GCTTGCCTGT CAGGTCGACT CTAGAGCCCG GGTACCGAGC TCGAATTCGG CGGGGTTTGT 60ACTATCCTCG GTGCTGTGGT GCAGAGCTAG TTCCTCTCCA GCTCAGCCGC GTAGGTTTGG 120ACATATTTAC TCTTTTCCCC CCAGGTTGAA TTGACCAAAG CAATGGTGAT GGAGAAGCCT 180AGTCCCCTGC TGGTCGGGCG GGAATTTGTG AGACAGTATT ACACACTGCT GAACCAGGCC 240CCAGACATGC TGCATAGATT TTATGGAAAG AACTCTTCTT ATGTCCATGG GGGATTGGAT 300TCAAATGGAA AGCCAGCAGA TGCAGTCTAC GGACAGAAAG AAATCCACAG GAAAGTGATG 360TCACAAAACT TCACCAACTG CCACACCAAG ATTCGCCATG TTGATGCTCA TGCCACGCTA 420AATGATGGTG TGGTAGTCCA GGTGATGGGG CTTCTCTCTA ACAACAACCA GGCTTTGAGG 480AGATTCATGC AAACGTTTGT CCTTGCTCCT GAGGGGTCTG TTGCAAATAA ATTCTATGTT 540CACAATGATA TCTTCAGATA CCAAGATGAG GTCTTTGGTG GGTTTGTCAC TGAGCCTCAG 600GAGGAGTCTG AAGAAGAAGT AGAGGAACCT GAAGAAAGCA GCAAACACCT GAGGTGGTAC 660CTGATGATTC TGGAACTTTC TATGATCAGG CAGTTGTCAG TAATGACATG GAAGAACATT 720TAGAGGAGCC TGTTGCTGAA CCAGAGCCTG ATCCTGAACC AGAACCAGAA CAAGAACCTG 780TATCTGAAAT CCAAGAGGAA AAGCCTGAGC CAGTATTAGA AGAAACTGCC CCTGAGGATG 840CTCAGAAGAG TTCTTCTCCA GCACCTGCAG ACATAGCTCA GACAGTACAG GAAGACTTGA 900GGACATTTTC TTGGGCATCT GTGACCAGTA AGAATCTTCC ACCCAGTGGA GCTGTTCCAG 960TTACTGGGAT ACCACCTCAT GTTGTTAAAG TACCAGCTTC ACAGCCCCGT CCAGAGTCTA 1020AGCCTGAATC TCAGATTCCA CCACAAAGAC CTCAGCGGGA TCAAAGAGTG CGAGAACAAC 1080GAATAAATAT TCCTCCCCAA AGGGGACCCA GACCAATCCG TGAGGCTGGT GAGCAAGGTG 1140ACATTGAACC CCGAAGAATG GTGAGACACC CTGACAGTCA CCAACTCTTC ATTGGCAACC 1200TGCCTCATGA AGTGGACAAA TCAGAGCTTA AAGATTTCTT TCAAAGTTAT GGAAACGTGG 1260TGGAGTTGCG CATTAACAGT GGTGGGAAAT TACCCAATTT TGGTTTTGTT GTGTTTGATG 1320ATTCTGAGCC TGTTCAGAAA GTCCTTAGCA ACAGGCCCAT CATGTTCAGA GGTGAGGTCC 1380GTCTGAATGT CGAAGAGAAG AAGACTCGAG CTGCCAGGGA AGGCGACCGA CGAGATAATC 1440GCCTTCGGGG ACCTGGAGGC CCTCGAGGTG GGCTGGGTGG TGGAATGAGA GGCCCTCCCC 1500GTGGAGGCAT GGTGCAGAAA CCAGGATTTG GAGTGGGAAG GGGGCTTGCG CCACGGCAGT 1560AATCTTCATG GATCTTCATG CAGCCATACA AACCCTGGTT CCAACAGAAT GGTGAATTTT 1620CGACAGCCTT TGGTATCTTG GAGTATGACC CCAGTCTGTT ATAAACTGCT TAAGTTTGTA 1680TAATTTTACT TTTTTTGTGT GTTAATGGTG TGTGCTCCCT CTCCCTCTCT TCCCTTTCCT 1740GACCTTTAGT CTTTCACTTC CAATTTTGTG GAATGATATT TTAGGAATAA CGGACTTTTA 1800CCCGAATTCG TAATCATGGT CATAGCTGTT TCCGTGTGAA ATTGTTATCC GCTCACAATT 1860CCACACAACA TACGAGCCGG AAGCATAAAG TGTAAAGCCT GGGGTGCCTA ATGAGTGAGC 1920TAACTCACAT TAATTGCGTT GCGCTCACTG CCCGCTTTCC AGTCGGGAAA CCTGTCGTGC 1980CAGCGCATTA ATGAATCGGC CAACGCGCGG GGAGAGGCGG TTTGCGTATT GGGCGCCAGG 2040GTGGTTTTCT TTTCACCAGT GAGACGGGCA ACAGCTGATT GCCCTTCACC GCTGGCCCTG 2100AGAGAGTTGC AGCAAGCGGT CCACGCTGG 2129