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葡糖淀粉酶变体
    【发明领域】

    本发明涉及亲本AMG的葡糖淀粉酶变体(突变体)，尤其其具有改善的热稳定性和/或增强的特异性活性，以适于如淀粉转化，如由淀粉生成葡萄糖。更具体地，本发明涉及葡糖淀粉酶变体及这类变体酶的应用。

    【发明背景】

    葡糖淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC 3.2.1.3.)是催化D-葡萄糖从淀粉或相关的寡糖和多糖分子释放的酶。葡糖淀粉酶由多种丝状真菌和酵母产生，其中包括具有极重要商业价值的曲霉属真菌。

    葡糖淀粉酶在商业上用于将已由α淀粉酶部分水解的玉米淀粉转化为葡萄糖。然后葡萄糖经葡糖异构酶转化为等量葡萄糖和果糖的混合物。这种混合物，或另外还富含果糖的混合物是全球市场上常用的高果糖玉米糖浆。这种糖浆是全球通过酶加工生产的产量最大的产品。淀粉到果糖的转化过程涉及的三种酶是所生产的最重要的工业用酶。

    在高果糖玉米糖浆的商业生产中应用葡糖淀粉酶的主要问题之一是葡糖淀粉酶的相对较低的热稳定性。葡糖淀粉酶不如α淀粉酶或葡糖异构酶耐热，其具有最大活性和稳定性的相应pH低于α淀粉酶或葡糖异构酶。因此，它需在具有较低温度和pH地隔离容器内使用。

    黑曲霉的葡糖淀粉酶具有由一段长而高度O-糖基化的接头所分隔催化结构域(氨基酸1-440)和淀粉结合结构域(氨基酸509-616)(Svensson等，1983,Carlsberg Res.Commun.48,529-544,1983和1986，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)154,497-502)。泡盛曲霉之X100变种的葡糖淀粉酶的催化结构域(氨基酸1-471)采用一种(α/α)6折叠，其中六个保守的α→α环连接着外柱和内柱(Aleshin等，1992，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)267,19291-19298)。葡糖淀粉酶的结晶结构与1-脱氧野尻霉素(Harris等，1993，生物化学(Biochemistry),32,1618-1626)及假四糖抑制物阿卡波糖和D-葡萄糖-二氢阿卡波糖(Aleshin等，1996，生物化学，35,8319-8328)的组合还分别与作为通用酸或碱起作用的谷氨酸179和400相容。已用蛋白质工程研究了这些残基在催化中的关键作用(Sierks等，1990，蛋白质工程(Protein α Engng.)3,193-198；Frandsen等，1994，生物化学，33,13808-13816)。在四个糖基结合亚位点-1、+1、+2和+3处葡糖淀粉酶与糖类的相互作用均主要突出在葡糖淀粉酶-复合体结构中(Aleshin等，1996，生物化学，35,8319-8328)，利用定点突变体结合动力学分析深入研究了对于结合和催化均很重要的残基(Sierks等，1989，蛋白质工程(Protein Engng.)2,621-625；Sierks等，1990，蛋白质工程3,193-198；Berland等，1995，生物化学，34,10153-10161；Frandsen等，1995，生物化学，34,10162-10169)。

    为增强黑曲霉葡糖淀粉酶的热稳定性而进行的各种置换已得到描述：ⅰ)置换α螺旋甘氨酸：G137A和G139A(Chen等，1996，蛋白质工程9,499-505)；ⅱ)消除Asp-X弱肽键D257E和D293E/Q(Chen等，1995，蛋白质工程8,575-582)；阻止N182位的脱氨基作用(Chen等，1994，生物化学杂志301,275-281)；ⅳ)通过遗传工程添加二硫键，A246C(Fierobe等，1996，生物化学，35,8698-8704)；ⅴ)在A435和S436位导入Pro残基(Li等，1997，蛋白质工程10,1199-1204)。此外ClarkFord于1997年10月17日提交了一份报告：酶工程，14，北京/中国，10月刊12-17,1997年，摘要编号：摘要集第0-61页。该摘要提到了在(未公开的)泡盛曲霉葡糖淀粉酶中G137A、N20C/A27C、及S30P位置的突变以增强热稳定性。

    其它有关葡糖淀粉酶的资料可在互联网主页http://www.public.iastate.edu/～pedro/glase/glase.html。由Pedro M.Coutinho公开的“葡糖淀粉酶WWW主页”(97年10月8日更新)公开了有关葡糖淀粉酶的资料，其中包括曲霉菌株衍生的葡糖淀粉酶。在黑曲霉葡糖淀粉酶中进行的化学修饰和定点修饰业已列出。

    发明简述

    本发明提供改良的葡糖淀粉酶变体，其热稳定性增强且/或适于在如淀粉转化过程的糖化步骤中应用的特异性活性增强。

    术语“一种增强了热稳定性的葡糖淀粉酶变体”在本发明中指一种葡糖淀粉酶变体，其T1/2()高于比相应亲本葡糖淀粉酶。T1/2测定法(方法Ⅰ和方法Ⅱ)见下文“材料和方法”部分。

    术语“一种增强了特异性活性的葡糖淀粉酶变体”在本发明中指一种葡糖淀粉酶变体，其针对目的糖分子中α-1,4键的特异性活性增强。所述特异性活性测定为Kcat或AGU/mg(如“材料和方法”部分所述进行测量)。增强了的特异性活性指当与相应亲本葡糖淀粉酶比较时，Kcat或AGU/mg值分别提高。

    本发明的发明人已针对一种亲本葡糖淀粉酶提供了一定数量的改良变体，它们的热稳定性和/或特异性活性均比相应亲本酶有了改善。热稳定性的增强通过置换亲本葡糖淀粉酶中的特定位点而获得。详见下述。

    命名

    在本说明书和权利要求书中，使用了氨基酸残基的传统的单字母和三字母密码。为便于参考，本发明的葡糖淀粉酶变体用以下命名法描述：

    来源氨基酸：位置：已置换的氨基酸

    根据该命名法，例如第30位的丙氨酸置换为天冬酰氨可表示为：

    Ala30Asn或A30N

    在同一位点删除丙氨酸表示为：

    Ala30*或A30*

    插入另一种氨基酸残基，如赖氨酸，表示为：

    Ala30AlaLys或A30AK

    一连串氨基酸残基如氨基酸残基30-33的删除表示为(30-33)*或Δ(A30-N33)。

    当一种特定葡糖淀粉酶与另一种葡糖淀粉酶相比包含一处“删除”并在这样一个位点进行了插入，这类情况下，将第36位插入一个天冬氨酸可表示为：

    *36Asp或*36D

    多个突变用符号+分隔，即：

    Ala30Asp+Glu34Ser或A30N+E34S

    表示分别将第30和34位的丙氨酸和谷氨酸置换为天冬酰氨和丝氨酸。多个突变还可按如下分隔，意思与符号+一样，即：

    Ala30Asp/Glu34Ser或A30N/E34S

    当在指定位置插入一或多种可替换的氨基酸残基时，表示为

    A30N,E或A30N/E，或A30N或A30E

    此外，当在本文中，一个适于修饰的位点得到鉴定而未提出任何特定修饰时，应理解为可用任何氨基酸残基置换该位点的氨基酸残基。因此，如当提到第30位丙氨酸的修饰，但未具体说明时，应理解为该丙氨酸可删除或置换成任何其它氨基酸，即R,N,D,A,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V中的任何一个。

    附图简述

    图1显示含有黑曲霉G1葡糖淀粉酶基因的质粒pCAMG91。

    发明详述

    本发明的工作旨在改善特定葡糖淀粉酶的热稳定性和/或特异性活性，所述特定葡糖淀粉酶可得自真菌，尤其曲霉属的特定菌株，而且它们自身是根据它们适于淀粉转化或乙醇发酵的特性被筛选出来的。

    鉴定可通过突变获得改善的热稳定性和/或增强的特异性活性的位点和/或区域

    分子动力学(MD)模拟指蛋白质结构中氨基酸的易变性(见McCammon,JA和Harvey,SC.,1987，蛋白质和核酸的动力学，Cambridge UniversityPress.)。通常将这类蛋白质动力学与结晶的B因子进行比较(见Stout,GH和Jensen,LH,1989,X-线结构测定，Wiley)。通过在可滴定的残基的不同质子化状态下实施MD模拟，可对与pH相关的残基变化进行模拟。选择具有高度易变性或灵活性(此处为各向同性波动)的区域进行随机诱变。在此应理解，蛋白质特定区域中所发现的高度易变性可通过置换这其中的残基而在更高温条件下得到改善。所述置换直接针对残基，可改变残基的动力学特性，使其如具有更大侧链和/或成为能使残基在邻近环境中形成更稳定接触的残基。黑曲霉的AMG可用于MD模拟。如何实施MD模拟已在下文“材料和方法”部分描述。

    通过分子动力学(MD)模拟发现的适于在希望获得改善的热稳定性和/或增强的特异性活性时进行突变的区域如下：

    区域：1-18，

    区域：19-35，

    区域：73-80，

    区域：200-212，

    区域：234-246，

    区域：334-341，

    区域：353-374，

    区域：407-411，

    区域：445-470，

    可用于增强特异性活性和/或改善热稳定性的区域是活性位点邻近的区域。位于底物结合位点的α螺旋之间，且可能包含这些α螺旋的N末端侧和C末端侧区域的区域对于该酶的活性很重要。这些区域包括：

    区域：40-62，

    区域：93-127，

    区域：170-184，

    区域：234-246，

    区域：287-319，

    区域：388-414。

    根霉属、踝节菌属如Talaromyces emersonii(公开在WO 99/28448中)、和草根霉属对麦芽糖糊精包括麦芽糖和麦芽糖庚糖(maltohepatose)具有高度特异性。因此，在增强特异性活性方面有重要意义的区域是：

    区域：200-212，

    区域：287-300，

    区域：305-319。

    本发明人已发现，确实有可能通过修饰亲本葡糖淀粉酶氨基酸序列中的一或多个氨基酸残基，而改善亲本葡糖淀粉酶的热稳定性和/或增强其特异性活性。本发明是基于这一发现。

    相应地，本发明第一方面涉及一种亲本葡糖淀粉酶的改良变体，其在下述区域和位点中包含一或多个突变。

    亲本葡糖淀粉酶

    本发明所考虑的亲本葡糖淀粉酶包括真菌葡糖淀粉酶，尤其获自曲霉属菌株如黑曲霉或泡盛曲霉的葡糖淀粉酶以及它们的变体或突变体、同源葡糖淀粉酶、还包括结构和/或功能类似于SEQ ID NO:2的葡糖淀粉酶。具体实例有黑曲霉葡糖淀粉酶G1和G2，公开于Boel等，1984，“黑曲霉的葡糖淀粉酶G1和G2已自两种不同但密切相关的mRNA合成”，欧洲分子生物学组织杂志(EMBOJ),3(5)，第1097-1102页。G2葡糖淀粉酶公开于SEQID NO:2。G1葡糖淀粉酶公开于SEQ ID NO:13。另一可考虑的AMG骨架为Talaromyces emersonii，尤其公开于WO 99/28448(Novo Nordisk)的Talaromyces emersonii DSM。

    市售亲本葡糖淀粉酶

    市售亲本葡糖淀粉酶包括Novo Nordisk的AMG，还包括Genencor,Inc.USA、Gist-Brocades,Delft，荷兰这两家公司的葡糖淀粉酶。

    葡糖淀粉酶变体

    本发明第一方面涉及一种亲本葡糖淀粉酶的变体，其在示于NO:2的氨基酸序列中的以下位点或区域内包含一或多个突变：

    区域：1-18，

    区域：19-35，

    区域：40-62，

    区域：73-80，

    区域：93-127，

    区域：170-184，

    区域：200-212，

    区域：234-246，

    区域：287-319，

    区域：334-341，

    区域：353-374，

    区域：388-414，

    区域：445-470，

    和/或一种同源葡糖淀粉酶的相应位点或区域，所述同源葡糖淀粉酶显示与示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列有至少60％的同源性，不同之处在于以下置换：N20C,A27C,S30P,Y48W,Y50F,W52F,R54K/L,D55G/V,G57A,K108R,D112Y,Y116A/W,S119C/W/E/G/Y/P,W120H/L/F/Y,G121T/A,R122Y,P123G,Q124H,R125K,W170F,N171S,Q172N,T173G,G174C,Y175F,D176N/E,L177H/D,W178R/D,E179Q/D,E180D/Q,V181D/A/T,N182A/D/Q/Y/S,G183K,S184H,W212F,R241K,A246C,D293E/Q,A302V,R305K,Y306F,D309N/E,Y312W,W317F,E389D/Q,H391W,A392D,A393P,N395Q,G396S,E400Q/C,Q401E,G407D,E408P,L410F,S411A/G/C/H/D,S460P

    在一个实施方案中，突变区为：1-18。特别优选的位点包括以下之一或更多：1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18。

    特异性突变包括以下之一或更多：A1V,T2P/Q/R/H/M/E/K,L3N,N9A,A11E/P,I18V。

    优选的突变组合包括以下之一或更多：

    A1V+L66R+Y402F+N427S+S486G,

    T2K+S30P+N427M+S44G+V470M,

    T2E+T379A+S386K+A393R,

    T2Q+A11P+S394R,

    T2R+L66V+S394P+Y402F,

    T2M+N9A+T390R+D406N+L410R,

    T2R+S386R+A393R,

    A11P+T2Q+S394R,

    A11E+E408R,

    I18V+T51S+S56A+V59T+L60A。

    在一个实施方案中，突变区为：19-35。优选的亚区包括以下之一或更多：21-26,31-35。特别优选的位点包括以下之一或更多：19,21,22,23,24,25,26,28,29,31,32,33,34,35。特异性突变包括以下之一或更多：L19N,N20T,G23A,A24S/T,D25S/T/R,G26A,A27S/T,W28R/Y S30T/N,G31A,A32V,D33R/K/H,S34N。

    在一个实施方案中，突变区为：40-62。优选的亚区包括以下之一或更多：40-47,58-62。特别优选的位点包括以下之一或更多：40,41,42,43,44,45,46,47,49,51,53,56,58,59,60,61,62。

    特异性突变包括以下之一或更多：

    S40C/A/G,

    T43R,

    T51S/D,

    T53D,

    S56A/C,

    V59T/A,

    L60A。

    优选的突变组合包括以下之一或更多：

    T51S+S56A+V59T+L60A+I18V

    V59A+A393R+T490A+PLASD(N末端延伸)。

    一个实施方案中，突变区为：73-80。特别优选的位点包括以下之一或更多：73,74,75,76,77,78,79,80。

    特异性突变包括以下之一或更多：

    S73P/D/T/N/Q/E,

    L74I/D,

    L75MR/N/D/C/Q/E/G/H/I/K/M/P/S/T/V，优选为I/N/D,

    S76A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V，优选T/A,

    T77V/T,

    I78V,

    E79A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/Y/V，优选为Q/R/K,

    N80A/R/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V，优选为H/D/E/R/K/T/S/Y

    在一个实施方案中，突变区为：93-127。在另一个实施方案中，亚区为：93-124。优选的亚区包括以下之一或更多：93-107,109-111,113-115。

    特别优选的位点包括以下之一或更多：93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,109,110,111,113,114,115,117,118,126,127。

    特异性突变包括以下之一或更多：N93T,

    P94V,

    S95N,

    D97S,

    L98S/P,

    S100T/D,

    A102S/* ,

    P107M/L/A/G/S/T/V/I,

    N110T,

    V111P,

    D112N,

    E113M/A,

    T114S,

    A115Q/A,

    Y116F,

    S119A/R/N/D/Q/H/I/L/K/F/M/T/V,优选为A,

    R122A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/V,

    G127A.

    优选的突变组合包括以下之一或更多：

    S119P+G447S,

    S119P+Y402F,

    S119P+A393R,

    S119P+I189T+223F+F227Y+Y402F

    S119P+T416H+Y402F+Y312Q.

    在一个实施方案中,突变区为：170-184。特异性突变包括以下之一或更多： N171R/K/Q/E/W/F/Y, Q172A/R/N/D/C/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V, T173K/R/S/N/Q, G174A,S, Y175N/Q/D/E, D176L L177I E180N/M V181I/T N182R/C/E/G/H/I/L/K/M/P/T/W/Y/V. G183A S184D/N/E/Q/L/I/T/R/K.

    在一个实施方案中突变区为：200-212。优选的亚区包括：200-211。特别优选的位点包括以下之一或更多：200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,210,211。特异性突变包括以下之一或更多：A201D,F202L,A203L,T204K,A205R/S,V206L/N,G207N,S208H/T/D,S209T,S211P,W212N/A/T。

    在一个实施方案中突变区为：234-246。优选的亚区包括以下之一或更多：234-240,242-245。特别优选的位点包括以下之一或更多：234,235,236,237,238,239,240,242,243,244,245。特异性突变包括以下之一或更多：L234A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/K/M/F/P/S/T/W/Y/V.

    A235S

    F237Y/H/N/D.

    D238T/S.

    S239A/R/N/D/C/G/H/I/L/F/P/S/T/Y/V.

    S240G

    S242S/P/T/A/Y/H/N/D.

    G243S/P/T/A/Y/H/N/D.

    K244R,

    A246T.

    优选的突变组合包括以下之一或更多：A246T+T72I。

    在一个实施方案中突变区为：287-319。优选的亚区包括以下之一或更多：287-292,294-301,313-316。

    特别优选的位点包括以下之一或更多：

    287,288,289,290,291,292,294,295,296,297,298,299,300,301,

    303,307,308,310,311,313,314,315,316,318,319.

    特异性突变包括以下之一或更多：

    S287A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/T/V,

    I288L/N/Q,

    Y289F,

    T290A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/V,

    L291I/D/N,

    N292D,

    D293A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/S/T/V,

    G294A/R/N/D/C/Q/E/H/I/L/K/M/P/S/T/V,

    L295A/R/N/D/C/Q/E/G/H/K/M/S/T/V,

    S296A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/T/V,

    D297A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/V,

    S298A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/T/V,

    E299A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/M/S/T/V,

    V301T/I,

    A302R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V/,优选为S,

    V303T/I,

    G304A,

    R305A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/F/M/P/S/T/W/Y/V,

    Y306A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/W/V.

    E308A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/M/P/S/T/V,优选为Q,

    D309L,

    T310V/S,

    Y311N,

    Y312Q/N,

    N313T/S/G

    N315Q/E/R,

    F318A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/W/Y/V，优选为Y。

    优选的突变组合包括以下之一或更多：

    Y312Q+S119P+T416H+Y402F,

    Y312Q+S119P+Y402F+T416H+S411V,

    Y312Q+T416H

    N313G+F318Y.

    在一个实施方案中突变区为：334-341。特别优选的位点包括以下之一或更多：334,335,336,337,338,339,340,341。

    特异性突变包括以下之一或更多：

    D336A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/S/T/W/Y/V.

    K337A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/M/F/P/S/T/W/Y/V.

    Q338A/R/N/D/C/G/H/I/L/F/P/S/T/Y/V.

    G339S/P/T/A.

    S340I/T/N/V/A/D/G.

    L341F/L/I/V.

    优选突变组合包括以下之一或更多：S340G+D357S+T360V+S386P。

    在一个实施方案中突变区包括：353-374。特别优选的位点包括以下之一或更多：353,354,355,356,357,358,359,360,361,362,363,364,365,366,367,368,369,370,371,372,373,374。

    特异性突变包括以下之一或更多：

    A353D/S,

    S356P/N/D,

    D357S,

    A359S,

    T360V,

    G361S/P/T/A,

    T362R,

    S364A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,

    S365A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,

    S366T,

    S368P/T/A,

    T369A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,

    S371Y/H/N/D,

    S372F/Y/C/L/P/H/R/I/T/N/S/V/A/D/G.

    优选的突变组合包括以下之一或更多：

    S356P+S366T,

    D357S+T360V+S371H.

    D357S+T360V+S386P+S340G.

    在一个实施方案中突变区包括：388-414。优选的亚区包括以下之一或更多：397-399,402-406,412-414。

    特别优选的位点包括以下之一或更多：388,389,390,394,397,398,399,402,403,404,405,406,409,412,413,414.

    特异性突变包括以下之一或更多：T390R,

    A393R,

    S394P/R,

    M398L,

    S399A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/T/W/Y/V,优选为T/Q//C,

    Y402A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/V,优选为F,

    D403S,

    S405T,

    D406N,

    E408C/R,

    A4Q9R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V,优选为P,

    L410R/I,

    S411R/N/Q/E/I/L/K/F/M/P/T/W/Y/V,优选为V,

    A412C,

    R413A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V.

    D414A.

    优选的突变组合包括以下之一或更多：

    A393R+T490A+V59A+PLASD(N末端延伸)

    S394R+T2Q+A11P,

    Y402F+S411V,

    Y402F+S411V+S119P

    Y402F+S411V+S119p+A393R,

    Y402F+Y312Q+S119P+T416H,

    E408R+S386N,

    E408R+A425T+S465P+T494A,

    L410R+A393R,

    Y402F+Y312Q+S119P+T416H+S411V+A393R.

    在一个实施方案中突变区为445-470。优选的亚区包括以下之一或更多：445-459,461-470。特别优选的位点包括以下之一或更多：445,446,447,448,449,450,451,452,453,454,455,456,457,458,459,461,462,463,464,465,466,467,467,468,469,470.

    特异性突变包括以下之一或更多：G447S,G456C/P,S465P。

    特异性变体包括具有一或多个以下置换的变体：

                  A1V,T2E/P/Q/R/H/M,L3P/N,N9A,A11P/E,I18V,L19N,N20T,G23A,A24S/T,D25S/T/R,G26A,A27S/T,W28R/Y,S30T/N,G31A,A32V,D33R/K/H,S34N,S40C,T43R,T51D/S,T53D,S56A/C,V59T/A,L60A,N93T,P94V,S95N,D97S,L98P/S,S100T/D,A102S/*,N110T,V111P,D112N,E113M/A,T114S,A115Q/G,Y116F,S119A,G127A,N182E,A201D,F202L,A203L,T204K,A205R/S,V206L/N,G207N,S208H/T/D,S209T,S211P,W212N/A/T,A246T Y312Q,N313T/S/G,A353D/S,S356P/N/D,D357S,A359S,T360V,G361S/P/T/A,T362R,            S364A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,S365A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,S366T,S368P/T/A,T369A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,     S371Y/H/N/D,S372F/Y/C/L/P/H/R/I/T/N/S/V/A/D/G,T390R,A393R,S394R/P,M398L,S399C/Q/T,Y402F,D403S,S405T,D406N,E408C/R,L410I/R,S411V,A412C,D414A,G447S,S465P.

    改善的热稳定性

    本发明第二方面涉及一种亲本葡糖淀粉酶的热稳定性(尤其在40-80℃，优选60-80℃，且优选在pH4-5时)改善了的变体，所述变体在示于NO:2的氨基酸序列中以下位点或区域包含一或更多突变：

    区域：1-18，

    区域：19-35，

    区域：73-80，

    区域：93-127，

    区域：170-184，

    区域：200-212，

    区域：234-246，

    区域：287-319，

    区域：334-341，

    区域：353-374，

    区域：388-414，

    区域：445-470，

    和/或一种同源葡糖淀粉酶的相应位点或区域，所述同源葡糖淀粉酶显示与示于SEQID NO:2的氨基酸序列有至少60％的同源性，不同之处在于以下置换：N20C,A27C,S30P,A246C。

    正如底物结合可能改善稳定性区域93-127，根据本发明改善热稳定性时还可考虑区域：170-184，区域：305-319。

    在一个实施方案中，突变区为：1-18。特别优选的位点包括以下之一或更多：1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18。

    特异性突变包括以下之一或更多：A1V,T2P/Q/R/H/M/E,N9A,A11E/P。

    优选的突变组合包括以下之一或更多：

    A1V+L66R+Y402F+N427S+S486G,

    T2K+S30P+N427M+S44G+V470M,

    T2E+T379A+S386K+A393R,

    T2R+S386R+A393R,

    A11P+T2Q+S394R,

    T2Q+A11P+S394R,

    T2R+L66V+S394P+Y402F,

    T2M+N9A+T390R+D406N+L410R,

    T2R+S386R+A393R,

    A11E+E408R。

    在一个实施方案中，突变区为：19-35。优选的亚区包括以下之一或更多：21-26,31-35。特别优选的位点包括以下之一或更多：19,21,22,23,24,25,26,28,29,31,32,33,34,35。特异性突变包括以下之一或更多：L19N,N20T,G23A,A24S/T,D25S/T/R,G26A,A27S/T,W28R/Y,S30T/N,G31A,A32V,D33R/K/H,S34N。

    一个实施方案中，突变区为：73-80。特别优选的位点包括以下之一或更多：73,74,75,76,77,78,79,80。

    特异性突变包括以下之一或更多：

    S73P/D/T/N/Q/E,

    L74I/D,

    L75A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/K/M/P/S/T/V，优选为I/N/ID，

    S76A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V，优选T/A,

    T77V/T,

    I78V,

    E79A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/Y/V，优选为Q/R/K,

    N80A/R/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V，优选为H/D/E/R/K/T/S/Y

    在一个实施方案中，突变区为：93-127。在另一个实施方案中，亚区为：93-124。优选的亚区包括以下之一或更多：93-107,109-111,113-115。

    特别优选的位点包括以下之一或更多：93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,109,110,111,113,114,115,117,118,126,127。

    优选的突变包括以下之一或更多：

    P107M/L/A/G/S/T/V/I,

    S119A/R/N/D/Q/H/I/L/K/F/M/T/V，优选为A,

    R122A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/V,

    优选的突变组合包括以下之一或更多：

    S119P+G447S。

    S119P+A393R。

    在一个实施方案中，突变区为：170-184。特异性突变包括以下之一或更多：

    N171R/K/Q/E/W/F/Y,

    Q172A/R/N/D/C/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V,

    T173K/R/S/N/Q,

    G174A,S,

    Y175N/Q/D/E,

    D176L

    L177I

    E180N/M

    V181I/T

    N182R/C/E/G/H/I/L/K/M/P/T/W/Y/V.

    G183A

    S184D/N/E/Q/L/I/T/R/K.

    在一个实施方案中突变区为：200-212。优选的亚区包括：200-211。特别优选的位点包括以下之一或更多：200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,210,211。特异性突变包括以下之一或更多：A203L,S211P。

    在一个实施方案中突变区为：234-246。优选的亚区包括以下之一或更多：234-240,242-245。特别优选的位点包括以下之一或更多：234,235,236,237,238,239,240,242,243,244,245。特异性突变包括以下之一或更多：

    L234A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/K/M/F/P/S/T/W/Y/V,

    A235S,

    F237Y/H/N/D,

    D238T/S,

    S239A/R/N/D/C/G/H/I/L/F/P/S/T/Y/V,

    8240G,

    S242S/P/T/A/Y/H/N/D,

    G243S/P/T/A/Y/H/N/D,

    K244R,

    A246T.

    优选的突变组合包括以下之一或更多：A246T+T72I。

    在一个实施方案中突变区为：287-319。优选的亚区包括以下之一或更多：287-292,294-301,313-316。

    在一个附加的实施方案中亚区包括：305-319。特别优选的位点包括以下之一或更多：287,288,289,290,291,292,294,295,296,297,298,299,300,301,302,303,307,308,310,311,313,314,315,316,318,319.

    特异性突变包括以下之一或更多：

    Y312Q,

    F318A/R/N D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/W/Y/V，优选为Y。

    优选的突变组合包括以下之一或更多：

    N313G+F318Y,

    Y302Q+S119P+T416H+Y402F。

    在一个实施方案中突变区为：334-341。特别优选的位点包括以下之一或更多：334,335,336,337,338,339,340,341。

    特异性突变包括以下之一或更多：

    D336A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/S/T/W/Y/V.

    K337A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/M/F/P/S/T/W/Y/V.

    Q338A/R/N/D/C/G/H/I/L/F/P/S/T/Y/V.

    G339S/P/T/A.

    S340I/T/N/V/A/D/G.

    L341F/L/I/V.

    优选突变组合包括以下之一或更多：S340G+D357S+T360V+S386P。

    在一个实施方案中突变区包括：353-374。特别优选的位点包括以下之一或更多：353,354,355,356,357,358,359,360,361,362,363,364,365,366,367,368,369,370,371,372,373,374。

    特异性突变包括以下之一或更多：

    A353D/S,

    S356P/N/D,

    D357S,

    A359S,

    T360V,

    G361S/P/T/A,

    T362R,

    S364A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,

    S365A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,

    S366T,

    S368P/T/A,

    T369A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,

    S371Y/H/N/D,

    S372F/Y/C/L/P/H/R/I/T/N/S/V/A/D/G.

    优选的突变组合包括以下之一或更多：

    S356P+S366T,

    D357S+T360V+S371H,

    D357S+T360V+S386P+S340G。

    在一个实施方案中突变区包括：388-414。优选的亚区包括以下之一或更多：397-399,402-406,412-414。

    在一个附加的实施方案中亚区为：407-411。

    特别优选的位点包括以下之一或更多：

    388,389,390,394,397,398,399,402,403,404,405,406,409,412,413,414.

    特异性突变包括以下之一或更多：T390R,

    A393R,

    A394P/R,

    S399A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/T/W/Y/V，优选为T/Q/C,

    Y402A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/V，优选为F，

    D403S,

    S405T,

    D406N,

    E408C/R,

    Q409A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V，优选为P,

    L410I/R,

    S411V,

    A412C,

    R413A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V,

    D414A。

    优选的突变组合包括以下之一或更多：

    A393R+T2R+S386R,

    A393R+T490A+V59A+PLASD(N末端延伸)

    S394R+T2Q+A11P,

    Y402F+T2R+L66V+S394P,

    Y402F+S411V+S119P

    Y402F+S411V,

    Y402F+312Q+S119P+T416H,

    S411V+A393R,

    E408R+S386N,

    E408R+A425T+S465P+T494A,

    L410R+A393R,

    S411V+S119P+402F+A393R,

    S411V+S119P+402F+A393R+T416H.

    在一个实施方案中突变区为445-470。优选的亚区包括以下之一或更多：445-459,461-470。特别优选的位点包括以下之一或更多：445,446,447,448,449,450,451,452,453,454,455,456,457,458,459,461,462,463,464,465,466,467,467,468,469,470.

    特异性突变包括以下之一或更多：G447S,G456C/P,S465P。

    优选的突变组合包括以下之一或更多：

    G447S+S119P,

    S465P+E408R+A425T+T494A。

    增强了的特异性活性

    本发明第三方面涉及一种亲本葡糖淀粉酶的具有增强之特异性活性的变体，其在示于NO:2的氨基酸序列中的以下位点或区域包含一或多个突变：

    区域：1-18，

    区域：40-62，

    区域：93-127，

    区域：170-184，

    区域：200-212，

    区域：234-246，

    区域：287-319，

    区域：388-414，

    和/或一种同源葡糖淀粉酶的相应位点或区域，所述同源葡糖淀粉酶显示与示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列有至少60％的同源性，不同之处在于以下置换：S411G。

    在一个实施方案中，突变区为：1-18。特别优选的位点包括以下之一或更多：1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18。

    特异性突变为：L3N,I18V。

    优选的突变组合包括以下之一或更多：

    I18V+T51S+S56A+V59T+L60A。

    在一个实施方案中,突变区为：40-62。优选的亚区包括以下之一或更多：40-47,58-62。特别优选的位点包括以下之一或更多：40,41,42,43,44,45,46,47,49,51,53,56,58,59,60,61,62。特异性突变包括以下之一或更多：S40C,T43R,T51S/C,T53D,S56A/C,V59T,L60A。

    优选的突变组合包括以下之一或更多：

    T51S+S56A+V59T+L60A+I18V。

    在一个实施方案中，突变区为：93-127。在一个附加实施方案中亚区为：93-124。优选的亚区包括以下之一或更多：93-107,109-111,113-115。

    特别优选的位点包括以下之一或更多：93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,109,110,111,113,114,115,117,118,126,127。

    优选的突变包括以下之一或更多：N93T,P94V,S95N,D97S,L98S/P,S100T/D,A102S/*,N110T,V111P,D112N,E113M/A,T114S,A115Q/G,Y116F,S119A,G127A。

    优选的突变组合包括以下之一或更多：

    S119P+Y402F。

    S119P+Y402F+1189T+Y223F+F227Y。

    在一个实施方案中，突变区为：170-184。特异性突变包括以下之一或更多： N171R/K/Q/E/W/F/Y, Q172A/R/N/D/C/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V, T173K/R/S/N/Q, G174A,S, Y175N/Q/D/E, D176L L177I E180N/M V181I/T N182R/C/E/G/H/I/L/K/M/P/T/W/Y/V,优选为E, G183A S184D/N/E/Q/L/I/T/R/K.

    在一个实施方案中突变区为：200-212。优选的亚区包括：200-211。特别优选的位点包括以下之一或更多：200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,210,211。特异性突变包括以下之一或更多：A201D,F202L,A203L,T204K,A205R/S,V206L/N,G207N,S208H/T/D,S209T,W212N/A/T。

    在一个实施方案中突变区为：234-246。优选的亚区包括以下之一或更多：234-240,242-245。特别优选的位点包括以下之一或更多：234,235,236,237,238,239,240,242,243,244,245。

    在一个实施方案中突变区为：287-319。优选的亚区包括以下之一或更多：287-292,294-301,313-316。

    特别优选的位点包括以下之一或更多：287,288,289,290,291,292,294,295,296,297,298,299,300,301,302,303,307,308,310,311,313,314,315,316, 318,319.

    特异性突变包括以下之一或更多：

    S287A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/T/V,

    I288L/N/Q,

    Y289F,

    T290A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/V,

    L291I/D/N,

    N292D,

    D293A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/S/T/V,

    G294A/R/N/D/C/Q/E/H/I/L/K/M/P/S/T/V,

    L295A/R/N/D/C/Q/E/G/H/K/M/S/T/V,

    S296A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/T/V,

    D297A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/V,

    S298A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/T/V,

    E299A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/M/S/T/V.

    V301T/I,

    A302R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V/，优选为S,

    V303T/I,

    G304A,

    R305A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/F/M/P/S/T/W/Y/V,

    Y306A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/W/V.

    E308A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/M/P/S/T/V，优选为Q,

    D309L,

    T310V/S,

    Y311N,

    Y312Q/N，优选为Q,

    N313T/S/G，优选为S,

    N315Q/E/R。

    在一个实施方案中突变区包括：388-414。优选的亚区包括以下之一或更多：397-399,402-406,412-414。

    特别优选的位点包括以下之一或更多：388,389,390,394,397,398,399,402,403,404,405,406,409,412,413,414。

    特异性突变包括以下之一或更多：M398L,S399C/Q/T,Y402F,D403S,S405T,E408C/R,S411V,A412C,D414A。

    优选的突变组合包括以下之一或更多：

    Y402F+S119P,

    Y402F+S119P+I189T+Y223F+F227Y。

    在本发明一个优选实施方案中突变区为：

    区域：287-300，

    区域：305-319，

    和/或一种同源葡糖淀粉酶的相应位点或区域，所述同源葡糖淀粉酶显示与示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列有至少60％的同源性。

    同源性(同一性)

    上文所述的亲代葡糖淀粉酶的同源性被测定为两个蛋白质序列之间的同一性程度，其显示出第一个序列与第二个序列的差异。利用本领域已知的计算机程序，例如GCG程序包中提供的GAP(Wisconsin Package程序手册，第8版，1994年8月，Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wisconsin,USA 53711)可适当地测定同源性(Needleman,S.B和Wunsch,C.D.,1970，分子生物学杂志，48,p443-453)。为了进行多肽序列对比，使用了具有下列设置的Gap:Gap产生罚分为3.0,Gap延伸罚分为0.1，由本发明的类似DNA序列编码的成熟多肽部分显示出与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的成熟部分的同一性优选至少为60％，如70％，至少80％，至少90％，更优选至少为95％，更优选至少为97％，最优选至少为99％。

    优选亲代葡糖淀粉酶含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或其等位基因变体；或其具有葡糖淀粉酶活性的片段。

    SEQ ID NO:2的片段是在此氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失了一个或多个氨基酸的多肽。例如，AMG G2(SEQ ID NO:2)是具有葡糖淀粉酶活性的黑曲霉G1葡糖淀粉酶(Boel等，1984,EMBOJ,3(5),p1097-1102)的片段。等位基因变体表示占据相同染色体基因座的任何两个或多个可替代的基因形式。等位基因变异是通过突变天然产生的，它可导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽没有改变)，或者可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

    由于插入或缺失了一个或多个氨基酸残基和/或用不同的氨基酸残基取代了一个或多个氨基酸残基，同源的亲代葡糖淀粉酶的氨基酸序列与SEQID NO:2的氨基酸序列有所不同。优选氨基酸的改变对酶特性的影响很小，即为不会显著影响蛋白质折叠和/或活性的保守的氨基酸取代；小的缺失，一般为1至约30个氨基酸缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基-末端的甲硫氨酸残基；约为20至25个残基的小连接肽；或便于通过改变净电荷或另一个功能进行纯化的小的延伸，所述功能如多-组氨酸通道，抗原性表位或结合结构域。

    在另一个实施方案中，分离的亲代葡糖淀粉酶由核酸序列编码，该序列在严紧度很低的条件下，优选在低严紧条件下，更优选在中度严紧条件下，更优选在中-高度严紧条件下，甚至更优选在高度严紧条件下，最优选在严紧度很高的条件下能与核酸探针杂交，所述探针能在相同的条件下与以下序列杂交：(ⅰ)SEQ ID NO:1的核酸序列，(ⅱ)SEQ ID NO:1的cDNA序列，(ⅲ)(ⅰ)或(ⅱ)的亚序列，或(ⅳ)互补于(ⅰ),(ⅱ)或(ⅲ)的链(J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989，分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港，纽约)。SEQID NO:1的亚序列至少为100个核苷酸，或者优选至少为200个核苷酸。此外，该亚序列可编码具有葡糖淀粉酶活性的多肽片段。亲代多肽也可以是具有葡糖淀粉酶活性的多肽的等位基因变体或片段。

    可使用SEQ ID NO:1的核酸序列或其亚序列，以及SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其片段设计核酸探针，从而根据本领域已知的方法从不同的属或种的菌株中鉴定和克隆编码具有葡糖淀粉酶活性之多肽的DNA。特别是，可根据标准的Southern印迹方法，使用这种探针与感兴趣的属或种的基因组DNA或cDNA杂交，以鉴定和分离其中的相应基因。这种探针可以比完整序列短很多，但其长度应该至少为15，优选至少为25，更优选至少为35个核苷酸。也可使用较长的探针。DNA和RNA探针都可以使用。一般需标记探针以检测相应的基因(例如用32P,3H,35S，生物素或亲和素)。本发明包括这种探针。

    因此，可从由其它生物体制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选与上述探针杂交，且编码具有葡糖淀粉酶活性之多肽的DNA。通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其它分离技术可分离得自其它生物体的基因组或其它DNA。将文库中的DNA或经分离的DNA转移至并固定于硝酸纤维素或其它适当的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或其亚序列同源的克隆或DNA，将载体材料用于Southern印迹。本发明意义上的杂交指的是：在严紧度很低至很高的条件下，核酸序列与核酸探针杂交，所述探针对应于SEQID NO:1所示的核酸序列，其互补链或其亚序列。使用X-射线胶片检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。

    对于长度至少为100个核苷酸的长探针而言，最终使用2×SSC,0.2％SDS将载体材料洗涤3次，每次15分钟，洗涤温度优选至少为45℃(很低的严紧度)，更优选至少为50℃(低严紧度)，更优选至少为55℃(中度严紧度)，更优选至少为60℃(中-高度严紧度)，甚至更优选至少为65℃(高严紧度)，最优选至少为70℃(很高的严紧度)。

    对于长度约为15个核苷酸至70个核苷酸的短探针而言，严紧条件的定义是：根据标准的Southern印迹方法，在比根据Bolton和McCarthy(1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:1390)的算式计算出的Tm低5℃至10℃的温度下，在0.9M NaCl,0.09M Tris-HCl,pH7.6,6mM EDTA,0.5％NP-40,1×Denhardt’s溶液，1mM焦磷酸钠，1mM磷酸二氢钠，0.1mM ATP和0.2mg酵母RNA/ml中进行预杂交，杂交和杂交后的洗涤。

    对于长度约为15个核苷酸至70个核苷酸的短探针而言，在比计算出的Tm低5℃至10℃的温度下，用6×SSC+0.1％SDS将载体材料洗涤1次，共15分钟，再用6×SSC洗涤2次，每次15分钟。

    本发明还涉及通过下列方法产生的分离的核酸序列：(a)在很低，低，中度，中-高度，高度或很高的严紧条件下使DNA与SEQ ID NO:1的序列，或其互补链，或其亚序列杂交；和(b)分离核酸序列。优选亚序列是至少为100个核苷酸的序列，例如编码具有葡糖淀粉酶活性之多肽片段的序列。

    期望亲代葡糖淀粉酶具有的活性至少为SEQ ID NO:2所示成熟多肽的葡糖淀粉酶活性的20％，优选为至少40％，更优选至少为60％，甚至更优选至少为80％，甚至更优选至少为90％，最优选至少为100％。

    在优选的实施方案中，本发明的变体使用麦芽糖糊精作为底物，优选在约60-80℃的温度范围内，优选为63-75℃，优选在pH4-5，特别是4.2-4.7时具有改良的热稳定性和/或提高的比活性。

    在另一个优选的实施方案中，本发明的变体被用于例如乙醇发酵。

    在优选的实施方案中，亲代葡糖淀粉酶是黑曲霉G1葡糖淀粉酶(Boel等，1984,EMBO J,3(5),p1097-1102)。亲代葡糖淀粉酶可以是截短的葡糖淀粉酶，例如AMGG2葡糖淀粉酶。

    克隆编码亲代葡糖淀粉酶的DNA序列

    可使用本领域已知的多种方法，从能够产生葡糖淀粉酶的任何细胞或微生物中分离编码亲代葡糖淀粉酶的DNA序列。首先，应使用得自能够产生待研究的葡糖淀粉酶的生物体的染色体DNA或信使RNA来构建基因组DNA和/或cDNA文库。然后，如果葡糖淀粉酶的氨基酸序列是已知的，可合成标记的寡核苷酸探针，以用于从所述生物体制备的基因组文库中鉴定编码葡糖淀粉酶的克隆。或者，可将含有与另一个已知葡糖淀粉酶基因同源之序列的标记寡核苷酸探针用作探针，使用很低至很高严紧度的杂交和洗涤条件来鉴定编码葡糖淀粉酶的克隆。

    另一种鉴定编码葡糖淀粉酶的克隆的方法包括：将基因组DNA片段插入表达载体，如质粒，用所得基因组DNA文库转化葡糖淀粉酶-阴性细菌，然后将转化的细菌铺于含有葡糖淀粉酶底物(即麦芽糖)的琼脂上，从而鉴定出表达葡糖淀粉酶的克隆。

    或者，可通过已建立的标准方法经合成而制备编码酶的DNA序列，所述方法包括例如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers(1981)，四面体通讯，22,p.1859-1869所述的膦酰胺(phosphoroamidite)法，或Matthes等，1984,EMBOJ,3,p.801-805所述的方法。在膦酰胺法中，寡核苷酸在如DNA自动合成仪中合成，纯化，退火，连接并克隆至适当载体中。

    最后，DNA序列可以是基因组和合成物质的混合，合成物质和cDNA的混合或基因组和cDNA物质的混合，它们是根据标准技术，通过连接合成性，基因组性或cDNA来源性片段(适当时，片段对应于完整DNA序列的多个部分)而制备的。也可使用特异性引物，经聚合酶链反应(PCR)制备DNA序列，例见US4,683,202或R.K.Saiki等，1988，科学，239,1988,p487-491。

    定点诱变

    一旦分离出编码葡糖淀粉酶的DNA序列,鉴定出理想的突变位点，可使用合成的寡核苷酸导入突变。这些寡核苷酸含有侧翼于所需突变位点的核苷酸序列。在特定的方法中，在携有葡糖淀粉酶基因的载体中产生DNA(即葡糖淀粉酶编码序列)的单链缺口。然后使携有所需突变的合成核苷酸与单链DNA的同源部分退火。用DNA聚合酶Ⅰ(Klenow片段)补平残留的缺口，使用T4连接酶连接构建体。此方法的具体例子描述于Morinaga等，1984，生物技术，2,p646-639。US4,760,025公开了通过对表达盒进行微小的改变来导入编码多个突变的寡核苷酸。另外，通过Morinaga的方法可导入大批不同长度的寡核苷酸，因此可同时导入差异更大的突变。

    另一种将突变导入编码葡糖淀粉酶的DNA序列的方法描述于Nelson和Long,1989，分析生物化学，180,p147-151。该方法包括3步产生PCR片段，所述片段含有通过使用化学合成的DNA链作为PCR反应中的一个引物而导入的所需突变。通过用限制性内切核酸酶裂解，从PCR-产生的片段中分离出携有突变的DNA片段，重新插入表达质粒中。

    另外，Sierks等，1989，蛋白质工程，2,621-625；Sierks等，1990，蛋白质工程，卷3,193-198也描述了曲霉属葡糖淀粉酶中的定点诱变。

    随机诱变

    适当的随机诱变可以是翻译成所需氨基酸序列之基因的至少三个部分中的定位或区域-特异性随机诱变，也可以是整个基因中的随机诱变。

    可使用本领域已知的任何方法方便地对编码亲代葡糖淀粉酶的DNA序列进行随机诱变。

    有关上述内容，本发明的另一方面涉及产生亲代葡糖淀粉酶变体的方法，其中相对于亲代而言，变体表现出改良的热稳定性，所述方法包括：

    (a)对编码亲代葡糖淀粉酶的DNA序列进行随机诱变，

    (b)在宿主细胞中表达步骤(a)中所得的突变DNA序列，和

    (c)筛选表达葡糖淀粉酶变体的宿主细胞，相对于亲代葡糖淀粉酶而言，所述变体具有改变的特性(即热稳定性)。

    如本文工作实施例所述，优选使用掺加(doped)引物进行本发明之上述方法的步骤(a)(参见下文)。

    例如，可通过使用适当的物理或化学诱变剂，通过使用适当的寡核苷酸，或通过对DNA序列进行PCR-产生的诱变来进行随机诱变。另外，可通过使用这些诱变剂的任何组合进行随机诱变。诱变剂可以诱导例如碱基转换，颠换，倒位，转频，缺失和/或插入。

    适用于本发明的物理或化学诱变剂的例子包括紫外线(UV)照射，羟胺，N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG),O-甲基羟胺，亚硝酸，乙基甲烷磺酸酯(EMS)，亚硫酸氢钠，甲酸和核苷酸类似物。当使用这些诱变剂时，一般通过下述方法进行诱变，即在适于发生诱变的条件下，在存在选定诱变剂时保温待诱变的编码亲代酶的DNA序列，并选择具有所需特性的突变DNA。

    当通过使用寡核苷酸进行诱变时，在合成待改变的位置处的寡核苷酸的过程中，可在寡核苷酸中添加或掺加3个非亲代核苷酸。可进行添加或掺加以避免出现不必要的氨基酸密码子。可通过任何已知技术，必要时使用例如PCR,LCR或任何DNA聚合酶和连接酶，将经添加或掺加的寡核苷酸掺入编码葡糖淀粉酶的DNA中。

    优选使用“恒定不变的随机添加”进行添加，其中各个位置处的野生型和突变的百分比是预先确定好的。另外，可优先进行有目的的添加以导入某些核苷酸，籍此优先导入一个或多个特定的氨基酸残基。可进行添加以在每个位置处导入90％野生型和10％突变。选择添加方案的其它考虑基于基因以及蛋白质结构的限制。通过使用DOPE程序可制订掺加方案，所述程序可特别地确保不会导入终止密码子。

    当使用PCR-产生的诱变时，在增加核苷酸掺入错误率的条件下，对经化学处理或未经处理的编码亲代葡糖淀粉酶的基因进行PCR(Deshler,1992；Leung等，技术，Vol.1,1989,p11-15)。

    可使用大肠杆菌(Fowler等，普通分子遗传学，133,1974,p179-191)，酿酒酵母或任何其它微生物的增变菌株随机诱变编码葡糖淀粉酶的DNA，诱变方法包括例如：将含有亲代糖基化酶的质粒转化至增变菌株，培养具有质粒的增变菌株，从增变菌株中分离突变质粒。随后，将突变质粒转化至表达生物体。

    待诱变的DNA序列可方便地存在于基因组或cDNA文库中，所述文库制备自表达亲代葡糖淀粉酶的生物体。或者，DNA序列可存在于适当载体，如质粒或噬菌体上，再将所述载体与诱变剂保温，或将所述载体暴露于诱变剂中。待诱变的DNA也可存在于宿主细胞中，或者整合于所述细胞的基因组中，或者存在于细胞所携有的载体上。最后，待诱变的DNA可以是分离的形式。应理解需进行随机诱变的DNA序列优选为cDNA或基因组DNA序列。

    在某些情况下，在进行表达步骤b)或筛选步骤c)之前，可方便地扩增突变的DNA序列。可根据本领域已知的方法进行这种扩增，本发明优选的方法是使用寡核苷酸引物进行PCR-产生的扩增，所述引物是根据亲代酶的DNA或氨基酸序列制备的。

    与诱变剂保温或暴露于其中之后，通过在允许表达发生的条件下培养携有突变DNA序列的适当宿主细胞来表达突变的DNA。用于此目的的宿主细胞可以被任选存在于载体上的突变的DNA序列转化，或者携有处于诱变处理过程中的编码亲代酶的DNA序列。适当宿主细胞的例子如下：革兰氏阳性细菌，如枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌，短芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，灿烂芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌，青紫链霉菌或鼠灰链霉菌；和革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌。

    突变的DNA序列可进一步含有编码允许突变的DNA序列表达的DNA序列。

    定位随机诱变

    随机诱变定位于所述亲代葡糖淀粉酶的一部分较为有利。当鉴定出酶的某些区域对酶的特定特性十分重要时，和当经修饰后有望产生具有改良特性的变体时，进行定位随机诱变较有利。当已阐明亲代酶的四级结构，并证实该结构与酶功能有关时，一般即可鉴定出该区域。

    通过使用上文所述的PCR-产生的诱变技术或本领域已知的任何其它适当技术，可方便地进行定位的或区域特异性的随机诱变。或者，可通过例如插入适当的载体来分离编码待修饰的DNA序列部分的DNA序列，随后，可使用上述诱变方法中的任一种诱变所述部分。

    另一种提供本发明变体的方法包括基因改组，其描述于例如WO95/22625(Affymax Technologies N.V.)或WO 96/00343(Novo Nordisk A/S)。

    葡糖淀粉酶变体的表达

    根据本发明，使用表达载体可将通过上述方法或本领域已知的任何其它方法产生的编码变体的DNA序列表达成酶的形式，所述载体一般包括编码启动子的调控序列，操纵基因，核糖体结合位点，翻译起始信号，并任选包括阻抑蛋白基因或多种激活物基因。

    表达载体

    携有编码本发明葡糖淀粉酶变体之DNA序列的重组表达载体可以是便于经受重组DNA方法的任何载体，载体的选择经常取决于欲导入该载体的宿主细胞。当将所述载体导入宿主细胞时，该载体能整合至宿主细胞基因组并与整合了该载体的染色体一起复制。适当表达载体的例子包括pMT838。

    启动子

    在载体中，DNA序列应与适当启动子序列可操作相连。启动子可以是在选定宿主细胞中具有转录活性的任何DNA序列，所述启动子可得自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。

    用于介导编码本发明葡糖淀粉酶变体的DNA序列的转录，尤其是在细菌宿主中的转录的适当启动子的例子是大肠杆菌lac操纵子的启动子，天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因dagA启动子，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子，嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子，解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(amyQ)的启动子，枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。为了在真菌宿主中转录，有用启动子的例子是得自编码米曲霉TAKA淀粉酶的基因的启动子，酿酒酵母的TPI(丙糖磷酸异构酶)启动子(Alber等，1982，应用分子遗传学杂志，1,p419-434),Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，Rhizomucor miehei脂肪酶，米曲霉碱性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸异构酶或构巢曲霉乙酰胺酶基因的启动子。

    表达载体

    本发明的表达载体也可含有适当的转录终止子，在真核生物中，还含有与编码本发明的α-淀粉酶变体的DNA序列可操作相连的聚腺苷酸化序列。终止和聚腺苷酸化序列适于得自与启动子相同的来源。

    载体还可含有能使载体在所述宿主细胞中复制的DNA序列。这种序列的例子是质粒pUC19,pACYC177,pUB110,pE194,pAMB1和pIJ702的复制起点。

    载体也可含有选择标记，例如其产物可补偿宿主细胞缺陷的基因，如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或能赋予抗生素抗性的基因，所述抗生素抗性包括例如氨苄青霉素，卡那霉素，氯霉素或四环素抗性。此外，载体可含有曲霉选择标记，如amdS,argB,niaD和sC，产生潮霉素抗性的标记，或按WO91/17243所述通过共转化完成选择。

    分别连接本发明编码葡糖淀粉酶变体的DNA构建体，启动子，终止子和其它元件，并将它们插入含有复制所必需信息的适当载体，所用方法是本领域技术人员众所周知的(参见例如Sambrook等，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港，1989)。

    宿主细胞

    本发明的细胞含有上文所述的本发明的DNA构建体或表达载体，在重组生产本发明的葡糖淀粉酶变体时，所述细胞可有利地用作宿主细胞。可方便地通过将DNA构建体(一个或多个拷贝)整合至宿主染色体，而用编码变体的本发明的DNA构建体转化细胞。一般认为整合是有利的，因为此时DNA序列更可能在细胞中稳定维持。可根据常规方法，如同源或异源重组将DNA构建体整合至宿主染色体。或者，可用上文所述的与不同类型的宿主细胞相关的表达载体转化细胞。

    本发明的细胞可以是高等生物，如哺乳动物或昆虫的细胞，但优选是微生物细胞，例如细菌或真菌(包括酵母)细胞。

    适当细菌的例子是革兰氏阳性细菌，如枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌，短芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，灿烂芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌，或青紫链霉菌或鼠灰链霉菌，或革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌。通过例如以本身已知的方式进行原生质体转化或使用感受态细胞即可实现对细菌的转化。

    从糖酵母或裂殖酵母，如酿酒酵母的种中选择酵母生物体较为有利。

    宿主细胞也可以是丝状真菌，例如属于曲霉属的种的菌株，最优选为米曲霉或黑曲霉，或镰孢菌属的菌株，例如尖孢镰孢菌，禾谷镰孢菌(其确切的名称为Gribberella zeae，以前被称为Sphaeria zeae，与Gibberella roseum和Gibberella roseum f.sp.cerealis同义)或硫色镰孢菌(其确切的名称为Gibberella puricaris，与Fusarium trichothecioides，杆孢状镰孢菌，接骨木镰孢(Fusarium sambucium)，玫瑰色镰孢菌和玫瑰色镰孢菌graminearum变种同义)，樱桃镰孢(Fusarium cerealis)(与Fusarium crokkwellnse同义)或Fusariumvenenatum。

    在本发明的优选实施方案中，宿主细胞是蛋白酶缺损或蛋白酶阴性菌株。

    例如，蛋白酶缺损菌株米曲霉JaL 125缺损了被称为“alp”的碱性蛋白酶基因。该菌株描述于WO 97/35956(Novo Nordisk)。

    可通过下述方法转化丝状真菌细胞，所述方法包括形成原生质体并进行原生质体转化，接着以本身已知的方法再生细胞壁。曲霉属用作宿主微生物描述于EP 238023(Novo Nordisk A/S)，其内容列入本文作为参考。

    产生葡糖淀粉酶变体的方法

    在另一方面，本发明涉及产生本发明的葡糖淀粉酶变体的方法，所述方法包括在有助于产生变体的条件下培养宿主细胞，并从细胞和/或培养基中回收变体。

    用于培养细胞的培养基是适用于培养所述宿主细胞和表达本发明的葡糖淀粉酶变体的任何常规培养基。适当的培养基可以商购或根据已知方法(例如按美国典型培养物保藏中心目录所述的方法)制备。

    通过众所周知的方法可从培养基中方便地回收宿主细胞所分泌的葡糖淀粉酶变体，所述方法包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，利用诸如硫酸铵的盐沉淀培养基中的蛋白质组分，接着使用层析方法，如离子交换层析，亲和层析等。

    淀粉转化

    本发明提供了使用本发明的葡糖淀粉酶变体由淀粉生产葡萄糖等的方法。该方法一般包括以下步骤，即在α-淀粉酶的存在下部分水解前体淀粉，然后在葡糖淀粉酶的存在下，通过裂解α-(1→4)和α-(1→6)葡糖苷键，从淀粉或相关寡-和多糖分子的非-还原末端进一步水解释放D-葡萄糖。

    利用α-淀粉酶部分水解前体淀粉可通过水解内部的α-(1→4)连键而初步裂解淀粉分子。在商业应用中，使用α-淀粉酶初步水解在约105℃的温度下进行。处理了很高浓度的淀粉，通常为30％至40％固体。通常在此高温下将初步水解进行5分钟。然后将部分水解的淀粉转移至第二个罐中，在85℃至98℃的温度下保温约1至2小时以使葡萄糖当量(D.E.)为10至15。

    通常在降低的温度，即30℃至62℃下，在独立的罐中，在葡糖淀粉酶的存在下，从淀粉或相关寡-和多糖分子的非-还原末端进一步水解释放D-葡萄糖。优选将底物液体的温度降至55℃至60℃，溶液的pH从约5.5至6.5降至约3至5.5。优选溶液的pH为4至4.5。在溶液中加入葡糖淀粉酶，将反应进行24至72小时，优选36至48小时。

    在比传统的分批糖化法高的温度下，使用本发明的热稳定性葡糖淀粉酶变体进行糖化。根据本发明，可在60至80℃，优选在63至75℃的温度下进行糖化。该温度适用于传统的分批法(上文所述)和连续糖化法。

    实际上，必须在超过60℃的温度下进行连续糖化法，所用温度应能维持合理高的流量穿过膜，或者能使微生物污染最小化，所述糖化法包括一个或多个膜分离步骤，即过滤步骤。因此，本发明的热稳定性变体提供了以较合理的成本和/或使用较低酶蛋白质剂量，在工业糖化法可接受的时间内进行大规模连续糖化法的可能性。根据本发明，糖化时间甚至可以缩短。

    在60℃至80℃的温度下，本发明的葡糖淀粉酶变体(如AMG变体)的活性基本上高于传统使用的30至60℃的温度下的活性。因此，通过升高葡糖淀粉酶的工作温度，可在较短的时间内进行糖化过程。

    另外，通过改善热稳定性，T1/2(“材料和方法”一节所定义的半寿期)也得以改善。由于本发明的葡糖淀粉酶变体的热稳定性得以改善，只需加入很少量的葡糖淀粉酶以替代在糖化过程中失活的葡糖淀粉酶。在本发明的糖化过程中，更多的葡糖淀粉酶能维持活性。此外，当在高于63℃的温度下进行糖化过程时，微生物污染的风险也有所降低。

    用葡糖淀粉酶，酸性淀粉酶和支链淀粉酶进行的典型糖化试验的葡萄糖产率为95.5至96.5％。其余的糖类一般由1％麦芽糖，1.5-2％异麦芽糖和1-1.5％高级寡糖组成。由于在高浓度的葡萄糖和高的干-固体水平存在下，葡糖淀粉酶趋向于形成回复突变产物，因此也产生了二糖。

    对液化之后溶液中存在的糖类和糖化过程中形成的糖类具有提高的比活性的葡糖淀粉酶可能是有利的，因为随后可使用降低的酶蛋白质剂量或缩短的反应时间。通常，相对于短链糖类而言，葡糖淀粉酶偏好由长链糖类组成的底物，因此，针对麦芽糖庚糖的比活性约比针对麦芽糖的比活性高6倍。因此，针对短链糖类，如麦芽糖的比活性提高(不降低针对寡糖的活性)也允许使用较低酶剂量和/或较短反应时间。

    此外，用具有增加的α-1,4-水解活性(如果α-1,6活性未改变或甚至降低)的葡糖淀粉酶变体可得到较高的葡萄糖产量，由于使用了量有所降低的酶蛋白质，减少了α-1,6回复突变产物的形成(较少的异麦芽糖)。

    可使用“材料和方法”一节中所述的方法，在37℃或60℃下测定比活性。

    其中使用了本发明的葡糖淀粉酶变体的糖化方法的例子包括JP 3-224493；JP 1-191693；JP 62-272987；EP 452,238和WO 99/27124中所述的方法(所有参考文献皆列入本文作为参考)。

    另一方面，本发明涉及糖化液化淀粉溶液的方法，所述方法包括步骤：

    (ⅰ)糖化步骤，在该步骤中，发生了一个或多个酶促糖化过程，随后的步骤是

    (ⅱ)一个或多个高温膜分离步骤，

    其中使用本发明的热稳定性葡糖淀粉酶变体进行酶促糖化。

    在本发明的方法中，可联合使用本发明的葡糖淀粉酶变体和仅水解具有至少4个葡糖残基的分子中的α-(1→6)葡糖苷键的酶。优选联合使用本发明的葡糖淀粉酶变体和支链淀粉酶或异淀粉酶。异淀粉酶和支链淀粉酶的脱支用途，酶的分子特性和具有葡糖淀粉酶活性的酶的潜在用途示于G.M.A.van Beynum等，淀粉转化技术，Marcel Dekker，纽约，1985,101-142。

    另一方面，本发明涉及本发明的葡糖淀粉酶变体在淀粉转变过程中的用途。

    另外，本发明的葡糖淀粉酶变体可用于包括连续糖化步骤的淀粉连续转变过程。

    本发明的葡糖淀粉酶变体也可以固定化的形式被使用。这种固定化酶是合适的，经常用于产生特制的浆液，如麦芽糖浆液，并进一步用于与果糖浆液的生产有关的寡糖残液流。

    本发明的葡糖淀粉酶也可用于生产燃料或饮料用乙醇的方法，或者用于生产有机化合物的发酵方法，如柠檬酸，抗坏血酸，赖氨酸，谷氨酸。

    材料和方法

    材料：

    酶：

    AMG G1：黑曲霉葡糖淀粉酶G1，公开于Boel等，1984,EMBOJ,3(5),p1097-1102和SEQ ID NO:13，可得自Novo Nordisk。

    AMG G2：截短的黑曲霉葡糖淀粉酶G1，示于SEQ ID NO:2，可得自Novo Nordisk。

    溶液：

    缓冲液：0.05M醋酸钠(6.8g溶于11milli-Q-水中)，pH4.5

    终止溶液：0.4M NaOH

    GOD-perid,124036,Boehringer Mannheim

    底物：

    麦芽糖：29mM(1g麦芽糖溶于100ml 50mM醋酸钠，pH4.5)(Sigma)

    麦芽糖庚糖：10mM,115m/10ml(Sigma)

    宿主细胞：

    米曲霉JaL 125：米曲霉IFO4177得自Osaka发酵研究所；17-25 JusoHammachi 2-Chome Yodogawa-ku,Osaka，日本，其具有被称为“alp”的碱性蛋白酶基因(描述于Murakami K等，1991，农业生物化学，55,p2807-2811)缺失，所述缺失是通过使用米曲霉pyrG基因为标记，经一步基因取代法(描述于G.May，“丝状真菌的应用分子遗传学”，1992,p1-25,J.R.Kinghom和G.Turner编；Blackie Academic and Professional)完成的。菌株JaL 125进一步描述于WO 97/35956(Novo Nordisk)。

    微生物

    菌株：酿酒酵母YNG318:MATαleu2-Δ2 ura3-52his4-539pep4-Δ1[cir+]

    质粒：

    pCAMG91：见图1，该质粒含有黑曲霉G1葡糖淀粉酶(AMG G1),pCAMG91的构建描述于Boel等，1984,EMBOJ,3(7),p1581-1585。

    pMT838：该质粒编码截短的黑曲霉葡糖淀粉酶G2(SEQ ID NO:2)。

    pJSO026：(酿酒酵母表达质粒)(J.S.Okkels,1996,“pYES载体中的URA3启动子缺失增加酿酒酵母中的真菌脂肪酶表达水平”，重组DNA生物技术Ⅲ：生物学和工程学的结合，纽约科学院年刊Vol.782)。更具体地，通过用得自酿酒酵母的组成型表达的TPI(丙糖磷酸异构酶)启动子(Albert和Karwasaki,1982，应用分子遗传学杂志，1,419-434)替代pYES2.0中的诱导型GAL1-启动子，并缺失URA3启动子的一部分，由pYES2.0衍生得到表达质粒pJSO37。

    方法：

    酿酒酵母YNG318的转化

    混合DNA片段和开环载体，并通过标准方法转化至酵母酿酒酵母YNG318中。

    测定以Kcat(sec.-1)表示的比活性

    在选定的温度下，如37℃或60℃，将750μl底物(1％麦芽糖，50mM醋酸钠，pH4.3)保温5分钟。

    加入50μl用醋酸钠稀释的酶。在0,3,6,9和12分钟之后取出100μl等分试样，并转移至100μl 0.4M氢氧化钠中以终止反应。也包括空白对照。

    将20μl转移至微滴板中，加入200μl GOD-Perid溶液，室温下保温30分钟之后，在650nm下测定光吸收值。

    葡萄糖被用作标准，比活性被计算为Kcat(sec.-1)。

    测定AGU活性并表示为AGU/mg

    一个Novo淀粉葡糖苷酶单位(AGU)被定义为于37℃和pH4.3，每分钟水解1μM麦芽糖的酶量。分析方法(AEL-SM-0131)的详细描述可由NovoNordisk提供。

    使用Boehringer Mannheim的Glucose GOD-Perid试剂盒，124036，通过(AEL-SM-0131)的改良方法将活性测定为AGU/ml。标准：AMG-标准，批号7-1195,195AGU/ml。

    于37℃，将375μl底物(1％麦芽糖，50mM醋酸钠，pH4.3)保温5分钟。加入25μl用醋酸钠稀释的酶。10分钟之后通过加入100μl 0.25M氢氧化钠以终止反应。将20μl转移至96孔微滴板中，加入200μl GOD-Perid溶液，室温下保温30分钟之后，在650nm下测定光吸收值，根据AMG-标准将活性计算为AGU/ml。

    然后用活性(AGU/ml)除以蛋白质浓度(mg/ml)，计算出比活性(AGU/mg)。

    米曲霉的转化(一般方法)

    用米曲霉的孢子接种100ml YPD(Sherman等，1981，酵母遗传学方法，冷泉港实验室)，振荡培养约24小时。通过流经miracloth过滤以收集菌丝体，并用200ml 0.6M MgSO4洗涤。将菌丝体悬浮于15ml 1.2M MgSO4,10mMNaH2PO4,pH5.8中。在冰上冷却悬浮液，加入1ml含有120mg NovozymTM 234的缓冲液。5分钟之后，加入1ml 12mg/ml BSA(Sigma H25型)，于37℃持续缓慢搅拌保温达1.5至2.5小时，直至在显微镜下检查出样品中可见大量原生质体。

    流经miracloth过滤悬浮液，将滤液转移至无菌的试管中，铺一层5ml0.6M山梨糖醇，100mM Tris-HCl,pH7.0。1000g离心15分钟，从MgSO4垫层的上部收集原生质体，在原生质体悬浮液中加入2倍体积的STC(1.2M山梨糖醇，10mM Tris-HCl,pH7.5,10mM CaCl2)，以1000g将混合物离心5分钟。将原生质体沉淀物重新悬浮于3ml STC中，并重新沉淀。重复该步骤，最终，将原生质体重新悬浮于0.2-1ml STC中。

    将100μl原生质体悬浮液与溶于10μl STC中的5-25μg p3SR2(携有构巢曲霉amdS基因的质粒，其描述于Hynes等，分子和细胞生物学，Vol.3,No.8,1430-1439,Aug.1983)混合。将混合物置于室温放25分钟，加入0.2ml 60％PEG4000(BDH29576),10mM CaCl2和10mM Tris-HCl,pH7.5，小心混合(两次)，最终加入0.85ml相同的溶液并小心混合。将混合物置于室温放25分钟，以2500g离心15分钟，将沉淀物重新悬浮于2ml 1.2M山梨糖醇中。再进行一次沉降之后，将原生质体铺于基本平板(Cove,1966,Biochem.Biophys.Acta 113,51-56)，所述平板含有1.0M蔗糖，pH7.0，以10mM乙酰胺为氮源，并含20mM CsCl以抑制背景生长。于37℃保温4至7天之后，挑选孢子，悬浮于无菌水中，铺平板以得到单菌落。重复该方法，储存第二次重分离之后的单菌落孢子，将其作为确定的转化子。

    补料分批发酵

    在含有麦芽糖糊精作为碳源，尿素作为氮源，并含有酵母提取物的培养基中进行补料分批发酵。通过将所述米曲霉宿主细胞的摇瓶培养物接种于含有3.5％碳源和0.5％氮源的培养基中来进行补料分批发酵。在pH5.0和34℃下培养24小时之后，开始持续补加碳源和氮源。碳源被当成限速因子，它可以确保存在过量的氧。补料分批培养持续4天，然后通过离心，超滤，清洗过滤和除菌过滤回收酶。

    纯化

    过滤培养物肉汤，加入硫酸铵(AMS)至浓度为1.7M AMS，将pH调节为pH5。离心除去沉淀的物质，将含有葡糖淀粉酶活性的溶液上样于预先用1.7M AMS,20mM醋酸钠，pH5平衡过的Toyo Pearl Butyl柱。使用1.7至0M AMS的线性梯度，用超过10倍柱体积的10mM醋酸钠，pH4.5洗脱结合的蛋白质。收集含葡糖淀粉酶的级分，对着20mM醋酸钠，pH4.5进行透析。然后将溶液上样于预先用10mM Piperazin,Sigma,pH5.5平衡过的QSepharose柱。用平衡缓冲液洗下未结合的物质。用超过10倍柱体积的含10mM Piperazin,pH5.5的0-0.3M氯化钠线性梯度洗脱结合的蛋白质。收集含葡糖淀粉酶的级分，通过SDS-PAGE证实纯度。

    T1/2(半寿期)方法Ⅰ

    使用下列方法将变体的热稳定性测定为T1/2：于68℃或70℃，将950μl50mM醋酸钠缓冲液(pH4.3)(NaOAc)保温5分钟。加入50μl溶于缓冲液中的酶(4AGU/ml)。在0,5,10,20,30和40分钟之后取出2×40μl样品，并在冰上冷却。将保温(0分钟)之前测定的活性(AGU/ml)用作对照(100％)。稳定性的降低(百分比)被计算为保温时间的函数。在不同的时间测定残留的葡糖淀粉酶活性所占的百分比。T1/2是直至相对活性的百分比降低为50％所花的时间。

    T1/2(半寿期)(方法Ⅱ)

    通过在所述温度(如70℃)下，在pH4.5的30％葡萄糖，50mM醋酸钠中保温所述酶(ca0.2AGU/ml)来测定T1/2。以给定的时间间隔取出样品，置于冰上冷却，通过pNPG法(如下文所述)测定残留的酶活性。

    在不同的时间测定残留的葡糖淀粉酶活性所占的百分比。T1/2是直至相对活性的百分比降低为50％所花的时间。

    残留的酶活性(pNPG法)

    pNPG试剂：

    将0.2gpNPG(对-硝基苯基葡糖吡喃糖苷)溶解于0.1M醋酸盐缓冲液(pH4.3)，并将体积调节至100ml。

    硼酸盐溶液：

    将3.8g Na2B4O7·10H2O溶解于Milli-Q水中，并将体积调节为100ml。在25μl样品中加入50μl底物，于50℃保温2小时。通过加入150μl硼酸盐溶液以终止反应。测定405nm处的光密度，计算残留的活性。

    构建pAMGY

    按下述构建pAMGY载体：用AMG基因取代pJSO026中的脂肪酶基因，AMG基因是使用含有AMG基因的模板质粒pLAC103，用正向引物FG2:5’-CAT CCC CAG GAT CCT TAC TCA GCA ATG-3’和反向引物RG2:5’-CTC AAA CGA CTC ACC AGC CTC TAG AGT-3’经PCR扩增得到的。于37℃，用XbaⅠ和SmaⅠ将pJSO026质粒消化2小时，使用Klenow片段使PCR扩增子成为平端，然后用XbaⅠ消化。连接载体片段和PCR扩增子，通过电转化转化至大肠杆菌。所得载体被称为pAMGY。

    构建pLaC103

    黑曲霉AMGⅡcDNA克隆(Boel等，1984，文献同上)被用作来源以构建pLaC103，从而在酿酒酵母中表达GⅡ型AMG。

    按下述几个步骤进行构建。

    用XbaⅠ裂解pT7-212(EP37856/US5162498)，用Klenow DNA聚合酶和dNTP使其成为平端。用EcoRⅠ裂解之后，从琼脂糖凝胶电泳中纯化所得的载体片段，并与pBoe153的2.05kb EcoRⅠ-EcoRⅤ片段连接，籍此在所得质粒pG2x中重新产生位于AMG编码片段之EcoRⅤ末端的XbaⅠ位点。

    为了除去AMG编码序列上游的DNA，并在编码AMG的DNA中安插适当的限制性内切核酸酶识别位点，需制备下列构建体：

    分离p53的930bp EcoRⅠ-PstⅠ片段，用AluⅠ裂解，将所得771bp Alu-PstⅠ片段连接至具有平端EcoRⅠ位点的pBR322(见上文)，并用PstⅠ裂解。在所得质粒pBR-AMG’中，在离AMG编码序列起始密码子仅34bp的位置处重新产生了EcoRⅠ位点。

    从pBR-AMG’中分离775bp EcoRⅠ-PstⅠ片段，并在包括pT7-212的XbaⅠ-EcoRⅠ载体片段的连接反应中与pG2x的1151bp PstⅠ-XbaⅠ片段连接。

    在碱性磷酸酶的存在下，用BamHⅠ裂解所得质粒pT7GⅡ，灭活磷酸酶之后用SphⅠ进行部分消化。由此反应得到2489bp SphⅠ-BamHⅠ片段，其含有与AMGⅡ编码序列相连的酿酒酵母TPⅠ启动子。

    上述片段和pT7GⅡ的1052bp BamHⅠ片段与经碱性磷酸酶处理的，由SphⅠ-BamHⅠ消化所得的pMT743(EP37856/US5162498)载体片段相连接，所得质粒是pLaC103。

    筛选热稳定性AMG变体

    在下文所述的热稳定性滤膜分析试验中筛选文库。

    滤膜试验分析热稳定性

    于30℃，将酵母文库铺于含100μg/ml氨苄青霉素的SCFura琼脂平板上的醋酸纤维素(OE67,Schleicher & Schuell,Dassel，德国)-和硝酸纤维素滤膜(Protran-Ba 85,Schleicher＆Schuell,Dassel，德国)的夹层中放置至少72小时。将菌落影印铺板于用甲醇激活1分钟的PVDF滤膜(Immobilon-P,Millipore,Bedford)，或者Protran滤膜(未激活)，随后用0.1M NaAc洗涤，置于室温下保温2小时。用自来水洗涤PVDF/Protran滤膜上的菌落，在保温之前用针头特异性标记各个滤膜夹层和PVDF/Protran滤膜，从而能在筛选之后将阳性变体定位于滤膜上。将具有结合变体的PVDF滤膜转移至含0.1MNaAc,pH4.5的容器中，于47℃保温(如果是Protran滤膜，则在67-69℃保温)15分钟。室温下储存SC ura-琼脂平板上的醋酸纤维素和硝酸纤维素滤膜夹层直至使用。保温之后，在含有5％麦芽糖，1％琼脂糖，50mM NaAc,pH4.5的平板上检测残留的活性。按与滤膜夹层相同的方式标记具PVDF滤膜的检测平板，50℃保温2小时。取出PVDF滤膜之后，用Glucose GODperid(Boehringer Mannheim GmbH，德国)染色检测平板。在白色背景上，检测平板上具有残留活性的变体被检测为暗绿色的点。改良变体位于储存平板上。在与第一次筛选相同的条件下再将改良变体筛选2次。

    使用掺加方案进行随机诱变的一般方法

    通过下列步骤进行随机诱变：

    1．在亲代酶中选择需修饰的区域，

    2．确定选定区域中的突变位点和无需突变的位点，

    3．确定应进行何种类型的突变，例如与所构建的变体的所需稳定性和/或特性相关的突变，

    4．选择结构合理的突变，

    5．考虑到步骤4，调整步骤3所选择的残基，

    6．利用适当的掺加算法规则分析核苷酸分布，

    7．必要时，将需要的残基调整为实实在在的遗传密码，例如考虑到遗传密码的局限性，例如为了避免导入终止密码子；本领域技术人员会意识到在实践中不能使用一些密码子的组合，而需改动这些组合，

    8．制备引物，

    9．使用引物进行随机诱变，

    10．通过筛选所需的改良特性来选择所得的葡糖淀粉酶变体。

    掺加算法规则

    用于步骤6的适当的掺加算法规则是本领域众所周知的。一个这种算法规则描述于Tomandl,D等，1997，计算机辅助的分子设计杂志，11:29-38。另一个算法规则是DOPE(Jensen,LJ,Andersen,KV,Svendsen,A和Kretzschmar,T,1998，核酸研究，26:697-702)。

    使用分子模拟推断出温度活性重要区的方法

    对目的酶(本文是AMG)的X-射线结构和/或模型-制作结构进行分子动力学模拟。使用CHARMM(得自分子模拟(MSI))程序或其它适当程序，如DISCOVER(得自MSI)进行分子动力学模拟。所述动力学模拟在真空，或包括结晶水，或与包埋于适当水体如球体或盒中的目的酶一起进行。模拟进行300皮秒(ps)，或更长时间，如300至1200ps。推断出结构中CA碳的各向同性波动，并且进行结构之间的比较。有关如何获得各向同性波动的详细描述见于CHARMM手册(得自MSI)(列入本文作为参考)。

    可使用可带电氨基酸上的标准电荷进行分子动力学模拟。例如，Asp和Glu带负电，Lys和Arg带正电。此状况类似于约7.0的中性pH。为了分析较低的pH，可以滴定分子以便得到正常可滴定残基在pH2-10的pKa变化；所述残基为Lys,Arg,Asp,Glu,Tyr和His。Ser,Thr和Cys也是可滴定的，但是不在考虑之列。此处，因pH所致的电荷改变被描述为：在高pH时Arg,Lys都带负电，Asp,Glu都不带电。这模仿了4至5的pH，此时一般会发生Asp和Glu的滴定。

    通过使用MSI程序包中的HOMOLOGY模型可进行目的酶的模型制作。泡盛曲霉变体X100的晶体结构见于例如Brookhaven数据库中的3GLY和1DOG。

    实施例

    实施例1  构建AMG G2变体

    定点诱变：

    为了构建AMG G2(SEQ ID NO:2)的变体，按说明书使用了市售的Chameleon双链定点诱变试剂盒。

    在含有AMG G1形式的质粒pCAMG91(见图1)中删除介于G2第1362位核苷酸和G2第1530位核苷酸之间的DNA，制成pMT838，将编码所选AMG G2酶的基因置于上述pMT838上。

    按说明书用以下引物：

    7258:5’p gaatga ctt ggt tga cgc gtc acc agt cac 3’(SEQ ID NO:3)

    将pMT838中氨苄青霉素基因的ScaⅠ位点转换为MluⅠ位点(从而改变在氨苄青霉素抗性基因中发现的ScaⅠ位点，并用于切割MluⅠ位点)。然后以含有所选AMG基因的pMT838载体为DNA聚合酶、寡聚核苷酸7258(SEQID NO:3)和21401(SEQ ID NO:4)的模板。

    引物编号21401(SEQ ID NO:4)作为筛选引物使用。

    21401:5’pgg gga tca tga tag gac tag cca tat taa tga agg gca tat acc acg ccttgg acctgc gtt ata gcc 3’

    (改变了在AMG基因中发现的ScaⅠ位点但未改变氨基酸序列)

    通过添加含所需突变的相应寡聚核苷酸将所需突变(如半胱氨酸残基的引入)引入所选AMG基因中。

    用引物107581引导T12P

    107581:5’pgc aacgaa gcg ccc gtg gct cgt ac 3’(SEQ ID NO:5)

    通过对整个基因测序而对突变进行检验。用上述质粒转化米曲霉，方法如上文“材料与方法”部分所述。发酵变体并如上文“材料与方法”部分所述纯化。

    实施例2  通过局部随机掺加诱变来构建比亲代酶热稳定性增强了的黑曲霉AMG变体

    在黑曲霉AMG的预选区实施随机诱变以增强热稳定性。

    残基：

    区域：L19-G35

    区域：A353-V374

    用DOPE软件(见材料与方法)测定上述区域中每一改变的插入(spiked)密码子以使终止密码子的量减至最少(见表1)。计算密码子的三个位置中核苷酸的真实分布，从而得出所选的氨基酸改变群体。在指定位置对掺加区域进行特异性掺加，从而能有较多机会获得所需残基，但仍允许有其它可能性。

    第一柱为待突变的氨基酸，第二柱为野生型的百分率，第三柱为新的氨基酸。

    表1  在L19-G35中的掺加

        L19    90％    N

        N20    95％    T

        N21    恒定不变的

        I22    恒定不变的

        G23    95％    A

        A24    90％    S,T

        D25    93％    S,T,R

        G26    95％    A

        A27    90％    S,T

        W28    ＜80％    R,Y

        V29    恒定不变的

        S30    93％    T,N

        G31    95％    A

        A32    95％    V

        D33    80％    R,K,H

        S34    90％    N

        G35    恒定不变的

    所得掺加寡核苷酸链示于表2，为有义链：包含引物序列、野生型核苷酸序列、亲代氨基酸序列及每一掺加位置的核苷酸分布。

    表2：

    位            置：19  20  21  22  23  24  25  26  27

    氨 基  酸  序 列：L   N   N   I   G   A   D   G   A

    引            物：12T A3T AAC ATC G4G 5CG 67C G4T 8CT

    野生型核苷酸序列：CTG AAT AAC ATC GGG GCG GAC GGT GCT

    位        置(续)：28  29   30   31   32   33   34   35

    氨基酸序列(续)：  W    V    S    G    A    D    S    G

    引           物：91010 GTG 1112C G4C G13G 14151 61718T GGC

    野生型核苷酸序列：TGG  GTG TCG   GGC GCG  GAC   TCT    GGC

    每一掺加位置的核苷酸分布：

        1:A10,C90

        2:A6,T94

        3:A95,C5

        4:G95,C5

        5:G91,A3,T3,C3

        6:G95,A3,C2

        7:G3,A95,C2

        8:G92,A4,T4

        9:A3,T97

        10:G95,T5

        11:G3,A97

        12:G95,A2,C3

        13:T5,C95

        14:G88,A8, C4

        15:G7,A93

        16:G4,C96

        17:G4,A96

        18:G95,A2,C3

    正向引物(SEQ ID NO:6):FAMGII｀5-C GAA GCG ACC GTG GCT CGT ACT GCC ATC 12T A3T AAC ATCG4G 5CG 67C G4T 8CT 91010 GTG 1112C G4C G13G 141516 1718T GGC ATTGTC GTT GCT AGT CCC AGC ACG GAT AAC-3′   反向引物(SEQ ID NO:7):RAMG1:5′-GAT GGC AGT ACG AGC CAC GGT CGC TTC G-3′

    表3  在A353-V374区中的掺加A353    ＜80％  D,E,Q,N,YL354    90％    Q,EY355    90％    N,QS356    90％    T,D,NG357    80％    P,A,S,TA358    93％    SA359    90％    S,T,NT360    90％    R,KG361    85％    A,S,TT362    90％    SY363    恒定不变的S364    93％    DS365    93％    N,Q,KS366    93％    P,DS367    恒定不变的S368    93％    D,N,TT369    93％    Q,EY370    恒定不变的S371    93％    NS372    93％    N,TI373    恒定不变的V374    93％    N,Y,H

    所得掺加寡核苷酸链示于表4，为有义链：包含引物序列、野生型核苷酸序列、亲代氨基酸序列及每一掺加位置的核苷酸分布。

    表4：

    位            置：353  354  355 356 357  358  359  360  361  362

    氨 基  酸  序 列：A    L    Y   S   D    A    A     T     G    T

    引            物：123 45A 6AC 78C 910T 11CT 1213T 1415A 1617C 18CC

    野生型核苷酸序列：GCA CTG TAC AGC GAT  GCT  GCT   ACT    GGC   ACC

    位        置(续)：363 364 365 366 367  368  369   370

    氨基 酸 序列(续)：Y    S   S   S   S    S    T    Y

    引            物：TAC 1920T A2122 2324C AGT 1425C 2627G T28T

    野生型核苷酸序列：TAC TCT   TCG   TCC   AGT TCG   ACT   TAT

    位        置(续)：371 372   373   374

    氨基 酸 序列(续)：S    S     I     V

    引            物：A16T 2930T ATT 313233

    野生型核苷酸序列：AGT  AGC   ATT GTA

    每一掺加位置的核苷酸分布。

          1:G91,A3,T3,C3

          2:A13,C87

          3:A40,T60

          4:G3,A3,C94

          5:A6,T94

          6:G4,A4,T92

          7:G2,A96,C2

          8:G93,A3.5,C3.5

          9:G87,A8,C5

          10:A84,C16

          11:G93,T7

          12:G92,A5,T3

          13:A3,C97

          14:G3,A97

          15:G2,A2,T4,C92

          16:G93,A7

          17:G93,C7

          18:A90,T10

        19:G4,A96

        20:G95,A5

        21:G96,A4

        22:G3,C97

        23:G2,A1,T95,C2

        24:A3,C97

        25:G95,A3,C2

        26:G2,A96,C2

        27:A5,C95

        28:A95,T5

        29:G2,A98

        30:G94,A4,C2

        31:G94,A3,T1,C2

        32:A4,T96

        33:A20,C80

    引物：FAMGIV(SEQ ID NO:8)

    5′-GTG TCG CTG GAC TTC TTC AAG 123 45A 6AC 78C 910T 11CT 1213

    1415A 1617C 18CC TAC 1920T A2122 2324C AGT 1425C 2627G T28T A16

    2930C ATT 313233 GAT GCC GTG AAG ACT TTC GCC GA-3＇

    引物：RAMGⅥ(SEQ ID NO:9)

    5’-ctt gaa gaa gtc cag cga cac-3’

    随机诱变

    使用表2和3中显而易见的插入的寡核苷酸(均称为FAMG)、L19-G35的反向引物RAMG，以及特异性SEQ ID NO:2引物的跨N末端(FG2:5’-CAT CCC CAG GAT CCT TAC TCA GCA ATC-3’(SEQ ID NO:10)和C末端(RG2:5’-CTC AAA CGA CTC ACC AGC CTC TAG AGT(SEQ IDNO:11)序列，以通过重叠延伸法(Horton等，基因(Gene),77(1989)，第61-68页)产生带有21个碱基对的一段重叠的PCR-文库-片段。质粒pAMGY是聚合酶链式反应的模板。经同源重组在大肠杆菌/酵母穿梭质粒pAMGY中克隆PCR片段(见材料和方法)。

    筛选

    如“材料和方法”部分所述，在热稳定性过滤试验中用Protran滤膜，并在67-69℃温育，以筛选文库。

    实施例3通过有DNA寡聚核苷酸插入的PCR改组来构建比亲代酶热稳定性增强的黑曲霉AMG变体

    用聚合酶链式反应(PCR)方法装备携带AMG基因及侧翼区的DNA片段。约10μg DNA用DNA酶消化，并在2％琼脂糖凝胶上电泳。50-150bp的片段从凝胶上纯化。约1μg纯化片段与5-15倍摩尔过量的含所需突变之寡聚核苷酸混合。寡聚核苷酸如下(分别用于构建Hklib1,Hklib2,Hklib3等)：Hklib1:

    Hk1- T2X:

    5′-ATGTGATTTCCAAGCGCGCGVNNTTGGATTCATGGTTGAGCAA

    Hk1-N9X:

    5′-CCTTGGATTCATGGTTGAGCVNNGAAGCGACCGTGGCTCGTAC

    Hk1-A11X:

    5′-ATTCATGGTTGAGCAACGAAVNNACCGTGGCTCGTACTGCCAT

    Hk1-L66X:

    5′-TCCTCAAGACCCTCGTCGATVNNTTCCGAAATGGAGATACCAG

    Hk1-S386X:

    5′-CTTTCGCCGATGGCTTCGTCVNNATTGTGGAAACTCACGCCGC

    Hk1-E389X:

    5′-ATGGCTTCGTCTCTATTGTGVNNACTCACGCCGCAAGCAACGG

    Hk1-T390X:

    5′-GCTTCGTCTCTATTGTGGAAVNNCACGCCGCAAGCAACGGCTC

    Hk1-A393X:

    5′-CTATTGTGGAAACTCACGCCVNNAGCAACGGCTCCATGTCCGA

    Hk1- S394X:

    5′-TTGTGGAAACTCACGCCGCAVNNAACGGCTCCATGTCCGAGCA

    Hk1-N395X:

    5′-TGGAAACTCACGCCGCAAGCVNNGGCTCCATGTCCGAGCAATA

    Hk1-G396X:

    5′-AAACTCACGCCGCAAGCAACVNNTCCATGTCCGAGCAATACGAHk1-K404X:5′-CCATGTCCGAGCAATACGACVNNTCTGATGGCGAGCAGCTTTCHk1-D406X:5′-CCGAGCAATACGACAAGTCTVNNGGCGAGCAGCTTTCCGCTCGHk1-E408X:5′-AATACGACAAGTCTGATGGCVNNCAGCTTTCCGCTCGCGACCTHk1-L410X:5′-ACAAGTCTGATGGCGAGCAGVNNTCCGCTCGCGACCTGACCTHk1-L423X:5′-CCTGGTCTTATGCTGCTCTGVNNACCGCCAACAACCGTCGTAAHk1 -N426X:5′-ATGCTGCTCTGCTGACCGCCVNNAACCGTCGTAACTCCGTCGTGHk1-N427X:5′-CTGCTCTGCTGACCGCCAACVNNCGTCGTAACTCCGTCGTGCCTHk1-Y402X:5′-ACGGCTCCATGTCCGAGCAANNCGACAAGTCTGATGGCGAGCAGCTHklib2:Hk2-L234X- SENSE:5′-CTGGACCGGCAGCTTCATTNNKGCCAACTTCGATAGCAGCCHk2-A235S -ANTISENSE:5′-GAACGGCTGCTATCGAAGTTAGACAGAATGAAGCTGCCGGTCHk2-F237X- SENSE:5-CAGCTTCATTCTGGCCAACNATGATAGCAGCCGTTCCGGCAHk2-D238T-ANTISENSE:5′-CCTTGCCGGAACGGCTGCTAGTGAAGTTGGCCAGAATGAAGCHk2-D238S-ANTISENSE:5′-CCTTGCCGGAACGGCTGCTAGAGAAGTTGGCCAGAATGAAGCHk2-S239X- SENSE:5′-TCATTCTGGCCAACTTCGATNNCAGCCGTTCCGGCAAGGACGHk2-S240G-ANTISENSE:5′-TTGCGTCCTTGCCGGAACGACCGCTATCGAAGTTGGCCAGAAHk2-S242X-ANTISENSE:5′-GGGTGTTTGCGTCCTTGCCAKNACGGCTGCTATCGAAGTTGHk2-G243X-ANTISENSE:5′-GGAGGGTGTTTGCGTCCTTAKNGGAACGGCTGCTATCGAAGHk2-K244R-SENSE:5′-CGATAGCAGCCGTTCCGGCAGAGACGCAAACACCCTCCTGGHk2-T310V-ANTISENSE:5′-ACGGGTTGCCGTTGTAGTAAACGTCCTCAGGGTACCGACCCHk2-T310S-ANTISENSE:5′-ACGGGTTGCCGTTGTAGTAAGAGTCCTCAGGGTACCGACCCHk2-Y311N-SENSE:5′-TCGGTACCCTGAGGACACGAATTACAACGGCAACCCGTGGTHk2-Y312Q-ANTISENSE:5′-GGAACCACGGGTTGCCGTTTTGGTACGTGTCCTCAGGGTACHk2-Y312N-ANTISENSE:5′-GGAACCACGGGTTGCCGTTATTGTACGTGTCCTCAGGGTACHk2-N313T-SENSE:5′-CCCTGAGGACACGTACTACACTGGCAACCCGTGGTTCCTGT Hk2-N313S-SENSE:5′-CCCTGAGGACACGTACTACTCTGGCAACCCGTGGTTCCTGTHk2-N313G-SENSE:5′-CCCTGAGGACACGTACTACGGTGGCAACCCGTGGTTCCTGTHk2-N315Q-ANTISENSE:5′-AGGTGCACAGGAACCACGGTTGGCCGTTGTAGTACGTGTCCHk2-N315E-ANTISENSE:5′-AGGTGCACAGGAACCACGGTTCGCCGTTGTAGTACGTGTCCHk2-N315R-ANTISENSE:5′-AGGTGCACAGGAACCACGGTCTGCCGTTGTAGTACGTGTCCHk2-F318Y-ANTISENSE:5′-CGGCAGCCAAGGTGCACAGATACCACGGGTTGCCGTTGTAGHk2- Q409P-SENSE:5′-CGACAAGTCTGATGGCGAGCCACTTTCCGCTCGCGACCTGAHklib3:Hk3-D336X-SENSE:5′-CGATGCTCTATACCAGTGGNNKAAGCAGGGGTCGTTGGAGGHk3-K337X-SENSE:5′-TGCTCTATACCAGTGGGACNNKCAGGGGTCGTTGGAGGTCAHk3- Q338X-ANTISENSE:5′-CTGTGACCTCCAACGACCCGNNCTTGTCCCACTGGTATAGAHk3-G339X-SENSE:5′-ATACCAGTGGGACAAGCAGNCUTCGTTGGAGGTCACAGATGHk3-S340X′-ANTISENSE:5′-ACACATCTGTGACCTCCAAANTCCCCTGCTTGTCCCACTGGHk3-S340X″-ANTISENSE:5′-ACACATCTGTGACCTCCAAANCCCCCTGCTTGTCCCACTGGHk3-L341X-SENSE:5′-GTGGGACAAGCAGGGGTCGNUUGAGGTCACAGATGTGTCGCHk3-K352Q-SENSE:5′-TGTGTCGCTGGACTTCTTCCAAGCACTGTACAGCGATGCTGHk3-K352R-SENSE:5′- TGTGTCGCTGGACTTCTTCAGAGCACTGTACAGCGATGCTGHk3-A353D-ANTISENSE:5′-TAGCAGCATCGCTGTACAGATCCTTGAAGAAGTCCAGCGACHk3-A353S-ANTISENSE:5′-TAGCAGCATCGCTGTACAGAGACTTGAAGAAGTCCAGCGACHk3-S356P-SENSE:5′-ACTTCTTCAAGGCACTGTACCCAGATGCTGCTACTGGCACCTHk3-S356N-SENSE:5′-ACTTCTTCAAGGCACTGTACAAUGATGCTGCTACTGGCACCTAHk3-S356D-SENSE:5′-ACTTCTTCAAGGCACTGTACGAUGATGCTGCTACTGGCACCTAHk3-D357S-ANTISENSE:5′-GAGTAGGTGCCAGTAGCAGCAGAGCTGTACAGTGCCTTGAAGAHk3-A359S-SENSE:5′-GGCACTGTACAGCGATGCTTCTACTGGCACCTACTCTTCGTHk3-T360V-ANTISENSE:5′-TGGACGAAGAGTAGGTGCCAACAGCAGCATCGCTGTACAGTHk3-G361X- SENSE:5′-TGTACAGCGATGCTGCTACTNCTACCTACTCTTCGTCCAGTTCHk3-T362R-ANTISENSE:5′-GTCGAACTGGACGAAGAGTATCTGCCAGTAGCAGCATCGCTGHk3-S364X-SENSE:5′- TGCTGCTACTGGCACCTACNNKTCGTCCAGTTCGACTTATAGHk3-S365X-SENSE:5′-TGCTACTGGCACCTACTCTNNKTCCAGTTCGACTTATAGTAGHk3-S366T-ANTISENSE:5′-ATGCTACTATAAGTCGAACTAGTCGAAGAGTAGGTGCCAGTAHk3-S368X-ANTISENSE:5′-TCTACAATGCTACTATAAGTAGNACTGGACGAAGAGTAGGTGHk3-T369X-SENSE:5′-CTACTCTTCGTCCAGTTCGNNKTATAGTAGCATTGTAGATGCCHk3- S371X-ANTISENSE:5′-TTCACGGCATCTACAATGCTATNATAAGTCGAACTGGACGAAGHk3-S372X-SENSE:5′-CGTCCAGTTCGACTTATAGTNNTATTGTAGATGCCGTGAAGAC

    向DNA酶处理的DNA与寡聚核苷酸的混合物中添加核苷酸、PCR缓冲液和Taq/PWo聚合酶。实施PCR装配反应，条件为首先94℃ 2分钟，然后94℃30秒、45℃30秒、72℃ 60秒共进行35-40个循环；再以72℃ 5分钟结束。

    以1μl装配反应物为模板，并加入与AMG基因侧翼区退火的引物，进行PCR扩增反应。参数为：首先94℃ 2分钟，然后以94℃ 30秒、55℃30秒、72℃ 90秒进行35-40个循环；再以72℃ 10分钟结束。

    所得PCR称为在1％琼脂糖凝胶上纯化，与线性载体混合并转化至感受态的酵母细胞中，如上述。

    实施例4    比活性

    如上实施例1所述构建AMG G32变体。以Kcat表示的比活性在纯化样品上，以pH4.3,37℃的条件，用麦芽糖和麦芽糖庚糖为底物，如在“材料和方法”部分所述进行测定。以AGU/mg表示的比活性也在pH4.3,37℃，用麦芽糖为底物，如在“材料和方法”部分所述进行测定。Kcat(第一部分)    变体   麦芽糖麦芽糖庚糖AMG G2(野生型)    N110T    V111P    S119P    G127A    G207N    6.0    9.7    12.0    62    21.0    305    38    27.8    43.2    44.0    40.0    363变体AGU/mgAMGG2(野生型)N110TV111PS119PG127AG207NL3NS56AA102*D403SI18V+T51S+S56A+V59T+L60A1.83.53.12.15.85.72.32.62.52.23.3S119P+Y402FS119P+I189T+Y223F+F227Y+Y402F2.73.0

    实施例5在70℃时的热稳定性

    用实施例1所述方法构建一个AMG G2 S119P变体。

    按上文“材料和方法”一节中所述，使用方法Ⅰ将热稳定性测定为T1/2，在50mM NaOAc,pH4.5,70℃,0.2AGU/ml中保温30分钟之后将热稳定性测定为％残留活性。试验结果列于下表，并将试验结果与野生型黑曲霉AMG G2相比。黑曲霉AMG(酶)残留活性(％)  T1/2(分钟)    S119P变体    22     17野生型(SEQ ID NO:2)    13      8

    实施例6    68℃时的热稳定性

    使用实施例3所述的方法构建AMG G2变体，但下表中的第1和2号变体是通过按WO 95/22625所述进行改组而制备的(Affymax Technologies N.V.)。

    按上文“材料和方法”一节中所述，于68℃使用方法Ⅰ将热稳定性测定为T1/2，并与相同条件下的野生型黑曲霉AMGG2比较。过滤上清液之后对培养物肉汤进行变体评价。变体T1/2(分钟)T1/2黑曲霉AMGG2(野生型)(分钟) 1A246T+T72I    11.3       8.5 2G447S+S119P    11.4       7.9 3E408R+A425T+S465P+T494A    8.6       8.1 4E408R+S386N    12.6       8.9 5T2P    9.3       8.5 6T2Q+A11P+S394R    10.7       8.5 7T2H    9.5       8.9 8A11E+E408R    12.7       9.3 9T2M+N9A+T390R+D406N+L410R    10.7       8.5 10A393R    17.7       8.4 11T2R+S386R+A393R    14.1       8.4 12A393R+L410R    14.7       7.913A1V+L66R+Y402F+N427S+S486G    11.7       8.514T2K+S30P+N427M+S444G+V470M    11.4       8.4

    纯化样品在70℃的热稳定性酶T1/2(分钟) 15AMG G2(野生型)    7.4 16T2E+T379A+S386K+A393R    11.6 17F408R+S386N    10.2 18T2Q+A11P+S394R    9.8 19A1V+L66R+Y402F+N427S+S486G    14.1 20A393R    14.6 21T2R+S386R+A393R    14.1 22A393R+L410R    12.9 23Y402F    10.1

    实施例7    在68℃的热稳定性

    用实施例3所述方法并随后改组阳性变体，从而构建AMG G2变体。

    如“材料和方法”部分所述以方法Ⅰ测定在68℃时的T1/2以示热稳定性，并与同样条件下的野生型黑曲霉AMG G2相比较。将培养液上清过滤后实施对变体的评估。变体T1/2(分钟)T1/2黑曲霉AMGG2(野生型)(分钟) 24PLASD1+V59A+A393R+T490A    27.2       6.8

    i为N末端延伸

    实施例8

    在68℃的热稳定性

    用实施例3所述方法构建AMG G2变体。如“材料和方法”部分所述以方法Ⅰ测定在68℃时的T1/2以示热稳定性，并与同样条件下的野生型黑曲霉AMG G2相比较。将培养液上清过滤后实施对变体的评估。

    实施例9

    在70℃的热稳定性

    用实施例1所述方法构建AMG G2变体，并评价为半纯化样品(将培养液过滤，再于G-25上脱盐)。

    用方法Ⅰ在50mM NaOAc,pH 4.5,70℃，如以上“材料和方法”部分所述将热稳定性测定为残留活性的百分率。检验结果列于下表，并与黑曲霉AMG G2比较。酶T1/2(分钟) 29AMG G2(野生型)    7 30Y402F+S411V    60 31S119P+Y402F+S411V    115 32S119P+Y312Q+Y402F+T416H    50

    实施例10  在70℃时有30％葡萄糖存在的情况下的热稳定性

    用实施例3的方法构建AMG G2变体。

    用方法Ⅱ在70℃如“材料和方法”所述将热稳定性测定为T1/2，并与同样条件下的野生型黑曲霉AMG G2比较。酶 T1/2(小时) 33AMG G2(野生型)    1.5 34Y402F    2.5 35A393R    4.0 36T2R+S386R+A393R    2.0 37PLASD(N末端)+V59A+A393R+T490A

    实施例11  分别对AMG变体S119P+Y402F+S411V和PLASD(N末端)+V59A+A393R+T490A实施糖化

    AMG变体S119P+Y402F+S411V和PLASD(N末端)+V59A+A393R+T490A均具有改良的热稳定性，分别对它们实施糖化，在70℃时如下述进行检验。

    参照酶为野生型黑曲霉AMG G2。

    糖化条件如下：

    底物      10DE麦芽糖糊精，约30％DS(w/w)

    温度      70℃

    起始pH    4.3(在70℃)

    酶的用量  0.24AGU/g DS

    糖化

    糖化底物通过将(从普通玉米制备的)麦芽糖糊精溶于100℃的Milli-Q水中，并将底物干重调为约30％(w/w)。pH调为4.3。将相当于15g干物质的底物转移至50ml兰帽玻璃烧瓶中，并于水浴中搅拌。加入酶，必要时重新调整pH。做平行实验。定期取样，在HPLC上分析糖的组成。

                      序列表(1)序列资料：  (ⅰ)申请人：

    (A)姓名：NOVO NORDISK A/S

    (B)街道：Novo Alle

    (C)城市：DK-2880 Bagsvaerd

    (E)国家：丹麦

    (F)邮编：DK-2880

    (G)电话：+45 4444 8888

    (H)电传：+45 4449 3256  (ⅱ)发明标题：葡糖淀粉酶变体  (ⅲ)序列数：81  (ⅳ)计算机可读形式：

    (A)介质类型：软盘

    (B)计算机：IBM PC兼容机

    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

    (D)软件：PatentIn Release#1.0,Version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO:1的资料：  (ⅰ)序列特征：

    (A)长度：1605个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑构型：线性  (ⅱ)分子类型：其它核酸

    (A)描述：/desc=“cDNA”  (ⅵ)来源：

    (B)菌株：黑曲霉  (ⅸ)特征：

    (A)名称/关键词：信号肽

    (B)位置：1..72  (ⅸ)特征：

    (A)名称/关键词：成熟肽

    (B)位置：73..1602  (ⅸ)特征：

    (A)名称/关键词：CDS

    (B)位置：1..1602  (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1ATG TCG TTC CGA TCT CTA CTC GCC CTG AGC GGC CTC GTC TGC ACA GGG   48Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly-24             -20                  -15                 -10TTG GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC CCG ACC TTG GAT TCA TGG TTG AGC   96Leu Ala Asn Val Ile Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser

            -5                   1               5AAC GAA GCG ACC GTG GCT CGT ACT GCC ATC CTG AAT AAC ATC GGG GCG   144Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr Ala Ile Leu Asn Asn Ile Gly Ala

    10                  15                  20GAC GGT GCT TGG GTG TCG GGC GCG GAC TCT GGC ATT GTC GTT GCT AGT   192Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala Asp Ser Gly Ile Val Val Ala Ser25                   30                  35                 40CCC AGC ACG GAT AAC CCG GAC TAC TTC TAC ACC TGG ACT CGC GAC TCT   240Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser

                45                   50                  55GGT CTC GTC CTC AAG ACC CTC GTC GAT CTC TTC CGA AAT GGA GAT ACC   288Gly Leu Val Leu Lys Thr Leu Val Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr

            60                   65                  70AGT CTC CTC TCC ACC ATT GAG AAC TAC ATC TCC GCC CAG GCA ATT GTC   336Ser Leu Leu Ser Thr Ile Glu Asn Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Ile Val

         75                  80                  85CAG GGT ATC AGT AAC CCC TCT GGT GAT CTG TCC AGC GGC GCT GGT CTC   384Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly Leu

     90                  95                  100GGT GAA CCC AAG TTC AAT GTC GAT GAG ACT GCC TAC ACT GGT TCT TGG   432Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp105                 110                 115                 120GGA CGG CCG CAG CGA GAT GGT CCG GCT CTG AGA GCA ACT GCT ATG ATC   480Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile

                125                 130                  135GGC TTC GGG CAG TGG CTG CTT GAC AAT GGC TAC ACC AGC ACC GCA ACG   528Gly Phe Gly Gln Trp Leu Leu Asp Asn Gly Tyr Thr Ser Thr Ala Thr

            140                 145                 150GAC ATT GTT TGG CCC CTC GTT AGG AAC GAC CTG TCG TAT GTG GCT CAA   576Asp Ile Val Trp Pro Leu Val Arg Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln

        155                 160                 165TAC TGG AAC CAG ACA GGA TAT GAT CTC TGG GAA GAA GTC AAT GGC TCG   624Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser

    170                 175                 180TCT TTC TTT ACG ATT GCT GTG CAA CAC CGC GCC CTT GTC GAA GGT AGT   672Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser185                 190                 195                 200GCC TTC  GCG ACG GCC GTC GGC TCG TCC TGC TCC TGG TGT GAT TCT CAG  720Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln

                205                 210                 215GCA CCC GAA ATT CTC TGC TAC CTG CAG TCC TTC TGG ACC GGC AGC TTC   768Ala Pro Glu Ile Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe

            220                 225                 230ATT CTG GCC AAC TTC GAT AGC AGC CGT TCC GGC AAG GAC GCa AAC ACC   816Ile Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr

        235                 240                 245CTC CTG GGa AGC ATC CAC ACC TTT GAT CCT GAG GCC GCA TGC GAC GAC   864Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp

    250                 255                 260TCC ACC TTC CAG CCC TGC TCC CCG CGC GCG CTC GCC AAC CAC AAG GAG   912Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu265                 270                 275                 280GTT GTA GAC TCT TTC CGC TCA ATC TAT ACC CTC AAC GAT GGT CTC AGT   960Val Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser

                285                 290                 295GAC AGC GAG GCT GTT GCG GTG GGT CGG TAC CCT GAG GAC ACG TAC TAC  1008Asp Ser Glu Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu ASp Thr Tyr Tyr

            300                 305                  310AAC GGC AAC CCG TGG TTC CTG TGC ACC TTG GCT GCC GCA GAG CAG TTG  1056Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Cys Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu

        315                 320                 325TAC GAT GCT CTA TAC CAG TGG GAC AAG CAG GGG TCG TTG GAG GTC ACA  1104Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp ASp Lys Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr

    330                 335                 340GAT GTG TCG CTG GAC TTC TTC AAG GCA CTG TAC AGC GAT GCT GCT ACT  1152Asp Val Ser Leu Asp Phe Phe Lys Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr345                 350                 355                 360GGC ACC TAC TCT TCG TCC AGT TCG ACT TAT AGT AGC ATT GTA GAT GCC  1200Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Ser Ile Val Asp Ala

                365                 370                 375GTG AAG ACT TTC GCC GAT GGC TTC GTC TCT ATT GTG GAA ACT CAC GCC  1248Val Lys Thr Phe Ala Asp Gly Phe Val Ser Ile Val Glu Thr His Ala

            380                  385                 390GCA AGC AAC GGC TCC ATG TCC GAG CAA TAC GAC AAG TCT GAT GGC GAG  1296Ala Ser Asn Gly Ser Met Ser Glu Gln Tyr Asp Lys Ser Asp Gly Glu

        395                 400                 405CAG CTT TCC GCT CGC GAC CTG ACC TGG TCT TAT GCT GCT CTG CTG ACC  1344Gln Leu Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Leu Leu Thr

    410                 415                 420GCC AAC AAC CGT CGT AAC TCC GTC GTG CCT GCT TCT TGG GGC GAG ACC   1392Ala Asn Asn Arg Arg Asn Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Thr425                 430                 435                 440TCT GCC AGC AGC GTG CCC GGC ACC TGT GCG GCC ACA TCT GCC ATT GGT   1440Ser Ala Ser Ser Val Pro Gly Thr Cys Ala Ala Thr Ser Ala Ile Gly

                445                 450                 455ACC TAC AGC AGT GTG ACT GTC ACC TCG TGG CCG AGT ATC GTG GCT ACT   1488Thr Tyr Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Trp Pro Ser Ile Val Ala Thr

            460                 465                 470GGC GGC ACC ACT ACG ACG GCT ACC CCC ACT GGA TCC GGC AGC GTG ACC   1536Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr

        475                 480                 485TCG ACC AGC AAG ACC ACC GCG ACT GCT AGC AAG ACC AGC ACC ACG ACC   1584Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala Ser Lys Thr Ser Thr Thr Thr

    490                 495                  500CGC TCT GGT ATG TCA CTG TGA                                       1605Arg Ser Gly Met Ser Leu505                 510(2)SEQ ID NO:2的资料：  (ⅰ)序列特征：

    (A)长度：534个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑构型：线性  (ⅱ)分子类型：蛋白质  (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly-24             -20                 -15                 -10Leu Ala Asn Val Ile Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser

             -5                  1                5Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr Ala Ile Leu Asn Asn Ile Gly Ala

    10                  15                       20Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala Asp Ser Gly Ile Val Val Ala Ser25                  30                  35                  40Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser

                45                  50                   55Gly Leu Val Leu Lys Thr Leu Val Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr

             60                  65                  70Ser Leu Leu Ser Thr Ile Glu Asn Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Ile Val

         75                  80                  85Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly Leu

     90                  95                 100Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp105                 110                 115                 120Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile

                125                 130                 135Gly Phe Gly Gln Trp Leu Leu Asp Asn Gly Tyr Thr Ser Thr Ala Thr

            140                 145                 150Asp Ile Val Trp Pro Leu Val Arg Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln

        155                 160                 165Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser

    170                 175                 180Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser185                 190                 195                 200Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln

                205                 210                 215Ala Pro Glu Ile Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe

            220                 225                 230Ile Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr

        235                 240                 245Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp

    250                 255                 260Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu265                 270                 275                 280Val Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser

                285                 290                 295Asp Ser Glu Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Thr Tyr Tyr

            300                 305                 310Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Cys Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu

        315                 320                 325Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp Lys Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr

    330                 335                 340Asp Val Ser Leu Asp Phe Phe Lys Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr345                 350                 355                 360Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Ser Ile Val Asp Ala

                365                 370                 375Val Lys Thr Phe Ala Asp Gly Phe Val Ser Ile Val Glu Thr His Ala

            380                 385                 390Ala Ser Asn Gly Ser Met Ser Glu Gln Tyr Asp Lys Ser Asp Gly Glu

        395                  400                 405Gln Leu Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Leu Leu Thr

    410                 415                  420Ala Asn Asn Arg Arg Asn Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Thr425                 430                 435                 440Ser Ala Ser Ser Val Pro Gly Thr Cys Ala Ala Thr Ser Ala Ile Gly

                445                 450                  455Thr Tyr Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Trp Pro Ser Ile Val Ala Thr

            460                 465                 470Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr

        475                 480                 485Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala Ser Lys Thr Ser Thr Thr Thr

    490                 495                 500Arg Ser Gly Met Set Leu505                 510(2)SEQ ID NO:3的资料：  (ⅰ)序列特征：

    (A)长度：20个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑构型：线性  (ⅸ)特征：

    (A)名称/关键词：misc-特征

    (B)其它资料：/desc=“引物7258”  (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3

    gaatgacttg gttgacgcgt caccagtcac    20(2)SEQ ID NO:4的资料：  (ⅰ)序列特征：

    (A)长度：68个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑构型：线性  (ⅸ)特征：

    (A)名称/关键词：misc-特征

    (B)其它资料：/desc=“引物21401”  (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4

    ggggatcatg ataggactag ccatattaat gaagggcata taccacgcct

    tggacctgcg ttatagcc           68(2)SEQ ID NO:5的资料：  (ⅰ)序列特征：

    (A)长度：25个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑构型：线性  (ⅸ)特征：

    (A)名称/关键词：misc-特征

    (B)其它资料：/desc=“引物10758l”  (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5

    gcaacgaagc gcccgtggct cgtac    25(2)SEQ ID NO:6的资料：  (ⅰ)序列特征：

    (A)长度：109个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑构型：线性  (ⅱ)分子类型：其它核酸  (ⅸ)特征：

    (A)名称/关键词：misc-特征

    (B)其它资料：/dese=“引物FAMGⅡ”  (ⅸ)特征：

    (A)名称/关键词：misc-特征

    (B)位置：

       30,33,42,44,47,48,51,53,56,57,58,

       62,63,66,69,71,72,73,74,75

    (D)其它资料：/Note=

    1:A10,C90

    2:A6,T94

    3:A95,C5

    4:G95,C5

    5:G91,A3,T3,C3

    6:G95,A3,C2

    7:G3,A95,C2

    8:G92,A4,T4

    9:A3,T97

    10:G95,T5

    11:G3,A97

    12:G95,A2,C3

    13:TS,C95

    14:G88,A8,C4

    15:G7,A93

    16:G4,C96

    17:G4,A96

    18:G95,A2,C3  (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6

    CGAAGCGACC GTGGCTCGTA CTGCCATC12 TA3TAACATC G4GSCG67CG

    4T8CT91010GT G1112CG4CG13G 1415161718TGGCA TTGTCGTTGC

    TAGTCCCAGC ACGGATAAC                                 109(2)SEQ ID NO:7的资料：  (ⅰ)序列特征：

    (A)长度：28个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑构型：线性  (ⅸ)特征：

    (A)名称/关键词：misc-特征

    (B)其它资料：/desc=“引物RAMG1”  (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7

    GATGGCAGTA CGAGCCACGG TCGCTTCG                        28(2)SEQ ID NO:8的资料：  (ⅰ)序列特征：

    (A)长度：110个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑构型：线性  (ⅱ)分子类型：其它核酸  (ⅸ)特征：

    (A)名称/关键词：misc-特征

    (B)其它资料：/desc=“引物FAMGIV”  (ⅸ)特征：

    (A)名称/关键词：misc-特征

    位置：22,23,24,25,26,28,31,32,34,35,

    37,40,41,43,44,46,47,49,55,56,59,60,

    61,62,67,68,70,71,74,77,79,80,85,86,87(D)其它资料：/Note=

    1:G91,A3,T3,C3

    2:A13,C87

    3:A40,T60

    4:G3,A3,C94

    5:A6,T94

    6:G4,A4,T92

    7:G2,A96,C2

    8:G93,A3.5,C3.5

    9:G87,A8,C5

    10:A84,C16

    11:G93,T7

    12:G92,A5,T3

    13:A3,C97

    14:G3,A97

    15:G2,A2,T4,C92

    16:G93,A7

    17:G93,C7

    18:A90,T10

    19:G4,A96

    20:G95,A5

    21:G96,A4

    22:G3,C97

    23:G2,A1,T95,C2

    24:A3,C97

    25:G95,A3,C2

    26:G2,A96,C2

    27:A5,C95

    28:A95,T5

    29:G2,A98

    30:G94,A4,C2

    31:G94,A3,T1,C2

    32:A4,T96

    33:A20,C80  (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8

    GTGTCGCTGG ACTTCTTCAA G12345A6AC 78C910T11CT12

    13T1415A1617C18C CTAC1920TA2122 2324CAGT1425C26

    27GT28TA16T2930 CATT313233GAT GCCCGTGAAGA CTTTCGCCGA 110(2)SEQ ID NO:9的资料：  (ⅰ)序列特征：

    (A)长度：21个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑构型：线性  (ⅸ)特征：

    (A)名称/关键词：misc-特征

    (B)其它资料：/desc=“引物RAMGVI”  (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9

    CTTGAAGAAG TCCAGCGACA C                                21(2)SEQ ID NO:10的资料：  (ⅰ)序列特征：

    (A)长度：27个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑构型：线性  (ⅸ)特征：

    (A)名称/关键词：misc-特征

    (B)其它资料：/desc=“引物FG2”  (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:10

    CATCCCCAGG ATCCTTACTC AGCAATG                          27(2)SEQ ID NO:11的资料：  (ⅰ)序列特征：

    (A)长度：27个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑构型：线性  (ⅸ)特征：

    (A)名称/关键词：misc-特征

    (B)其它资料：/desc=“引物RG2”  (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:11

    CTCAAACGAC TCACCAGCCT CTAGAGT    27

    <210>12

    <211>2602

    <212>DNA

    <213>黑曲霉

    <220>

    <22l>信号肽

    <222>(270)…(323)

    <221>成熟肽

    <222>(342)…(2438)

    <221>内含子

    <222>(484)…(558)

    <221>内含子

    <222>(846)…(900)

    <221>内含子<222>(998)…(1058)<221>内含子<222>(1697)…(1754)<400>12ttcgtcgcct aatgtctcgt ccgttcacaa actgaagagc ttgaagtggc gagatgtctc      60tgcaggaatt caagctagat gctaagcgat attgcatggc aatatgtgtt gatgcatgtg     120cttcttcctt cagcttcccc tcgtgcgagt gaggtttggc tataaattga agtggttggt     180cggggttccg tgaggggctg aagtgcttcc tcccttttag gcgcaactga gagcctgagc     240ttcatcccca gcatcattac acctcagcaa tgtcgttccg atctctactc gccctgagcg     300gcctcgtctg cacagggttg gcaaatgtga tttccaagcg cgcgaccttg gattcatggt     360tgagcaacga agcgaccgtg gctcgtactg ccatcctgaa taacatcggg gcggacggtg     420cttgggtgtc gggcgcggac tctggcattg tcgttgctag tcccagcacg gataacccgg     480actgtatgtt tcgagctcag atttagtatg agtgtgtcat tgattgattg atgctgactg     540gcgtgtcgtt tgttgtagac ttctacacct ggactcgcga ctctggtctc gtcctcaaga     600ccctcgtcga tctcttccga aatggagata ccagtctcct ctccaccatt gagaactaca     660tctccgccca ggcaattgtc cagggtatca gtaacccctc tggtgatctg tccagcggcg     720ctggtctcgg tgaacccaag ttcaatgtcg atgagactgc ctacactggt tcttggggac     780ggccgcagcg agatggtccg gctctgagag caactgctat gatcggcttc gggcagtggc     840tgcttgtatg ttctccaccc ccttgcgtct gatctgtgac atatgtagct gactggtcag     900gacaatggct acaccagcac cgcaacggac attgtttggc ccctcgttag gaacgacctg     960tcgtatgtgg ctcaatactg gaaccagaca ggatatggtg tgtttgtttt attttaaatt    1020tccaaagatg cgccagcaga gctaacccgc gatcgcagat ctctgggaag aagtcaatgg    1080ctcgtctttc tttacgattg ctgtgcaaca ccgcgccctt gtcgaaggta gtgccttcgc    1140gacggccgtc ggctcgtcct gctcctggtg tgattctcag gcacccgaaa ttctctgcta    1200cctgcagtcc ttctggaccg gcagcttcat tctggccaac ttcgatagca gccgttccgg    1260caaggacgca aacaccctcc tgggaagcat ccacaccttt gatcctgagg ccgcatgcga    1320cgactccacc ttccagccct gctccccgcg cgcgctcgcc aaccacaagg aggttgtaga    1380ctctttccgc tcaatctata ccctcaacga tggtctcagt gacagcgagg ctgttgcggt    1440gggtcggtac cctgaggaca cgtactacaa cggcaacccg tggttcctgt gcaccttggc    1500tgccgcagag cagttgtacg atgctctata ccagtgggac aagcaggggt cgttggaggt    1560cacagatgtg tcgctggact tcttcaaggc actgtacagc gatgctgcta ctggcaccta    1620ctcttcgtcc agttcgactt atagtagcat tgtagatgcc gtgaagactt tcgccgatgg    1680cttcgtctct attgtggtaa gtctacgcta gacaagcgct catgttgaca gagggtgcgt    1740actaacagaa gtaggaaact cacgccgcaa gcaacggctc catgtccgag caatacgaca    1800agtctgatgg cgagcagctt tccgctcgcg acctgacctg gtcttatgct gctctgctga    1860ccgccaacaa ccgtcgtaac tccgtcgtgc ctgcttcttg gggcgagacc tctgccagca    1920gcgtgcccgg cacctgtgcg gccacatctg ccattggtac ctacagcagt gtgactgtca    1980cctcgtggcc gagtatcgtg gctactggcg gcaccactac gacggctacc cccactggat    2040ccggcagcgt gacctcgacc agcaagacca ccgcgactgc tagcaagacc agcaccagta    2100cgtcatcaac ctcctgtacc actcccaccg ccgtggctgt gactttcgat ctgacagcta    2160ccaccaccta cggcgagaac atctacctgg tcggatcgat ctctcagctg ggtgactggg    2220aaaccagcga cggcatagct ctgagtgctg acaagtacac ttccagcgac ccgctctggt    2280atgtcactgt gactctgccg gctggtgagt cgtttgagta caagtttatc cgcattgaga    2340gcgatgactc cgtggagtgg gagagtgatc ccaaccgaga atacaccgtt cctcaggcgt    2400gcggaacgtc gaccgcgacg gtgactgaca cctggcggtg acaatcaatc catttcgcta    2460tagttaaagg atggggatga gggcaattgg ttatatgatc atgtatgtag tgggtgtgca    2520taatagtagt gaaatggaag ccaagtcatg tgattgtaat cgaccgacgg aattgaggat    2580atccggaaat acagacaccg gg                                             2602<210>SEQ ID NO:13<211>长度：640<212>类型：PRT<213>生物体：黑曲霉<400> SEQ ID NO:13Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly1                5                  10                  15Leu Ala Asn Val Ile Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser

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